CN106163504B - 水凝胶毒素-吸收或结合纳米颗粒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了包含浸渍了毒素吸收或结合纳米颗粒的聚合物水凝胶的组合物。本发明还提供了上述组合物用于在受试者中减少或中和毒素的作用或者用于治疗或预防被产生毒素的微生物感染的用途。示例性毒素是生物毒素，诸如病毒毒素、细菌毒素、真菌毒素、植物毒素或动物毒素。

Description

水凝胶毒素-吸收或结合纳米颗粒

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年3月20日提交的标题为“Biomimetic Toxin Nanosponges”的美国临时申请序列第61/955,962号的优先权，该申请的全部内容通过引用并入本文中。

关于联邦政府赞助研究的声明

本发明是在由美国国家卫生研究院的糖尿病、消化病和肾病研究所授予的政府支持下以授权号R01DK095168进行。美国政府依据本授权拥有本发明的某些权利。

发明领域

本发明涉及包含浸渍了毒素吸收或结合纳米颗粒的聚合物水凝胶的组合物。本发明还涉及上述组合物用于在受试者中减少或中和毒素的作用或用于治疗或预防被产生毒素的微生物感染的用途。示例性毒素包括生物毒素，如病毒毒素、细菌毒素、真菌毒素、植物毒素或动物毒素。

发明背景

抗菌水凝胶在对抗局部微生物威胁中具有许多应用。各种抗菌水凝胶制剂已被应用于促进细菌清除，促进伤口愈合，并防止植入物污染(1a,2a)。这些制剂通常由从天然或合成聚合物制成并载有普通抗生素药物的高度水合的生物材料组成(3a,4a)。尽管对抗菌水凝胶进行了大量开发，但没有制剂已被证明包含消除由感染性微生物产生的毒力因子的能力。这些毒力因子可促进局部炎症并使感染的临床结果恶化(5a)。

涂膜纳米颗粒已被证明使许多膜损伤细菌毒力因子解毒(8a,9a)。然而，它们的应用迄今被限于全身施用，因为颗粒稳定化脂质膜结构(用于毒素吸收的基本特征)需要呈用于实现适当功能的水合状态。因此，将纳米颗粒应用于局部治疗或装置涂覆是具有挑战性的，因为制剂会迅速脱水。

发明概要

在一个方面，本发明提供一种包含浸渍了毒素吸收或结合纳米颗粒的聚合物水凝胶的组合物，其中所述纳米颗粒包含：a)内核，其包含非细胞材料；和b)外表面，其包含被配置来用于吸收或结合所述毒素的细胞膜。

在另一个方面，本发明提供一种用于在受试者中减少或中和毒素的作用或用于治疗或预防被产生毒素的微生物感染的方法，所述方法包括向有需要的受试者或所述受试者的细胞施用有效量的上述组合物。

在又一个方面，本发明提供了一种用于保留毒素吸收或结合纳米颗粒的治疗功能的方法，所述方法包括将毒素吸收或结合纳米颗粒浸渍在聚合物水凝胶中以形成包含浸渍所述毒素吸收或结合纳米颗粒的所述聚合物水凝胶的组合物，其中所述纳米颗粒包含：a)内核，其包含非细胞材料；和b)外表面，其包含被配置来用于吸收或结合所述毒素的细胞膜。

在又一个方面，本发明提供了有效量的包含浸渍了毒素吸收或结合纳米颗粒的聚合物水凝胶的组合物用于制造用来在受试者中减少或中和毒素的作用或治疗或预防被产生毒素的微生物感染的药物的用途，其中所述纳米颗粒包含：a)内核，其包含非细胞材料；和b)外表面，其包含被配置来用于吸收或结合所述毒素的细胞膜。

由于感染性细菌的生存和定植依赖许多毒力因子(6a,7a)，因此毒素中和抗菌水凝胶制剂可用于通过抗生素和抗毒力治疗之间的协同作用增强杀菌效果。在一些实施方案中，本发明将广泛适用的毒素中和纳米颗粒平台并入抗菌水凝胶中以用于感染治疗和预防。在一些实施方案中，在水凝胶中掺入毒素中和涂膜纳米颗粒允许所述颗粒保留其功能，因为水凝胶保留其结构内的水分子(最多99.6重量％的水)。通过将水凝胶制剂与涂膜纳米颗粒结合，可以由此制备毒素解毒水凝胶制剂。鉴于水凝胶和聚合物颗粒的货物装载能力，抗生素可以被封装到毒素中和水凝胶中。

在一些方面，本公开涉及2013年3月14日提交的美国申请第13/827,906号、2012年5月24日提交并且公布为WO 2013/052167 A2的国际申请第PCT/US2012/039411号以及2011年6月2日提交的美国临时申请第61/492,626号。上述申请的内容通过引用整体并入。

附图简述

图1说明了包含掺杂有毒素中和纳米颗粒的水凝胶基质或由其组成的毒素中和水凝胶的示意图。

图2A说明了纳米海绵从具有不同PEG浓度的水凝胶的释放。具有高于0.6％(体积比)的PEG百分比的水凝胶可以在24小时后保留约95％的纳米海绵。图2B说明了不同的水凝胶的流变学表征。对于每种凝胶，其G'比其G”高，这表明两种凝胶的凝胶化。图2C说明了纳米海绵水凝胶的SEM图像。

图3说明了具有不同浓度的纳米海绵的水凝胶对α-毒素的吸收。将0.5mlα-毒素溶液(10μg/ml)添加到具有2、1或0mg/ml浓度的纳米海绵的0.5ml水凝胶上。将具有α-毒素和水凝胶的所有试管放入37℃振荡孵育器中。在不同的时间取出40μl上清液并使用ELISA方法检测上清液中的α-毒素的浓度。对于没有纳米海绵的水凝胶，24小时后只有22％的α-毒素扩散到凝胶中，而纳米海绵浓度为1mg/ml和2mg/ml的水凝胶分别吸收46％和72％的α-毒素。

图4说明了在用混合于PBS、水凝胶或载有纳米海绵的水凝胶中的α-毒素进行孵育后离心的RBC。

图5说明了在用混合于PBS、水凝胶或载有纳米海绵的水凝胶中的MRSA进行孵育后离心的RBC。MRSA在液体TSB中培养24小时。然后利用涡旋将TSB和含在其中的MRSA与PBS、水凝胶或载有纳米海绵的水凝胶(2mg/ml)混合。然后加入新鲜的血液并且所有样品在37℃振荡孵育器中孵育2小时。

图6A-6F说明了体内毒素中和作用。给小鼠皮下注射α-毒素/纳米海绵水凝胶或α-毒素/水凝胶。图6A和6B分别示出了纳米海绵水凝胶组和水凝胶组的小鼠皮肤的图像。来自上述纳米海绵水凝胶的小鼠皮肤的H.E.染色切片的图像示于组6C或水凝胶组6D中。来自上述纳米海绵水凝胶的小鼠皮肤的TUNEL染色切片的图像示于组6E或水凝胶组6F中。

图7A-7E说明了载有纳米海绵的水凝胶(NS-凝胶)的制剂和表征。图7A：用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染的局部治疗的保留毒素吸收纳米海绵的水凝胶的示意图。毒素纳米海绵是用包裹在天然红细胞(RBC)双层膜中的聚合物核心构造且随后被嵌入基于丙烯酰胺的水凝胶中。图7B：毒素纳米海绵从具有不同交联剂浓度的水凝胶的释放。误差棒表示标准偏差(n＝3)。图7C：不含纳米海绵(空心标记)或载有2mg/mL纳米海绵(实心标记)的水凝胶(0.6重量％的交联剂)的流变学表征。绘制了储能模量G’和损耗模量G”对频率(0.1–10Hz，在37℃下)的对数图。图7D：NS-凝胶的代表性扫描电子显微镜(SEM)图像。刻度条代表1μm。图7E：通过将1mLα-毒素溶液(2μg/mL PBS溶液)与1mL NS-凝胶或空凝胶一起孵育研究了α-毒素的吸收。使用ELISA对不同孵育时间下的α-毒素在上清液中的浓度进行定量。误差棒表示标准偏差(n＝3)。

图8A-8D说明了体外毒素中和作用。图8A：在用分别混合于PBS、空凝胶和NS-凝胶中的α-毒素进行孵育后离心的RBC。图8B：图8A中的样品的溶血定量。图8C：在用分别与PBS、空凝胶和NS-凝胶混合的MRSA培养基进行孵育后离心的RBC。图8D：图8C中的样品的溶血定量。误差棒表示标准偏差(n＝3)。

图9A-9B说明了由水凝胶实现的体内纳米海绵滞留。使用标记有DiD荧光染料的纳米海绵配制NS-凝胶，然后在小鼠左侧腹的松弛皮肤下皮下注射所述NS-凝胶。在同一小鼠的右侧腹注射自由悬浮的纳米海绵(无水凝胶)作为对照组。图9A：在不同时间点下获取的荧光图像示出了纳米海绵在小鼠皮肤下的滞留。图9B：如图9A中所观察到的荧光强度的量化。所有图像都是3只小鼠/组的代表并且误差棒代表标准偏差(n＝3)。

图10A-10F说明了体内毒素中和作用。图10A-10C：先后注射α-毒素和空凝胶的小鼠。虚线描绘了大概的组织-水凝胶边界。图10A：毒素注射后72小时发生的皮肤病变。图10B：苏木精和曙红(H&E)染色的组织学切片显示出表皮中的炎性浸润、细胞凋亡、坏死和水肿。图10C：肌肉纤维的撕裂、原纤维间水肿以及嗜中性粒细胞从周围脉管系统的外渗指示肌肉损伤。图10D-10F：先后注射α-毒素和NS-凝胶的小鼠。图10D：无皮肤病变发生。图10E：在表皮中没有观察到异常。图10F：观察到正常的肌肉结构。刻度条代表50μm，每个组中n＝6。

图11说明了MRSA感染的体内治疗。将1×10⁹ CFU的MRSA 252与0.2mL的2mg/mLNS-凝胶或空凝胶混合，随后在小鼠背部的松弛皮肤下进行皮下注射(n＝9/组)。在注射后第1天到第4天监测皮肤病变并拍照，并且测量病变尺寸。线条代表中位数值。*P<0.05，n.s.：不显著。

具体实施方式

除非另外指明，否则本发明的实践将采用纳米技术、纳米工程学、分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学、免疫学以及药理学的常规技术，所述技术属于本领域技术的范围内。在以下文献中充分地解释了此类技术：诸如Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版(Sambrook等人，1989)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编著，1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编著，1987)；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编著，1987，以及定期更新)；PCR:The Polymerase Chain Reaction(Mullis等人编著，1994)；以及Remington,The Science and Practice of Pharmacy，第22版(Pharmaceutical Press and Philadelphia College of Pharmacy atUniversity of the Sciences 2012)。

除非另有规定，否则本文所使用的所有技术和科技术语具有如本发明所属技术领域的一般技术人员通常所理解的相同含义。本文中引用的所有专利、申请、公开申请和其它出版物是通过引用整体并入。如果在本节中列出的定义与在通过引用并入本文的专利、申请、公开申请和其它出版物中陈述的定义相反或另外不一致，那么在本节中列出的定义胜过通过引用并入本文中的定义。

A.定义

为了促进理解本发明，本文中所使用的许多术语和缩写在下文中定义如下：

当介绍本发明或其优选实施方案的要素时，冠词“一”、“一个”、“该”和“所述”意指有一个或多个这些要素。术语“包含”、“包括”和“具有”旨在为包括性且意指可以有除列举的元件外的其它元件。

当在一系列的两个或更多个事项中使用时，术语“和/或”意指所列事项中的任何一个可以单独采用或与所列事项中的任何一个或多个组合采用。例如，表述“A和/或B”旨在意指A和B之一或两者，即单独A、单独B或A与B组合。表述“A、B和/或C”旨在意指单独A、单独B、单独C、A与B组合、A与C组合、B与C组合或A、B与C组合。

细胞膜：如本文中所使用的术语“细胞膜”是指在细胞或意外病毒颗粒之内或周围充当选择性屏障的封闭或分隔结构的生物膜。细胞膜可选择性地透过离子和有机分子，并控制物质进出细胞的运动。细胞膜包含磷脂单层或双层和任选地结合的蛋白质和碳水化合物。如本文中所使用，细胞膜是指获自细胞或细胞器的天然存在的生物膜的膜，或由所述天然存在的生物膜衍生的膜。如本文中所使用，术语“天然存在的”是指在自然中存在的膜。如本文中所使用，术语“由其衍生的”是指天然膜的任何后续修饰，诸如分离细胞膜、产生膜的部分或片段、从由细胞或细胞器取得的膜去除某些组分(如脂质、蛋白质或碳水化合物)和/或添加所述组分至所述膜中。可以通过任何适合的方法从天然存在的膜得到膜。例如，可以从细胞或病毒制备或分离膜，并且所制备或分离的膜可以与其它物质或材料组合以形成衍生膜。在另一个实例中，细胞或病毒可以被重组改造以产生在体内并入其膜中的“非天然”物质，并且细胞膜或病毒膜可以从所述细胞或病毒制备或分离出来而形成衍生膜。

在多个实施方案中，覆盖单层或多层纳米颗粒的细胞膜可以被进一步修饰为饱含或不饱含其它脂质组分(如胆固醇、游离脂肪酸和磷脂)，还可以包括内源性或添加的蛋白质和碳水化合物，如细胞表面抗原。在此类情况下，过量的其它脂质组分可以被添加至膜壁中，直到膜壁中的浓度达到平衡所述膜壁才会脱落，这可以取决于纳米颗粒环境。膜还可以包含可能会或可能不会增加纳米颗粒活性的其它试剂。在其它实例中，官能团如抗体和适体可以被添加至膜的外表面上以增强位点靶向，诸如靶向癌细胞中发现的细胞表面表位。纳米颗粒的膜还可以包含颗粒，所述颗粒可以是生物可降解的阳离子纳米颗粒(包括但不限于金、银和合成纳米颗粒)。

合成或人工膜：如本文中所使用，术语“合成膜”或“人工膜”是指由有机材料(如聚合物和液体)以及无机材料生产的人造膜。各种各样的合成膜在本领域中是众所周知的。

如本文中所使用的术语“纳米颗粒”是指至少一个尺寸(例如，高度、长度、宽度或直径)介于约1nm和约10μm之间的纳米结构、颗粒、囊泡或其断片。对于全身使用来说，平均直径为约50nm至约500nm或100nm至250nm可以是优选的。术语“纳米结构”包括但不一定限于颗粒和工程化特征。所述颗粒和工程化特征可以具有例如规则的或不规则的形状。此类颗粒也被称为纳米颗粒。纳米颗粒可以由有机材料或其它材料组成，并且可以替代地用多孔颗粒实现。可以用呈单层形式的纳米颗粒或用具有团聚纳米颗粒的层来实现纳米颗粒的层。在一些实施方案中，所述纳米颗粒包括被外表面覆盖的内核或由其组成，所述外表面包含如本文中所讨论的膜。本发明涵盖了现今已知的和后来开发的可以涂覆有本文中所描述的膜的任何纳米颗粒。

药物活性的：如本文中所使用的术语“药物活性的”是指物质对生命体并且具体地说对人体的细胞和组织的有益生物活性。“药物活性剂”或“药物”是具有药物活性的物质并且“药物活性成分”(API)是药物中具有药物活性的物质。

药学上可接受的：如本文中所使用的术语“药学上可接受的”意指除了安全地用于动物并且更具体来说用于人类和/或非人类哺乳动物的其它制剂之外，得到联邦或州政府的监管机构批准或被列于美国药典、其它公认的药典中。

药学上可接受的盐：如本文中所使用的术语“药学上可接受的盐”是指本公开中的化合物如多药物缀合物的酸加成盐或碱加成盐。药学上可接受的盐是保留母体纳米颗粒或化合物的活性并且对被施用所述盐的受试者以及在其中施用所述盐的环境下不造成任何有害或不良作用的任何盐。药学上可接受的盐可以衍生自氨基酸，包括但不限于半胱氨酸。用于产生作为盐的化合物的方法是本领域技术人员已知的(参见例如Stahl等人，Handbookof Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,Wiley-VCH；VerlagHelvetica Chimica Acta,Zurich,2002；Berge等人，J Pharm.Sci.66:1,1977)。在一些实施方案中，“药学上可接受的盐”旨在意指本文中所描绘的纳米颗粒或化合物的游离酸或游离碱的盐，所述盐是非毒性的、生物可耐受的或另外在生物上适合于施用给受试者。通常参见Berge等人，J.Pharm.Sci.,1977,66,1-19。优选的药学上可接受的盐是药理上有效的并且适合于与受试者的组织接触而没有不当的毒性、刺激或过敏反应的那些盐。本文中所描述的纳米颗粒或化合物可以拥有足够酸性的基团、足够碱性的基团、这两种类型的官能团、或多于每种类型一个的基团，并且相应地与许多无机或有机碱以及无机和有机酸进行反应而形成药学上可接受的盐。

药学上可接受的盐的实例包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔-1,4-二酸盐、己炔-1,6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、磺酸盐、甲基磺酸盐、丙基磺酸盐、苯磺酸盐、二甲苯磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、[γ]-羟丁酸盐、乙醇酸盐、酒石酸盐以及扁桃酸盐。

药学上可接受的载体：如本文中所使用的术语“药学上可接受的载体”是指纳米颗粒或化合物如多药物缀合物随其一起施用的赋形剂、稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或媒介物。此类载体可以是无菌的液体如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等，聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂。抗菌剂，如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；以及用于调节紧张性的试剂如氯化钠或葡萄糖也可以是载体。用于产生与载体组合的组合物的方法是本领域技术人员已知的。在一些实施方案中，语言“药学上可接受的载体”旨在包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、涂层、等渗剂和吸收延迟剂等。此类介质和试剂针对药物活性物质的使用在本领域中是众所周知的。参见例如Remington,The Science and Practice of Pharmacy，第20版(Lippincott,Williams&Wilkins2003)。除非任何常规的介质或试剂与活性化合物不相容，否则预期了在组合物中的这种使用。

磷脂：如本文中所使用的术语“磷脂”是指含有甘油二酯、磷酸基团以及简单的有机分子(如胆碱)的任何众多脂质。磷脂的实例包括但不限于磷脂酸(磷脂酸脂)(PA)、磷脂酰乙醇胺(脑磷脂)(PE)、磷脂酰胆碱(卵磷脂)(PC)、磷酯酰丝氨酸(PS)以及磷酸肌醇，所述磷酸肌醇包括但不限于磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰肌醇磷酸脂(PIP)、磷脂酰肌醇二磷酸酯(PIP2)以及磷脂酰肌醇三磷酸脂(PIP3)。PC的额外实例包括如本领域中所定义的DDPC、DLPC、DMPC、DPPC、DSPC、DOPC、POPC、DRPC和DEPC。

治疗有效量：如本文中所使用，术语“治疗有效量”是指当鉴于具体受试者的疾病或病状的性质和严重性向该受试者施用时将会具有所需的治疗作用的那些量，例如将会治愈、预防、抑制或至少部分阻止或部分预防目标疾病或病状的量。更具体的实施方案被包括在以下药物制剂和施用方法的小节中。在一些实施方案中，术语“治疗有效量”或“有效量”是指当单独或与额外的治疗剂组合施用于细胞、组织或受试者时能有效预防或改善疾病或病状(如溶血性疾病或病状)或疾病或病状的进展的治疗剂的量。治疗有效剂量进一步是指足以改善症状(例如，治疗、治愈、预防或改善相关医学病状)或增加治疗、治愈、预防或改善此类病状的速率的治疗剂的量。当应用于单独施用的个别活性成分时，治疗有效剂量是指所述单独的成分。当应用于组合时，治疗有效剂量是指产生治疗作用的活性成分的组合量，无论是组合、连续或同时施用。

“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“缓解”是指其中目的是减缓(减轻)(若非治愈)靶向的病理状况或病症或预防病状的复发的治疗性治疗。如果在接受治疗量的治疗剂之后，受试者显示出具体疾病的一种或多种病征和症状的可观察和/或可测量的减少或消失，那么受试者被成功地“治疗”。患者也可以感觉到疾病的病征或症状的减少。如果患者经历稳定的疾病，也可以认为患者被治疗。在一些实施方案中，用治疗剂进行治疗有效地使患者在治疗后3个月、优选地6个月、更优选地1年、甚至更优选地在治疗后2年或更多年没有疾病。这些用于评估疾病的成功治疗和改善的参数容易通过本领域中具有适当技能的医师所熟悉的常规程序来测量。

如本文中所使用，“预防性”治疗意指推迟疾病、疾病的症状或医学病状的发展、抑制可能出现的症状、或降低疾病或症状的发展或复发的风险。“治愈性”治疗包括降低现有的疾病、症状或病状的严重性或抑制其恶化。

术语“组合”是指呈一种剂量单位形式的固定组合或用于组合施用的部分的试剂盒，其中纳米颗粒或化合物和组合伴侣(例如，如下所解释的另一种药物，又被称为“治疗剂”或“共药剂”)可以同时独立地施用或在时间间隔内分开施用，尤其在这些时间间隔允许组合伴侣显示出合作作用(例如，协同作用)的情况下。如本文中所使用的术语“共同施用”或“组合施用”等意图涵盖向有需要的单个受试者(例如，患者)施用所选择的组合伴侣，并且旨在包括其中不必通过相同的施用途径或在相同的时间下施用药剂的治疗方案。如本文中所使用的术语“药物组合”意指通过混合或组合多于一种活性成分所得到的产品，并且包括活性成分的固定和非固定组合。术语“固定组合”意指活性成分(例如，纳米颗粒或化合物)和组合伴侣被以单一实体或剂量的形式同时施用给患者。术语“非固定组合”意指活性成分(例如，纳米颗粒或化合物)和组合伴侣被作为分开的实体同时、一并或相继(没有具体时间限制)施用给患者，其中这种施用在患者体内提供治疗有效水平的两种部分或化合物。后者还适用于鸡尾酒疗法，例如施用三种或更多种活性成分。

应该理解，本文所描述的本发明的方面和实施方案包括“由多个方面和实施方案组成”和/或“基本上由多个方面和实施方案组成”。

在整个本公开中，本发明的各个方面是以范围形式呈现。应当理解，以范围形式进行的描述只是为了方便和简洁的目的，并且不应当被解释为对本发明的范围的僵化限制。因此，范围的描述应当被认为已经明确地公开了所有可能的子范围以及所述范围内的单个数值。例如，诸如1至6的范围的描述应当被认为已经明确地公开了子范围如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及所述范围内的单个数值，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的宽度如何，这都适用。

如本文中所使用，有需要的受试者是指动物、非人类哺乳动物或人类。如本文中所使用，“动物”包括宠物、农场动物、经济动物、运动动物以及实验动物，如猫、狗、马、母牛、公牛、猪、驴、绵羊、羊羔、山羊、小鼠、兔、鸡、鸭、鹅、灵长类动物(包括猴和黑猩猩)。

通过结合附图所作的以下说明，本发明的其它目的、优点和特征将变得显而易见。

B.包含浸渍毒素吸收或结合纳米颗粒的聚合物水凝胶的组合物

在一个方面，本发明提供一种包含浸渍了毒素吸收或结合纳米颗粒的聚合物水凝胶的组合物，其中所述纳米颗粒包含：a)内核，其包含非细胞材料；和b)外表面，其包含被配置来用于吸收或结合所述毒素的细胞膜。

在本组合物中可以使用任何合适的聚合物水凝胶。在一些实施方案中，聚合物水凝胶可以包含选自由以下所组成的组的材料：聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯(PEGDMA)、硅酮、明胶、壳聚糖、藻酸盐、聚酯、聚(乙烯醇)和聚丙烯酰胺、聚环氧乙烷、聚乙烯醇、CARBOPOL、聚丙烯酰胺基甲基丙磺酸酯、聚丙烯酸、丙烯酸的盐(包括钠和丙烯酸磺丙酯、甲基丙烯酸2-羟乙酯)、琼脂糖、甲基纤维素、透明质酸及其共聚物。在一个具体的实例中，聚合物水凝胶可以包含聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯(PEGDMA)。

在制造、运输和/或储存期间，本组合物中的聚合物水凝胶可以为任何适合的形式。例如，在制造、运输和/或储存期间，本组合物中的聚合物水凝胶可以为水合或脱水形式。在一些实施方案中，在制造、运输和/或储存期间，本组合物中的聚合物水凝胶可以是水合的，例如包含至少约1％(w/w)、2％(w/w)、3％(w/w)、4％(w/w)、5％(w/w)、6％(w/w)、7％(w/w)、8％(w/w)、9％(w/w)、10％(w/w)、20％(w/w)、30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)、60％(w/w)、70％(w/w)、80％(w/w)、90％(w/w)、91％(w/w)、92％(w/w)、93％(w/w)、94％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)、99％(w/w)或更多的水含量。在其它实施方案中，在制造、运输和/或储存期间，本组合物中的聚合物水凝胶可以为脱水形式，例如干燥或粉末形式。在使用期间，本组合物中的聚合物水凝胶可以为水合形式。例如，在使用期间，本组合物中的聚合物水凝胶可以包含至少约1％(w/w)、2％(w/w)、3％(w/w)、4％(w/w)、5％(w/w)、6％(w/w)、7％(w/w)、8％(w/w)、9％(w/w)、10％(w/w)、20％(w/w)、30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)、60％(w/w)、70％(w/w)、80％(w/w)、90％(w/w)、91％(w/w)、92％(w/w)、93％(w/w)、94％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)、99％(w/w)或更多的水含量。

本组合物中的聚合物水凝胶可以具有任何合适的柔性度。在一些实施方案中，聚合物水凝胶可以具有适于施用于组织或器官的柔性度。在其它实施方案中，聚合物水凝胶可以具有适于施用于天然组织或天然器官的柔性度。

本组合物中的纳米颗粒可以包含任何合适的内核。例如，纳米颗粒的内核可以包括聚合物颗粒核心、二氧化硅颗粒核心或金属(例如，金)颗粒核心。可以使用任何合适的聚合物颗粒核心。在一些实施方案中，聚合物颗粒核心可以包含光学移动特性。在其它实施方案中，聚合物颗粒核心可以包含金属，例如，金、铁氧化物或量子点。在其它实施方案中，纳米颗粒的内核可以包括生物相容性材料或合成材料，诸如聚(乳酸-乙醇酸)(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己内酯(PCL)、聚赖氨酸和聚谷氨酸。在其它实施方案中，纳米颗粒的内核支持外表面。

纳米颗粒可以包含源自任何合适的作为标靶或吸收或结合毒素的细胞的细胞膜。例如，纳米颗粒可以包含源自作为标靶或吸收或结合毒素的细胞的质膜或细胞内膜。纳米颗粒可以包含源自红细胞的任何合适的细胞膜。例如，纳米颗粒可以包含源自红细胞的质膜或细胞内膜。在一些实施方案中，所述细胞膜包括源自红细胞、淋巴细胞或血小板的质膜，例如，源自人类红细胞、淋巴细胞或血小板的质膜。在一些实施方案中，纳米颗粒可以包含源自红细胞、淋巴细胞或血小板的任何合适的天然存在的细胞膜。在一些实施方案中，所述细胞膜包括源自红细胞、淋巴细胞或血小板的天然存在的质膜，例如，源自人类红细胞、淋巴细胞或血小板的天然存在的质膜。在一些实施方案中，纳米颗粒的细胞膜包含膜结合蛋白或聚糖。

本组合物中的纳米颗粒可以具有任何合适的尺寸。例如，纳米颗粒可以具有约10nm至约10μm的直径。在某些实施方案中，纳米颗粒的直径为约10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm和10μm。

本组合物中的纳米颗粒可以具有任何形状，包括但不限于球形、正方形、矩形、三角形、圆盘形、立方体样形状、立方体、长方体(立方形)、圆锥形、圆柱形、棱柱形、棱锥形、直角圆柱形以及其它规则或不规则的形状。

在一些实施方案中，本组合物中的纳米颗粒大体上缺少衍生出细胞膜的细胞(例如，红细胞)的成分。例如，纳米颗粒可以缺少衍生出细胞膜的细胞(例如，红细胞)的至少10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的成分。在一些实施方案中，纳米颗粒包含源自红细胞的质膜且纳米颗粒大体上缺少血红蛋白。例如，纳米颗粒可以缺少至少10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的血红蛋白。

在一些实施方案中，本组合物中的纳米颗粒大体上保持细胞膜的天然结构完整性或活性或细胞膜的成分，以便该纳米颗粒充当毒素的靶细胞(例如，红细胞)的诱饵。例如，纳米颗粒可以保持至少10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的天然结构完整性以用于充当毒素的靶细胞(例如，红细胞)的诱饵。

在一些实施方案中，本组合物中的纳米颗粒是生物相容的或生物可降解的。例如，纳米颗粒的内核包含PLGA且纳米颗粒的外表面包含源自红细胞的质膜。

本组合物中的纳米颗粒可以具有任何合适的体内半衰期。例如，纳米颗粒可以具有为PEG涂覆的相当纳米颗粒的半衰期的至少约2-5倍的体内血液循环半衰期，或具有至少约1小时至约40小时(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40小时)的体内血液循环半衰期。

本组合物中的纳米颗粒的外表面可以包含合成膜。在一些实施方案中，本组合物中的纳米颗粒包含以下两者的混合物：包含含有细胞膜的外表面的纳米颗粒和包含含有合成膜的外表面的纳米颗粒。包含含有合成膜的外表面的纳米颗粒可能会或可能不会吸收或结合毒素。在一些实施方案中，包含含有细胞膜的外表面的纳米颗粒和包含含有合成膜的外表面的纳米颗粒都吸收或结合毒素。在其它实施方案中，包含含有细胞膜的外表面的纳米颗粒吸收或结合毒素，但是包含含有合成膜的外表面的纳米颗粒不吸收或结合毒素。

本组合物可以包含任何合适比率的以下纳米颗粒：包含含有细胞膜的外表面的纳米颗粒和包含含有合成膜的外表面的纳米颗粒。在一些实施方案中，本组合物可以包含至少约1％(w/w)、2％(w/w)、3％(w/w)、4％(w/w)、5％(w/w)、6％(w/w)、7％(w/w)、8％(w/w)、9％(w/w)、10％(w/w)、20％(w/w)、30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)、60％(w/w)、70％(w/w)、80％(w/w)、90％(w/w)、91％(w/w)、92％(w/w)、93％(w/w)、94％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)、99％(w/w)或更多的包含含有细胞膜的外表面的纳米颗粒。在其它实施方案中，本组合物可以包含至少约1％(w/w)、2％(w/w)、3％(w/w)、4％(w/w)、5％(w/w)、6％(w/w)、7％(w/w)、8％(w/w)、9％(w/w)、10％(w/w)、20％(w/w)、30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)、60％(w/w)、70％(w/w)、80％(w/w)、90％(w/w)、91％(w/w)、92％(w/w)、93％(w/w)、94％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)、99％(w/w)或更多的包含含有合成膜的外表面的纳米颗粒。例如，本组合物可以包含约1-10％(w/w)的包含含有细胞膜的外表面的纳米颗粒和约90-99％(w/w)的包含含有合成膜的外表面的纳米颗粒、约11-25％(w/w)的包含含有细胞膜的外表面的纳米颗粒和约75-89％(w/w)的包含含有合成膜的外表面的纳米颗粒、约50％(w/w)的包含含有细胞膜的外表面的纳米颗粒和约50％(w/w)的包含含有合成膜的外表面的纳米颗粒、约51-75％(w/w)的包含含有细胞膜的外表面的纳米颗粒和约49-25％(w/w)的包含含有合成膜的外表面的纳米颗粒、或约90-100％(w/w)的包含含有细胞膜的外表面的纳米颗粒和约0-10％(w/w)的包含含有合成膜的外表面的纳米颗粒。

本组合物中的纳米颗粒的外表面的细胞膜可以被构造来吸收或结合任何合适的毒素。例如，本组合物中的纳米颗粒的外表面的细胞膜可以被构造来吸收或结合生物毒素。示例性生物毒素可以是病毒、细菌、真菌、植物或动物毒素，无论是天然形式还是修饰形式的。在一些实施方案中，细菌毒素是来自革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌的毒素，或来自大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的毒素，例如，来自耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的强毒株的毒素。在其它实施方案中，真菌毒素是来自白色念珠菌(Candida albicans)或烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的毒素。在其它实施方案中，动物毒素是来自爬行动物(例如，乌龟、鳄鱼、蛇、蜥蜴或大蜥蜴)或节肢动物(例如，昆虫、蜘蛛或蝎子)的毒素。动物毒素可以是任何合适的形式，例如，动物毒素被包含在动物毒液中。在其它实施方案中，所述生物毒素是成孔毒素，例如，来自金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的强毒株的α-毒素。在其它实施方案中，成孔毒素的天然标靶是哺乳动物红细胞，例如，人红细胞。

在一些实施方案中，聚合物水凝胶和/或纳米颗粒中的聚合物网络可以以任何合适的方式彼此交联。例如，聚合物水凝胶可以包括彼此物理或共价交联的聚合物网络。在另一个实例中，聚合物水凝胶可以包括与纳米颗粒物理或共价交联的聚合物网络。在又一个实例中，聚合物水凝胶可以包括彼此物理或共价交联的聚合物网络以及与纳米颗粒物理或共价交联的聚合物网络。

本组合物可以进一步包含合适的物质，例如，治疗剂、预防剂、诊断或标记试剂、预后剂、分离剂、监测剂或其组合。示例性治疗剂或预防剂可以是抗病毒剂、抗生素、抗真菌剂或抗原生动物剂。在一些实施方案中，治疗剂或预防剂是奎宁。在其它实施方案中，治疗剂或预防剂是抗生素。可以使用任何合适的抗生素。例如，抗生素可以是细胞壁合成抑制剂、蛋白质合成抑制剂、膜功能抑制剂、叶酸途径抑制剂或核酸合成功能抑制剂。可以使用任何合适的细胞壁合成抑制剂。例如，细胞壁合成抑制剂可以是青霉素、头孢菌素、单胺菌素、青霉烯、糖肽或脂糖肽。

在一些实施方案中，本组合物可以进一步包含在下表1中列出的示例性抗生素或其组合。

表1.示例性抗生素

(改自Biomerieux Vitek 2 Customer Education，2008年3月-<http://www.biomerieux-usa.com/upload/VITEK-Bus-Module-1-Antibiotic-Classification-and-Modes-of-Action-1.pdf>)。

治疗剂、预防剂、诊断或标记试剂、预后剂、分离剂、监测剂或其组合可以包含在本组合物中的任何合适的位置。例如，治疗剂、预防剂、诊断或标记试剂、预后剂、分离剂、监测剂或其组合可以包含在纳米颗粒中。在一些实施方案中，治疗剂、预防剂、诊断或标记试剂、预后剂、分离剂、监测剂或其组合可以包含在纳米颗粒中的可释放货物中。纳米颗粒可以在任何合适的位置包含可释放货物。例如，可释放货物可以位于内核中或内核上、内核与外表面之间、或外表面中或外表面上。可释放货物的释放可以由任何合适的机制触发。例如，可释放货物的释放可以由纳米颗粒与受试者或受试者细胞之间的接触或由纳米颗粒周围的物理参数的变化触发。所述纳米颗粒可以包含任何适当类型的可释放货物。例如，可释放货物可以是金属颗粒、聚合物颗粒、树状物颗粒或无机颗粒。在一些实施方案中，治疗剂、预防剂、诊断或标记试剂、预后剂、分离剂、监测剂或其组合可以包含在本组合物中，但位于纳米颗粒的外部。

本组合物可以以任何合适的制剂形式来制备、储存、运输和/或使用。在一些实施方案中，本组合物可以进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。在其它实施方案中，本组合物可以包含在药物递送系统、医疗装置或消费品中。可以使用任何合适的药物递送系统或医疗装置。例如，所述药物递送系统或医疗装置可以是植入物(例如，乳房植入物或在骨科手术期间或之后放置的植入物)、导管、缓释型药物递送系统或用于烧伤或其它难愈合创伤的愈合的敷料。本组合物可以以任何合适的消费品形式来制备、储存、运输和/或使用。例如，消费品可以是卫生制品，例如一次性尿布。在其它实施方案中，本组合物可以被构造为组织工程学中的支架的一部分。

本组合物可以被配置来用于任何合适的施用途径。例如，本组合物可以被配置来用于直肠、鼻腔、局部、眼内、肌内、腹膜内或皮下施用途径。

在一些实施方案中，本组合物可以被配置为毒素中和抗菌水凝胶。毒素中和抗菌水凝胶可以被配置来用于在感染部位局部施用。毒素中和抗菌水凝胶还可以被涂覆在医疗装置(例如，被配置成用于治疗性或预防性施用的医疗装置)上。

在另一个方面，本发明提供了有效量的上述组合物用于制造用来在受试者中减少或中和毒素的作用或用于治疗或预防被产生毒素的微生物感染的药物的用途。本发明还提供了制造的药物。

在又一个方面，本发明提供了一种用于保留毒素吸收或结合纳米颗粒的治疗功能的方法，所述方法包括将毒素吸收或结合纳米颗粒浸渍在聚合物水凝胶中以形成包含浸渍所述毒素吸收或结合纳米颗粒的所述聚合物水凝胶的组合物，其中所述纳米颗粒包含：a)内核，其包含非细胞材料；和b)外表面，其包含被配置来用于吸收或结合所述毒素的细胞膜。所述纳米颗粒和聚合物水凝胶是如上所述。本发明还提供了一种制造的组合物，其中毒素吸收或结合纳米颗粒的治疗功能被保留。

在一些实施方案中，所述组合物中的水凝胶可以包含聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯(PEGDMA)。在其它实施方案中，所述组合物中的纳米颗粒的细胞膜可以包括源自红细胞的质膜。仍在其它实施方案中，本方法可以进一步包括添加抗生素至所述组合物中。抗生素可以包含在组合物的任何合适的部分(例如，纳米颗粒)中。抗生素可以包含在纳米颗粒的任何合适的部分(例如，纳米颗粒的可释放货物)中。本发明还提供了一种制造的组合物，其中毒素吸收或结合纳米颗粒的治疗功能被保留。

C.用于在受试者中减少或中和毒素的作用或治疗或预防感染的方法

在另一个方面，本发明提供一种用于在受试者中减少或中和毒素的作用或用于治疗或预防被产生毒素的微生物感染的方法，所述方法包括向有需要的受试者或所述受试者的细胞施用有效量的描述于以上部分B中的组合物或药物。

本方法可以用于在任何合适的受试者中减少或中和毒素的作用或治疗或预防感染。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人类。在其它实施方案中，哺乳动物是非人类哺乳动物，包括宠物、农场动物、经济动物、运动动物以及实验动物，如猫、狗、马、母牛、公牛、猪、驴、绵羊、羊羔、山羊、小鼠、兔、灵长类动物(包括猴和黑猩猩)。

在一些实施方案中，本方法可以用于降低毒素在受试者中的作用。在其它实施方案中，本方法可以用于中和毒素在受试者中的作用。在其它实施方案中，本方法可以用于治疗产生毒素的微生物在受试者中的感染。在其它实施方案中，本方法可以用于预防产生毒素的微生物在受试者中的感染。

在一些实施方案中，在本方法中使用的组合物，尤其是本组合物中的纳米颗粒大体上缺少对受试者例如哺乳动物的免疫原性。例如，细胞膜可以源自与哺乳动物相同的物种的细胞，例如红细胞。在另一个实例中，哺乳动物是人类，且细胞膜源自人类细胞，例如人红细胞。在一些实施方案中，细胞膜可以源自待治疗的哺乳动物的细胞，例如红细胞。例如，细胞膜可以源自待治疗的人的红细胞。

在本方法中使用的组合物可以包含任何合适的聚合物水凝胶。在一些实施方案中，聚合物水凝胶可以包含选自由以下所组成的组的材料：聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯(PEGDMA)、硅酮、明胶、壳聚糖、藻酸盐、聚酯、聚(乙烯醇)和聚丙烯酰胺、聚环氧乙烷、聚乙烯醇、

聚丙烯酰胺基甲基丙磺酸酯、聚丙烯酸、丙烯酸的盐(包括钠和丙烯酸磺丙酯、甲基丙烯酸2-羟乙酯)、琼脂糖、甲基纤维素、透明质酸及其共聚物。在一个具体的实例中，聚合物水凝胶可以包含聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯(PEGDMA)。

在使用期间，在本方法中使用的组合物中的聚合物水凝胶可以为水合形式。例如，在使用期间，本组合物中的聚合物水凝胶可以包含至少约1％(w/w)、2％(w/w)、3％(w/w)、4％(w/w)、5％(w/w)、6％(w/w)、7％(w/w)、8％(w/w)、9％(w/w)、10％(w/w)、20％(w/w)、30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)、60％(w/w)、70％(w/w)、80％(w/w)、90％(w/w)、91％(w/w)、92％(w/w)、93％(w/w)、94％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)、99％(w/w)或更多的水含量。

在本方法中使用的组合物中的聚合物水凝胶可以具有任何合适的柔性度。在一些实施方案中，聚合物水凝胶可以具有适于施用于组织或器官的柔性度。在其它实施方案中，聚合物水凝胶可以具有适于施用于天然组织或天然器官的柔性度。

在本方法中使用的组合物中的纳米颗粒可以包含任何合适的内核。例如，纳米颗粒的内核可以包括聚合物颗粒核心、二氧化硅颗粒核心或金属(例如，金)颗粒核心。可以使用任何合适的聚合物颗粒核心。在一些实施方案中，聚合物颗粒核心可以包含光学移动特性。在其它实施方案中，聚合物颗粒核心可以包含金属，例如，金、铁氧化物或量子点。在其它实施方案中，纳米颗粒的内核可以包括生物相容性材料或合成材料，诸如聚(乳酸-乙醇酸)(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己内酯(PCL)、聚赖氨酸和聚谷氨酸。在其它实施方案中，纳米颗粒的内核支持外表面。

在本方法中使用的组合物中的纳米颗粒可以包含源自任何合适的作为标靶或吸收或结合毒素的细胞的细胞膜。例如，纳米颗粒可以包含源自作为标靶或吸收或结合毒素的细胞的质膜或细胞内膜。纳米颗粒可以包含源自红细胞的任何合适的细胞膜。例如，纳米颗粒可以包含源自红细胞的质膜或细胞内膜。在一些实施方案中，所述细胞膜包括源自红细胞、淋巴细胞或血小板的质膜，例如，源自人类红细胞、淋巴细胞或血小板的质膜。在一些实施方案中，纳米颗粒可以包含源自红细胞、淋巴细胞或血小板的任何合适的天然存在的细胞膜。在一些实施方案中，所述细胞膜包括源自红细胞、淋巴细胞或血小板的天然存在的质膜，例如，源自人类红细胞、淋巴细胞或血小板的天然存在的质膜。在一些实施方案中，纳米颗粒的细胞膜包含膜结合蛋白或聚糖。

在本方法中使用的组合物中的纳米颗粒可以具有任何合适的尺寸。例如，纳米颗粒可以具有约10nm至约10μm的直径。在某些实施方案中，纳米颗粒的直径为约10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm和10μm。

在本方法中使用的组合物中的纳米颗粒可以具有任何形状，包括但不限于球形、正方形、矩形、三角形、圆盘形、立方体样形状、立方体、长方体(立方形)、圆锥形、圆柱形、棱柱形、棱锥形、直角圆柱形以及其它规则或不规则的形状。

在一些实施方案中，在本方法中使用的组合物中的纳米颗粒大体上缺少衍生出细胞膜的细胞(例如，红细胞)的成分。例如，纳米颗粒可以缺少衍生出细胞膜的细胞(例如，红细胞)的至少10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的成分。在一些实施方案中，纳米颗粒包含源自红细胞的质膜且纳米颗粒大体上缺少血红蛋白。例如，纳米颗粒可以缺少至少10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的血红蛋白。

在一些实施方案中，在本方法中使用的组合物中的纳米颗粒大体上保持细胞膜的天然结构完整性或活性或细胞膜的成分，以便该纳米颗粒充当毒素的靶细胞(例如，红细胞)的诱饵。例如，纳米颗粒可以保持至少10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的天然结构完整性以用于充当毒素的靶细胞(例如，红细胞)的诱饵。

在一些实施方案中，在本方法中使用的组合物中的纳米颗粒是生物相容的或生物可降解的。例如，纳米颗粒的内核包含PLGA且纳米颗粒的外表面包含源自红细胞的质膜。

在本方法中使用的组合物中的纳米颗粒可以具有任何合适的体内半衰期。例如，纳米颗粒可以具有为PEG涂覆的相当纳米颗粒的半衰期的至少约2-5倍的体内血液循环半衰期，或具有至少约1小时至约40小时(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40小时)的体内血液循环半衰期。

在本方法中使用的组合物中的纳米颗粒的外表面可以进一步包含合成膜。在一些实施方案中，在本方法中使用的组合物中的纳米颗粒包含以下两者的混合物：包含含有细胞膜的外表面的纳米颗粒和包含含有合成膜的外表面的纳米颗粒。包含含有合成膜的外表面的纳米颗粒可能会或可能不会吸收或结合毒素。在一些实施方案中，包含含有细胞膜的外表面的纳米颗粒和包含含有合成膜的外表面的纳米颗粒都吸收或结合毒素。在其它实施方案中，包含含有细胞膜的外表面的纳米颗粒吸收或结合毒素，但是包含含有合成膜的外表面的纳米颗粒不吸收或结合毒素。

在本方法中使用的组合物可以包含任何合适比率的以下纳米颗粒：包含含有细胞膜的外表面的纳米颗粒和包含含有合成膜的外表面的纳米颗粒。在一些实施方案中，本组合物可以包含至少约1％(w/w)、2％(w/w)、3％(w/w)、4％(w/w)、5％(w/w)、6％(w/w)、7％(w/w)、8％(w/w)、9％(w/w)、10％(w/w)、20％(w/w)、30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)、60％(w/w)、70％(w/w)、80％(w/w)、90％(w/w)、91％(w/w)、92％(w/w)、93％(w/w)、94％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)、99％(w/w)或更多的包含含有细胞膜的外表面的纳米颗粒。在其它实施方案中，本组合物可以包含至少约1％(w/w)、2％(w/w)、3％(w/w)、4％(w/w)、5％(w/w)、6％(w/w)、7％(w/w)、8％(w/w)、9％(w/w)、10％(w/w)、20％(w/w)、30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)、60％(w/w)、70％(w/w)、80％(w/w)、90％(w/w)、91％(w/w)、92％(w/w)、93％(w/w)、94％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)、99％(w/w)或更多的包含含有合成膜的外表面的纳米颗粒。例如，在本方法中使用的组合物可以包含约1-10％(w/w)的包含含有细胞膜的外表面的纳米颗粒和约90-99％(w/w)的包含含有合成膜的外表面的纳米颗粒、约11-25％(w/w)的包含含有细胞膜的外表面的纳米颗粒和约75-89％(w/w)的包含含有合成膜的外表面的纳米颗粒、约50％(w/w)的包含含有细胞膜的外表面的纳米颗粒和约50％(w/w)的包含含有合成膜的外表面的纳米颗粒、约51-75％(w/w)的包含含有细胞膜的外表面的纳米颗粒和约49-25％(w/w)的包含含有合成膜的外表面的纳米颗粒、或约90-100％(w/w)的包含含有细胞膜的外表面的纳米颗粒和约0-10％(w/w)的包含含有合成膜的外表面的纳米颗粒。

本方法可以用于吸收或结合任何合适的毒素。例如，在本方法中使用的组合物中的纳米颗粒可以被构造来吸收或结合生物毒素。示例性生物毒素可以是病毒、细菌、真菌、植物或动物毒素，无论是天然形式还是修饰形式的。在一些实施方案中，细菌毒素是来自革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌的毒素，或来自大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的毒素，例如，来自耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的强毒株的毒素。在其它实施方案中，真菌毒素是来自白色念珠菌(Candida albicans)或烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的毒素。在其它实施方案中，动物毒素是来自爬行动物(例如，乌龟、鳄鱼、蛇、蜥蜴或大蜥蜴)或节肢动物(例如，昆虫、蜘蛛或蝎子)的毒素。动物毒素可以是任何合适的形式，例如，动物毒素被包含在动物毒液中。在其它实施方案中，所述生物毒素是成孔毒素，例如，来自金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的强毒株的α-毒素。在其它实施方案中，成孔毒素的天然标靶是哺乳动物红细胞，例如，人红细胞。

在一些实施方案中，在本方法中使用的组合物中的聚合物水凝胶和/或纳米颗粒中的聚合物网络可以以任何合适的方式彼此交联。例如，聚合物水凝胶可以包括彼此物理或共价交联的聚合物网络。在另一个实例中，聚合物水凝胶可以包括与纳米颗粒物理或共价交联的聚合物网络。在又一个实例中，聚合物水凝胶可以包括彼此物理或共价交联的聚合物网络以及与纳米颗粒物理或共价交联的聚合物网络。

本方法可以进一步包括向受试者施用其它合适的物质，例如，治疗剂、预防剂、诊断或标记试剂、预后剂、分离剂、监测剂或其组合。示例性治疗剂或预防剂可以是抗病毒剂、抗生素、抗真菌剂或抗原生动物剂。在一些实施方案中，治疗剂或预防剂是奎宁。在其它实施方案中，治疗剂或预防剂是抗生素。可以使用任何合适的抗生素。例如，抗生素可以是细胞壁合成抑制剂、蛋白质合成抑制剂、膜功能抑制剂、叶酸途径抑制剂或核酸合成功能抑制剂。可以使用任何合适的细胞壁合成抑制剂。例如，细胞壁合成抑制剂可以是青霉素、头孢菌素、单胺菌素、青霉烯、糖肽或脂糖肽。

在一些实施方案中，所述方法可以进一步包括向受试者施用在上表1中列出的一种或多种示例性抗生素或其组合。

治疗剂、预防剂、诊断或标记试剂、预后剂、分离剂、监测剂或其组合可以包含在用于本方法中的组合物中的任何合适的位置。例如，治疗剂、预防剂、诊断或标记试剂、预后剂、分离剂、监测剂或其组合可以包含在纳米颗粒中。在一些实施方案中，治疗剂、预防剂、诊断或标记试剂、预后剂、分离剂、监测剂或其组合可以包含在纳米颗粒中的可释放货物中。纳米颗粒可以在任何合适的位置包含可释放货物。例如，可释放货物可以位于内核中或内核上、内核与外表面之间、或外表面中或外表面上。可释放货物的释放可以由任何合适的机制触发。例如，可释放货物的释放可以由纳米颗粒与受试者或受试者细胞之间的接触或由纳米颗粒周围的物理参数的变化触发。所述纳米颗粒可以包含任何适当类型的可释放货物。例如，可释放货物可以是金属颗粒、聚合物颗粒、树状物颗粒或无机颗粒。在一些实施方案中，治疗剂、预防剂、诊断或标记试剂、预后剂、分离剂、监测剂或其组合可以包含在用于本方法中的组合物中，但位于纳米颗粒的外部。在一些实施方案中，治疗剂、预防剂、诊断或标记试剂、预后剂、分离剂、监测剂或其组合可以与在本方法中使用的组合物分开来施用给受试者。在本方法中使用的组合物和额外的物质可以被同时或相继施用给受试者。

在一些实施方案中，本方法可以进一步包括将药学上可接受的载体或赋形剂施用给受试者。

在本方法中使用的组合物可以使用任何合适的递送机制或技术来施用。在一些实施方案中，所述组合物可以单独施用。在其它实施方案中，所述组合物可以与药学上可接受的载体或赋形剂一起施用。在其它实施方案中，所述组合物可以经由药物递送系统、医疗装置或消费品来施用。可以使用任何合适的药物递送系统或医疗装置。例如，所述药物递送系统或医疗装置可以是植入物(例如，乳房植入物或在骨科手术期间或之后放置的植入物)、导管、缓释型药物递送系统或用于烧伤或其它难愈合创伤的愈合的敷料。在另一个实例中，消费品可以是卫生制品，例如一次性尿布。在又一个实例中，本方法可以通过将本组合物包括在组织工程学中的支架中而用于组织工程学。

在本方法中使用的组合物可以经由任何合适的施用途径被施用给受试者。在一些实施方案中，所述组合物可以经由直肠、鼻腔、局部、眼内、肌内、腹膜内或皮下施用途径被施用给受试者。

在一个实例中，所述组合物可以经由局部施用途径被施用给受试者。所述组合物中的水凝胶可以包含聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯(PEGDMA)。所述组合物中的纳米颗粒的细胞膜可以包括源自红细胞的质膜。本方法可以进一步包括向受试者施用抗生素。抗生素可以包含在组合物的任何合适的部分(例如，纳米颗粒)中。抗生素可以包含在纳米颗粒的任何合适的部分(例如，纳米颗粒的可释放货物)中。

D.药物组合物和施用途径

本文中所描述的包含单独存在或与其它活性成分组合的纳米颗粒的药物组合物可以进一步包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂是无毒的并且另外在生物学上适于施用给受试者的物质。此类赋形剂促进本文中所描述的单独存在或与其它活性成分组合的纳米颗粒的施用并且与活性成分相容。药学上可接受的赋形剂的实例包括稳定剂、润滑剂、表面活性剂、稀释剂、抗氧化剂、粘合剂、着色剂、增量剂、乳化剂或变味剂。在优选的实施方案中，根据各个实施方案的药物组合物是无菌组合物。药物组合物可以使用已知的或本领域技术人员可利用的混合技术来制备。

无菌组合物是在本公开的范围内，包括符合管理此类组合物的国家和地方法规的组合物。

根据本领域中已知的用于制备各种剂型的常规方法，本文所描述的药物组合物和单独存在或与其它活性成分组合的纳米颗粒可以被配制为在合适的药物溶剂或载体中的溶液剂、乳剂、混悬剂或分散剂，或与固体载体一起被配制为丸剂、片剂、锭剂、栓剂、药囊、糖衣丸、颗粒剂、散剂、重构用散剂或胶囊剂。本文所述的单独存在或与其它活性成分组合的纳米颗粒(优选为药物组合物形式)可以通过合适的递送途径(如口服、肠胃外、直肠、鼻腔、局部或眼内途径)或通过吸入来施用。在一些实施方案中，所述组合物被配制来用于静脉内或口服施用。

对于口服施用，单独存在或与另一种活性成分组合的纳米颗粒可以以固体形式如片剂或胶囊剂提供，或作为溶液剂、乳剂或混悬剂提供。为了制备口服组合物，单独存在或与其它活性成分组合的纳米颗粒可以经过配制以得到例如约0.01至约50mg/kg/天、或约0.05至约20mg/kg/天或约0.1至约10mg/kg/天的剂量。口服片剂可以包括与相容的药学上可接受的赋形剂(如稀释剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂)混合的活性成分。合适的惰性填充剂包括碳酸钠和碳酸钙、磷酸钠和磷酸钙、乳糖、淀粉、糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露醇、山梨醇等。示例性的液体口服赋形剂包括乙醇、甘油、水等。淀粉、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羟乙酸淀粉钠、微晶纤维素和藻酸是示例性崩解剂。粘合剂可以包括淀粉和明胶。润滑剂如果存在的话可以是硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。如果需要，片剂可以用材料如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯进行涂覆以延迟在胃肠道中的吸收，或者可以用肠溶衣进行包衣。

用于口服施用的胶囊剂包括硬明胶胶囊和软明胶胶囊。为了制备硬明胶胶囊，活性成分可以与固体、半固体或液体稀释剂混合。软明胶胶囊可以通过将活性成分与水、油如花生油或橄榄油、液体石蜡、短链脂肪酸的单甘油酯和二甘油酯的混合物、聚乙二醇400或丙二醇混合来制备。

用于口服施用的液体可以为混悬剂、溶液剂、乳剂或糖浆剂的形式，或者可以是冻干的或呈现为在使用前用水或其它合适的媒介物重构的干燥产品。此类液体组合物可以任选地含有：药学上可接受的赋形剂，诸如悬浮剂(例如，山梨醇、甲基纤维素、藻酸钠、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶等)；非水性媒介物，例如油(例如，杏仁油或分馏椰子油)、丙二醇、乙醇或水；防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)；湿润剂，如卵磷脂；以及调味剂或着色剂(如果需要)。

组合物可以被配制成栓剂以用于直肠施用。对于肠胃外使用，包括静脉内、肌内、腹膜内、鼻内或皮下途径，单独存在或与其它活性成分组合的纳米颗粒可以以缓冲至适当的pH和等渗性的无菌水溶液或悬浮液形式提供，或以胃肠外可接受的油形式提供。合适的水性媒介物可以包括林格氏溶液(Ringer's solution)和等渗氯化钠。此类形式可以以单位剂量形式如安瓿或一次性注射装置、以多剂量形式如小瓶(可以从其中抽出适当的剂量)或以可用于制备注射制剂的固体形式或预浓缩物提供。示例性的输注剂量的范围为在几分钟至几天的时间段内与药物载体混合的约1至1000μg/kg/分钟药剂。

对于经鼻、吸入或口服施用，单独存在或与其它活性成分组合的纳米颗粒可以使用例如还含有合适载体的喷雾制剂来施用。

对于局部应用，单独存在或与其它活性成分组合的纳米颗粒优选被配制成乳膏或软膏或适合于局部施用的类似媒介物。对于局部施用，单独存在或与其它活性成分组合的纳米颗粒可以与药物载体在约0.1％至约10％的药物对媒介物的浓度下混合。施用单独存在或与其它活性成分组合的纳米颗粒的另一种方式可以利用贴剂来实现经皮递送。

在某些实施方案中，本公开提供了包含纳米颗粒和甲基纤维素的药物组合物，所述纳米颗粒单独存在或与其它活性成分组合。在某些实施方案中，甲基纤维素在约0.1、0.2、0.3、0.4或0.5至约1％的悬浮液中。在某些实施方案中，甲基纤维素在约0.1至约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或约1％的悬浮液中。在某些实施方案中，甲基纤维素在约0.1至约1％的悬浮液中。在某些实施方案中，甲基纤维素在约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.8或1％的悬浮液中。在某些实施方案中，甲基纤维素在约0.5％的悬浮液中。

E.示例性实施方案

在一些实施方案中，本发明提供了用于感染部位的局部治疗的包含毒素吸收纳米颗粒的组合物及其使用方法，以及可植入装置上的抗菌涂层。本发明进一步提供了通过水凝胶保留治疗性纳米颗粒官能的方法。

在某些实施方案中，本发明提供的组合物是经由掺入毒素吸收纳米颗粒而被赋予毒素中和能力的抗菌水凝胶，此类抗菌水凝胶可以吸收和/或消除由感染性微生物产生的毒素。在某些实施方案中，此类具有毒素吸收纳米颗粒的抗菌水凝胶是纳米海绵。在其它实施方案中，本发明的组合物包含可变形水凝胶，其可以用于允许递送持续的局部水平的抗生素以减少当前护理标准的涉及团注给药的毒素问题。

在一些实施方案中，本发明进一步提供了通过向有需要的受试者施用有效量的包含毒素吸收纳米颗粒的本发明组合物来治疗感染的方法。施用途径包括但不限于在感染部位的局部施用。本发明进一步提供了使用包含毒素吸收纳米颗粒的本发明组合物作为抗菌涂层来进行在医疗装置(包括但不限于整形外科植入物和导管)上的预防性和/或治疗性施用的方法。

在一些实施方案中，本发明提供了经由掺入毒素吸收纳米颗粒而被赋予毒素中和能力的抗菌水凝胶。在其它实施方案中，本发明进一步提出了本发明的抗菌水凝胶可以用于在感染部位的局部应用或用于在医疗装置(包括整形外科植入物和导管)上的预防性施用。还提供了经由水凝胶制剂保留治疗性纳米颗粒功能的方法。

在本发明的一个实施方案中，展示了聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯(PEGDMA)水凝胶制剂中嵌有被红细胞膜包覆的纳米颗粒平台(图1)。通过调节制剂中的PEG的百分比，可以制备以不同的效率保留纳米颗粒的密集而水合的矩阵(图2a)。例如，含有0.6％(体积比)的PEG的水凝胶制剂被示出保留95％的RBC膜包覆型纳米微粒达24小时。纳米颗粒掺入不干扰水凝胶形成，因为使用流变学表征确认了凝胶化(图2b)。扫描电子显微术可视化也验证了纳米颗粒存在于水凝胶制剂中(图2c)。

在本发明的另一个实施方案中，证明了通过掺入RBC膜包覆型纳米颗粒，水凝胶制剂被赋予吸收α-毒素(由金黄色葡萄球菌分泌的主要膜损伤毒素)的能力(图3)。已发现吸收效率与纳米颗粒的嵌入量相关，这表明纳米颗粒的毒素吸收能力在水凝胶中得以保留。通过将RBC与毒素中和水凝胶混合进行的溶血实验还表明，吸收的毒素被完全中和(图4a和图4b)。这种毒素中和作用特异于掺杂有RBC膜包覆型纳米颗粒的水凝胶制剂。水凝胶的抗毒力作用也可以适用于细菌。在将水凝胶与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的α-毒素分泌菌株混合后，发现毒素中和水凝胶极大地抑制由MRSA引起的溶血(图5a和图5b)。还在体内展示了毒素中和水凝胶的应用。皮下注射α-毒素与不同水凝胶制剂的混合物揭示了毒素中和水凝胶的有益作用。正常的PEGDMA水凝胶未能消除α-毒素的坏死性作用，而掺杂有纳米颗粒的水凝胶完全除去了毒素的毒力作用，使得注射部位未受细菌毒素伤害(图6)。

示范性应用

所述毒素中和抗菌水凝胶的示例性应用包括但不限于局部施用以治疗局部感染以及涂覆在可植入装置(例如，导管和假体)上以防止与手术程序相关的感染。

示例性水凝胶组合物

在一些实施方案中，由PEGDMA组成的水凝胶被用于展示毒素中和水凝胶。水凝胶制剂包括但不限于：硅酮、明胶、壳聚糖、藻酸盐、聚酯、聚(乙烯醇)和聚丙烯酰胺、聚环氧乙烷、聚乙烯醇、

聚丙烯酰胺基甲基丙磺酸酯、聚丙烯酸、丙烯酸的盐(包括钠和丙烯酸磺丙酯、甲基丙烯酸2-羟乙酯)及其共聚物。

示例性纳米颗粒组合物

在一些实施方案中，红细胞膜包覆的PLGA纳米颗粒被用来展示在水凝胶制剂中并入毒素中和纳米颗粒。纳米颗粒可以包含任何核心材料或尤其组成，所述核心材料包括但不限于聚合物纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒和金纳米颗粒。用于纳米颗粒涂层的材料包括但不限于生物衍生的或合成制备的脂质膜。

通过以下示例性实施方案进一步说明本发明：

1.一种组合物，其包含浸渍毒素吸收纳米颗粒的聚合物水凝胶。

2.根据实施方案1所述的组合物，其中所述聚合物水凝胶选自由以下所组成的组：聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯(PEGDMA)、硅酮、明胶、壳聚糖、藻酸盐、聚酯、聚(乙烯醇)和聚丙烯酰胺、聚环氧乙烷、聚乙烯醇、

聚丙烯酰胺基甲基丙磺酸酯、聚丙烯酸、丙烯酸的盐(包括钠和丙烯酸磺丙酯、甲基丙烯酸2-羟乙酯)及其共聚物。

3.根据实施方案1所述的组合物，其中所述聚合物水凝胶是聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯(PEGDMA)。

4.根据实施方案1所述的组合物，其中所述纳米颗粒包含被生物衍生的或合成制备的脂质膜包覆的核心材料。

5.根据实施方案4所述的组合物，其中所述核心材料选自由聚合物纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒和金纳米颗粒组成的组。

6.根据实施方案4所述的组合物，其中所述生物衍生的脂质膜源自红细胞膜。

7.根据实施方案1所述的组合物，其中所述组合物进一步包含抗生素。

8.根据实施方案7所述的组合物，其中所述抗生素选自由细胞壁合成抑制剂、蛋白质合成抑制剂、膜功能抑制剂、叶酸途径抑制剂和核酸合成功能抑制剂组成的组。

9.根据实施方案8所述的组合物，其中所述细胞壁合成抑制剂是青霉素、头孢菌素、单胺菌素、青霉烯、糖肽或脂糖肽。

10.根据实施方案1所述的组合物，其中所述组合物是毒素中和抗菌水凝胶。

11.根据实施方案10所述的组合物，其中所述毒素中和抗菌水凝胶被用于在感染部位局部施用。

12.根据实施方案10所述的组合物，其中所述毒素中和抗菌水凝胶被涂覆在用于预防施用的医疗装置上。

13.根据实施方案12所述的组合物，其中所述医疗装置是植入物或导管。

14.一种治疗感染的方法，其包括在感染部位局部施用有效量的浸渍毒素吸收纳米颗粒的毒素中和抗菌水凝胶。

15.根据实施方案14所述的方法，其中所述毒素中和抗菌水凝胶包含聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯(PEGDMA)。

16.根据实施方案14所述的组合物，其中所述纳米颗粒包含被红细胞膜包覆的核心材料。

17.根据实施方案14所述的方法，其中所述毒素中和抗菌水凝胶进一步包含抗生素。

18.一种保留治疗性纳米颗粒功能的方法，其包括配制浸渍毒素吸收纳米颗粒的毒素中和抗菌水凝胶。

19.根据实施方案18所述的方法，其中所述毒素中和抗菌水凝胶包含聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯(PEGDMA)。

20.根据实施方案18所述的方法，其中所述纳米颗粒包含被红细胞膜包覆的核心材料。

参考文献

1a.Siddiqui，A.R.&Bernstein，J.M.Chronic wound infection：Facts andcontroversies.Clin

Dermatol 28，519-526(2010).

2a.Salome Veiga，A.&Schneider，J.P.Antimicrobial hydrogels for thetreatment of infection.Biopolymers 100，637-644(2013).

3a.Woo，G.L.，Mittelman，M.W.&Santerre，J.P.Synthesis andcharacterization of a novel biodegradable antimicrobial polymer.Biomaterials21，1235-1246(2000).

4a.Campbell，A.A.et al.Development，characterization，and anti-microbialefficacy of hydroxyapatite-chlorhexidine coatings produced by surface-inducedmineralization.J Biomed Mater Res53，400-407(2000).

5a.Dinges，M.M.，Orwin，P.M.&Schlievert，P.M.Exotoxins of Staphylococcusaureus.Clinical microbiology reviews 13，16-34，table of contents(2000).

6a.Uhal，N.et al.Panton-Valentine leukocidin and some exotoxins ofStaphylococcus aureus and antimicrobial susceptibility profiles ofstaphylococci isolated from milks of small ruminants.Tropical animal healthand production 44，573-579(2012).

7a.Stassen，M.et al.The streptococcal exotoxin streptolysin Oactivates mast cells to produce tumor necrosis factor alpha by p38 mitogen-activated protein kinase-and protein kinase C-dependent pathways.Infectionand immunity 71，6171-6177(2003).

8a.Hu，C.M.，Fang，R.H.，Copp，J.，Luk，B.T.&Zhang，L.A biomimetic nanospongethat absorbs pore-forming toxins.Nature nanotechnology 8，336-340(2013).

9a.Hu，C.M.，Fang，R.H.，Luk，B.T.&Zhang，L.Nanoparticle-detained to xinsfor safe and effective vaccination.Nature nanotechnology(2013).

F.实施例

用于局部治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的保留毒素吸收纳米海绵的水凝 胶

针对致病因素，如细菌毒素等代表与扩大细菌目标的曲目，可将主机内生微生物，降低选择压力的抗性发展的潜在优势有吸引力的抗菌方法。^[1,2]在各种毒素中，成孔毒素(PFT)是最普通类别的细菌蛋白毒素且构成重要细菌毒力因子。^[3]这些毒素通过在细胞膜上形成孔并且针对生物活性改变细胞膜的渗透性来破坏细胞。^[4]然而，当前毒素靶向策略(如抗血清、^[5]单克隆抗体、^[6,7]小分子抑制剂^[8,9]和分子印迹聚合物)^[10])中的大部分主要依赖于结构特异性表位结合并且需要专门合成以匹配特定毒素。因此，PFT的大量多样性对针对抗细菌感染想出有效解毒平台提出了严苛挑战。为解决此挑战，最近已开发一种独特的涂覆有红细胞(RBC)膜的纳米颗粒系统，方式为将完整的RBC膜包裹到聚合物纳米颗粒上，从而形成用于解毒应用的广泛可适用的毒素吸收“纳米海绵”。^[11,12]与现行解毒策略不同，所述纳米海绵靶向PFT共有的膜破坏机制；从而提供通用毒素诱饵策略以吸收各种类型的PFT，而与其分子结构无关。^[12]

同时，处于纳米科技发展的前沿，治疗性纳米颗粒越来越多地与其它生物材料组合以形成杂化纳米结构以改善治疗指数。特别来说，将纳米颗粒装载至水凝胶中已受到很多关注。^[13]水凝胶是亲水性3D聚合物网络，其在组织工程学和药物递送中具有广泛用途。利用适当的组合物，水凝胶不仅可以保护所含纳米颗粒的结构完整性和功能性，而且还提供额外的工程学灵活性以改善治疗功效。例如，生物聚合物是通过选择性吸附到纳米颗粒而连接在一起，从而形成具有剪切稀化和自愈性质的自组装水凝胶。^[14]改良水凝胶组合物也允许适用于局部应用的可控纳米颗粒释放和可调粘弹性。^[15,16]也已尝试由反应性聚合物基质制得的水凝胶来装载由环境信号(例如pH、离子强度和温度)触发的控制释放的纳米颗粒。^[17,18]最近，也将聚合物纳米颗粒装载到肝小叶模拟水凝胶中以截留毒素。^[19]受到水凝胶在保留纳米颗粒和增强其性质的诸多优势启发，在本文，我们报告一种用于先进杂化纳米制剂，其整合了毒素纳米海绵与水凝胶局部治疗细菌性感染。

在各种细菌病原体中，金黄色葡萄球菌(S.aureus)是一种重要的革兰氏阳性细菌和各种人类皮肤和创伤感染的主要原因。^[20,21]在过去几十年，金黄色葡萄球菌已经历了若干波抗生素耐受性并且现在展现对整个β-内酰胺类抗生素(包括青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类)的广泛耐受性。^[22]为了跟上抗生素耐受性的步伐，近年来已开发并引入新的抗生素，包括万古霉素(vancomycine)、利奈唑胺(linezolid)、tedezolid、达托霉素(daptomycin)、头孢洛林(ceftaroline)和替加环素(tigecycliine)。然而，耐受性金黄色葡萄球菌菌株(尤其针对万古霉素)的出现显著增加。^[23]当前，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的毒力菌株已变得越来越常见，从而造成威胁公众健康的至为重要的临床挑战。^[24-26]总体来说，这些事实强调了对开发用于MRSA治疗的新型且有效的治疗途径的无可争议且迫切的需求。

值得注意的是，MRSA感染通常局限于皮肤和软组织。^[27]在这些感染中，毒力的关键要素源自各种各样的由细菌分泌的PFT，所述PFT攻击宿主细胞。^[28]MRSA感染的这些独特特征使得纳米海绵-水凝胶杂化制剂成为对抗此类感染的有吸引力治疗策略(图7A)。所述水凝胶组合物可以被优化以将纳米海绵有效地保留在其基质内而不损害用于中和的毒素运输。在所述研究中，我们证实了所述纳米海绵-水凝胶制剂的体外和体内毒素中和能力。当原位注射时，所述水凝胶可以将纳米海绵有效地保留在注射部位，一种有利于毒素吸收的性质。在皮下MRSA小鼠模型中，所述杂化制剂展现显著抗毒力治疗功效，这由明显减少的MRSA皮肤病变发展所证实。总之，我们证实所述装载纳米海绵的水凝胶作为用于治疗局部MRSA感染的新型且有效的解毒策略的潜力。

装载纳米海绵的水凝胶(表示为“NS-凝胶”)的制备分成两个步骤。在第一个步骤中，我们通过用100nm聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)聚合物核机械挤出纯化的小鼠RBC膜来制备纳米海绵。用透射电子显微镜(TEM)证实膜涂覆。^[11,29]在第二个步骤中，我们将预形成的纳米海绵与单体丙烯酰胺和交联剂聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯(PEGDMA)混合。通过添加过硫酸铵和四甲基乙二胺(TEMED)启动水凝胶化，并使其在室温下进行12h。^[16]

使所述水凝胶组合物优化以用于有效的纳米海绵滞留且同时保留可用于注射的低粘度。至此，我们首先用1,1′-双十八烷基-3,3,3′,3′-四甲基吲哚二碳菁、4-氯苯磺酸盐(DiD)(激发/发射＝644nm/655nm)(一种来自PLGA聚合物基质的具有可忽略泄露的疏水性萤光团)标记纳米海绵。^[11,30]然后，我们将纳米海绵、丙烯酰胺、过硫酸铵和TEMED的浓度分别固定为2mg/mL(PLGA含量)、40mg/mL、1mg/mL和1μL/mL，但改变PEGDMA浓度并因此检查来自相应水凝胶的纳米海绵释放。如图7B中所示，纳米海绵历时24h的累积释放从在0.5(w/v)％交联剂浓度下的约53％急剧下降至在0.6(w/v)％下的不大于5％，这表明后者PEGDMA浓度在形成用于有效保留纳米海绵的水凝胶中是充分的。使用这个交联剂浓度以制备NS-凝胶以供后续研究。

用作为频率的函数的储存模量(G′)和损耗模量(G″)的动态流变学测量值来进一步表征所述NS-凝胶(图7C)。在所述研究中，G′在整个频率范围内超过G″，这是一种指示水凝胶网络形成的明显粘弹性行为。^[16]另外，从NS-凝胶测得的G′和G″值与从空水凝胶(没有纳米海绵)测得的G′和G″值接近，这表明装载的纳米海绵对凝胶的流变学特征具有可忽略的影响。我们随后冷冻干燥NS-凝胶并在扫描电子显微镜(SEM)下观察其结构。所述样品展现具有一些不规则薄层状特征的特征性多孔海绵样结构(图7D)。在较高放大倍数下，还观察到具有约100nm直径的纳米海绵颗粒被包埋在水凝胶内(图7D，插图)。

我们随后比较了NS-凝胶吸收α-毒素的能力与空凝胶吸收毒素的能力。当将α-毒素溶液添加到等体积的空凝胶时，毒素浓度在孵育的第一个1h内逐渐降低，直到其达到原始浓度的约50％(图7E)。随着孵育时间的延续，未观察到毒素浓度的进一步降低，这表明α-毒素扩散到水凝胶网络中的过程缓慢，直至达到平衡。相比之下，当用NS-凝胶孵育α-毒素溶液时，观察到毒素浓度在孵育的前30min内急剧下降。1h后，溶液中剩下不到初始毒素的5％。NS-凝胶吸收α-毒素的此类能力显著增加表明其用于解毒应用的潜力。

为测试NS-凝胶中和PFT的能力，我们使用溶血测定，在溶血测定中将α-毒素与NS-凝胶混合并且随后添加到纯化的小鼠RBC。^[12]将PBS和空凝胶作为对照进行平行测试。如图8A中所示，NS-凝胶样品展现透明上清液，这表明RBC未被破坏。相比之下，对其它样品观察到明显差异，其它样品展现显著的RBC裂解。通过测量上清液中释放的血红蛋白在540nm下的吸光度来定量溶血程度(图8B)。通过将NS-凝胶与已知含有多种毒力PFT的MRSA培养基混合来进一步检查NS-凝胶吸收由MRSA细菌分泌的毒素的能力。^[31,32]如图8C和D中所示，与对照组相比，观察到NS-凝胶对RBC溶血有相似的减少，这证实NS-凝胶在中和多种类型的由细菌分泌的RBC膜-靶向的PFT的适用性。

接着，我们评估了在体内施用后水凝胶对纳米海绵的滞留。在所述研究中，我们将NS-凝胶与DiD标记的纳米海绵进行配制并且将NS-凝胶皮下注射到小鼠的左侧。作为对照，将相同量的悬浮于PBS中的纳米海绵注射到相同小鼠的右侧。对于两组，全身成像揭示在48h内萤光局限在注射部位(图9A)。然而，在用悬浮于PBS中的纳米海绵注射的部位观察到萤光强度的更快速衰减，这指示纳米颗粒通过扩散到周围组织而快速损耗。萤光强度的定量展现近80％的游离纳米海绵在2h内从注射部位扩散掉。相比之下，NS-凝胶具有在最初2h内可忽略的纳米海绵负荷损耗且在48h测试阶段期间仅损耗总纳米海绵的约20％(图9B)。所述研究与先前体外纳米海绵释放结果(图7B)一起明显证实水凝胶制剂赋予的延长纳米海绵滞留。这些结果进一步指示NS-凝胶可为用于治疗其中病原体定居在组织局部面积上的局部细菌性感染的合格制剂。

通过皮下注射α-毒素(50μL，浓度为40μg/mL，于PBS中)，紧接着立即在小鼠右侧皮肤底下分别注射空凝胶或NS-凝胶(100μL)来进一步体内检查NS-凝胶中和α-毒素的能力。对于用空凝胶处理过的小鼠，在注射后72h，引起明显的皮肤病变伴随显而易见的水肿和炎症(图10A)。皮肤组织的近距离检查展现毒素诱导的损伤的典型适应症，包括坏死、细胞凋亡和嗜中性粒细胞的炎性渗透伴皮肤水肿(图10B)。^[12,33]此外，毒素破坏底层肌肉组织，如原纤维间水肿、肌肉纤维撕裂和从周围血管系统渗出显著量的嗜中性粒细胞所指示(图10C)。^[12]然而，用NS-凝胶处理过的小鼠不展现可见的皮肤损害(图10D)。所述组织样品展现皮肤组织学上正常上皮结构(图10E)和肌肉组织学上不具有可见渗透的完整纤维结构(图10F)。

最后，我们继续检查NS-凝胶的体内抗MRSA功效。为建立皮下MRSA感染模型，我们在各ICR小鼠的侧面皮肤下注射1×10⁹个CFU MRSA细菌。^[33]将感染的小鼠随机分成两组(n＝9)并且随后在感染部位分别注射NS-凝胶和空凝胶。此处，为评估治疗功效，我们选择比较MRSA诱导的皮肤病变尺寸(一种反映感染严重度的常用指数)。^[33-35]24h后，两组中的小鼠均出现可见的皮肤病变但尺寸差异不显著(图11)。在48h，两组中的病变尺寸均增加，然而，当与用空凝胶处理过的小鼠相比时，用NS-凝胶处理过的小鼠展现显著更小的皮肤病变。在72h和96h，两组中的病变尺寸继续增加，因为感染继续发展。NS-凝胶处理组的病变尺寸保持显著小于用空凝胶处理过的组的病变尺寸。针对NS-凝胶观察到的这种优异功效证实其作为有效对抗MRSA感染的局部治疗策略的潜力。

先前，我们报告了涂覆有RBC膜的纳米颗粒(即纳米海绵)可有效中和PFT(包括α-毒素、链球菌溶血素-O和蜂毒素)。^[12]当前研究通过直接证实这个平台在小鼠模型中治疗MRSA感染的有效性而使该平台更前进了重要的一步。这种进步可以通过纳米海绵和水凝胶的组合优势来实现：当纳米海绵从细胞标靶吸收PFT并且转移PFT时，水凝胶将纳米海绵保留在感染部位，从而促进局部毒素中和以获得更佳治疗功效。所述观察到的抗毒力效率反映此类组合的协同作用。随着多样性和功能性的改善，预期此类先进杂化材料提供促进下游临床前和临床测试的实际且可靠的制剂。

纳米技术和生物材料的快速技术发展通过杂化(hybridization)改造先进材料提供前景性潜力。^[36,37]一方面，纳米颗粒平台正在获得越来越多的对于广谱毒素中和的关注。^[38,39]例如，我们近年来已拓展纳米海绵以中和靶向RBC的其它化学和生物分子(例如抗体驱动盛行的自体免疫疾病的病理性抗体)。^[30]同时，已在不断地探索细胞膜涂覆技术以使各种类型的纳米颗粒(包括由金、^[40,41]二氧化硅^[42]和明胶^[43]制得的纳米颗粒)功能化，从而开启前所未有的控制创新治疗剂的天然功能的能力。另一方面，技术进步已促进开发特征为具有高互动性、整合性和生物相容性特性的水凝胶以用于不断进步的药物递送和组织工程学应用。^[44-46]预期一般将水凝胶与纳米海绵或涂覆有细胞膜的纳米颗粒整合会得到利用每种构建材料的优点的先进材料。我们相信这种设计策略将为广泛治疗应用创造独特机遇。

总之，我们开发了一种用于抗毒力治疗局部感染的先进杂化材料，其整合了独特毒素吸收纳米海绵与水凝胶。所述纳米海绵是通过将完整RBC膜包裹到由PLGA制得的聚合物纳米颗粒上，接着装载到水凝胶中来制得。使水凝胶组合物优化以将纳米海绵有效地保留在其基质内而不损害用于中和的毒素运输。在对小鼠皮下注射后，纳米海绵被有效地保留在了注射部位。在MRSA皮下小鼠模型中，用所述纳米海绵-水凝胶杂化物治疗过的小鼠显示显著降低的MRSA皮肤病变发展。这些结果统一指示所述纳米海绵-水凝胶杂化制剂代表用于治疗局部细菌性感染的新型且有效的解毒策略。

实验部分

纳米海绵的制备。纳米海绵是根据先前描述的方法来制备的。^[11,12]简而言之，用0.67dL/g的羧基封端的50:50PLGA聚合物(LACTEL Absorbable Polymers)通过纳米沉淀法来制备具有约100nm直径的聚(_DL-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)聚合物纳米颗粒。具体来说，将所述PLGA聚合物首先以10mg/mL的浓度溶解于丙酮中。然后将1mL溶液添加到3mL去离子水中。随后将混合物于开放空气中搅拌1h并且再放置于真空中3h。使用具有10kDa截留分子量(Millipore)的Amicon Ultra-4离心过滤器过滤所得纳米颗粒溶液。为制备萤光标记的纳米海绵，将0.1wt％1,1′-双十八烷基-3,3,3′,3′-四甲基吲哚二碳菁高氯酸盐(DiD；激光/发射＝644/665nm；Life Technologies)在PLGA纳米颗粒合成之前添加到所述聚合物中。随后通过使用FS30D浴超声波振荡仪在42kHz的频率和100W的功率下超声波振荡2min，使RBC膜衍生的泡囊与PLGA纳米颗粒融合来完成RBC膜涂覆。所得纳米海绵的动态光散射(DLS)测量值(Malvern ZEN 3600Zetasizer)展现在膜涂覆过程之前和之后分别约100nm和115nm的平均流体动力学直径。通过使用透射电子显微镜(TEM,FEI 200kV Sphera显微镜)证实纳米海绵的核壳结构。

载有纳米海绵的水凝胶(NS-凝胶)的制备。为制备水凝胶，从Sigma-Aldrich购买丙烯酰胺(用作单体)、聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯(PEGDMA，用作交联剂)、四甲基乙二胺(TEMED)和过硫酸铵(均用作引发剂)。对于空水凝胶，丙烯酰胺、过硫酸铵和TEMED的最终浓度分别恒定保持在40mg/mL、1mg/mL和1μL/mL，而PEGDMA浓度经检测在0–1％w/w的范围内。将液体混合物涡旋1min并且随后放置于室温下的真空室中2h以使完全凝胶化发生。对于NS-凝胶，将具有2mg/mL最终浓度的纳米海绵与前述化学品混合，接着凝胶化。

为测量从水凝胶的纳米海绵释放速率，使用DiD染料-标记的纳米海绵以制备不同PEGDMA浓度的NS-凝胶。随后将0.5mL NS-凝胶浸没到50mL PBS中。将混合物在37℃下孵育24h并且测量上清液中的DiD信号。在具有22mm直径平行板几何的应变控制式AR-G2流变仪(TA Instruments Inc.,New Castle,DE)上在37±0.1℃下进行流变学分析。在线性粘弹性方案中进行振荡流变学测量。将应变保持在0.1％并且进行0.1到10rad/s的动态频率扫描以测量储存模量G′和损耗模量G″。为研究水凝胶形态，冻干NS-凝胶并且将凝胶薄片放置于硅晶片上。样品用铱涂覆并且随后用扫描电子显微镜(SEM)检查。通过在37℃下用0.5mLNS-凝胶孵育2mLα-毒素(2μg/mL)24h来检查NS-凝胶对α-毒素的吸收。使用空水凝胶作为对照组。在4、8和24h时间点，用ELISA(R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN)定量上清液中的α-毒素浓度。

体外α-毒素中和研究。为体外评估NS-凝胶中和的α-毒素，进行溶血测定。简而言之，将3μLα-毒素(1mg/mL)分别与0.5mL NS-凝胶、空水凝胶和PBS混合。随后，将1mL 5％纯化的小鼠RBC添加到各样品的顶部，接着在37℃下孵育1h。随后小心离心所述样品。通过测量上清液在540nm下的吸收来定量RBC裂解程度。为中和细菌性上清液中的毒素，使用MRSA培养物(来自1×10⁹CFU/mL MRSA 252的过夜培养物)以溶解用于水凝胶制备的化学品。所有实验均以一式三份进行。

小鼠的活全身成像以研究纳米海绵滞留。在研究之前，对小鼠(来自CharlesRiver Laboratories的6周龄雄性ICR小鼠，n＝3)的背部小心地刮毛。随后将50μL DiD标记的NS-凝胶皮下注射到小鼠左侧。作为对照，将悬浮于PBS中的纳米海绵(2mg/mL，50μL)皮下注射到相同小鼠的右侧。在指定时间点(0、6、24和48h)，用异氟烷麻醉小鼠并且用XenogenIVIS 200系统成像。定量萤光强度并跨时间点标准化。热图在明视场影像上叠加。

体内α-毒素中和研究。通过将50μL 40μg/mLα-毒素溶液皮下注射到6周龄雄性ICR小鼠的侧面区域中(Charles River Laboratories，n＝3)，接着将100μL空凝胶或NS-凝胶立即注射到相同区域中来进行NS-凝胶对α-毒素的中和。72h后，使小鼠成像。随后牺牲小鼠并移除皮肤和肌肉样品。将所述组织冷冻，切片并随后用苏木精和伊红(H&E)染色以进行组织学分析。

对抗局部MRSA感染的体内解毒功效。为评估NS-凝胶对MRSA感染的体内解毒功效，使用MRSA皮下感染小鼠模型。简而言之，在研究之前，对18只ICR小鼠(6周龄雄性，CharlesRiver Laboratories)的背部小心地刮毛。随后将悬浮于50μL PBS中的1×10⁹CFU的MRSA252皮下注射到侧面区域内。随后将小鼠随机分成两组(n＝9)。对于治疗组，将0.2mL NS-凝胶注射到感染区域中。对于对照组，注射空凝胶代替NS-凝胶。小心地监测每个小鼠的病变。对病变照相并通过使用Image J从相片测量病变尺寸。

参考文献

[1]A.E.Clatworthy，E.Pierson，D.T.Hung，Nat.Chem.Biol.2007，3，541.

[2]D.A.Rasko，V.Sperandio，Nat.Rev.Drug Discov.2010，9，117.

[3]F.C.O.Los，T.M.Randis，R.V.Aroian，A.J.Ratner，Microbiol.Mol.Biol.Rev.2013，77，173.

[4]R.J.C.Gilbert，Cell.Mol.Life Sci.2002，59，832.

[5]D.G.Beghini，S.Hernandez-Oliveira，L.Rodrigues-Simioni，J.C.Novello，S.Hyslop，S.Marangoni，Toxicon 2004，44，141.

[6]L.W.Cheng，T.D.Henderson，II，S.Patfield，L.H.Stanker，X.He，Toxins2013，5，1845.

[7]V.Oganesyan，L.Peng，M.M.Damschroder，L.Cheng，A.Sadowska，C.Tkaczyk，B.R.Sellman，H.Wu，W.F.Dall′Acqua，J.Biol.Chem.2014，289，29874.

[8]D.T.Hung，E.A.Shakhnovich，E.Pierson，J.J.Mekalanos，Science 2005，310，670.

[9]C.C.McCormick，A.R.Caballero，C.L.Balzli，A.Tang，R.J.O′Callaghan，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.2009，50，2848.

[10]Y.Hoshino，H.Koide，K.kuruya，W.W.Haberaecker，III，S.-H.Lee，T.Kodama，H.Kanazawa，N.Oku，K.J.Shea，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2012，109，33.

[11]C.-M.J.Hu，L.Zhahg，S.Aryal，C.Cheung，R.H.Fang，L.Zhang，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2011，108，10980.

[12]C.-M.J.Hu，R.H.Fang，J.Copp，B.T.Luk，L.Zhang，Nat.Nanotechnol.2013，8，336.

[13]P.Schexnailder，G.Schmidt，Colloid.Polym.Sci.2009，287，1.

[14]E.A.Appel.M.W.Tibbitt，M.J.Webber，B.A.Mattix，O.Veiseh，R.Langer，Nat.Commun.2015，6，article number 6295.

[15]Y.Sekine，Y.Moritani，T.Ikeda-Fukazawa，Y.Sasaki，K.Akiyoshi，Adv.Healthc.Mater.2012，1，722.

[16]W.Gao，D.Vecchio，J.Li，J.Zhu，Q.Zhang，V.Fu，J.Li，S.Thamphiwatana，D.Lu，L.Zhang，ACS Nano 2014，8，2900.

[17]R.M.K.Ramanan，P.Chellamuthu，L.P.Tang，K.T.Nguyen，Biotechnol.Prog.2006，22，118.

[18]Y.Xiang，D.Chen，Eur.Polym.J.2007，43，4178.

[19]M.Gou，X.Qu，W.Zhu，M.Xiang，J.Yang，K.Zhang，Y.Wei，S.Cben，Nat.Commun.2014，5，article number 3774.

[20]M.J.Kuehnert，D.Kruszon-Moran，H.A.Hill，G.McQuillan，S.K.McAllister，G.Fosheim，L.K.McDougal，J.Chaitram，B.Jensen，S.K.Fridkin，G.Killgore，F.C.Tenover，J.Infect.Dis.2006，193，172.

[21]A.J.Singer，D.A.Talan，New Engl.J.Med.2014，370，1039.

[22]H.F.Chambers，F.R.DeLeo，Nat.Rev.Microbiol.2009，7，629.

[23]L.M.Weigel，D.B.Clewell，S.R.Gill，N.C.Clark，L.K.McDougal，S.E.Flannagan，J.F.Kolonay，J.Shetty，G.E.Killgore，F.C.Tenover，Science 2003，302，1569.

[24]K.Hiramatsu，N.Aritaka，H.Hanaki，S.Kawasaki，Y.Hosoda，S.Hori，Y.Fukuchi，I.Kobayashi，Lancet 1997，350，1670.

[25]R.M.Klevens，J.R.Edwards，F.C.Tenover.L.C.McDonald，T.Horan，R.Gaynes，S.Natl Nosocomial Infections，Clin.Infect.Dis.2006，42，389.

[26]M.McKenna，Nature 2012，482，23.

[27]R.J.Gordon，F.D.Lowy，Clin.Infect.Dis.2008，46，S350.

[28]R.J.Gorwitz，J.Infect.Dis.2008，197，179.

[29]C.-M.J.Hu，L.Zhang，Nano Today 2014，9，401.

[30]J.A.Copp，R.H.Fang.B.T.Luk，C.-M.J.Hu，W.Gao，K.Zhang，L.Zhang，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2014，111，13481.

[31]R.Wang，K.R.Braughton，D.Kretschmer，T.-H.L.Bach，S.Y.Queck，M.Li，A.D.Kennedy，D.W.Dorward，S.J.Klebanoff，A.Peschel，F.R.DeLeo，M.Otto，Nat.Med.2007，13，1510.

[32]M.Li，G.Y.C.Cheung，J.Hu，D.Wang，H.-S.Joo，F.R.DeLeo，M.Otto，J.Infect.Dis.2010，202，1866.

[33]M.R.Yeaman，S.G.Filler，S.Chaili，K.Barr，H.Wang，D.Kupferwasser，J.P.Hennessey，Y.Fu，C.S.Schmidt，J.E.Edwards，Jr.，Y.Q.Xiong，A.S.Ibrahim，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2014，111，E5555.

[34]Y.Guo，R.I.Ramos，J.S.Cho，N.P.Donegan，A.L.Cheung，L.S.Miller，Antimicrob.Agents Chemother.2013，57，855.

[35]D.Das，P.M.Tulkens，P.Mehra，E.Fang，P.Prokocimer，Clin.Infect.Dis.2014，58，S51.

[36]J.Kopecek，J.Yang，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2012，51，7396.

[37]K.Kanie，R.Kurimoto，M.Ebara，N.Idota，Y.Narita，H.Honda，R.Kato，J.Tissue Eng.Regen.Med.2014，8，220.

[38]V.Forster，R.D.Signorell，M.Roveri，J.-C.Leroux，Sci.Transl.Med.2014，6，article number 258ra141.

[39]A.Weisman，Y.A.Chen，Y.Hoshino，H.Zhang，K.Shea，Biomacromolecules2014，15，3290.

[40]W.Gao，C.-M.J.Hu，R.H.Fang，B.T.Luk，J.Su，L.Zhang，Adv.Mater.2013，25，3549.

[41]J.-G.Piao，L.Wang，F.Gao，Y.-Z.You，Y.Xiong，L.Yang，ACS Nano 2014，8，10414.

[42]A.Parodi，N.Quattrocchi，A.L.van de Ven，C.Chiappini，M.Evangelopoulos，J.O.Martinez，B.S.Brown，S.Z.Khaled，I.K.Yazdi，M.Vittoria Enzo．L.Isenhart，M.Ferrari，E.Tasciotti，Nat.Nanotechnol.2013，8，61.

[43]L.-L.Li，J.-H.Xu，G.-B.Qi，X.Zhao，F.Yu，H.Wang，ACS Nano 2014，8，4975.

[44]J.A.Burdick，W.L.Murphy，Nat.Commun.2012，3，article number 1269.

[45]Y.Li，J.Rodrigues，H.Tomas，Chem.Soc.Rev.2012，41，2193.

[46]A.S.Hoffman，Adv.Drug Del.Rev.2012，64，18.

Claims (89)

1.一种组合物，所述组合物包含浸渍了毒素吸收或结合纳米颗粒的聚合物水凝胶，其中所述纳米颗粒包含：a)内核，其包含非细胞材料；和b)外表面，其包含被配置来用于吸收或结合所述毒素的细胞膜，其中所述纳米颗粒的细胞膜包括质膜或细胞内膜，并且所述组合物在水性液体中孵育24小时之后保留至少95％的所述毒素吸收或结合纳米颗粒。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述聚合物水凝胶包含选自由以下所组成的组的材料：聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯、硅酮、明胶、壳聚糖、藻酸盐、聚酯、由聚(乙烯醇)和聚丙烯酰胺组成的混合物、聚环氧乙烷、聚乙烯醇、

聚丙烯酰胺基甲基丙磺酸酯、聚丙烯酸、丙烯酸的盐、丙烯酸磺丙酯、甲基丙烯酸2-羟乙酯、琼脂糖、甲基纤维素、透明质酸及由聚环氧乙烷、聚乙烯醇、

聚丙烯酰胺基甲基丙磺酸酯和聚丙烯酸中的两种或多种组成的共聚物。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述丙烯酸的盐包括丙烯酸的钠盐。

4.根据权利要求2所述的组合物，其中所述聚合物水凝胶包含聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯。

5.根据权利要求3所述的组合物，其中所述聚合物水凝胶包含聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中在使用期间所述聚合物水凝胶包含至少1％的水(w/w)。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述聚合物水凝胶具有适于施加至组织或器官的柔性度。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述聚合物水凝胶具有适于施加至天然组织或天然器官的柔性度。

9.根据权利要求6所述的组合物，其中所述纳米颗粒的内核包括聚合物颗粒核心、二氧化硅颗粒核心或金属颗粒核心。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述纳米颗粒的内核包括金颗粒核心。

11.根据权利要求9所述的组合物，其中所述聚合物颗粒核心包含光学移动性质。

12.根据权利要求9所述的组合物，其中所述聚合物颗粒核心包含金属。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述金属是金、铁氧化物或量子点。

14.根据权利要求6所述的组合物，其中所述纳米颗粒的内核包含选自由聚(乳酸-c-乙醇酸)、聚乳酸、聚乙醇酸、聚己内酯、聚赖氨酸和聚谷氨酸所组成的组的生物相容性材料或合成材料。

15.根据权利要求6所述的组合物，其中所述纳米颗粒的内核支持所述纳米颗粒的外表面。

16.根据权利要求6所述的组合物，其中所述纳米颗粒的细胞膜包含膜结合蛋白或聚糖。

17.根据权利要求6所述的组合物，其中所述纳米颗粒的细胞膜包括源自红细胞、淋巴细胞或血小板的质膜。

18.根据权利要求6所述的组合物，其中所述纳米颗粒具有10nm至10μm的直径。

19.根据权利要求6所述的组合物，其中所述纳米颗粒缺少衍生出所述细胞膜的细胞的10％-100％的成分。

20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述纳米颗粒的细胞膜包括源自红细胞的质膜且所述纳米颗粒缺少所述红细胞的10％-100％的血红蛋白。

21.根据权利要求6所述的组合物，其中所述纳米颗粒保持所述细胞膜的10％-100％的天然结构完整性或活性或者所述细胞膜的成分。

22.根据权利要求6所述的组合物，其中所述纳米颗粒是生物相容的或生物可降解的。

23.根据权利要求1所述的组合物，其中所述纳米颗粒的内核包含聚(乳酸-c-乙醇酸)且所述纳米颗粒的外表面包含源自红细胞的质膜。

24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述纳米颗粒具有为PEG涂覆的相当纳米颗粒的半衰期的至少2-5倍的体内血液循环半衰期，或具有至少1小时至40小时的体内血液循环半衰期。

25.根据权利要求6所述的组合物，其中所述纳米颗粒的外表面进一步包含合成膜。

26.根据权利要求6所述的组合物，其中所述纳米颗粒的外表面的细胞膜被构造来吸收生物毒素或结合至生物毒素。

27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述生物毒素是病毒毒素、细菌毒素、真菌毒素、植物毒素或动物毒素。

28.根据权利要求27所述的组合物，其中所述细菌毒素是来自革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌的毒素。

29.根据权利要求27所述的组合物，其中所述细菌毒素是来自大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的毒素。

30.根据权利要求27所述的组合物，其中所述真菌毒素是来自白色念珠菌或烟曲霉的毒素。

31.根据权利要求27所述的组合物，其中所述动物毒素是来自爬行动物或者节肢动物的毒素。

32.根据权利要求27所述的组合物，其中所述动物毒素是来自乌龟、鳄鱼、蛇或蜥蜴的毒素。

33.根据权利要求27所述的组合物，其中所述动物毒素是来自昆虫、蜘蛛、蝎子或大蜥蜴的毒素。

34.根据权利要求31-33中任一项所述的组合物，其中所述动物毒素包含在动物毒液中。

35.根据权利要求26-33中任一项所述的组合物，其中所述生物毒素是成孔毒素。

36.根据权利要求35所述的组合物，其中所述成孔毒素的天然标靶是哺乳动物红细胞。

37.根据权利要求36所述的组合物，其中所述哺乳动物红细胞是人红细胞。

38.根据权利要求6所述的组合物，其中所述聚合物水凝胶包括彼此物理或共价交联和/或与所述纳米颗粒物理或共价交联的水合聚合物网络。

39.根据权利要求6所述的组合物，其进一步包含治疗剂、预防剂、诊断剂或标记剂、预后剂、分离剂、监测剂或其组合。

40.根据权利要求39所述的组合物，其中所述治疗剂或预防剂是抗病毒剂、抗生素、抗真菌剂或抗原生动物剂。

41.根据权利要求39所述的组合物，其中所述治疗剂或预防剂是奎宁。

42.根据权利要求40所述的组合物，其中所述治疗剂或预防剂是抗生素。

43.根据权利要求42所述的组合物，其中所述抗生素选自由细胞壁合成抑制剂、蛋白质合成抑制剂、膜功能抑制剂、叶酸途径抑制剂和核酸合成功能抑制剂组成的组。

44.根据权利要求43所述的组合物，其中所述细胞壁合成抑制剂是青霉素、头孢菌素、单胺菌素、青霉烯、糖肽或脂糖肽。

45.根据权利要求39-44中任一项所述的组合物，其中所述治疗剂、预防剂、诊断剂或标记剂、预后剂、分离剂、监测剂或其组合包含在所述纳米颗粒中。

46.根据权利要求45所述的组合物，其中所述治疗剂、预防剂、诊断剂或标记剂、预后剂、分离剂、监测剂或其组合包含在所述纳米颗粒的可释放货物中。

47.根据权利要求46所述的组合物，其中所述可释放货物位于所述纳米颗粒的内核中或内核上、内核与外表面之间、或者外表面中或外表面上。

48.根据权利要求47所述的组合物，其中所述可释放货物的释放是由所述纳米颗粒与受试者或所述受试者的细胞之间的接触，或者由所述纳米颗粒周围的物理参数的变化触发。

49.根据权利要求46-48中任一项所述的组合物，其中所述可释放货物是聚合物颗粒、树状物颗粒或无机颗粒。

50.根据权利要求46-48中任一项所述的组合物，其中所述可释放货物是金属颗粒。

51.根据权利要求6所述的组合物，其进一步包含针对所述受试者的药学上可接受的载体或赋形剂。

52.根据权利要求6所述的组合物，其包含在药物递送系统、医疗装置或消费品中。

53.根据权利要求52所述的组合物，其中所述药物递送系统或所述医疗装置是植入物、导管、缓释型药物递送系统或用于烧伤或其它难愈合创伤的愈合的敷料。

54.根据权利要求53所述的组合物，其中所述植入物是乳房植入物或在骨科手术期间或之后放置的植入物。

55.根据权利要求52所述的组合物，其中所述消费品是卫生产品。

56.根据权利要求55所述的组合物，其中所述卫生产品是一次性尿布。

57.根据权利要求6所述的组合物，其被构造为组织工程学中的支架的一部分。

58.根据权利要求6所述的组合物，其被配置来用于经直肠、经鼻腔、经眼、肌内、腹膜内或皮下施用途径。

59.根据权利要求6所述的组合物，其被配置来用于局部施用途径。

60.根据权利要求6所述的组合物，其为毒素中和抗微生物水凝胶。

61.根据权利要求60所述的组合物，其中所述毒素中和抗微生物水凝胶被配置为用于在感染部位局部施加。

62.根据权利要求60所述的组合物，其中所述毒素中和抗微生物水凝胶被涂覆在医疗装置上。

63.根据权利要求62所述的组合物，其中所述医疗装置被配置为用于治疗性或预防性施用。

64.根据权利要求1-63中任一项所述的组合物在制备用于在受试者中减少或中和毒素的作用或者治疗或预防被产生毒素的微生物感染的药物中的用途，其中，当所述药物被施用时，以下被包括：向有需要的受试者或所述受试者的细胞施用有效量的根据权利要求1-63中任一项所述的组合物。

65.根据权利要求64所述的用途，其中所述受试者是哺乳动物。

66.根据权利要求65所述的用途，其中所述哺乳动物是人类。

67.根据权利要求65所述的用途，其中所述哺乳动物是非人类哺乳动物。

68.根据权利要求64-67中任一项所述的用途，其用于在所述受试者中减少毒素的作用。

69.根据权利要求64-67中任一项所述的用途，其用于在所述受试者中中和毒素的作用。

70.根据权利要求64-67中任一项所述的用途，其用于在所述受试者中治疗产生毒素的微生物的感染。

71.根据权利要求64-67中任一项所述的用途，其用于在所述受试者中预防产生毒素的微生物的感染。

72.根据权利要求64-67中任一项所述的用途，其中所述组合物中的纳米颗粒缺少对所述受试者的免疫原性。

73.根据权利要求72所述的用途，其中所述细胞膜源自与所述受试者相同的物种的红细胞。

74.根据权利要求73所述的用途，其中所述受试者是人类且所述细胞膜源自人红细胞。

75.根据权利要求74所述的用途，其中所述细胞膜源自待治疗的人的红细胞。

76.根据权利要求64-67中任一项所述的用途，其中使用药物递送系统或医疗装置将所述组合物施用给所述受试者。

77.根据权利要求64-67中任一项所述的用途，其中经由直肠、鼻腔、眼、肌内、腹膜内或皮下施用途径将所述组合物施用给所述受试者。

78.根据权利要求64-67中任一项所述的用途，其中经由局部施用途径将所述组合物施用给所述受试者。

79.根据权利要求78所述的用途，其中所述组合物中的水凝胶包含聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯。

80.根据权利要求79所述的用途，其中所述组合物中的纳米颗粒的细胞膜包括源自红细胞的质膜。

81.根据权利要求80所述的用途，其中，当所述药物被施用时，以下被进一步包括：向所述受试者施用抗生素。

82.根据权利要求81所述的用途，其中所述抗生素包含在所述组合物中。

83.根据权利要求82所述的用途，其中所述抗生素包含在所述组合物中的纳米颗粒的可释放货物中。

84.一种保留毒素吸收或结合纳米颗粒的治疗功能的方法，所述方法包括将毒素吸收或结合纳米颗粒浸渍在聚合物水凝胶中以形成包含浸渍了所述毒素吸收或结合纳米颗粒的所述聚合物水凝胶的组合物，其中所述纳米颗粒包含：a)内核，其包含非细胞材料，和b)外表面，其包含被配置来用于吸收或结合所述毒素的细胞膜，其中所述纳米颗粒的细胞膜包括质膜或细胞内膜，并且所述组合物在水性液体中孵育24小时之后保留至少95％的所述毒素吸收或结合纳米颗粒。

85.根据权利要求84所述的方法，其中所述组合物中的水凝胶包含聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯。

86.根据权利要求84所述的方法，其中所述组合物中的纳米颗粒的细胞膜包括源自红细胞的质膜。

87.根据权利要求84-86中任一项所述的方法，其进一步包括向所述组合物中添加抗生素。

88.根据权利要求87所述的方法，其中所述抗生素包含在所述组合物中的纳米颗粒的可释放货物中。

89.有效量的包含浸渍了毒素吸收或结合纳米颗粒的聚合物水凝胶的组合物用于制造用来在受试者中减少或中和毒素的作用或者治疗或预防被产生毒素的微生物感染的药物的用途，其中所述纳米颗粒包含：a)内核，其包含非细胞材料；和b)外表面，其包含被配置来用于吸收或结合所述毒素的细胞膜，其中所述纳米颗粒的细胞膜包括质膜或细胞内膜，并且所述组合物在水性液体中孵育24小时之后保留至少95％的所述毒素吸收或结合纳米颗粒。

Images