CN112739332A - 生物体颗粒、氧化还原体、方法和组合物 - Google Patents

生物体颗粒、氧化还原体、方法和组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN112739332A
CN112739332A CN201980035986.7A CN201980035986A CN112739332A CN 112739332 A CN112739332 A CN 112739332A CN 201980035986 A CN201980035986 A CN 201980035986A CN 112739332 A CN112739332 A CN 112739332A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
acid
cell
organism
tissue
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980035986.7A
Other languages
English (en)
Inventor
S·格洛兹曼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Olguinness Inc
Orgenesis Inc
Original Assignee
Olguinness Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Olguinness Inc filed Critical Olguinness Inc
Publication of CN112739332A publication Critical patent/CN112739332A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5005—Wall or coating material
    • A61K9/5063—Compounds of unknown constitution, e.g. material from plants or animals
    • A61K9/5068—Cell membranes or bacterial membranes enclosing drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/98—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D11/00—Solvent extraction
    • B01D11/02—Solvent extraction of solids
    • B01D11/0203—Solvent extraction of solids with a supercritical fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/40—Chemical, physico-chemical or functional or structural properties of particular ingredients
    • A61K2800/41—Particular ingredients further characterized by their size
    • A61K2800/412—Microsized, i.e. having sizes between 0.1 and 100 microns
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/40—Chemical, physico-chemical or functional or structural properties of particular ingredients
    • A61K2800/56—Compounds, absorbed onto or entrapped into a solid carrier, e.g. encapsulated perfumes, inclusion compounds, sustained release forms

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)

Abstract

提供一种包含细胞膜组分并被设计以与靶细胞进行融合的人造生物体颗粒、颗粒的用途方法以及其制造方法，其中所述生物体颗粒被工程化以携带包含至少一个预定活性分子的货物；并且在该生物体颗粒与该靶细胞融合后所述货物能够释放到该靶细胞中；并且其中细胞膜组分源自所选的细胞或细胞外来源。

Description

生物体颗粒、氧化还原体、方法和组合物
技术领域
本发明涉及被工程化以递送活性生物材料的新型生物体(bioxomes)颗粒、他们的制备方法及其用途。
发明背景
外泌体是一类天然存在的分泌型脂膜微囊泡，他们携带核酸和蛋白质，通过在细胞器之间和细胞之间转移这些物质来实现细胞间通讯。外泌体是通过内吞溶酶体(endolysosomal)囊泡的内陷而形成的，这些囊泡与质膜融合后在细胞外释放。
外泌体在稳态条件下或在疾病状态的病理期间具有多种生理功能。细胞向细胞外环境释放不同类型的、来源于内体(endosomal)膜和质膜的膜囊泡，其分别称为外泌体和微囊泡(MV)。通过作为细胞之间转移膜蛋白和胞浆蛋白、脂质以及RNA的运载体，总体上这些细胞外囊泡(EV)表示了细胞间通讯的一种重要模式。
由于脂肪酸，特别是多不饱和脂肪酸(PUFA)中存在多个双键，脂质对于FR而言是一种特别有价值的底物。脂质过氧化(LPO)是一种链式过程，由三个主要步骤组成：引发、增长和终止。天然质膜的主要组分是极性磷脂(PL)，其由PUFA组成，并且因此易受氧化应激的影响。传统上，LPO被认为是氧自由基引起损伤从而导致膜破坏、退化和细胞死亡的主要过程。
天然外泌体中存在遗传物质和蛋白质意味着外泌体可能作为此类生物物质的运载体。类似于脂质体的结构，膜双层和水性核的结构使得他们的内容物能够穿过细胞膜递送。因此，外泌体具有作为各种生物材料的递送系统的巨大潜力。外泌体以及用于外泌体制备的方法的大量应用描述于US2004/0082511；US5,428,008、US5,165,938；US2004/0082511；US9/119,974；US2013/0143314；US2011/0014251；US2013/0052647；WO2015110957；WO/2015/138878；US20130209528；WO2009105044；US8,138,147；US8,518,879；US8,138,147；US2011/0003008；US2013/0209528；US2011/0003008；US2013/0209528中。
基于其膜融合和细胞内靶向特性，外泌体有望用作药物递送系统(Drug DeliverySystem)，以克服现有技术中目前使用的DDS的尚未解决的需求：(i)由于细胞外酶，裸基因和核酸的递送不稳定；(ii)病毒和脂质体DDS被宿主免疫系统识别为外来颗粒，导致产生针对他们的抗体，并且因而降低递送和安全性；(iii)大多数活性天然药物和治疗药物本质上都是疏水性的，因此易于LPO，并且具有较差的生物利用性。上述所有是为了实现外泌体DDS(药物递送系统)目标而有待克服的主要挑战，该目标为：提高生产产量，控制加载、稳定性和组合物(包括蛋白质和DNA)。此外，目前用于外泌体生产的已知方法复杂且多步骤，其限制了其作为治疗货物的递送运载体的临床适用性。因此，仍然需要一种简单、稳健、有成本效益、工业化方法用于大规模生产外泌体激发的人造膜囊泡，该人造膜囊泡将保持最大的膜完整性、对LPO链反应的稳定性以及他们作为治疗剂、递送运载体和研究工具用途所需的天然特征。
发明内容
因此，本发明的主要目的是克服现有技术方法和系统的缺点，以便工业化规模生产外泌体样人造颗粒，该人造颗粒保持最大的膜完整性并且工程化用于作为递送活性生物分子的运载体或为具有多种工业应用的独立制剂。
本发明提供一种包含细胞膜组分并被设计以与靶细胞进行融合的人造生物体颗粒，其中所述生物体颗粒被工程化以携带包含至少一个预定活性分子的货物；并且其中在该生物体颗粒与该靶细胞融合后，所述货物可释放进该靶细胞中；并且其中该细胞膜组分源自所选的细胞或细胞外来源。
本发明进一步提供一种包含人造生物体颗粒和至少一种载体的组合物，该人造生物体颗粒包含细胞膜组分并被设计以与靶细胞进行融合，其中所述生物体颗粒被工程化以携带包含至少一个预定活性分子的货物；并且其中在该生物体颗粒与该靶细胞融合后，所述货物可释放进该靶细胞中；并且其中，该细胞膜组分源自所选的细胞或细胞外来源。
本发明进一步提供一种用于制造包含多个生物体颗粒的样品的方法，其中，生物体颗粒被工程化以携带包含至少一个活性分子的货物并且被设计以与靶细胞进行融合以释放该货物；并且其中，所述生物体颗粒包含源自所选细胞或细胞外来源的细胞膜组分；该方法包含：
a.在温和溶剂系统中从所选细胞或细胞外来源进行总细胞脂质提取，以获得脂质提取物；
b.干燥该脂质提取物；以及
c.通过进行至少一步的超声处理来诱导生物体颗粒的自组装；
其中，样品中所得的生物体颗粒的特征在于平均颗粒大小为约0.03μm至5μm。
本发明进一步提供一种治疗或预防需要此种治疗的对象的病理的方法，包含向该对象施用包含人造生物体颗粒和至少一种载体的药物组合物，该人造生物体颗粒包含细胞膜组分并被设计以与靶细胞进行融合，其中，所述生物体颗粒被工程化以携带包含至少一个预定活性分子的货物；并且其中，在该生物体颗粒与该靶细胞融合后，所述货物可释放进该靶细胞中；并且其中，该细胞膜组分源自所选的细胞或细胞外来源。
本发明进一步提供一种改善有需要的对象的皮肤症状的方法，包含向该对象施用包含人造生物体颗粒和至少一种载体的组合物，该人造生物体颗粒包含细胞膜组分并被设计以与靶细胞进行融合，其中，所述生物体颗粒被工程化以携带包含至少一个预定活性分子的货物；并且其中，在该生物体颗粒与该靶细胞融合后，所述货物可释放进该靶细胞中；并且其中，该细胞膜组分源自所选的细胞或细胞外来源。
附图说明
图1.由Malvern仪器测量的生物体颗粒的颗粒大小分布：A.分离后立即；B.分离后一个月；
图2.生物体颗粒大小分布。A.由ZetaSizer纳米分析仪测量的生物体的颗粒大小分布。该分析仪的测量值以直方图上的两个峰来表示(x轴表示颗粒大小)。B.由NanoSight颗粒大小分析仪检测到的生物体的颗粒大小分布。X轴以nm表示颗粒大小，y轴表示每ml颗粒的数目。左侧表示相同样品的3个测量值。右侧表示左边进行的3个测量值的平均值；
图3.生物体稳定性和颗粒大小分布。展现的是由3种不同样品产生的生物体的大小分布图。A.没有再次超声处理的样品。B.再次超声处理的样品。C.冷冻干燥和超声处理后的样品；
图4.BioDipy标记的生物体融合进人包皮成纤维(HFF)原代培养中的共聚焦显微镜图像。由三种不同细胞来源产生的生物体以及实验前24小时测量的颗粒大小平均直径。A.原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)-
Figure BDA0002802844900000031
PCS-100-010TM颗粒大小：>90％～1,4mcn；B.原代人乳腺上皮细胞；
Figure BDA0002802844900000032
PCS-600-010TM。实验前24小时测量的颗粒大小：40％-～300nm；60％：600颗粒大小；实验前24小时测量-1mcn nm。C.NIH3T3成纤维细胞；
Figure BDA0002802844900000033
CRL-1658；颗粒大小：>90％～750nm；
图5.从粘附细胞分离生物体颗粒的总体方案；
图6.生物体颗粒对其来源靶组织的特异性。A.该过程的示意图。B.实验数据；
图7.氧化还原体(Redoxome)颗粒的示意图；
图8.通过在两种不同浓度的DHA中以及在α-生育酚存在下，通过测量POBN加合物形成(EPR光谱)的氧化还原体颗粒的氧化还原敏感性；
图9.A.羟基自由基诱导的氧化还原体颗粒的泄漏的动力学。B.Triton诱导的氧化还原体颗粒的钙黄绿素渗漏；以及
图10.RNA封装能力。用由源自骨髓(PromoCell，C-12974)的人间充质干细胞(MSC)产生的共提取RNA所封装的生物体，其大小测量值由NanoSight分析仪进行。A.重复(三次)冻融稳定性作为一种加载增强途径，失去均匀性，但保持spec<1，5mcn。B.单次冻融循环后的RNA均匀封装以及C-无冻融循环-超声处理/RNA封装后马上测量。
具体实施方式
下面将参照附图更加全面地描述本发明，附图中示出了本发明的实施方案。然而，本发明可以以多种不同形式体现，并且不应被解释为限于本文陈述的实施方案；更确切地说，提供这些实施方案以便本公开将是充分且完整的，并且将向本领域技术人员全面地传达本发明的范围。
本发明提供一种包含细胞膜组分并被设计以与靶细胞进行融合的人造生物体颗粒，其中，所述生物体颗粒被工程化以携带包含至少一个预定活性分子的货物；并且其中，在该生物体颗粒与该靶细胞融合后，所述货物可释放进该靶细胞中；并且其中，该细胞膜组分源自所选的细胞或细胞外来源。如本文所用，术语“生物体”是指，不限于与天然细胞外囊泡(EV)具有相似之处的人造亚微米纳米颗粒。本发明生物体的颗粒大小的范围为0.03μm至5μm。在一个实施方案中，生物体的大小为0.1-0.7μm；0.1-0.5μm，0.2-0.5μm；0.3-0.5μm。在另一实施方案中，平均颗粒大小为5μm或更小；1.5μm或更小；0.7μm或更小；0.5μm或更小；0.3μm或更小；0.15μm或更小。在一个实施方案中，平均颗粒大小为0.5μm至1.5μm；在一个实施方案中，平均颗粒大小为0.4μm至0.8μm；在另一实施方案中，平均颗粒大小为0.3μm至0.5μm；在又另一个的实施方案中，当在制备后数小时内测量颗粒大小时，平均颗粒大小为0.4μm至1.5μm。在又另一实施方案中，当在制备后的一个月内测量颗粒大小且将生物体颗粒储存在0℃至-4℃时，该颗粒大小为0.8μm至5μm。
在一个实施方案中，生物体颗粒是无加载的。在又另一实施方案中，颗粒携带包含至少一个活性分子的货物。在一个实施方案中，货物包含至少两个活性分子。在另一实施方案中，货物包含多个活性分子。如本文所用，术语“活性分子”是指，不限于信号分子、生物分子；遗传和翻译修饰核酸材料；脱氧核糖核酸(DNA)；核糖核酸(RNA)；有机分子；无机分子；氨基酸；维生素；多酚、类固醇、亲脂性难溶药物、血管调节剂；肽；神经递质及其类似物；核苷；蛋白质(包括不限于生长因子、激素、适体、抗体、细胞因子、酶和热休克蛋白)；或任何其他能够发挥生物学功能的分子。在一个实施方案中，活性分子为大麻素、大麻素酸和内源性大麻素。在又另一实施方案中，大麻素或大麻素酸选自：四氢大麻酚酸(THCa)、大麻二酚酸(CBDa)、大麻酚酸(CBNa)、大麻色烯酸(CBCa)、四氢大麻酚(THC)、大麻酚(CBN)、大麻二酚(CBD)和大麻色原烯(CBC)、以及内源性大麻素及其类似物。根据一个实施方案，核酸为核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。根据进一步的实施方案，核酸为RNA，并且选自：siRNA、反义RNA、iRNA、微小RNA、微小RNA阻断剂(antagomir)、适体和核酶mRNA、或其任何组合。根据一个实施方案，活性分子具有治疗效果。如本文所用，术语“治疗效果”是指，不限于在任何种类的治疗后的反应，其结果被判断为有用或有利。无论结果是预期的、意外的，甚至是意想不到的结果，都是如此。在一个实施方案中，治疗效果选自：抗炎效果、抗纤维化效果、抗肿瘤效果和神经保护效果。用于对抗炎症、纤维化、糖过多症(诸如糖尿病性肾病)的所选货物的非限制性清单包含：天然来源的普遍存在的酚类化合物，诸如阿魏酸、天然酚类，例如白藜芦醇、芦丁、槲皮素、酚酸、维生素和大蒜素，大麻素类，其选自：四氢大麻酚酸(THCa)、大麻二酚酸(CBDa)、大麻酚酸(CBNa)、大麻色烯酸(CBCa)、四氢大麻酚(THC)、大麻酚(CBN)、大麻二酚(CBD)和大麻色原烯(CBC)或/和其衍生物，以及合成类似物、右美托咪定、(α2-AR)激动剂、代谢保护剂，包括不限于维格列汀、扁蒴藤素、二甲双胍、吡哆胺、血管调节剂、肾上腺素、芦丁、异克舒令。发挥抗肿瘤效果的货物的非限制性清单包含不限于：化学治疗剂(包括不限于顺铂、卡铂、苯丁酸氮芥、美法仑、奈达铂、奥沙利铂、四硝酸三铂、沙特拉铂、伊马替尼、尼洛替尼、达沙替尼和根赤壳菌素)；免疫调节剂、抗血管生成剂、有丝分裂抑制剂、核苷类似物、DNA嵌入剂、抗衰老剂、二肽、表观遗传因子和调节剂、二甲双胍、雷帕霉素、丙戊酸或盐、渥曼青霉素、多胺亚精胺(polyaminespermidine)、HDAC抑制剂丁酸钠、丁酸、sirtuin激活剂、白藜芦醇、辅酶CoQ1、小二元羧酸、阿司匹林、水杨酸、苯甲酸、肉碱类似物、人生长激素、拓扑异构酶类似物、抗体、细胞因子、叶酸抗代谢物、抗糖酵解剂、人致癌或原致癌转录因子的抑制剂寡核苷酸；或化学治疗剂、免疫调节剂、抗血管生成剂、有丝分裂抑制剂、核苷类似物、DNA嵌入剂、拓扑异构酶类似物、抗体、细胞因子或叶酸抗代谢物、己糖激酶抑制剂、乳酸脱氢酶抑制剂、磷酸果糖激酶2或磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶抑制剂、丙酮酸激酶M2抑制剂、转酮醇酶抑制剂、丙酮酸脱氢酶抑制剂、丙酮酸脱氢酶激酶抑制剂、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶抑制剂、GLUT抑制剂、质子转运抑制剂、单羧酸转运蛋白抑制剂、缺氧诱导因子1α抑制剂、AMP激活的蛋白激酶抑制剂、谷氨酰胺抑制剂、天冬酰胺抑制剂、精氨酸抑制剂、脂肪酸合酶抑制剂、ATP柠檬酸裂解酶抑制剂、苹果酸二甲酯和苹果酸酶2抑制剂、或其任何组合。
在本发明的一个实施方案中，细胞或细胞外来源选自：成纤维细胞、间充质干细胞、干细胞、免疫系统细胞、树突状细胞、外胚层、角质形成细胞、GI细胞、口腔细胞、鼻粘膜细胞、神经元细胞、视网膜细胞、内皮细胞、心球样细胞团(cardiospheres)、心肌细胞、周细胞、血细胞、黑色素细胞、实质细胞、肝脏储备细胞、神经干细胞、胰腺干细胞、胚胎干细胞、骨髓、皮肤组织、肝脏组织、胰腺组织、产后脐带、胎盘、羊膜囊、肾脏组织、神经组织、肾上腺组织、粘膜上皮、平滑肌组织、细菌细胞、细菌培养物、真菌、藻类、全微生物、条件培养基、羊水、脂肪抽吸物、吸脂副产物、粪便样品和植物组织。
在一个实施方案中，生物体是氧化还原体。如本文所用，术语“氧化还原体”是指，不限于携带包含至少一种氧化还原活性的自由基清除化合物的货物的生物体颗粒。在一个实施方案中，从氧化还原体颗粒释放经包装的复合物阻断了LPO链反应。在又另一个的实施方案中，在氧化应激位点处优先刺激从氧化还原体颗粒释放经包装的复合物。在一个实施方案中，通过不限于脂质自由基/过氧化物捕获剂(诸如维生素E、萜烯类、多酚、类黄酮、酚酸、大麻素类、类维生素A、维生素D、硫辛酸、固醇类)，氧化还原体能够阻断LPO链反应。根据一个实施方案，氧化还原体包含芬顿反应复合物阻断剂、羟基自由基捕获剂、铁螯合剂和脂质自由基捕获剂。在一个实施方案中，自由基捕获剂为抗坏血酸、一氧化氮供体(S-亚硝基谷胱甘肽)、或其衍生物。本发明的铁螯合剂的非限制性清单包括不限于：去铁胺(DFX)、乙二胺四乙酸(EDTA)、芦丁、EDTA二钠、EDTA四钠、EDTA钙二钠、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或其盐、羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)或其盐、次氮基三乙酸(NTA)、乙酰柠檬酸三己酯、氨基三亚甲基膦酸、β-丙氨酸二乙酸、柠檬酸铋、柠檬酸、环己二胺四乙酸、柠檬酸二铵、草酸二丁酯、草酸二乙酯、草酸二异丁酯、草酸二异丙酯、草酸二锂、草酸二甲酯、EDTA二钾、草酸二钾、草酸二丙酯、EDTA铜二钠、焦磷酸二钠、依替膦酸、HEDTA、甲基环糊精、草酸、三聚磷酸钾、氨基三亚甲基膦酸五钠、喷替酸五钠、三聚磷酸钠、喷替酸、植酸、柠檬酸钾、柠檬酸钠、二羟乙基甘氨酸钠、葡庚糖酸钠、葡萄糖酸钠、六偏磷酸钠、偏磷酸钠、偏硅酸钠、草酸钠、三偏磷酸钠、tea-EDTA、四羟丙基乙二胺、羟乙磷酸四钾、焦磷酸四钾、羟乙膦酸四钠、焦磷酸四钠、EDTA三钾、EDTA三钠、HEDTA三钠、NTA三钠、磷酸三钠、苹果酸、富马酸、麦芽酚、二巯丁二酸、青霉胺、二巯基丙醇、去铁酮、基于天然蛋白质的铁螯合剂、褪黑素、铁载体、锌或铜阳离子、或盐或复合物、以及去铁胺甲磺酸盐、或其组合。在又另一实施方案中，铁螯合剂选自：EDTA(乙二胺四乙酸)、DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)、NTA(次氮基三乙酸)、去毒胺(detoxamin)、去铁胺、去铁酮、地拉罗司、谷胱甘肽、金属蛋白、铁螯合物(双-甘氨酸盐螯合物)、铜蓝蛋白、青霉胺、铜宗、曲恩汀、阿魏酸、乙酸锌、脂质运载蛋白2和二巯基丙醇。
根据本发明的一个实施方案，氧化还原体颗粒的组分为天然螯合剂和经批准的饮食补充剂。本发明的天然螯合剂为不限于柠檬酸、氨基酸(例如肌肽)、蛋白质、多糖、核酸、谷氨酸、组氨酸、有机二酸、多肽、植物螯合素、血红蛋白、叶绿素、腐殖酸、膦酸酯和转铁蛋白。在一个实施方案中，螯合剂属于多酚组，诸如黄酮和类黄酮。在一个实施方案中，多酚为不限于芦丁、槲皮素、叶黄素和EGCG。
根据一个实施方案，氧化还原体颗粒可以加载有如酚类抗氧化剂之类的抗氧化剂，诸如丁基羟基甲苯(BHT)(IUPAC名称：2,6-双(1,1-二甲基乙基)-4-甲基苯酚)；二丁基化羟基茴香醚(BHA)；没食子酸丙酯；硫酸钠；柠檬酸；焦亚硫酸钠；抗坏血酸；生育酚；生育酚酯衍生物；2-巯基苯并咪唑或其组合。在一个实施方案中，所使用的抗氧化剂的量(以质量计)为0.1％至20％。在又另一实施方案中，相对于薄膜剂(film dosage)组合物的总质量，所使用的抗氧化剂的量(以质量计)为0.5％至10％；0.7％至10％；1％至8％；3％至8％；2％至5％；5％至10％；3％至10％；以及2.5％至10％。在一个实施方案中，氧化还原体颗粒富含LC-PUFA、二十二碳六烯酸(DHA)或乙醇胺缩醛磷脂或其衍生物。在又另一个的实施方案中，氧化还原体颗粒递送抑制age-介导的胶原蛋白片段化的DFX。在一个实施方案中，氧化还原体颗粒递送抑制透明质酸降解的抗坏血酸或其衍生物，从而延迟胶原蛋白和细胞外基质的损失。在本发明的一个实施方案中，氧化还原体颗粒可以用于伤口愈合；美容医学；以及辅助皮肤填充剂手术(dermal filler procedures)。在本发明的一个实施方案中，氧化还原体源自人包皮/皮肤成纤维细胞、角质形成细胞、脂肪来源的干细胞、以及皮肤微生物组细胞。
根据本发明的实施方案，根据货物或物理属性对生物体颗粒进行分类。在一个实施方案中，生物体颗粒是pH敏感性生物体。在一个实施方案中，生物体颗粒是核酸转染生物体。如本文所用，术语“核酸转染生物体”是指，不限于由生物体封装并递送到靶细胞、组织、器官的核苷酸，其目的是调节靶多核苷酸或多肽的表达。在本发明的上下文中，术语“调节”是指不限于增加、增强、降低、消除内源性核酸或基因或相应蛋白质的表达。在一个实施方案中，此类封装的多核苷酸本质上可以是天然的或重组的，并且可以使用有义或反义作用机制发挥其治疗活性。在一个实施方案中，核酸转染生物体补充有合成的阳离子脂质。在另一实施方案中，生物体颗粒是长循环缓释生物体。短语“长循环缓释生物体”是指被工程化以通过生物体核心聚合物或蛋白质或多糖修饰来提供货物的持续递送、并且因此延长药物在血液循环或靶组织中的治疗水平的生物体。本发明的长循环缓释生物体是不限于通过添加核心-PEG缀合脂质、白蛋白、透明质酸；锚定金属离子；或其组合来制备的。与未经修饰的生物体相比，核心生物体膜的亲水性修饰增加了生物体在靶器官或血液中的停留时间。延长的循环时间归因于在聚乙二醇化颗粒表面上的血浆蛋白的吸收速率降低。
在一个实施方案中，生物体颗粒是选择性靶向生物体。在本发明的上下文中，术语“选择性靶向生物体”是指不限于被设计成用于特异性靶向配体或归巢部分(homingmoieties)的生物体颗粒。在本发明的选择性靶向生物体中，配体或归巢部分是不限于糖胺聚糖；单特异性或双特异性抗体；适体；受体；融合蛋白；融合肽；或其合成模拟物；癌症靶向叶酸；特异性磷脂；细胞因子、生长因子；或其组合。
在又另一个的实施方案中，生物体颗粒是免疫原性生物体。在本发明的上下文中，术语“免疫原性生物体”是指源自病原体细胞培养物的生物体颗粒，或具有共提取的或外部包埋的免疫原性部分的生物体颗粒。如本文所用，术语“免疫原性”是指不限于诸如抗原或表位的特定物质在人和其他动物的体内激发免疫反应的能力。换句话说，免疫原性是诱导体液和/或细胞介导的免疫反应的能力。
在一个实施方案中，本发明的生物体颗粒的膜包含从在预定义细胞培养条件下培养的细胞来源获得的细胞膜的至少50％。在一个实施方案中，源自不同来源的生物体颗粒与质膜相比可以示出脂质组成的差异。
本发明进一步提供一种包含生物体颗粒和至少一种载体的组合物。在一个实施方案中，组合物是药物组合物，并且载体是药学上可接受的载体。在一个实施方案中，组合物适合于口服、静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内、局部、眼、鼻内(包括直接到用于CNS递送的嗅球)、直肠、阴道、肺、舌下、透粘膜、组织内(利用超声引导、内窥镜，通过组织插入的植入物施用)、鞘内和透皮施用。在又另一实施方案中，组合物是药物化妆品组合物，并且载体是药物化妆品上可接受的载体。在又另一实施方案中，载体是食物级载体。在一个实施方案中，组合物是可食用组合物，载体是食物级载体。在一个实施方案中，组合物进一步包含赋形剂、经安全测试的活性化合物、试剂、或其组合。在一个实施方案中，生物体颗粒在组合物中的浓度为总组合物的0.005％至80％。在又另一实施方案中，浓度为0.005％至25％。在一个实施方案中，生物体颗粒与合适的赋形剂和载体进行配制；被封装成和储存成用于细胞保存目的、细胞治疗目的、成像或药物递送目的，作为用于转染的试剂或用于研究试剂盒的试剂。包含生物体颗粒的组合物为不限于固体、液体、半固体、冷冻保存的、冷藏的或干燥的即用型。
本发明进一步提供一种用于制造包含多个生物体颗粒的样品的方法，其中，这些生物体颗粒被工程化以携带包含至少一个活性分子的货物并且被设计以与靶细胞进行融合以释放该货物；并且其中该生物体颗粒包含源自所选细胞或细胞外来源的细胞膜组分；该方法包含：
A.在温和溶剂系统中从所选细胞或细胞外来源进行总细胞脂质提取，以获得脂质提取物；
B.干燥该脂质提取物；以及
C.通过进行至少一步的超声处理来诱导生物体颗粒的自组装；
其中，样品中所得的生物体颗粒的特征在于平均颗粒大小为0.03μm至5μm。如本文所用，参照https://www.fda.gov/downloads/drugs/guidances/ucm073395.pdf，术语“温和溶剂”是指不限于PDE＞2.5mg/天且浓度极限＞250ppm的第3类或第2类的任何溶剂。
在一个实施方案中，平均颗粒大小为0.05μm至3μm；在又另一实施方案中，平均颗粒大小为0.08μm至1.5μm；在进一步的实施方案中，平均颗粒大小为0.1-0.7μm；0.1-0.5μm，0.2-0.5μm；0.3-0.5μm。在另一实施方案中，平均颗粒大小为5μm或更小；1.5μm或更小；0.7μm或更小；0.5μm或更小；0.3μm或更小；0.15μm或更小。在一个实施方案中，平均颗粒大小为0.5μm至1.5μm；在一个实施方案中，平均颗粒大小为0.4μm至0.8μm；在另一实施方案中，平均颗粒大小为0.3μm至0.5μm；在一个实施方案中，包含生物体颗粒的样品的pH为4.5至5。在又另一实施方案中，包含生物体颗粒的样品的pH为4.5至5。在一个实施方案中，溶剂系统包含极性溶剂与非极性溶剂的混合物。在一个实施方案中，溶剂系统中的极性溶剂选自：异丙醇、乙醇、正丁醇、以及水饱和的正丁醇。在一个实施方案中，溶剂系统中的非极性溶剂选自己烷以及来自萜烯组的溶剂。在一个实施方案中，溶剂系统中的非极性溶剂为正己烷。在一个实施方案中，可以使用超临界二氧化碳(scCO2)通过超临界流体提取将己烷完全或部分悬浮，因为温和的“绿色”溶剂具有许多有利的特性，包括气体样粘度、液体样密度、在环境条件下比有机溶剂中快约100倍的扩散率、以及在相对低温下操作。萜烯/类黄酮可以进一步选自α-蒎烯、d-柠檬烯、芳樟醇、桉油精、萜品醇-4-醇、对伞花烃、冰片、δ-3-蒈烯、β-谷甾醇、β-月桂烯、β-石竹烯、cannflavin A、芹菜素、槲皮素和胡薄荷酮。在一个实施方案中，来自萜烯组的溶剂选自：d-柠檬烯、α-蒎烯和对伞花烃。
在一个实施方案中，溶剂系统中的极性溶剂为异丙醇，并且非极性溶剂为正己烷。在又另一实施方案中，溶剂是己烷-异丙醇3:2低毒性溶剂混合物。在一个实施方案中，溶剂系统进一步包含稳定剂。在另一实施方案中，稳定剂为丁基羟基甲苯(BHT)。在一个实施方案中，溶剂系统可以进一步包含添加剂，诸如不限于抗氧化剂、表面活性剂、稳定剂、维生素E、角鲨烯和胆固醇、或其组合。在一个实施方案中，方法进一步包含核酸共沉淀步骤。在一个实施方案中，核酸为核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。在一个实施方案中，核酸为RNA。RNA递送是主要挑战之一。在一个实施方案中，在亲水性运载体中的空化超声处理过程中、通过亲水-疏水自组装、使用从细胞或细胞外来源收集的细胞膜来实现生物体工程化。在一个实施方案中，在超声处理后的脂质膜分离后，将生物体颗粒挤出。在一个实施方案中，包含活性分子的货物是亲水的，并且在超声处理或挤出期间被截留在亲水性运载体中。在又另一实施方案中，货物是疏水性货物，并且在使用溶剂系统提取之前、在提取期间、在干燥/溶剂蒸发过程中、在超声处理期间、在挤出期间被截留。干燥和超声处理后，重复冻融可以提高亲水性货物的封装率。封装加载的水平受基于如每一特异性治疗或研究部分中预先设计的所选货物的敏感性、稳定性和期望加载剂量来选择工程化参数影响。在一个实施方案中，可以将活性分子以没有作为安全担忧的病毒基因载体杂质的风险的预定浓度交织到生物体核心中。在一个实施方案中，生物体颗粒可以被电穿孔或显微注射。在一个实施方案中，可以存在任何合适的保护性缓冲液以保持用于治疗性递送的核酸材料的完整性、通过在4℃温和超声处理将RNA或DNA掺入到生物体颗粒中。根据本发明的实施方案，制造方法符合大多数已知的LNP和脂质体工业特性。
在一个实施方案中，用于总脂质提取的细胞或细胞外来源选自：成纤维细胞、间充质干细胞、干细胞、免疫系统细胞、树突状细胞、外胚层、角质形成细胞、GI细胞、口腔细胞、鼻粘膜细胞、神经元细胞、视网膜细胞、内皮细胞、心球样细胞团、心肌细胞、周细胞、血细胞、黑色素细胞、实质细胞、肝脏储备细胞、神经干细胞、胰腺干细胞、胚胎干细胞、骨髓、皮肤组织、肝脏组织、胰腺组织、产后脐带、胎盘、羊膜囊、肾脏组织、神经组织、生物体液、以及排泄物或手术提取的组织(例如乳汁、唾液、粘液、血浆、尿液、粪便、羊水、皮脂)、产后脐带、胎盘、羊膜囊、肾组织、神经组织、肾上腺组织、粘膜上皮、平滑肌组织、肾上腺组织、粘膜上皮、平滑肌组织、细菌细胞、细菌培养物、全微生物、条件培养基、羊水、脂肪抽吸物、吸脂副产物以及植物组织。在又另一实施方案中，从细胞条件培养基、冻干条件细胞培养基、细胞沉淀物、冷冻细胞、干细胞、经冲洗的细胞块(bulk)、非粘附性细胞悬浮液和粘附性细胞层进行脂质提取。在又另一实施方案中，细胞层生长在被细胞外基质或合成基质涂覆的或未被涂覆的细胞培养塑料器具中，该塑料器具选自(多用)烧瓶、培养皿、支架、珠(beads)和生物反应器。根据本发明的一个实施方案，通过冷冻或/和/或喷雾/冷冻干燥来干燥膜提取物。在又另一实施方案中，通过蒸发来干燥膜提取物。蒸发可以通过任何合适的技术进行，包括但不限于真空离心蒸发浓缩器(speed-vac)离心、氩气/氮气吹扫、螺旋气流以及在受控温度环境下其他可用的溶剂蒸发方法，诸如微波或转子(rotor)蒸发、索氏提取仪器、离心蒸发器。在又另一个的实施方案中，在加载有所需活性分子的缓冲液中、利用尖端超声发生器对膜提取物进行超声。在一个实施方案中，当在制备后数小时内测量颗粒大小时，平均颗粒大小为0.4μm至1.5μm。在又另一实施方案中，当在制备后且生物体颗粒储存在0℃至-4℃的一个月内测量颗粒大小时，该颗粒大小为0.8μm至5μm。
在一个实施方案中，生物体颗粒源自细胞或细胞外来源的膜。在一个实施方案中，根据预定义来源需求对生物体颗粒进行工程化。在一个实施方案中，细胞来源是自体的。术语“自体的”是指供体和受体相同的情况。在一个实施方案中，细胞来源是非自体的。在一个实施方案中，供体来源为中胚层细胞，包括但不限于成纤维细胞、间充质干细胞、多能和分化的干细胞、免疫系统细胞、树突状细胞、外胚层、角质形成细胞、GI和口腔细胞、鼻粘膜细胞、神经元和视网膜细胞、内皮细胞、心球样细胞团、心肌细胞、周细胞和血细胞。在一个实施方案中，生物体颗粒的来源为：基质细胞、角质形成细胞、黑色素细胞、实质细胞、间充质干细胞(有系或无系祖细胞)、肝脏储备细胞、神经干细胞、胰腺干细胞和/或胚胎干细胞、骨髓、皮肤、肝脏组织、胰腺、肾脏组织、神经组织、肾上腺、粘膜上皮和平滑肌。
在本发明的方法中，生物体颗粒可以加载有所选的活性分子。在一个实施方案中，加载在提取期间进行。在又另一实施方案中，加载在干燥期间、在提取之前或之后进行。在一个实施方案中，获得的生物体颗粒可以进行挤出。
与传统的氯仿-甲醇脂质提取相比，本发明的HIP提取系统的优点在于：能够以最小的脂肪酶活性并且直接从氯仿可溶性组分(诸如塑料、细胞培养无菌表面孔，包括但不限于中空纤维、珠、核孔和聚碳酸酯过滤器)或在其上提取膜脂质。例如，HIP将允许直接从聚碳酸酯提取，其在这些溶剂中是稳定的。HIP提取可以用于consolation来自细胞或条件培养基的生物体，同时从相同细胞培养物或组织样品共提取RNA或蛋白质。对于细胞层或细胞沉淀物或冻干条件培养基或组织提取物的此种处理，可以将HIP与大约1/4-1/5每体积水缓冲液或RNA或DNA或蛋白质稳定溶液(例如RNAsave bioind1.com或Trhaloze或含RNAse抑制剂的缓冲液)进行预混合。水性相缓冲液或稳定溶液提取共沉淀的核酸或蛋白质提取物，其中，所述共提取的核酸或蛋白质相然后可以例如通过离心或冷冻梯度等进行分离。此种含RNA或/和DNA或/和蛋白质的相可以进一步在颗粒形成期间与生物体颗粒的疏水性相一起，并且然后用作生物治疗剂或用于生物标志物诊断或研究试剂用途。
在一个实施方案中，本发明的方法与GMP和GLP指南兼容。在一个实施方案中，根据本发明的方法，生物体颗粒收获自细胞生物质；细胞沉淀物；粘附性细胞层；培养基；或其组合。在一个实施方案中，通过允许OECD批准的溶剂提取方法的单一低毒性步骤，对生物体颗粒进行提取。
在一个实施方案中，来源细胞可以在提取之前，通过在培养中暴露于温和的氧化应激、饥饿、辐射或其他体外细胞修饰来进行修饰，以表达更多的亲脂性抗氧化剂。在一个实施方案中，亲脂性抗氧化剂为芦丁、角鲨烯、生育酚、视黄醇、叶酸以及其衍生物。在一个实施方案中，脂质溶液组分是过滤消毒的。在又另一个的实施方案中，可以将脂质溶液组分储存在-20℃至-80℃温度的氮气或氩气中。
在进一步的实施方案中，溶剂进一步包含洗涤剂表面活性剂。在一个实施方案中，洗涤剂为Polaxomer。在一个实施方案中，所述方法包含冷冻干燥/蒸发HIP溶剂部分以形成生物体颗粒-核酸复合物；以及在亲水性载体/缓冲液中进行超声处理，和/或以期望的颗粒大小任选挤出。
本发明进一步提供一种包含根据本发明方法制备的多个生物体颗粒的样品。
本发明进一步提供一种治疗或预防需要此种治疗的对象的病理的方法，包含向该对象施用包含生物体颗粒和至少一种载体的药物组合物。在一个实施方案中，组合物是药物组合物，并且载体是药学上可接受的载体。在一个实施方案中，组合物适合于口服、静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内、局部、眼、鼻、直肠、阴道、肺、舌下、透粘膜和透皮施用。在又另一实施方案中，组合物是药物化妆品组合物，并且载体是药物化妆品上可接受的载体。在一个实施方案中，病理选自：炎症性疾病、神经疾病、感染性疾病、恶性肿瘤、免疫系统疾病和自身免疫疾病。疾病的非限制性清单包含炎症性疾病，诸如慢性或急性炎症性皮肤疾病、炎症性肠病(IBD)、关节炎、炎症性呼吸疾病、或急性或慢性伤口或损伤；感染性疾病是由细菌性病原体、病毒性病原体或寄生物引起的感染性疾病；增生性疾病是与升高的促炎细胞因子水平和/或降低的抗炎细胞因子水平相关联的恶性肿瘤；代谢紊乱、I型糖尿病、II型糖尿病、或糖尿病相关症状；由促炎细胞因子(诸如不限于IL-1α、IL-6、TNF-α、IL-17)的升高介导的炎症；通过升高至少一种抗炎细胞因子(诸如不限于IL-13、IL-4或IL-10)的水平而介导的炎症；慢性鼻窦炎(CRS)、过敏性鼻炎；COPD；鼻息肉病(NP)；血管舒缩性鼻炎、气道反应过度、囊性纤维化；肺纤维化；过敏性鼻窦炎、IBD；克罗恩病；以及溃疡性结肠炎。
在本发明的上下文中，可以将生物体颗粒掺入到范围广泛的美容药品、化妆品、局部剂型(包括但不限于凝胶、油、皮肤填充剂、乳剂等)中。例如，可以以局部用乳膏、糊剂、软膏、凝胶、洗剂等，将含有所述颗粒的悬浮液配制并施用。在某一实施方案中，可以通过“局部”、“开放”或“封闭”手术，来对美容药品进行应用。通过“局部”意指将药物组合物直接应用于暴露于环境的组织，诸如皮肤。“开放”手术是指包括切开患者的皮肤并使药物组合物应用其上的下层组织直接可见的那些手术。“封闭”手术是侵入性手术，其中，例如在美容手术期间或在皮肤区域、伤口、皱纹上的局部施用后，结合皮肤填充剂，内部靶组织器械直接进入到疾病位点。本发明进一步提供一种改善有需要的对象的皮肤状况的方法，包含向该对象施用包含本发明的生物体颗粒的组合物。在一个实施方案中，本发明进一步提供生物体颗粒作为活性生物分子的递送运载体的用途。本发明的活性生物分子具有不限于抗炎活性；抗衰老活性；抗癌活性；代谢活性；或遗传DNA或RNA生物活性物质。在一个实施方案中，活性生物分子为细胞因子。在又另一个的实施方案中，活性生物分子为生长因子。在一个实施方案中，活性生物分子为寡核苷酸，包含脱氧核糖核酸或核糖核酸。在一个实施方案中，寡核苷酸的长度为2到100个核苷酸。在一个实施方案中，寡核苷酸是天然的、合成的、经修饰的或未经修饰的。在一个实施方案中，寡核苷酸为RNAi；siRNA；miRNA模拟物；anti-miR；核酶、适体、外显子跳跃分子、合成mRNA、短发夹RNA(shRNA)。在又另一个的实施方案中，生物体颗粒的膜被工程化以提供货物至靶的受控释放。在一个实施方案中，氧化应激敏感性脂质包埋在生物体颗粒的膜中。在另一实施方案中，生物体颗粒加载有金属螯合剂和抗氧化剂。在一个实施方案中，外泌体样颗粒用于将多能性因子引入体细胞或干细胞中，以从而获得非病毒诱导的多能干细胞(iPSC)。在又另一实施方案中，生物体颗粒用于处理细胞。在生理温度(约37℃)使用本发明的生物体颗粒对细胞进行处理。处理时间为2分钟至72小时。本发明进一步提供本发明的生物体颗粒用作药物(medicament)。
在本发明的实施方案中，用于生物体颗粒的颗粒大小表征的QC规范包括，不限于以下各项：颗粒大小；对靶组织/细胞的穿透能力；无菌性；由蛋白质和核酸的缺乏所定义的非免疫原性和安全性。使用Malvern Nano Zetasizer测量颗粒大小分布，并且用Zetasizer软件对其进行提炼。利用通常可用的缩小大小技术，基于所需的应用来控制生物体颗粒组装体的大小。可以通过将组装体挤出穿过具有预选网孔大小的膜来减小其大小。
在本发明的上下文中，用于生物体颗粒脂质表征的QC规范包括不限于以下各项：根据膜脂质组成和特征对生物体颗粒进行定性和定量，诸如：(1)脂肪酸-FA的去/饱和指数，(2)FA链长特征，(GC；HPLC分析方法)，即，长链LC-多不饱和脂肪酸FA(PUFA)/中链-MC/；(3)极性(IZON测定)；(4)脂质组成，即，含量百分比和/或比率，例如，PL-磷脂组成和比率PC-PE/PI-PS或生物体膜不同脂质组之间的比率/百分比，例如，PL/NL(中性脂质)/CL/GL/TG/FFA(HPLC；TLC；LC-MS；MALDI；柱层析法；等)；(5)总脂质(香草醛测定等)；(6)可选的功能性脂质和脂质衍生物含量，例如，前列腺素、前列环素、白三烯、凝血噁烷(tromboxan)(HPLC；MS-MS；ELISA；RIA；等)；或(7)代谢物，诸如羟基指数(碘测定)；以及(8)ROS介导的氧化。
在本发明的上下文中，用于包含生物体颗粒的最终组合物的QC规范包括，不限于以下各项：粘度和渗透性；pH；每批次颗粒的数目；浊度；稳定性规范参数。由IZON有限公司提供的颗粒测量和表征方法也适用于生物体颗粒生产中的QC。
在本发明的上下文中，用于生物体生产效能的QC规范包括，不限于对希望的生物体活性的测定。例如，可在体外基于产品的功能性效果测试生物体和氧化还原体的细胞培养测定。可以通过划痕测定(scratch assay)、细胞毒性测定，例如化学治疗药细胞毒性测定、ROS产生或羟基脲老化诱导测定、炎症IL19或TGF-β诱导测定将效果筛选为QC效能测定。
实施例
实施例1.使用溶剂从细胞沉淀物提取脂质。
培养以下细胞样品：样品1-原代脐静脉内皮细胞；正常人(HUVEC)(
Figure BDA0002802844900000111
PCS-100-010TM)；样品2-原代乳腺上皮细胞；正常人
Figure BDA0002802844900000112
PCS-600-010TM；样品3-人包皮成纤维细胞(HFF)(初次捐赠)；样品4-人脂肪来源的间充质干细胞；(
Figure BDA0002802844900000113
PCS-500-011)。将所有的细胞样品传代3-6代，每一样品在每个冷冻保存瓶中储存2X10upp6个细胞，收集沉淀物并储存在液氮中的冷冻保存培养基(GIBCO)中。用PBS冲洗沉淀物，并通过离心浓缩细胞团(cellular mass)。将细胞浓缩液与由己烷:异丙醇(3:2)溶剂和0.02％BHT所组成的HIP溶剂混合物进行混合。在室温下，对沉淀物进行反复涡旋，每次涡旋循环持续2-4分钟。然后将样品离心并收集上清液。将收集的上清液蒸发直至形成油状残余物。进一步制备生物体颗粒并将其封装。
实施例2.颗粒形成和表征。
使用尖端超声处理(vibra-cell Sonics)来进行生物体颗粒形成：每个样品3次超声处理循环，每次循环3秒，循环之间间隔10秒。在此过程中，通过在超声处理期间用冰冷却样品，将样品保持在环境温度下(在60℃监测超声发生器的温度)，以防止超声处理引起的升温。测量最终产物的pH并且使用Nanosizer-Malvern确定颗粒大小，如图1A所示。所形成的产物的特性落入pH测量为4.5-5且平均颗粒大小为0.05-1.5μm大小的QC规范中。为了稳定性测试，将获得的样品在4℃储存一月(图1B)。使用Nanosizer-Malvern测量的经观察的平均颗粒大小显著更大，表明生物体颗粒发生了聚集/相互融合(interfusion)。
实施例3.建立被设计用于产生生物体的实验系统。
使用冷冻细胞沉淀物或细胞的相同来源的新鲜培养物建立从由溶剂提取的脂质的生物体产生的方案。用于方案建立的细胞为源自以下的人间充质干细胞(MSC)：脂肪组织；骨髓细胞、以及HepG2肝脏细胞系。使用己烷:异丙醇溶剂提取脂质膜，并且通过氮气蒸发或冻干机对脂质膜进行干燥。在脂质提取之前，将新鲜细胞培养物用HBSS-HEPES培养以产生条件培养基2小时。还收集所得的条件培养基，并且提取和干燥脂质和RNA。将由细胞沉淀物或细胞培养物产生的干燥脂质样品在HBSS中进行超声处理以产生生物体。使用NanoDrop Lite分光光度计测量从每一样品提取(使用DDW)的RNA浓度。使用ZetaSizernano(Malvern Panalytical有限公司)颗粒大小分析仪和NanoSight分析仪(MalvernPanalytical有限公司)对所形成的生物体的大小和稳定性进行评估。使用ZetaSizer nano的测量示出了在81nm和267nm处出现峰的两个颗粒大小分布，如图2A所示。NanoSight结果表明平均颗粒大小为248nm(图2B)。
实施例3.生物体稳定性检验。
为了检验生物体稳定性，在生物体产生后，将实施例2中描述的从骨髓hMSC通过超声处理产生的生物体的样品分成8个子样品。将每对样品暴露于不同次数的冻融循环(0-3次循环)。将一半样品(每对之一)冻干，其余样品储存在-80℃冷冻箱中。使用NanoSight测量的生物体颗粒大小测量值表明，无论冻融循环次数如何，所有样品都是稳定的，但是颗粒大小的均匀性取决于条件(图3)。结果显示，在冻融循环后增加超声处理步骤(进行或不进行冷冻干燥)提高了生物体大小的均匀性(图2A-C)。
实施例4.生物体融合实验。
将荧光脂质生物标志物(BioDipyTMTR(D7540)，ThermoFisher Scientific)加载到生物体颗粒，以模拟活性疏水化合物并使生物体在细胞间和细胞内的运输可视化。掺入到荧光鞘脂中的BioDipyTM和NBD荧光团具有不同的光谱特性。由于BioDipyTMFL荧光团的高摩尔吸收率和荧光量子产率，其产生比NBD更大的荧光输出。其也比NBD对光更稳定。NBD标记的鞘脂比其BODIPY FL对应物具有更高的穿过水性相的转移速率。图4展示了荧光生物体颗粒的融合。将最终浓度为5μm的BioDipy融合进铺满的人包皮成纤维(HFF)细胞的膜中。使用荧光显微镜(X40倍放大)和CDD相机使荧光可视化，并且记录图像。每一样品在10-35分钟期间追踪荧光生物体颗粒与HFF细胞的融合。在两次测量之间，将细胞保持在37℃。在15分钟内将所有生物体制剂(实施例1，样品1至4)融合进靶细胞中(图4A-C)。
实施例5.通过HIP系统从条件培养基中的粘附细胞层提取细胞膜。
提取人包皮成纤维(HFF)细胞并且分离条件培养基，如图5所示。用HBSS+HEPES从生长培养基中冲洗粘附的HFF细胞层四次。然后将缓冲液去除，并添加包括0.02％BHT的HIP溶剂系统以覆盖多用烧瓶中的细胞层。在环境温度下轻轻摇动烧瓶20分钟进行提取。烧瓶中的内容物转移到50ml培养管中，并在氩气下进行水(36℃)蒸发，最终形成干燥的油状薄膜样残留物。
实施例6.具有膜蛋白的生物体颗粒的工程化。
根据实施例1接种并收集细胞。在包含1:1己烷-异丙醇混合物的温和溶剂混合物中从细胞团提取脂质和膜蛋白。提取后，收集上清液和沉淀物，并且用BSA标准品通过Bradford测定来测量总蛋白。测量的蛋白质含量为15％。通过用NaCl冲洗来将核酸从粗提取物中去除，并用分光光度计在280nm处进行测量。
实施例6.制备寡核苷酸封装的外泌体样颗粒。
根据实施例1接种并收集细胞。将细胞团溶解在HIP(3:2v/v)溶剂系统或己烷/乙醇(2:1v/v)溶剂系统中。在室温下孵育30分钟后，进行进一步的溶剂提取步骤(每次大约原体积的1/4)。然后，使用台式离心机将提取物在3000rpm离心10分钟，并且在水性相和溶剂相之间形成清晰的界面。将寡核苷酸溶解在与挤出的囊泡的溶液(pH4，30％乙醇)相匹配的水性溶液中，并滴加到细胞膜的HIP提取物中。对溶剂相进行温和的氮气吹扫以去除溶剂。然后，将样品放置在SpeedVac中3小时以蒸发残留的溶剂。用HBSS缓冲液(20mM HEPES，150mM NaCl，pH7.2)填充含有膜核酸的容器，并进行超声处理。
实施例7.向成纤维细胞靶与神经胶质细胞靶递送成纤维细胞来源的生物体颗粒的动力学。
在37℃将3T3NIH成纤维细胞用荧光C6-nbderythro-神经酰胺预先标记15分钟(C6-nbderythro-神经酰胺的最终浓度为5μM)。将培养基丢弃，随后用冰冷的PBS冲洗培养皿两次。对于提取，将细胞与1ml己烷:异丙醇(HIP)2:1(v/v)一起在RT摇动孵育15分钟。将HIP从3个Petri培养皿收集到一个玻璃试管中。每次用1ml HIP冲洗培养皿一次，将所有冲洗液添加到试管中。在氮气流下蒸发HIP。重新悬浮于300μl PBS后，将细胞团进行超声处理。为了分析NBD标记的释放和掺入，在实验前一天，将NIH 3T3成纤维细胞和原代培养的神经胶质细胞接种到24孔培养皿中的13mm玻璃盖玻片上。将由NIH 3T3成纤维细胞制备的生物体颗粒添加到细胞中(每孔10μl生物体悬浮液)，在指定的时间间隔从孔中取出盖玻片，冲洗以去除未结合的NBD标记，并使用荧光Zeist显微镜(X40倍放大)和CDD相机进行分析。将图像记录在计算机中。该实验的总体过程方案展现在图6A中。
结果：
成像结果展现在图6B中。在4分钟内观察到由经标记的生物体颗粒对成纤维细胞的显著标记。施用生物体颗粒后30分钟，该信号变得甚至更加强烈。相反，神经胶质细胞几乎没有显示经标记的生物体颗粒的结合，甚至在30分钟后也没有。这些结果表明起源于成纤维细胞的生物体颗粒对成纤维细胞靶细胞具有特异靶向性。
实施例8.氧化还原体的工程化
氧化还原体颗粒的示意图展示在图7中。乳杆菌属细菌的冻干细胞被用作生物体提取的来源。将生育酚和胆固醇(0.5％)溶解在由己烷:异丙醇(HIP)(3:2v/v)组成的、含有1.5％丁基羟基甲苯(BHT)作为稳定剂的溶剂溶液中。为了增加脂质双层膜的稳定性/刚性，使用了亲脂性抗氧化剂α-生育酚(～3％)、DHA(～3％)、作为刚性稳定剂的胆固醇(1.5％)。在氮气流下蒸发溶剂，并在4℃冷冻干燥2小时。将所得脂质分散体在尖端型超声发生器中进行超声处理10-20分钟，直到浊度被清除。使用电子顺磁共振(EPR)自旋捕获剂来检测脂质来源的自由基，该自由基是外泌体样颗粒中由铁诱导的氧化应激所产生的。使用硝酮自旋捕获剂α-(4-吡啶基-1-氧化物)-N-叔丁基硝酮(POBN)，检测以碳为中心的自由基加合物。超声处理时，将抗坏血酸和DFX或EDTA添加至缓冲液中。使用提取溶剂混合物从所选来源的细胞培养物提取所需的膜材料，该混合物包含溶解了所选脂质氧化还原活性试剂(DHA/EPA作为氧化还原传感物或/和α-生育酚作为氧化还原稳定剂)的HIP。使用以下过程进行HIP的脂质提取：在蒸发步骤之后，通过尖端超声处理获得所需的囊泡直径。
实施例9：氧化还原体颗粒的EPR-氧化还原敏感性。
将50和100μm DHA掺入到氧化还原体颗粒的脂质双层膜中，图8，两个中间光谱。观察以碳为中心的自旋加合物：经观察随着DHA浓度增加，自旋加合物EPR信号强度增加(表明LR形成中DHA剂量依赖性增加)。在没有DHA的氧化还原体颗粒中，获得了非常弱的(对照)光谱(图8，最上面的光谱)(表示基础POBN加合物形成)。当将稳定剂α-生育酚掺入到富含DHA的外泌体样颗粒中时，观察到LR形成几乎减少到基础水平(图8，最下面的光谱)，表明掺入外泌体样颗粒膜的抗氧化剂对LPO具有抑制作用。
实施例10：氧化还原体颗粒在正常条件下的稳定性。
含钙黄绿素的氧化还原体颗粒制备如下：将pH为8的10mM TRIS(NaCl 100mM)中含自猝灭浓度为60mM的钙黄绿素添加到冻干材料中，然后通过涡旋重新悬浮于0.2ml缓冲液中。通过使用Sephadex G-50柱(Pharmacia)的凝胶过滤，从氧化还原体颗粒悬浮液去除未被封装的钙黄绿素。30μl的氧化还原体悬浮液被注射到柱中，并在pH为8的10mM TRIS(NaCl150mM)中洗脱，并收集洗脱液部分。通过荧光光谱法在490nm的激发波长和520nm的发射波长下对未处理的氧化还原体颗粒中的以及暴露于最终浓度为0.2％的去污剂Triton X-100的氧化还原体颗粒中的荧光进行监测。
结果：
观察到，在将100μm H202添加到氧化还原体颗粒悬浮液之后，钙黄绿素释放没有变化(图9A)。在将50μm Fe2+(其作为催化剂以经由芬顿反应从H2O2产生羟基自由基)添加到悬浮液之后，在含有DHA或α-生育酚的氧化还原体颗粒群体中观察到荧光的变化速率显著增加，但是在对照群体中没有观察到。在将Triton X-100添加到溶液之后(图9B)，氧化还原体颗粒中所有剩余的钙黄绿素完全释放，其动力学比添加H202+Fe2+之后观察到的释放更快。
实施例11：氧化还原体对脑损伤的影响
为了测试氧化还原体对脑损伤的影响，根据针对动物研究的赫尔辛基依从性，将出生后产后年龄第8天的小鼠(每组n＝6)用异氟烷和氯胺酮/戊巴比妥钠麻醉处死。然后，将新鲜切开的脑切片通过在DMEM和Hepes中与50μm的七水合硫酸亚铁(Sigma)在37℃孵育15分钟来进行芬顿反应。通过此种离体诱导的氧化应激，使脑切片暴露于模拟以下各项的ROS产生中：炎症性疾病；缺血性应激；以及其他脑部疾病，诸如唐氏综合症；动脉粥样硬化引起的冠状动脉缺血性改变。TBARS通过脑切片将ROS生成物释放到孵育培养基中，从～80-100nM/mg/湿重增加到120-160nM每mg/湿重。用未封装在氧化还原体中的、浓度为1μm的DFX加α-生育酚(vE)处理，导致TBARS释放减少20-30％。当将切片与封装有0.5mcM DFX和vE的hAdTMSC-氧化还原体共同孵育时，TBARS产量减少了50-60％。
实施例12：氧化还原体的体外效能测定
将源自XCL-1DCXp-GFP的神经祖细胞(
Figure BDA0002802844900000151
ACS-5005)与诱导ROS的芬顿试剂一起孵育。对于LPO测量，作为细胞/组织损伤的选择性标记，以评估氧化还原体治疗的可行性，将己烷异丙醇–HIP(3/2按体积计)提取物的等分试样蒸发至干并溶于甲醇中，用于脂质过氧化物的微量测定。测定醛类脂质过氧化产物：丙二醛和4-羟基壬烯醛。向孵育培养基的0.5ml等分试样添加等体积的硫代巴比妥酸(50％冰醋酸中含0.34％TBA)。在水浴中沸腾10分钟后，发出带有535nm激发波长和553-发射波长的荧光的玫瑰色。并行运行适当的标准曲线(1,1,3,3-四乙氧基丙烷，Sigma)。为了测量体内实验后的组织LPO水平，将在体内实验后储存在-70℃的相关的脑、肝脏、肺、皮肤、肾冷冻组织切片在冰上在4℃的冷PBS中解冻；根据于组织来源清洗一次或两次。通过用含有0.01％w/v丁基化羟基甲苯(BHT，Sigma)的冷冰10％TCA提取来获得组织提取物。通过在冰上的高速匀浆器将组织进一步匀浆30秒，然后以3500Xg离心10分钟。测量提取后释放到上清液的丙二醛产物，对组织提取物上清液的等分试样进行LPO测试。在组织样品中，LPO表示为每湿重的TBA-反应性物质(TBARS)。
结果：
各种组织中的TBARS基础水平相似：在大鼠脑切片中为40-50pmol/g湿重，在肝脏中为60-80pmol/g湿重。在iPSC神经元前体中，通过芬顿反应(七水合硫酸亚铁(Sigma)0.1mM和0.2mM H2O2，20分钟)进行ROS诱导后，向条件培养基释放的LPO增加5至10倍。与含有七水合硫酸亚铁(Sigma)的骨髓氧化还原体的共同孵育抑制了LPO增加的40-80％。
用Concovalin A进行处理会引起肝脏中的LPO增加大约两倍，其中同时用源自人间充质脂肪组织的封装有5mcM的DFX和5mcMα-生育酚的氧化还原体进行处理可将LPO降至基础水平。
实施例13：RNA封装和电穿孔实验。
RBC：
从人血红细胞(RBC)制备生物体。优选地，从O组血液样品中收集RBC，然后通过离心和白细胞去除过滤器(日本Terumo)将其与血浆和白细胞分离。如上所述进行生物体提取步骤。使用Gene Pulser Xcell电穿孔仪(BioRad)(指数程序)在100μF的固定电容下用0.4cm的比色皿进行电穿孔实验。将从E9RBC获得的E12生物体在OptiMEM(ThermoFisherScientific)中稀释，并同4μg与AF647(ThermoFisher Scientific)缀合的葡聚糖进行混合，使总体积为200μl，将100μl生物体等分试样添加到每个比色皿中，并在150-250V冰上孵育15分钟。在形成聚集体的情况下，以在生物体颗粒形成期间的减少50％的能量通过额外的单脉冲超声处理进行解聚。为了测试封装效果，在将经电穿孔的生物体与5μg乳胶珠(ThermoFisher Scientific)孵育过夜后，进行葡聚糖-AF647的FACS测量。
脂肪组织来源的生物体：
制备RNA封装的脂肪组织来源的生物体粗品——从人脂肪组织的E6细胞培养物制备E8生物体并使用6秒的单脉冲和40％的能量和0.5mcg的RNA通过温和超声(以保持RNA完整性)进行封装。所获得的RNA封装的生物体的多分散指数PDI为548nm。将RNA封装的生物体进一步稀释十倍，然后再进行30秒脉冲超声，使得平均颗粒大小为450nm。通过Avant挤出机进行进一步的挤出是任选的，以达到100nm的大小，尤其是如果需要靶向肝脏时。
实施例14：生物体/RNA处理对人包皮成纤维细胞(HFF)培养物的生物活性。
进行MTT-a 3(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑细胞增殖测定(LifeTechnologies)以研究脂肪组织来源的加载了0.5mcg内置RNA/每生物体(源自如上文所述的E8细胞)的生物体对饥饿应激(血清剥夺)后的细胞活力的影响。简言之，将1×104个细胞/孔接种到96孔板中，并培养18～24h以达到90％铺满。附着后，将细胞用PBS冲洗两次，然后添加无血清培养基。在24小时收获无血清细胞和对照(10％血清)细胞。将细胞培养上清液丢弃，并将20μl MTT溶液添加到每个孔中(0.5mg/ml；Sigma Aldrich；Merck KGaA，Darmstadt，Germany)，然后将细胞进一步培养4小时。然后去除上清液并将200μl DMSO添加到每个孔中，轻微搅拌15分钟。然后检测490nm波长处的吸光度，每个孔重复4次，并计算平均值。在实验前24小时，进行从10％DMEM FBS到0％FBS的FBS饥饿后，与无血清样品相比(其中活力降低至大概30％)，用生物体处理的样品对HFF的相同增殖效果与阳性对照(10％FBS)类似。
实施例15：HFK的体外划痕测定
通过上述方法，从原代人包皮角质形成细胞-HFF细胞制备生物体。HFK用作伤口愈合模型体外功能性测定的细胞。在第1天，将细胞从原代储液(stock)(P0-1)中解冻并在补充有5％FBS(优选地，被证明为耗尽的外泌体)和1％Glutamax的常规培养基上培养P1-2。在第2-3天，扩展传代培养以达到铺满用于实验。然后将细胞通过分进直径为1.4cm的12-孔插入物而重新接种在1.5％的FBS上，该插入物具有直径为3μm的密度为2×106/cm2(Greiner)孔或6孔板(Corning)(取决于划痕测定试剂盒方案)，或每张0.75cm x 0.95cm的8室玻片(Nunc)。在第4天(传代培养后～1天)，将FBS降低至0.5％，保持12小时。结合通过玻璃巴斯德(Pasteur)吸管或试剂盒型模板进行的划痕测定，过夜进行完全FBS饥饿(Cytoselect伤口愈合测定，Cell Biolabs Incorporated，CBA-120)。用5％FBS处理细胞(一式四份或一式三份)，并在FBS饥饿之前的所有调整过程中留作阳性对照，将未经生物体处理的相同数目的孔用作阴性对照。收集用作饥饿期间释放的活性生物体/外泌体的来源的条件培养基，然后用HBSS和Hepes冲洗之后添加生物体。以细胞数相对于阳性对照的百分比进行细胞计数。
结果：
补充5％FBS的阳性对照在24小时达到完全的划痕闭合。未经处理的细胞在完全饥饿和划痕应激下停止生长，并在24小时凋亡。划痕后12小时对活细胞进行计数。在10sup5用HFF的生物体进行处理可达到阳性对照的60-75％。从HFF和第4代HFK的RNA制备的相同剂量的生物体造成相同的细胞数。具有所有剂量的HFK RNA的HFF生物体以与阳性对照相同的速率在24小时完全闭合划痕。没有10sup3的HFK RNA的HFF生物体中仍然可见划痕痕迹，具有HFF RNA的HFF生物体的表现类似于无高剂量的RNA的HFF。
实施例16：测试氧化还原体在肝脏纤维化体内模型中的肝脏保护效果的初步研究。
为了将生物体和氧化还原体开发为可选的肝脏保护处理物，选择Concovalin A(ConA)诱导的肝脏坏死作为病理性体内模型。为了体内测试生物体和氧化还原体的功效，将研究开始时的10-11周龄的SD大鼠(n＝36)分为3组，每组12只。另一组六只动物用于生物分布初步研究。ConA注射后，对照组用PBS处理；计算生物体和氧化还原体的肝脏保护效果并表示为对照的百分比。向所有动物静脉内注射20mg/kg的ConA以诱导与未经处理的基础动物相比的肝脏损伤。ConA施用后，静脉内注射单剂量的、带有荧光标记的神经酰胺BioDipy的E5生物体。因为已经知道炎症位点的脂质过氧化会影响货物在靶位点的释放，所以选择BoDipy神经酰胺作为脂质传感物(sensor)。ConA和生物体BioDipy注射后八小时，将来自生物分布研究的大鼠处死。
结果：
在肝脏、肾和肺中注射后2小时看到强荧光。肝脏是生物体BioDipy的主要靶器官。为了监测急性肝脏损伤的功能参数，在所有组中注射ConA后8小时测量丙氨酸转氨酶(ALT)的血液水平。ConA对照组的ALT水平范围在300到1000单位/升，而ALT的基础水平低于100单位/升。通过苏木精和曙红(H&E)染色检查肝脏坏死。为了进行组织学检查，在分级乙醇脱水后，修剪每只动物的一块肝脏并将其浸入在10％的福尔马林缓冲液中固定24小时。进一步地，将这些块包埋在石蜡中。将系列3mm切片用H&E染色。组织病理学评分的评估由两名“盲评”病理学家简化为三个等级：0基础/健康；1低至中度损害；3中毒至组织坏死。用氧化还原体和生物体处理的大多数动物被评为为2分，证明了在急性和慢性肝脏病理模型中进一步取决于剂量和时间的保护肝脏可行性。
实施例17：测试氧化还原体在肝脏纤维化体内模型中的肝脏保护效果的初步研究。
使用各种细胞培养物和起始提取细胞原料(从2E3至E9细胞)从干细胞、细胞系、以及植物细胞源的分化细胞和培养细胞来制备生物体。发现生物体颗粒的产量与开始细胞数相关，并且E6-E12生物体颗粒不同。使用多种工业干燥方法，包括标准转子蒸发、氮气和氩气蒸发以及冷冻干燥。通过多种方法获得类似的产量和颗粒大小分布。细胞生长在粘附培养物(adhesive culture)上，诸如所有使用过的干细胞、HFF、HFK、HepG2、原代细胞、烟草细胞和Jurkat(ATCC；克隆E6-1)，其都是生长在生物反应器中的表达CD3的T淋巴细胞。在亲水性赋形剂缓冲液中，在超声步骤之前或在挤出期间(根据需要)，添加相关的货物。为了提高封装效率，当从骨髓干细胞制备时，相隔至少24小时进行三次冷冻融化循环，使得颗粒大小<500nm。图10A展示了较不均匀的但仍在QC规范下的颗粒大小数据。
使用药品级、USP级、纯度>90％或分析级的溶剂。从收集的、液氮保存的、冲洗两次以去除FBD的或/和含DMSO的冷冻保存培养基、解冻的沉淀物中提取生物体颗粒。从新鲜的沉淀物以及通过从各种粘附培养细胞层(以避免胰蛋白酶应激)、从干细胞、基质和上皮细胞以及从原代细胞、永生化的和细胞系直接提取来进行生物体提取。从人脂肪组织分离的MSC获得具有代表性均匀颗粒大小的>E9生物体颗粒，如图10B所示。发现HIP 3:2是最佳的溶剂系统。它与RNAsave或不含RNAse的无菌水以2:1一起使用，以在单一步骤中共沉淀RNA。回收纯RNA，通过Nanodrop测量浓度以确保纯度并测试完整性。表1示出了通过与生物体颗粒浓度相关的方法所分离的RNA的典型浓度，以每细胞数和细胞重量标准化：
产量参数 RNA总提取 颗粒数
细胞数 ～1-10mcg/E6 E9/E6
细胞湿重 1.2mcg/mg wwt E8/mg wwt
通过类似的过程和额外的冲洗步骤从条件培养基制备生物体。在收集生物体之前，用HBSS和Hepes冲洗细胞。在FBS耗尽的条件下，收集到高产量的RNA。
各种分子被用作货物：抗坏血酸、去铁胺和EDTA-作为小分子亲水性货物的模型；RNA和绿色荧光素蛋白-作为生物分子；神经酰胺、生育酚、二十二碳六烯酸酯、鞘磷脂和萜烯-作为生物活性脂质样品。生物活性脂质封装的具有生物膜修饰和复杂货物的氧化还原体的代表性颗粒大小通常导致颗粒大小在平均大小0.5-3微米之间。
实施例18：RNA封装和电穿孔实验。
为了证明生物体是RNA转染和递送的可行载体，从人血红细胞RBC制备生物体。从O组血液样品中收集RBC，然后通过使用离心和白细胞去除过滤器(Terumo日本)将RBC与血浆和白细胞分离。如上所述进行生物体提取步骤。进行电穿孔校准，以便进一步通过经验证的阳性对照将纯化的寡核苷酸转移到生物体中。使用Gene Pulser Xcell电穿孔仪(BioRad)指数程序以100μF的固定电容用0.4cm比色皿进行电穿孔实验。将从E9RBC获得的E12生物体稀释在OptiMEM(ThermoFisher Scientific)中，并同4μg与AF647(ThermoFisherScientific)缀合的葡聚糖混合，总体积为200μl，将100μl的生物体等分试样添加到每个比色皿中并在150-250V在冰上孵育15分钟。在形成聚集体的情况下，以比如上的生物体颗粒形成期间减少50％的能量，通过额外的单脉冲超声处理进行解聚。为了测试封装效果，在将经电穿孔的生物体与5μg乳胶珠(ThermoFisher Scientific)孵育过夜后，进行葡聚糖-AF647的FACS测量。
另外，制备RNA封装的脂肪组织来源的生物体粗品并且然后封装—从人脂肪组织的E6细胞培养物制备E8生物体并使用6秒单脉冲和40％的能量和0.5mcg的RNA通过温和超声(以保持RNA完整性)进行封装。获得的RNA封装的生物体的多分散指数PDI为548nm。将RNA封装的生物体颗粒进一步稀释十倍，然后再进行30秒脉冲超声，使得平均颗粒大小为450nm。通过Avant挤出机的进一步挤出导致平均颗粒大小为100nm，特别是对于肝脏靶向。通过在相同步骤的有效总RNA分离来验证方法的稳健性(robustness)，并从条件培养基获得类似产量的RNA。
实施例19：生物体/RNA处理对人包皮成纤维细胞(HFF)培养物的生物活性。
进行MTT-a 3(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑细胞增殖测定(LifeTechnologies)以研究脂肪组织来源的加载了0.5mcg内置RNA/每生物体(源自如上文所述的E8细胞)的生物体对饥饿应激(血清剥夺)后的细胞活力的影响。将1×104个细胞/孔接种到96孔板中，并培养18～24h以达到90％铺满。附着后，将细胞用PBS冲洗两次，然后添加无血清培养基。在24小时收获无血清细胞和对照(10％血清)细胞。将细胞培养上清液丢弃，并将20μl MTT溶液添加到每个孔中(0.5mg/ml；Sigma Aldrich；Merck KGaA，Darmstadt，Germany)，然后将细胞进一步培养4小时。然后去除上清液并将200μl DMSO添加到每个孔中，轻微搅拌15分钟。然后检测490nm波长处的吸光度，每个孔重复4次，并计算平均值。在实验前24小时，进行从10％DMEM FBS到0％FBS的FBS饥饿后，与无血清样品相比(其中活力降低至大概30％)，用生物体处理的样品对HFF的相同增殖效果与阳性对照(10％FBS)类似。
实施例20：稳定性概念验证结果。
为了测试生物体稳定性设计的可行性，如上所述制备骨髓和其他各种源细胞来源的生物体，并在各种温度超声处理之后，4℃储存一天、一周和一月；-70℃储存在Revco中。使用NanoSight Tracking Analysis NS300系统(Malvern英国)对EV的浓度和大小分布进行定量。图3A-C表示颗粒大小的实例。其表明短期(不到一周)储存对颗粒浓度没有影响，在4℃储存一月后颗粒浓度会聚集。在-70℃冷冻后，样品的稳定性不受影响。值得注意的是，在-70℃预超声的生物体与在相同水平的在颗粒大小测量之前重复超声的生物体稳定一样也是稳定的。
本文所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明。如本文所用，单数形式“a”、“an”和“the”也意图包括复数形式，除非上下文明确指示并非如此。应该进一步理解的是，当用在本说明书中时，术语“包含”或“包括”指明存在多个所陈述的特征、整数、步骤、操作、元件、组分和/或组或其组合，但不排除存在或添加一或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、组分和/或组或其组合。如本文所用，术语“含有(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“涵盖(including)”、“具有(having)”以及他们的缀合词意指“包括但不限于”。术语“由……组成(consisting of)”是指“包括并限于”。
如本文所用，术语“和/或”包括任何和所有可能的组合或相关联的所列项目中的一个或多个、以及当在择一(“或”)中解释时缺乏组合。
如本文所用，术语“外泌体”是指膜来源的微囊泡，其包括一系列细胞外囊泡，包括外泌体、微粒和脱落的微囊泡、脱落的微囊泡、癌体(oncosome)、核外粒体，由多种细胞类型在正常生理和病理症状下分泌的并且可以应用于所有大小的细胞内囊泡、植物分泌组囊泡、微生物组和逆转录病毒样颗粒。
除非另有定义，否则本文所用的所有术语(包括技术和科学术语)具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。将进一步理解的是，诸如在常用词典中使用的那些术语应被解释为具有与其在说明书和权利要求书的上下文中的含义一致的含义，并且不应以理想化或过于正式的意思来解释，除非本文如此定义。为简洁和/或清楚起见，众所周知的功能或结构可能未予详细描述。
将理解的是，当元件被指为在另一元件“上”、“附着”到另一元件、“连接”到另一元件、“耦接”另一元件、“接触”另一元件等时，它可以直接在另一元件上、附着到另一元件、连接到另一元件、耦接另一元件和/或接触另一元件或也可存在介于中间的元件。相反，当元件被指为例如“直接在另一元件上”、“直接附着”到另一元件、“直接连接”到另一元件、“直接耦接”另一元件或“直接接触”另一元件时，不存在介于中间的元件。本领域技术人员还将理解的是，提及与另一特征“相邻”设置的结构或特征可以具有与相邻特征重叠或位于其下的部分。
将理解的是，尽管在本文中可以使用术语第一、第二等来描述各种元件、组分、区域、层和/或区段，但是这些元件、组分、区域、层和/或区段不应被这些术语限制。更确切地说，这些术语仅用于与另一元件、组分、区域、层和/或区段对一个元件、组分、区域、层和/或区段进行区分。
为清楚起见，在单独的实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单一实施方案中组合提供。相反地，为简洁起见，在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征，也可以单独地或以任何合适的子组合或在本发明的任何其他所描述的实施方案中合适地提供。在各种实施方案的上下文中描述的某些特征不应被认为是那些实施方案的必要特征，除非该实施方案在没有那些要素的情况下不可操作。
无论何时使用术语“约”，其旨在指可测量的值诸如量、时间持续等，并且旨在涵盖相对于指定值的±25％、±20％、±10％、±5％、±1％或±0.1％的变化，因为此类变化适合于进行所公开的方法。
贯穿本申请，本发明的各种实施方案可以以范围格式展现。应当理解的是，以范围格式的描述仅是为了方便和简洁而不应被构建为对本发明范围的不可改变的限制。因此，对范围的描述应被认为已具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，对诸如从1至6的范围的描述应被认为已具体公开了诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等的子范围、以及该范围内的单个数值，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的宽度如何，这都适用。
无论数范围在本文中如何指示，其旨在包括在指示范围内任何引用的数(分数的或整数的)。短语“在第一指示数与第二指示数之间的范围”和“从第一指示数到第二指示数的范围”在本文中可互换地使用，并且旨在包括第一指示数和第二指示数以及他们之间的所有分数和整数。
如本文所用，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和过程，包括但不限于：化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域从业人员已知的那些方式、手段、技术和过程；或由这些从业人员易于从已知的方式、手段、技术和过程开发的那些方式、手段、技术和过程。
“患者”或“对象”意指包括任何哺乳动物。如本文所用，“哺乳动物”是指被分类为哺乳动物的任何动物，包括但不限于：人、实验动物(包括猴子、大鼠、小鼠和豚鼠)、家畜和农场动物、和动物园动物、运动(sports)动物或宠物动物，诸如狗、马、猫、牛等。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入本文。在存在冲突的情况下，以定义的专利说明书为准。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的，并不意图限制。
本领域技术人员将理解的是，本发明不限于上文已经具体示出和描述的内容。更确切地说，本发明的范围由所附权利要求限定，并且包括上文描述的各种特征的组合和子组合二者以及其变化和修改，这对于阅读前述说明后的本领域技术人员来讲是可以发生的。

Claims (53)

1.一种包含细胞膜组分并被设计为与靶细胞进行融合的人造生物体颗粒，其中所述生物体颗粒被工程化以携带包含至少一个预定的活性分子的货物；并且其中在所述生物体颗粒与所述靶细胞融合后，所述货物能够释放进所述靶细胞中；并且其中所述细胞膜组分源自所选的细胞来源或细胞外来源。
2.权利要求1的生物体颗粒，其中所述货物包含至少两个活性分子。
3.权利要求1或2的生物体颗粒，其中所述货物包含多个活性分子。
4.权利要求1至3中任一项的生物体颗粒，其中所述来源选自：成纤维细胞、间充质干细胞、干细胞、免疫系统细胞、树突状细胞、外胚层、角质形成细胞、GI细胞、口腔细胞、鼻粘膜细胞、神经元细胞、视网膜细胞、内皮细胞、心球样细胞团、心肌细胞、周细胞、血细胞、黑素细胞、实质细胞、肝脏储备细胞、神经干细胞、胰腺干细胞、胚胎干细胞、骨髓、皮肤组织、肝脏组织、胰腺组织、生物流体、排泄物或手术提取的组织、乳、唾液、粘液、血浆、尿液、粪便、皮脂、产后脐带、胎盘、羊膜囊、肾脏组织、神经组织、肾上腺组织、粘膜上皮、平滑肌组织、细菌细胞、细菌培养物、全微生物、条件培养基、羊水、脂肪抽吸物、吸脂副产物和植物组织。
5.权利要求1至4中任一项的生物体颗粒，其中所述活性分子选自：核酸、肽、氨基酸、多肽、核苷、生长因子、有机分子、多酚、类固醇、亲脂性难溶药物、无机分子、抗氧化剂、激素、抗体、维生素、细胞因子、酶、热休克蛋白、或其组合。
6.权利要求5的生物体颗粒，其中所述活性分子选自大麻素、大麻素酸和内源性大麻素。
7.权利要求5或6的生物体颗粒，其中大麻素、大麻素酸和内源性大麻素选自四氢大麻酚酸(THCa)、大麻二酚酸(CBDa)、大麻酚酸(CBNa)、大麻色烯酸(CBCa)、四氢大麻酚(THC)、大麻酚(CBN)、大麻二酚(CBD)和大麻色原烯(CBC)、以及酰基乙醇酰胺。
8.权利要求5的生物体颗粒，其中所述核酸是核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。
9.权利要求8的生物体颗粒，其中所述核酸是RNA，并且选自siRNA、反义RNA、iRNA、微小RNA、微小RNA阻断剂、适体和核酶mRNA。
10.权利要求1至9中任一项的生物体颗粒，其中所述活性分子具有治疗作用。
11.权利要求10的生物体颗粒，其中所述治疗作用选自抗炎作用、抗纤维化作用、抗肿瘤作用和神经保护作用。
12.权利要求1至11中任一项的生物体，所述生物体是氧化还原体，其中所述货物包含至少一种氧化还原活性的自由基清除化合物。
13.权利要求12的氧化还原体，其包含芬顿反应复合物阻断剂、羟基自由基捕获剂、铁螯合剂和脂质自由基捕获剂。
14.权利要求12或11的氧化还原体，其能够阻断LPO链反应，诸如脂质自由基/过氧化物捕获剂，诸如维生素E、萜烯类、多酚、类黄酮、酚酸类、大麻素类、类维生素A、维生素D、硫辛酸、固醇类。
15.权利要求13或14的氧化还原体，其中自由基捕获剂为抗坏血酸、一氧化氮供体(S-亚硝基谷胱甘肽)、或其衍生物。
16.权利要求12至15中任一项的氧化还原体，其中所述铁螯合剂选自：去铁胺(DFX)、乙二胺四乙酸(EDTA)、芦丁、EDTA二钠、EDTA四钠、EDTA钙二钠、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或其盐、羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)或其盐、次氮基三乙酸(NTA)、乙酰柠檬酸三己酯、氨基三亚甲基膦酸、β-丙氨酸二乙酸、柠檬酸铋、柠檬酸、环己二胺四乙酸、柠檬酸二铵、草酸二丁酯、草酸二乙酯、草酸二异丁酯、草酸二异丙酯、草酸二锂、草酸二甲酯、EDTA二钾、草酸二钾、草酸二丙酯、EDTA铜二钠、焦磷酸二钠、依替膦酸、HEDTA、甲基环糊精、草酸、三聚磷酸钾、氨基三亚甲基膦酸五钠、喷替酸五钠、三聚磷酸钠、喷替酸、二元羧酸、植酸、柠檬酸钾、柠檬酸钠、二羟乙基甘氨酸钠、葡庚糖酸钠、葡萄糖酸钠、六偏磷酸钠、偏磷酸钠、偏硅酸钠、草酸钠、三偏磷酸钠、tea-EDTA、四羟丙基乙二胺、羟乙磷酸四钾、焦磷酸四钾、羟乙膦酸四钠、焦磷酸四钠、EDTA三钾、EDTA三钠、HEDTA三钠、NTA三钠、磷酸三钠、苹果酸、富马酸、麦芽酚、二巯丁二酸、青霉胺、二巯基丙醇、去铁酮、基于天然蛋白质的铁螯合剂、褪黑素、铁载体、锌或铜阳离子、或盐或复合物、以及去铁胺甲磺酸或其组合。
17.权利要求16的氧化还原体，其中所述铁螯合剂选自：EDTA(乙二胺四乙酸)、DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)、NTA(次氮基三乙酸)、去毒胺、去铁胺、去铁酮、地拉罗司、谷胱甘肽、金属蛋白、铁螯合物(双-甘氨酸盐螯合物)、铜蓝蛋白、青霉胺、铜宗、曲恩汀、阿魏酸、乙酸锌、脂质运载蛋白2和二巯基丙醇。
18.权利要求1至17中任一项的生物体颗粒，其为长循环缓释生物体。
19.权利要求1至18中任一项的生物体颗粒，其为选择性靶向生物体。
20.权利要求1至19中任一项的生物体颗粒，其为免疫原性生物体。
21.一种包含权利要求1至20中任一项的生物体颗粒和至少一种载体的组合物。
22.权利要求21的组合物，其中所述组合物是药物组合物，并且所述载体是药学上可接受的载体。
23.权利要求21或22的组合物，其中所述组合物适合于口服、静脉内、皮下、腹膜内、舌下、组织内、通过组织插入的植入物施用、鞘内、肌肉内、局部、眼、鼻内、直肠、阴道、肺、透粘膜和透皮施用。
24.权利要求21的组合物，其中所述组合物是药物化妆品组合物，并且所述载体是药物化妆品上可接受的载体。
25.权利要求21的组合物，其中所述组合物是可食用组合物，并且所述载体是食品级载体。
26.一种用于制造包含多个生物体颗粒的样品的方法，其中所述生物体颗粒被工程化以携带包含至少一个活性分子的货物，并且被设计为与靶细胞进行融合以释放所述货物；并且其中所述生物体颗粒包含源自所选的细胞来源或细胞外来源的细胞膜组分；所述方法包含：
a.在温和溶剂系统中从所选细胞来源或细胞外来源进行总细胞脂质提取，以获得脂质提取物；
b.干燥所述脂质提取物；以及
c.通过进行至少一步的超声处理来诱导生物体颗粒的自组装；
其中，所述样品中的所得生物体颗粒的特征在于平均颗粒大小为约0.03μm至5μm。
27.权利要求26的方法，其中所述平均颗粒大小为0.05μm至3μm。
28.权利要求27的方法，其中所述平均颗粒大小为0.08μm至1.5μm。
29.权利要求26至28中任一项的方法，其中包含所述生物体颗粒的样品具有的pH为3.5至5.5。
30.权利要求29的方法，其中包含所述生物体颗粒的样品具有的pH为4.5至5。
31.权利要求26至30中任一项的方法，其中所述温和溶剂系统包含极性溶剂和非极性溶剂的混合物。
32.权利要求31中任一项的方法，其中所述溶剂系统中的极性溶剂选自：异丙醇、乙醇、正丁醇、以及水饱和的正丁醇。
33.权利要求31或32中任一项的方法，其中所述溶剂系统中的非极性溶剂选自：己烷、来自萜烯组的溶剂、和超临界CO2提取。
34.权利要求33的方法，其中所述溶剂系统中的非极性溶剂是正己烷。
35.权利要求33的方法，其中所述来自萜烯组的溶剂选自：d-柠檬烯、α-蒎烯和对伞花烃。
36.权利要求31至34中任一项的方法，其中所述溶剂系统中的所述极性溶剂是异丙醇，并且所述非极性溶剂为正己烷。
37.权利要求26至36中任一项的方法，其中所述溶剂系统还包含稳定剂。
38.权利要求37的方法，其中所述稳定剂是丁基羟基甲苯(BHT)或脂质自由基捕获剂。
39.权利要求26至38中任一项的方法，其中所述溶剂系统进一步包含抗氧化剂、表面活性剂、维生素E、角鲨烯、胆固醇、或其组合。
40.权利要求26至39中任一项的方法，进一步包含核酸共沉淀的步骤。
41.权利要求40的方法，其中所述核酸是核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。
42.权利要求41的方法，其中所述核酸是RNA。
43.权利要求26至42中任一项的方法，其中用于总脂质提取的所述细胞来源或细胞外来源选自：成纤维细胞、间充质干细胞、干细胞、免疫系统细胞、树突状细胞、外胚层、角质形成细胞、GI细胞、口腔细胞、鼻粘膜细胞、神经元细胞、视网膜细胞、内皮细胞、心球样细胞团、心肌细胞、周细胞、血细胞、黑素细胞、实质细胞、肝脏储备细胞、神经干细胞、胰腺干细胞、胚胎干细胞、骨髓、皮肤组织、肝脏组织、胰腺组织、产后脐带、胎盘、羊膜囊、肾脏组织、神经组织、肾上腺组织、粘膜上皮、平滑肌组织、细菌细胞、细菌培养物、全微生物、条件培养基、羊水、脂肪抽吸物、吸脂副产物和植物组织。
44.权利要求26至43中任一项的方法，其中从细胞条件培养基、冻干条件细胞培养基、细胞沉淀物、冷冻细胞、干燥细胞、经冲洗的细胞块、非粘附性细胞悬浮液和粘附细胞层进行所述脂质提取。
45.权利要求44的方法，其中所述粘附细胞层在选自(多用)烧瓶、培养皿、支架、珠和生物反应器的细胞培养塑料器具中生长。
46.一种样品，其包含根据权利要求26至45中任一项的方法所制备的多个生物体颗粒。
47.一种在需要此种治疗的对象中治疗或预防病理的方法，其包含向所述对象施用权利要求21至23中任一项的药物组合物。
48.权利要求47的方法，其中所述病理选自炎症性疾病、神经疾病、感染性疾病、恶性肿瘤、免疫系统疾病和自身免疫疾病。
49.一种在需要的对象中改善皮肤状况的方法，其包含向所述对象施用权利要求21至24中任一项的组合物。
50.权利要求49的方法，其中所述组合物是局部施用的。
51.权利要求19至31中任一项的生物体颗粒作为将活性分子递送至靶位点的运载体的用途。
52.权利要求1至20中任一项的生物体颗粒，其用作药物。
53.权利要求19至31中任一项的生物体颗粒，其用于治疗炎症性疾病、神经疾病、感染性疾病、恶性肿瘤、免疫系统疾病和自身免疫疾病。
CN201980035986.7A 2018-04-09 2019-04-04 生物体颗粒、氧化还原体、方法和组合物 Pending CN112739332A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862654771P 2018-04-09 2018-04-09
US62/654,771 2018-04-09
US201962794859P 2019-01-21 2019-01-21
US62/794,859 2019-01-21
PCT/IL2019/050391 WO2019198068A1 (en) 2018-04-09 2019-04-04 Bioxomes particles, redoxomes, method and composition

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112739332A true CN112739332A (zh) 2021-04-30

Family

ID=68163380

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980035986.7A Pending CN112739332A (zh) 2018-04-09 2019-04-04 生物体颗粒、氧化还原体、方法和组合物

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20210052506A1 (zh)
EP (1) EP3773520A4 (zh)
JP (1) JP2021521141A (zh)
KR (1) KR20200141080A (zh)
CN (1) CN112739332A (zh)
AU (1) AU2019251449A1 (zh)
BR (1) BR112020020831A2 (zh)
CA (1) CA3096448A1 (zh)
IL (1) IL277728A (zh)
SG (1) SG11202009788TA (zh)
WO (1) WO2019198068A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115531369A (zh) * 2021-06-30 2022-12-30 采翼生医股份有限公司 用于缓解肾脏疾病与器官纤维化的方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL295166A (en) * 2020-01-28 2022-09-01 Orgenesis Inc A system for extracellular therapy and a procedure for its preparation
IL296612A (en) * 2020-03-20 2022-11-01 Orgenesis Inc Ribonucleases for the treatment of viral infections
WO2022204350A1 (en) * 2021-03-24 2022-09-29 Orgenesis Inc. Compositions comprising topiramate for treating dermatological conditions

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2062468C1 (ru) * 1992-05-21 1996-06-20 Онкологический научный центр РАМН Способ экстракции и разделения клеточных липидов
WO2010144740A1 (en) * 2009-06-10 2010-12-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Improved lipid formulation
WO2013052167A2 (en) * 2011-06-02 2013-04-11 The Regents Of The University Of California Membrane encapsulated nanoparticles and method of use

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5428008A (en) * 1989-04-14 1995-06-27 Prp, Inc. Therapeutic composition of micellar structures capable of promoting hemotasis
US5462752A (en) * 1994-07-28 1995-10-31 Prp, Inc. Inhibition of platelet binding
US6133322A (en) * 1998-10-29 2000-10-17 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Quinone derivatives for treating or preventing diseases associated with iron overload
NZ553910A (en) * 2004-08-26 2009-05-31 Engeneic Molecular Delivery Pty Delivering functional nucleic acids to mammalian cells via bacterially derived, intact minicells
JP2011517279A (ja) * 2007-10-29 2011-06-02 ユニバーシティ オブ マサチューセッツ 核酸（ｓｉＲＮＡ）送達用の酵母細胞壁粒子（ＹＣＷＰ）多層状ナノ粒子
SG10202010355PA (en) * 2010-03-12 2020-11-27 Berg Llc Intravenous formulations of coenzyme q10 (coq10) and methods of use thereof
US9119974B2 (en) * 2011-03-04 2015-09-01 Ahmed H. Al-Qahtani Skin cream
EP2729217B1 (en) * 2011-07-07 2018-05-30 Howard Foundation Holdings Limited Method for improving glare disability
US11559580B1 (en) * 2013-09-17 2023-01-24 Blaze Bioscience, Inc. Tissue-homing peptide conjugates and methods of use thereof
CN111206032A (zh) * 2013-12-12 2020-05-29 布罗德研究所有限公司 用于基因组编辑的crispr-cas系统和组合物的递送、用途和治疗应用
AU2016279062A1 (en) * 2015-06-18 2019-03-28 Omar O. Abudayyeh Novel CRISPR enzymes and systems
SG10202108306UA (en) * 2016-01-29 2021-08-30 Oncoceutics Inc G protein-coupled receptor (gpcr) modulation by imipridones
IT201700043316A1 (it) * 2017-04-20 2018-10-20 Lipogems Int S P A Drug delivery system
KR20200044806A (ko) * 2017-07-28 2020-04-29 내셔널 유니버시티 오브 싱가포르 변형된 유령 세포를 포함하는 생물분자 복합체
KR102015116B1 (ko) * 2018-05-04 2019-10-21 (주)메디톡스 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물로부터 유래한 세포외 소낭 및 그의 용도
IL296612A (en) * 2020-03-20 2022-11-01 Orgenesis Inc Ribonucleases for the treatment of viral infections

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2062468C1 (ru) * 1992-05-21 1996-06-20 Онкологический научный центр РАМН Способ экстракции и разделения клеточных липидов
WO2010144740A1 (en) * 2009-06-10 2010-12-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Improved lipid formulation
WO2013052167A2 (en) * 2011-06-02 2013-04-11 The Regents Of The University Of California Membrane encapsulated nanoparticles and method of use

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115531369A (zh) * 2021-06-30 2022-12-30 采翼生医股份有限公司 用于缓解肾脏疾病与器官纤维化的方法
CN115531369B (zh) * 2021-06-30 2024-03-08 采翼生医股份有限公司 用于缓解肾脏疾病与器官纤维化的方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20210052506A1 (en) 2021-02-25
WO2019198068A1 (en) 2019-10-17
CA3096448A1 (en) 2019-10-17
BR112020020831A2 (pt) 2021-04-13
SG11202009788TA (en) 2020-10-29
JP2021521141A (ja) 2021-08-26
IL277728A (en) 2020-11-30
EP3773520A4 (en) 2021-12-22
AU2019251449A1 (en) 2020-11-12
KR20200141080A (ko) 2020-12-17
EP3773520A1 (en) 2021-02-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112739332A (zh) 生物体颗粒、氧化还原体、方法和组合物
Aqil et al. Milk exosomes-Natural nanoparticles for siRNA delivery
LoPresti et al. The replacement of helper lipids with charged alternatives in lipid nanoparticles facilitates targeted mRNA delivery to the spleen and lungs
Fuhrmann et al. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect of porphyrins
McEwan et al. Combined sonodynamic and antimetabolite therapy for the improved treatment of pancreatic cancer using oxygen loaded microbubbles as a delivery vehicle
Zeng et al. Carbon dots as a trackable drug delivery carrier for localized cancer therapy in vivo
Munagala et al. Bovine milk-derived exosomes for drug delivery
Chang et al. RGD-modified pH-sensitive liposomes for docetaxel tumor targeting
Chen et al. Nonviral cell labeling and differentiation agent for induced pluripotent stem cells based on mesoporous silica nanoparticles
CN110152015A (zh) 负载抗肿瘤药物的人多能干细胞外泌体及其制备方法与用途
Gonçalves et al. Self-assembled dextrin nanogel as curcumin delivery system
Fang et al. Plant-derived extracellular vesicles as oral drug delivery carriers
Wang et al. Therapeutic potential of exosome‐based personalized delivery platform in chronic inflammatory diseases
Hercher et al. Extracellular vesicles and their role in peripheral nerve regeneration
Zhao et al. Multifunctional drug carrier based on PEI derivatives loaded with small interfering RNA for therapy of liver cancer
He et al. Intra-articular injection of lornoxicam and microRNA-140 co-loaded cationic liposomes enhanced the therapeutic treatment of experimental osteoarthritis
Dubey et al. PLGA nanoparticles augmented the anticancer potential of pentacyclic triterpenediol in vivo in mice
Riffault et al. PLGA-based nanoparticles: a safe and suitable delivery platform for osteoarticular pathologies
Lv et al. Nanosized drug delivery systems for breast cancer stem cell targeting
Wang et al. Comparison of extruded cell nanovesicles and exosomes in their molecular cargos and regenerative potentials
Azizsoltani et al. Obeticholic acid-loaded exosomes attenuate liver fibrosis through dual targeting of the FXR signaling pathway and ECM remodeling
Bai et al. Engineered urinary-derived extracellular vesicles loaded nanoenzymes as Trojan horses to regulate the inflammatory microenvironment for treatment of Alzheimer's disease
Zhao et al. Intranasal delivery of Borneol/R8dGR peptide modified PLGA nanoparticles co-loaded with curcumin and cisplatin alleviate hypoxia in pediatric brainstem glioma which improves the synergistic therapy
Shaikh et al. Bleomycin loaded exosomes enhanced antitumor therapeutic efficacy and reduced toxicity
Zhang et al. Enhanced antioxidation via encapsulation of isooctyl p-methoxycinnamate with sodium deoxycholate-mediated liposome endocytosis

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination