BR112020020831A2

BR112020020831A2 - Partículas de bioxomes, redoxomes, método e composição

Info

Publication number: BR112020020831A2
Application number: BR112020020831-0A
Authority: BR
Inventors: Sabina Glozman
Original assignee: Orgenesis Inc.
Priority date: 2018-04-09
Filing date: 2019-04-04
Publication date: 2021-04-13
Also published as: IL277728A; JP2021521141A; EP3773520A1; SG11202009788TA; WO2019198068A1; KR20200141080A; US20210052506A1; CA3096448A1; CN112739332A; AU2019251449A1; EP3773520A4

Abstract

partículas de bioxomes, redoxomes, método e composição. é prevista uma partícula de bioxome artificial compreendendo um componente de membrana celular e concebida para sofrer fusão com uma célula alvo, em que dita partícula de bioxome é modificada para transportar uma carga compreendendo pelo menos uma molécula ativa predeterminada; e em que dita carga pode ser liberada na célula alvo após a fusão da partícula de bioxome com a célula alvo; e em que o componente de membrana celular é derivado de uma fonte celular ou extracelular selecionada; métodos de uso das partículas; e processos para a fabricação das mesmas.

Description

PARTÍCULAS DE BIOXOMES, REDOXOMES, MÉTODO E COMPOSIÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A invenção refere-se a novas partículas de bioxome modificadas para entregar biomaterial ativo, métodos para sua preparação e usos das mesmas.

FUNDAMENTOS DA INVENÃO

[002] Exossomas são microvesículas de membrana de lipídeo secretadas e de ocorrência natural que transportam ácidos nucleicos e proteínas, permitindo comunicação intercelular por transferência destes materiais entre organelas celulares e entre as células. Exossomas são formados pela invaginação de vesículas endolisossomais que são liberadas extracelularmente após fusão com a membrana plasmática.

[003] Exossomas têm várias funções fisiológicas sob condições homeostáticas ou durante patologia de um estado doentio. As células liberam no ambiente extracelular diversos tipos de vesículas de membrana de origem de membrana endossomal e plasmática, chamadas exossomas e microvesículas (MV), respectivamente. Estas vesículas extracelulares (EVs), coletivamente, representam um modo importante de comunicação intercelular servindo como veículos para a transferência entre células de membrana e proteínas citossólicas, lipídeos e RNA.

[004] Lipídeos são um substrato particularmente valioso para FRs devido às múltiplas ligações duplas presentes nos ácidos graxos, especialmente ácidos graxos poliinsaturados (PUFA). Peroxidação de lipídeos (LPO) é um processo em cadeia, consistindo em três etapas principais: iniciação, propagação e terminação. O componente principal de membrana plasmática natural são fosfolipídeos polares (PL) que consistem de PUFA e, portanto, são vulneráveis ao estresse oxidativo. Tradicionalmente, LPO tem sido considerado como o processo principal que produz danos aos radicais de oxigênio levando à destruição da membrana, processos de degeneração e morte celular.

[005] A presença de material genético e proteína em exossomas naturais implica que o exossoma pode servir como um veículo para tais materiais biológicos. A estrutura de bicamada de membrana e núcleo aquoso, similar à do lipossoma, permite a entrega de seu conteúdo através de membranas celulares. Assim, exossomas têm grande potencial para servir como sistemas de entrega para vários biomateriais. Numerosas aplicações de exossomas e métodos para a preparação de exossomas são descritos em US 2004/0082511; US 5.428.008, US

5.165.938; US 2004/0082511; US 9/119.974; US 2013/0143314; US 2011/0014251; US 2013/0052647; WO2015110957; WO/2015/138878; US 20130209528; WO2009105044; US 8.138.147; US 8.518.879; US 8.138.147; US 2011/0003008; US 2013/0209528; US 2011/0003008; US 2013/0209528.

[006] Com base em suas características de fusão de membrana e direcionamento intracelular, exossomas prometem ser aplicados como Sistema de Entrega de Fármaco (DDS), a fim de superar necessidades não resolvidas atualmente usadas em DDS do estado da técnica: (i) instabilidade de gene ‘nu’ e entrega de ácidos nucleicos devido a enzimas extracelulares; (ii) DDS de vírus e lipossomas são reconhecidos pelo sistema imune do hospedeiro como partículas estranhas, resultando na geração de anticorpos contra eles e, desse modo, diminuindo a entrega e a segurança; (iii) a maioria dos fármacos naturais e terapêuticos ativos são de natureza hidrofóbica, portanto, propensos a LPO e apresentando baixa biodisponibilidade. Todos os descritos acima são os principais desafios a serem superados a fim de cumprir a promessa de exossoma-DDS (sistema de entrega de fármaco) para melhorar o rendimento da produção, carga de controle, estabilidade e composição, incluindo proteínas e DNA. Em adição, os métodos conhecidos atualmente para a produção de exossomas são complexos e de múltiplas etapas, o que limita sua aplicabilidade clínica como veículos de entrega para carga terapêutica. Assim, ainda existe uma necessidade de um método industrial simples, robusto e rentável, para a produção em larga escala de vesículas de membrana artificial inspiradas em exossoma que manterão a integridade máxima da membrana, estabilidade para reação de cadeia de LPO, e características naturais requeridas para seu uso como terapêuticos; veículos de entrega e ferramentas de pesquisa.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] Consequentemente, é um objetivo principal da presente invenção superar as desvantagens dos métodos e sistemas da técnica anterior para a produção em escala industrial de partículas artificiais do tipo exossomas que mantenham integridade máxima da membrana e modificadas para uso como veículos para entrega de biomoléculas ativas ou como agentes autônomos tendo múltiplas aplicações industriais.

[008] A invenção prevê uma partícula de bioxome artificial compreendendo um componente de membrana celular e concebida para passar por fusão com uma célula alvo, em que dita partícula de bioxome é modificada para transportar uma carga compreendendo pelo menos uma molécula ativa predeterminada; e em que dita carga pode ser liberada na célula alvo após a fusão da partícula de bioxome com a célula alvo; e em que o componente de membrana celular é derivado de uma fonte celular ou extracelular selecionada.

[009] A invenção prevê adicionalmente uma composição compreendendo uma partícula de bioxome artificial compreendendo um componente de membrana celular e concebida para sofrer fusão com uma célula alvo, em que dita partícula de bioxome é modificada para transportar uma carga compreendendo pelo menos uma molécula ativa predeterminada; e em que dita carga pode ser liberada na célula alvo após a fusão da partícula de bioxome com a célula alvo; e em que o componente de membrana celular é derivado de uma fonte celular ou extracelular selecionada e pelo menos um carreador.

[0010] A invenção prevê adicionalmente um processo para a fabricação de uma amostra compreendendo uma pluralidade de partículas de bioxome, em que as partículas de bioxome são modificadas para transportar uma carga compreendendo pelo menos uma molécula ativa e concebidas para sofrer fusão com uma célula alvo para liberar a carga; e em que ditas partículas de bioxome compreendem um componente de membrana celular derivado de uma fonte celular ou extracelular selecionada; o processo compreendendo: a. realizar extração de lipídeo da célula total a partir da fonte celular ou extracelular selecionada em um sistema solvente suave para obter um extrato de lipídeo; b. secar o extrato de lipídeo; e c. induzir a automontagem de partículas de bioxome para realizar pelo menos uma etapa de ultrassonicação; em que as partículas de bioxome resultantes na amostra são caracterizadas por um tamanho médio de partícula de em torno de 0,03 µm a 5 µm.

[0011] A invenção prevê adicionalmente um método de tratamento ou prevenção de uma patologia em um indivíduo em necessidade de tal tratamento, compreendendo administrar ao indivíduo a composição farmacêutica compreendendo uma partícula de bioxome artificial compreendendo um componente de membrana celular e concebida para sofrer fusão com uma célula alvo, em que dita partícula de bioxome é modificada para transportar uma carga compreendendo pelo menos uma molécula ativa predeterminada; e em que dita carga pode ser liberada na célula alvo após a fusão da partícula de bioxome com a célula alvo; e em que o componente de membrana celular é derivado de uma fonte celular ou extracelular selecionada, e pelo menos um carreador.

[0012] A invenção prevê adicionalmente um método de melhorar uma condição da pele em um indivíduo em necessidade compreendendo administrar ao indivíduo a composição compreendendo uma partícula de bioxome artificial compreendendo um componente de membrana celular e concebida para sofrer fusão com uma célula alvo, em que dita partícula de bioxome é modificada para transportar uma carga compreendendo pelo menos uma molécula ativa predeterminada; e em que dita carga pode ser liberada na célula alvo após a fusão da partícula de bioxome com a célula alvo; e em que o componente de membrana celular é derivado de uma fonte celular ou extracelular selecionada e pelo menos um carreador.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0013] Figura 1. Distribuição de tamanho de partículas de bioxome, como medida por instrumentos Malvern: A. imediatamente após o isolamento B. um mês após o isolamento;

[0014] Figura 2. Distribuição de tamanho de partícula de bioxome. A. distribuição de tamanho de partícula do bioxome medida pelo nano-analisador ZetaSizer. As medições pelo analisador são representadas com dois picos no histograma (eixo x representa tamanho de partícula). B. distribuição de tamanho de partícula do bioxome detectado pelo analisador de tamanho de partícula NanoSight. O eixo X representa tamanho de partícula em nm, o eixo y representa o número de partículas por ml. O painel da esquerda representa 3 medições da mesma amostra. O painel da direita representa as médias das 3 medições realizadas na esquerda;

[0015] Figura 3. Estabilidade dos bioxomes e distribuição de tamanho de partícula. São apresentados os perfis de distribuição de bioxome produzido a partir de 3 amostras diferentes. A. Amostra sem re-ultrassonicação. B. Amostra com re-ultrassonicação. C. Amostra após a liofilização e ultrassonicação;

[0016] Figura 4. Imagem de microscópio confocal de fusão de Bioxomes rotulados com BioDipy em cultura primária de Fibroblastos de Prepúcio Humano (HFF). Bioxomes produzidos a partir de três fontes de células variadas e diâmetro médio de tamanhos de partícula como medido 24 horas antes do experimento. A. Tamanho de partícula de Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana Primária (HUVEC)- ATCC®

PCS-100-010™: >90% ~1,4 mcn; B. Células Epiteliais Mamárias Humanas Primárias; ATCC® PCS-600-010™. Tamanho de partícula medido 24 horas antes do experimento: 40%-~300 nm; 60%: Tamanho de partícula 600; medido 24 horas antes do experimento -1 mcn nm. C. Fibroblastos NIH3T3; ATCC® CRL- 1658; Tamanho de partícula: >90% ~750 nm.;

[0017] Figura 5. Esquema geral de isolamento de partículas de bioxome de células aderentes;

[0018] Figura 6. Especificidade de partículas de bioxome para seu tecido alvo de origem. A. representação esquemática do procedimento. B. dados experimentais;

[0019] Figura 7. Representação esquemática de uma partícula de Redoxome;

[0020] Figura 8. Sensibilidade redox de partículas de redoxome por medição de formação de aduto POBN (espectros EPR) em duas concentrações diferentes de DHA, e na presença de α-Tocoferol;

[0021] Figura 9. A. Cinética de vazamento induzido por radical hidroxila de partículas de redoxome. B. Vazamento de calceína induzido por Triton a partir de partículas de redoxome; e

[0022] Figura 10. Capacidade de encapsulação de RNA. Bioxome encapsulado com RNA co-extraído produzido a partir de células-tronco mesenquimais humanas (MSCs) derivadas de medula óssea (PromoCell, C-12974), as medições de tamanho realizadas pelo analisador NanoSight. A. estabilidade de congelamento-descongelamento repetitivos (três vezes) como uma abordagem de intensificação de carga, uniformidade perdida, mas permanece na especificação de < 1,5 mcn. B. Encapsulação uniforme de RNA após ciclo único de congelamento-descongelamento e C. sem ciclo de congelamento- descongelamento medido logo após ultrassonicação/ encapsulação de RNA. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO.

[0023] A presente invenção é agora descrita mais completamente aqui abaixo com referência aos desenhos em anexo, em que modalidades da invenção são mostradas. Esta invenção pode, no entanto, ser realizada de muitas formas diferentes e não deve ser interpretada como limitada às modalidades descritas aqui; em vez disso, estas modalidades são dadas de modo que esta divulgação será minuciosa e completa e transmitirá completamente o escopo da invenção para os versados na técnica.

[0024] A invenção prevê uma partícula de bioxome artificial compreendendo um componente de membrana celular e concebida para sofrer fusão com uma célula alvo, em que dita partícula de bioxome é modificada para transportar uma carga compreendendo pelo menos uma molécula ativa predeterminada; e em que dita carga pode ser liberada na célula alvo após a fusão da partícula de bioxome com a célula alvo; e em que o componente de membrana celular é derivado de uma fonte celular ou extracelular selecionada. Como usado aqui, o termo “bioxome” refere-se, sem limitação, a uma nanopartícula artificial de tamanho submicrônico, tendo semelhança com vesículas extracelulares (EV) naturais. O tamanho de partícula do bioxome da invenção está na faixa de 0,03 µm a 5 µm. Em uma modalidade, o tamanho do bioxome é 0,1-0,7 µm; 0,1-0,5 µm, 0,2-0,5 µm; 0,3-0,5 µm. Em outra modalidade, o tamanho médio de partícula é 5 µm ou menos; 1,5 µm ou menos; 0,7 µm ou menos; 0,5 µm ou menos; 0,3 µm ou menos; 0,15 µm ou menos. Em uma modalidade, o tamanho médio de partícula é 0,5 µm a 1,5 µm. Em uma modalidade, o tamanho médio de partícula é 0,4 µm a 0,8 µm. Em outra modalidade, o tamanho médio de partícula é 0,3 µm a 0,5 µm. Em uma modalidade ainda adicional, o tamanho médio de partícula é 0,4 µm a 1,5 µm quando o tamanho de partícula é medido poucas horas após a preparação. Em ainda outra modalidade, o tamanho de partícula é 0,8 µm a 5 µm quando o tamanho de partícula é medido um mês após a preparação e partículas de bioxome são armazenadas a 0°C a -4°C.

[0025] Em uma modalidade, a partícula de bioxome é isenta de carga. Em ainda outra modalidade, a partícula está transportando uma carga compreendendo pelo menos uma molécula ativa. Em uma modalidade a carga compreende pelo menos duas moléculas ativas. Em outra modalidade, a carga compreende uma pluralidade de moléculas ativas. Como usado aqui, o termo “moléculas ativas” refere-se, sem limitação, a moléculas de sinalização, biomoléculas; material nucleico de modificação genética e tradução; ácidos deoxirribonucleicos (DNA); ácidos ribonucleicos (RNA); moléculas orgânicas; molécula inorgânicas; aminoácidos; vitaminas; polifenol, esteróide, fármaco lipofílico pouco solúvel, vasomoduladores; peptídeos; neurotransmissores e análogos dos mesmos; nucleosídeos; proteínas, incluindo sem limitação fatores de crescimento, hormônios, aptâmeros, anticorpos, citocinas, enzimas, e proteínas de choque térmico; ou quaisquer outras moléculas que podem exercer função biológica. Em uma modalidade, a molécula ativa é um canabinóide, ácido canabinóide e endocanabinóide. Em ainda outra modalidade, o canabinóide ou ácido canabinóide é selecionado dentre o grupo consistindo de ácido tetrahidrocanabinólico (THCa), ácido canabidiólico (CBDa), ácido canabinólico (CBNa) ácido canabicromênico (CBCa), tetrahidrocanabinol (THC), canabinol (CBN), canabidiol (CBD), e canabicromeno (CBC), e endocanabinóides e análogos dos mesmos.

De acordo com uma modalidade, o ácido nucleico é ácido ribonucleico (RNA) ou ácido deoxirribonucleico (DNA). De acordo com uma modalidade adicional, o ácido nucleico é RNA, e é selecionado dentre o grupo consistindo de siRNA, um RNA antisenso, iRNA, microRNA, um antagomir, um aptâmero, e um mRNA ribozima, ou qualquer combinação dos mesmos.

De acordo com uma modalidade, a molécula ativa tem um efeito terapêutico.

Como usado aqui, o termo “efeito terapêutico” refere-se, sem limitação, a(s) resposta(s) após um tratamento de qualquer tipo, cujos resultados são julgados como sendo úteis ou favoráveis.

Isto é verdade se o resultado foi esperado, inesperado, ou mesmo uma consequência não planejada.

Em uma modalidade, o efeito terapêutico é selecionado dentre o grupo consistindo de efeito anti- inflamatório, efeito antifibrótico, efeito antitumoral, e efeito neuroprotetor.

Uma lista não limitativa de carga selecionada para combater inflamação, fibrose, hiperglicólise, tal como nefropatia diabética, compreende compostos fenólicos onipresentes derivados naturalmente, tais como ácido ferúlico, fenóis naturais, por exemplo, resveratrol, rutina, quercetina, ácidos fenólicos, vitaminas, e alicina, canabinóides selecionados dentre o grupo consistindo de ácido tetrahidrocanabinólico (THCa), ácido canabidiólico (CBDa), ácido canabinólico (CBNa) ácido canabicromênico (CBCa), tetrahidrocanabinol (THC), canabinol

(CBN), canabidiol (CBD) e canabicromeno (CBC) ou/e os derivados dos mesmos, e análogos sintéticos, dexmedetomidina, agonista (α2-AR), protetores metabólicos, incluindo, sem limitação, vildagliptina, pristimerina, metformina, piridoxamina, vasomoduladores, epinefrina, rutina, isoxsuprina.

A lista não limitativa de carga que exerce efeito antitumoral compreende, sem limitação, agente quimioterapêutico, incluindo sem limitação cisplatina, carboplatina, clorambucil, melfalano, nedaplatina, oxaliplatina, tetranitrato de triplatina, satraplatina, imatinibe, nilotinibe, dasatinibe, e radicicol; um agente imunomodulador, um agente antiangiogênico, um inibidor mitótico, um análogo de nucleosídeo, um agente intercalante de DNA, agentes antienvelhecimento, dipeptídeos, fatores e moduladores epigenéticos, metformina, rapamicina, ácido ou sal valpróico, wortmanina, poliamina espermidina, inibidores de HDAC butirato de sódio e ácido butírico, ativadores de sirtuína, resveratrol, coenzima CoQ10, ácidos dicarboxílicos pequenos, aspirina, ácido salicílico, benzóico, análogos de carnitina, hormônio de crescimento humano, um análogo de topoisomerase, um anticorpo, uma citocina, um antimetabolito de folato, agente anti-glicólise, inibidor oligonucleotídeo para um fator de transcrição oncogênico ou proto-oncogênico humano; ou agente quimioterapêutico, um agente imunomodulador, um agente antiangiogênico, um inibidor mitótico, um análogo de nucleosídeo, um agente intercalante de DNA, um análogo de topoisomerase, um anticorpo, uma citocina, ou um antimetabolito de folato, inibidor de hexoquinase, um inibidor de lactato desidrogenase, um inibidor de fosfofrutoquinase 2 ou fosfofruto-2-

quinase/frutose-2,6-bisfosfatase, um inibidor de piruvato quinase M2, um inibidor de transcetolase, um inibidor de piruvato desidrogenase, um inibidor de piruvato desidrogenase quinase, um inibidor de glicose-6-fosfato desidrogenase, um inibidor de GLUT, um inibidor de transporte de próton, um inibidor de transportador de monocarboxilato, um inibidor alfa de fator induzível de hipóxia 1, um inibidor de proteína quinase ativada por AMP, um inibidor de glutamina, um inibidor de asparagina, um inibidor de arginina, um inibidor de ácido graxo sintase, um inibidor de ATP-citrato liase, malato de dimetila, e inibidor de enzima málica 2, ou qualquer combinação dos mesmos.

[0026] Em uma modalidade da invenção, a fonte celular ou extracelular é selecionada dentre o grupo consistindo de fibroblastos, células-tronco mesenquimais, células-tronco, células do sistema imune, células dendríticas, ectoderma, queratinócitos, células de GI, células de cavidade oral, células mucosais nasais, células neuronais, células retinais, células endoteliais, cardioesferas, cardiomiócitos, pericites, células sanguíneas, melanócitos, células parenquimais, células de reserva do fígado, células- tronco neurais, células-tronco pancreáticas, células-tronco embrionárias, medula óssea, tecido da pele, tecido do fígado, tecido pancreático, cordão umbilical pós-natal, placenta, saco amniótico, tecido renal, tecido neurológico, tecido da glândula adrenal, epitélio mucosal, tecido de músculo liso, uma célula bacteriana, uma cultura bacteriana, fungos, algas, um microrganismo completo, meio condicional, fluido amniótico, lipoaspirado, subprodutos de lipossucção, amostra fecal e um tecido de planta.

[0027] Em uma modalidade, o bioxome é um redoxome.

Como usado aqui, o termo “redoxome” refere-se, sem limitação, a partícula de bioxome transportando uma carga compreendendo pelo menos um composto redox ativo removedor de radicais livres.

Em uma modalidade, a liberação de um complexo embalado da partícula de redoxome bloqueia a reação de cadeia de LPO.

Em uma modalidade ainda adicional, a liberação de um complexo empacotado da partícula de redoxome é preferencialmente estimulada em sítios de estresse oxidativo.

Em uma modalidade, o redoxome é capaz de bloquear reação de cadeia de LPO, por meio de, sem limitação, armadilha de radical de lipídeo/peróxido, tal como vitamina E, terpenóides, polifenóis, flavonóide, ácidos fenólicos, canabinóides, retinóides, vitamina D, ácido lipóico, esteróis.

De acordo com uma modalidade, o redoxome compreende bloqueadores de complexo de reação de fentons, armadilha de radical de hidroxila, quelante de ferro e uma armadilha de radical de lipídeo.

Em uma modalidade, a armadilha de radical é ácido ascórbico, doador de óxido nítrico (S- nitrosoglutationa), ou um derivado dos mesmos.

Uma lista não limitativa de quelantes de ferro da invenção compreende, sem limitação, desferrioxamina (DFX), ácido etilenodiamina tetraacético (EDTA), rutina, EDTA dissódico, EDTA tetrassódico, EDTA dissódico de cálcio, ácido dietilenotriaminapentaacético (DTPA) ou um sal do mesmo, ácido hidroxietilenodiaminatriacético (HEDTA) ou um sal do mesmo, ácido nitrilotriacético (NTA), acetil trihexil citrato, ácido aminotrimetileno fosfônico, ácido beta- alanina diacético, citrato de bismuto, ácido cítrico, ácido ciclohexanodiamina tetraacético, citrato de diamônio,

oxalato de dibutila, oxalato de dietila, oxalato de diisobutila, oxalato de diisopropila, oxalato de dilítio, oxalato de dimetila, EDTA dipotássico, oxalato de dipotássio, oxalato de dipropila, EDTA dissódico-cobre, pirofosfato dissódico, ácido etidrônico, HEDTA, metil ciclodextrina, ácido oxálico, pentapotássio, trifosfato, fosfonato de aminotrimetileno pentassódico, pentetato pentassódico, trifosfato pentassódico, ácido pentético, ácido fítico, citrato de potássio, citrato de sódio, dihidroxietilglicinato de sódio, gluceptato de sódio, gluconato de sódio, hexametafosfato de sódio, metafosfato de sódio, metassilicato de sódio, oxalato de sódio, trimetafosfato de sódio, tea-EDTA, tetrahidroxipropil etilenodiamina, etidronato tetrapotássico, pirofosfato tetrapotássico, etidronato tetrassódico, pirofosfato tetrassódico, EDTA tripotássico, EDTA trissódico, hedta trissódico, NTA trissódico, fosfato trissódico, ácido málico, ácido fumárico, maltol, sucímero, penicilamina, dimercaprol, deferiprona, um quelante de ferro à base de proteína natural, melatonina, sideróforo, cátion de zinco ou cobre, ou sal ou complexo e mesilato de desferrioxamina, ou uma combinação dos mesmos.

Em ainda outra modalidade, o quelante de ferro é selecionado dentre o grupo consistindo de EDTA (ácido etilenodiaminatetraacético), DTPA (ácido dietileno triamina pentaacético), NTA (ácido nitrilotriacético), detoxamina, deferroxamina, deferiprona, deferasirox, glutationa, metaloproteína, ferrochel (quelato de bis-glicinato), ceruloplasmina, penicilamina, cuprizona, trientina, ácido ferrúlico, acetato de zinco, lipocalina 2, e dimercaprol.

[0028] De acordo com uma modalidade da invenção, os componentes das partículas de redoxome são quelantes naturais e suplementos dietéticos aprovados. Os quelantes naturais da invenção são, sem limitação, ácido cítrico, aminoácidos (por exemplo, carnosina), proteínas, polissacarídeos, ácidos nucleicos, ácido glutâmico, histidina, di-ácidos orgânicos, polipeptídeos, fitoquelatina, hemoglobina, clorofila, ácido húmico, fosfonatos, e transferrina. Em uma modalidade, o quelante pertence ao grupo de polifenóis, tais como flavonas e flavonóides. Em uma modalidade, o polifenol é, sem limitação, rutina, quercetina, luteína, e EGCG.

[0029] De acordo com uma modalidade, a partícula de redoxome pode ser carregada com tais antioxidantes como antioxidantes de fenol tais como dibutilhidroxitolueno (BHT) (nome IUPAC: 2,6-bis(1,1-dimetiletil)-4-metilfenol); hidroxianisol dibutilado (BHA); galato de propila; sulfato de sódio; ácido cítrico; metabissulfito de sódio; ácido ascórbico; tocoferol; derivados de éster de tocoferol; 2- mercaptobenzimidazol ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, a quantidade de um antioxidante a ser usado é de 0,1 a 20% em massa. Em ainda outra modalidade, a quantidade de um antioxidante a ser usado é de 0,5% a 10%; 0,7% a 10%; 1% a 8%; 3% a 8%; 2% a 5%; 5% a 10%; 3% a 10%; e 2,5% a 10% em massa pela massa total da composição de dosagem de película. Em uma modalidade, as partículas de redoxome são enriquecidas com LC-PUFA, ácido docosahexaenóico (DHA) ou plasmalogênios etanolamina ou derivados dos mesmos. Em uma modalidade ainda adicional, partículas de redoxome entregam DFX que inibe fragmentação de colágeno mediada por idade. Em uma modalidade, as partículas de redoxome entregam ácido ascórbico ou derivados do mesmo que inibem degradação de ácido hialurônico, para desse modo retardar a perda de colágeno e matriz extracelular. Em uma modalidade da invenção, as partículas de redoxome podem ser úteis na cura de feridas; medicina estética; e adjuntiva aos procedimentos de preenchimento dérmico. Em uma modalidade da invenção, o redoxome é derivado de prepúcio humano/fibroblastos dérmicos, queratinócitos, células-tronco derivadas de células adiposas e do microbioma da pele.

[0030] De acordo com as modalidades da invenção da invenção, partículas de bioxome são categorizadas de acordo com a carga ou atributos físicos. Em uma modalidade, a partícula de bioxome inclui bioxomes sensíveis ao pH. Em uma modalidade, as partículas de bioxome são bioxomes de transfecção de ácido nucleico. Como usado aqui, o termo “Bioxome de transfecção de ácido nucleico” refere-se, sem limitação, a nucleotídeos encapsulados pelo bioxome e entregues a uma célula alvo, tecido e órgão para fins de modular a expressão de um polinucleotídeo ou polipeptídeo alvo. No contexto da invenção, o termo “modular” refere-se, sem limitação, a aumentar; intensificar; diminuir; e eliminar a expressão de um ácido nucleico ou gene endógeno ou de uma proteína correspondente. Em uma modalidade, tais polinucleotídeos encapsulados podem ser naturais ou recombinantes em natureza e podem exercer sua atividade terapêutica usando ou mecanismos de ação senso ou antisenso. Em uma modalidade, o bioxome de transfecção de ácido nucleico é suplementado com lipídeos catiônicos sintéticos. Em outra modalidade,

a partícula de bioxome é bioxome de liberação lenta e circulação longa. A frase “bioxome de liberação lenta e circulação longa” refere-se a bioxomes modificados para produzir uma entrega sustentada da carga por polímero de núcleo de bioxome ou modificação de proteína ou polissacarídeo e, portanto, para prolongar o nível terapêutico do fármaco na circulação sanguínea ou tecido alvo. O bioxome de liberação lenta e circulação longa da invenção é fabricado, sem limitação, por adição de lipídeo conjugado com núcleo-PEG, albumina, Ácido Hialurônico; ancoragem de íons de metal; ou uma combinação dos mesmos. A modificação hidrofílica da membrana do bioxome do núcleo aumenta o tempo de residência do bioxome no órgão alvo ou sangue em comparação com o bioxome não modificado. O tempo de circulação prolongado é atribuído à taxa diminuída da absorção da proteína do plasma na superfície da partícula PEGuilada.

[0031] Em uma modalidade, as partículas de bioxome são bioxomes de direcionamento seletivo. No contexto da invenção, o termo “bioxome de direcionamento seletivo” refere-se, sem limitação, a partículas de bioxome concebidas para ligando de direcionamento específico ou porções de auto-guia. No bioxome de direcionamento seletivo da invenção, o ligando ou porções de auto-guia são, sem limitação, glicosaminoglicano; anticorpos monoespecíficos ou biespecíficos; aptâmeros; receptores; proteínas de fusão; peptídeos de fusão; ou miméticos sintéticos dos mesmos; ácido fólico dirigido a câncer; fosfolipídeos específicos; citocinas, fatores de crescimento; ou uma combinação dos mesmos.

[0032] Em uma modalidade ainda adicional, a partícula de bioxome é bioxome imunogênico. No contexto da invenção, o termo “bioxome imunogênico” refere-se a partículas de bioxome derivadas de cultura de células de patógenos, ou partículas de bioxome com porções imunogênicas co- extraídas, ou externamente incorporadas. Como usado aqui, o termo “imunogênico” refere-se, sem limitação, à capacidade de uma substância particular, tal como um antígeno ou epítopo, de provocar uma resposta imune no corpo de um humano e outro animal. Em outras palavras, imunogenicidade é a capacidade de induzir uma resposta imune humoral e/ou mediada por células.

[0033] Em uma modalidade, a membrana de partículas de bioxome da invenção compreende pelo menos 50% de membrana celular obtida a partir da fonte celular cultivada em condições de cultura de células predefinidas. Em uma modalidade, as partículas de bioxome derivadas de diferentes fontes podem mostrar diferenças na composição de lipídeo em comparação com a membrana plasmática.

[0034] A invenção prevê adicionalmente uma composição compreendendo a partícula de bioxome e pelo menos um carreador. Em uma modalidade a composição é uma composição farmacêutica e o carreador é um carreador farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, a composição é apropriada para administração oral, intravenosa, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular, tópica, ocular, intranasal, incluindo diretamente no bulbo olfatório para entrega no CNS, retal, vaginal, pulmonar, sublingual, transmucosa, intra-tecido, por ultrassom guiado, endoscópica, através de administração de implante inserido em tecido, administração intratecal e transdérmica. Em ainda outra modalidade, a composição é uma composição cosmecêutica e o carreador é um carreador cosmeceuticamente aceitável. Em ainda outra modalidade, o carreador um carreador de tipo comestível. Em uma modalidade, a composição é uma composição comestível, o carreador é carreador de tipo comestível. Em uma modalidade, a composição compreende adicionalmente excipientes, compostos ativos testados seguros, reagentes, ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, a concentração das partículas de bioxome na composição é 0,005% a 80% da composição total. Em ainda outra modalidade a concentração é 0,005% a 25%. Em uma modalidade, as partículas de bioxome são formuladas com excipientes e carreadores apropriados; embaladas e armazenadas para fins de bancos de células, fins de terapia celular, fins de imageamento ou entrega de fármaco, como reagentes para transfecção ou reagentes para kits de pesquisa. A composição compreendendo as partículas de bioxome são, sem limitação, sólidas, líquidas, semissólidas, criopreservadas, refrigeradas ou secas prontas para uso.

[0035] A invenção prevê adicionalmente um processo para a fabricação de uma amostra compreendendo uma pluralidade de partículas de bioxome, em que as partículas de bioxome são modificadas para transportar uma carga compreendendo pelo menos uma molécula ativa e concebidas para sofrer fusão com uma célula alvo para liberar a carga; e em que ditas partículas de bioxome compreendem um componente de membrana celular derivado de uma fonte celular ou extracelular selecionada; o processo compreendendo: a. realizar extração de lipídeo da célula total a partir da fonte celular ou extracelular selecionada em um sistema solvente suave para obter um extrato de lipídeo; b. secar o extrato de lipídeo; e c. induzir auto-montagem de partículas de bioxome realizando pelo menos uma etapa de ultrassonicação; em que as partículas de bioxome resultantes na amostra são caracterizadas por um tamanho médio de partícula de 0,03 µm a 5 µm. Como usado aqui, o termo “solvente suave” refere-se, sem limitação, a qualquer um de solventes de Classe 3 ou de Classe 2 com PDE >2,5 mg/dia e limite de concentração >250 ppm de acordo com https://www.fda.gov/downloads/drugs/guidances/ucm073395.pdf

[0036] Em uma modalidade, o tamanho médio de partícula é 0,05 µm a 3 µm. Em ainda outra modalidade, o tamanho médio de partícula é 0,08 µm a 1,5 µm. Em uma modalidade adicional o tamanho médio de partícula é 0,1-0,7 µm; 0,1- 0,5 µm, 0,2-0,5 µm; 0,3-0,5 µm. Em outra modalidade, o tamanho médio de partícula é 5 µm ou menos; 1,5 µm ou menos; 0,7 µm ou menos; 0,5 µm ou menos; 0,3 µm ou menos; 0,15 µm ou menos. Em uma modalidade, o tamanho médio de partícula é 0,5 µm a 1,5 µm. Em uma modalidade, o tamanho médio de partícula é 0,4 µm a 0,8 µm. Em outra modalidade, o tamanho médio de partícula é 0,3 µm a 0,5 µm. Em uma modalidade, a amostra compreendendo a partícula de bioxome tem o pH de 4,5 a 5. Em ainda outra modalidade, a amostra compreendendo a partícula de bioxome tem o pH de 4,5 a 5. Em uma modalidade, o sistema solvente compreende uma mistura de solventes polares e não polares. Em uma modalidade, o solvente polar no sistema solvente é selecionado dentre o grupo consistindo de isopropanol, etanol, n-butanol, e n-butanol saturado com água. Em uma modalidade, o solvente não polar no sistema solvente é selecionado dentre hexano e solventes do grupo terpeno. Em uma modalidade, o solvente não polar no sistema solvente é n-hexano. Em uma modalidade, hexano pode ser colocado em suspensão completamente ou parcialmente por extração de fluido supercrítico usando dióxido de carbono supercrítico (scCO2), visto que um solvente “verde” suave tem muitas propriedades vantajosas, incluindo viscosidade do tipo gás, densidade do tipo líquido, difusividade cerca de 100 vezes mais rápida do que em solventes orgânicos em condições ambientes, assim como, operação a temperatura relativamente baixa. Terpeno/flavonóide pode ser selecionado adicionalmente dentre alfa-pineno, d-limoneno, linalol, eucaliptol, terpineol-4-ol, p-cimeno, borneol, delta-3- careno, beta-sitosterol, beta-mirceno, beta-cariofileno, canflavina A, apigenina, quercetina e pulegona. Em uma modalidade, o solvente do grupo terpeno é selecionado dentre o grupo consistindo de d-limoneno, α-pineno e para-cimeno.

[0037] Em uma modalidade, o solvente polar no sistema solvente é isopropanol, e o solvente não polar é n-hexano. Em ainda outra modalidade, o solvente é uma mistura de solvente de baixa toxidade 3:2 de Hexano-Isopropanol. Em uma modalidade, o sistema solvente compreende adicionalmente um estabilizador. Em outra modalidade, o estabilizador é butil- hidroxitolueno (BHT). Em uma modalidade, o sistema solvente pode compreender adicionalmente aditivos tais como, sem limitação, antioxidantes, tensoativos, estabilizadores, vitamina E, esqualeno e colesterol, ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o processo compreende adicionalmente a etapa de co-precipitação de um ácido nucleico.

Em uma modalidade, o ácido nucleico é ácido ribonucleico (RNA) ou ácido deoxirribonucleico (DNA). Em uma modalidade, o ácido nucleico é RNA.

Entrega de RNA é um dos maiores desafios.

Em uma modalidade, o bioxome modificado é alcançado usando membrana celular coletada de fonte celular ou extracelular através de auto-montagem hidrofílica- hidrofóbica durante procedimento de ultrassonicação- cavitação em veículo hidrofílico.

Em uma modalidade, partículas de bioxome são extrudadas após isolamento de membrana de lipídeo após ultrassonicação.

Em uma modalidade, a carga compreendendo as moléculas ativas é hidrofílica, e é aprisionada em veículo hidrofílico durante ultrassonicação, ou durante extrusão.

Em ainda outra modalidade, a carga é carga hidrofóbica e é aprisionada antes da extração com o sistema solvente, durante extração, durante procedimento de secagem/evaporação de solvente, durante ultrassonicação, durante extrusão.

Congelamento- descongelamento repetitivo pode melhorar a taxa de encapsulação de carga hidrofílica após secagem e após ultrassonicação.

O nível de carregamento de encapsulação é afetado pela seleção do parâmetro modificado com base na sensibilidade, estabilidade e dose de carregamento desejado de carga selecionada como preconcebida em cada porção terapêutica ou de pesquisa específica.

Em uma modalidade, a molécula ativa pode ser entrelaçada no núcleo do Bioxome em concentração predefinida sem risco de impurezas de vetores de genes virais como questões de segurança.

Em uma modalidade, as partículas de bioxome podem ser eletroporadas ou microinjetadas.

Em uma modalidade, RNA ou DNA pode ser incorporado nas partículas de bioxome através de ultrassonicação suave a 4oC na presença de quaisquer tampões apropriados para manter a integridade de material nucleico para entrega terapêutica. De acordo com as modalidades da invenção, o processo de fabricação é compatível com as características industriais mais conhecidas de LNPs e lipossomas.

[0038] Em uma modalidade, a fonte celular ou extracelular para extração de lipídeo total é selecionada dentre o grupo consistindo de fibroblastos, células-tronco mesenquimais, células-tronco, células do sistema imune, células dendríticas, ectoderma, queratinócitos, células de GI, células de cavidade oral, células mucosais nasais, células neuronais, células retinais, células endoteliais, cardioesferas, cardiomiócitos, pericites, células sanguíneas, melanócitos, células parenquimais, células de reserva do fígado, células-tronco neurais, células-tronco pancreáticas, células-tronco embrionárias, medula óssea, tecido da pele, tecido do fígado, tecido pancreático, cordão umbilical pós-natal, placenta, saco amniótico, tecido renal, tecido neurológico, fluidos biológicos, e excrementos ou tecidos extraídos por cirurgia, (isto é, leite, saliva, muco, plasma sanguíneo, urina, fezes, fluidos amnióticos, sebo), cordão umbilical pós-natal, placenta, saco amniótico, tecido renal, tecido neurológico, tecido da glândula adrenal, epitélio mucosal, tecido de músculo liso, tecido da glândula adrenal, epitélio mucosal, tecido de músculo liso, uma célula bacteriana, uma cultura bacteriana, um microrganismo completo, meio condicional, fluido amniótico, lipoaspirado, subprodutos de lipossucção, e um tecido de planta. Em ainda outra modalidade, a extração de lipídeo é realizada a partir de meios condicionados com células, meios de células condicionadas liofilizadas, grânulo de células, células congeladas, células secas, volume de células lavadas, suspensão de células não adesivas, e camada de células não adesiva. Em ainda outra modalidade, a camada de células é cultivada em material plástico de cultura de células revestido ou não revestido por matriz extracelular ou matriz sintética, selecionada dentre um (multi)frasco, um prato, um armação, contas, e um biorreator. De acordo com uma modalidade da invenção, o extrato de membrana é seco por congelamento ou/e secagem por pulverização/congelamento. Em ainda outra modalidade, o extrato de membrana é seco por evaporação. A evaporação pode ser realizada por qualquer técnica apropriada, incluindo, mas não limitada a centrífuga do tipo speed-vac, sopro de argônio/nitrogênio, fluxo de ar em espiral e outros métodos de evaporação de solvente disponíveis em ambiente de temperatura controlada, tal como microondas ou evaporação em rotor, aparelho de extração Soxhlet, evaporadores centrífugos. Em uma modalidade ainda adicional, o extrato de membrana é ultrassonicado por ultrassonicador de ponta em um tampão carregado com moléculas ativas desejáveis. Em uma modalidade, o tamanho médio de partícula é 0,4 µm a 1,5 µm quando o tamanho de partícula é medido poucas horas após a preparação. Em ainda outra modalidade, o tamanho de partícula é 0,8 µm a 5 µm quando o tamanho de partícula é medido um mês após a preparação e partículas de bioxome são armazenadas a 0°C a -4°C.

[0039] Em uma modalidade, as partículas de bioxome são derivadas de membranas de fonte celular ou extracelular. Em uma modalidade, as partículas de bioxome são modificadas sob demanda a partir de uma fonte predefinida. Em uma modalidade, a fonte de células é autóloga. O termo “autóloga” refere-se a uma situação quando o doador e o recipiente são os mesmos. Em uma modalidade, a fonte de célula é não autóloga. Em uma modalidade a fonte doadora são células mesodermas incluindo, mas não limitadas a fibroblastos, células-tronco mesenquimais, células-tronco pluripotentes e diferenciadas, células do sistema imune, células dendríticas, ectoderma, queratinócitos, células de GI e cavidade oral, células mucosais nasais, neuronal e células retinais, células endoteliais, cardioesferas, cardiomiócitos, pericites, e células sanguíneas. Em uma modalidade, a fonte para as partículas de bioxome são células estromais, queratinócitos, melanócitos, células parenquimais, células-tronco mesenquimais (células progenitoras comprometidas ou não comprometidas com linhagem), células de reserva do fígado, células-tronco neurais, células-tronco pancreáticas, e/ou células-tronco embrionárias, medula óssea, pele, tecido do fígado, pâncreas, tecido renal, tecido neurológico, glândula adrenal, epitélio mucosal, e músculo liso.

[0040] No processo da invenção, as partículas de bioxome podem ser carregadas com moléculas ativas selecionadas. Em uma modalidade, o carregamento é realizado durante extração. Em ainda outra modalidade, o carregamento é realizado durante secagem, antes ou após extração. Em uma modalidade, as partículas de bioxome obtidas podem sofrer extrusão.

[0041] A vantagem do sistema de extração HIP da invenção é que, em contraste com extração clássica de lipídeos em clorofórmio-metanol, ele permite extrair lipídeos da membrana com atividade mínima de lipase e diretamente de/em componentes solúveis em clorofórmio, tais como plásticos, cavidades de superfície estéril de cultura de células, incluindo mas não limitado a fibras ocas, contas, nucleoporo, e filtros de policarbonato. Por exemplo, HIP permitiria extração direta de policarbonato que é estável nestes solventes. Extração HIP pode ser usada para suporte de Bioxomes a partir de células ou meio condicionado em paralelo com coextração de RNA ou proteínas da mesma cultura de células ou amostra de tecido. Para tal processo, a camada de células ou grânulo de células ou meio condicionado liofilizado ou extrato de tecido HIP pode ser pré-misturado com aproximadamente 1/4 - 1/5 por volume de tampão de água ou RNA ou DNA ou solução de estabilização de proteína (por exemplo, RNAsave bioind1.com ou tampão contendo inibidor de Trhaloze ou RNAse). O tampão de fase água ou solução de estabilização extrai o extrato nucleico ou proteico co- precipitado em que dita fase nucleica ou proteica pode ser então separada, por exemplo, por centrifugação ou gradiente de congelamento etc. Tal fase contendo RNA ou/e DNA ou/e proteína pode ser adicionalmente durante a formação de partícula com fase hidrofóbica de partícula de bioxome e, então, usada como bioterapêutica ou para diagnóstico de biomarcador ou uso de reagente de pesquisa.

[0042] Em uma modalidade, o processo da invenção é compatível com a diretriz GMP e GLP. Em uma modalidade, de acordo com o processo da invenção, as partículas de bioxome são coletadas de biomassa celular; grânulo celular; camada celular adesiva; meio; ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, as partículas de bioxome são extraídas por uma única etapa de baixa toxidade que permite o processo de extração de solvente aprovado por OECD.

[0043] Em uma modalidade, células fonte podem ser modificadas antes da extração por exposição a estresse oxidativo suave, privação de meio, radiação ou outra modificação in vitro de células em cultura, em cultura para expressar mais antioxidantes lipofílicos. Em uma modalidade o antioxidante lipofílico é rutina, esqualeno, tocoferol, retinol, ácido fólico e derivados dos mesmos. Em uma modalidade, o componente da solução de lipídeos é esterilizado no filtro. Em uma modalidade ainda adicional, o componente da solução de lipídeos pode ser armazenado em nitrogênio ou argônio a uma temperatura de -20°C a -80°C.

[0044] Em uma modalidade adicional, o solvente compreende adicionalmente detergente tensoativo. Em uma modalidade, o detergente é Polaxômero. Em uma modalidade, o processo compreende liofilização/ evaporação da porção de solvente HIP para formar um complexo de partícula de bioxome-ácido nucleico; e ultrassonicação em um carreador/ tampão hidrofílico, e/ou extrusão opcional com tamanho de partícula desejado.

[0045] A invenção prevê adicionalmente uma amostra compreendendo uma pluralidade de partículas de bioxome, preparadas de acordo com o processo da invenção.

[0046] A invenção prevê adicionalmente um método de tratamento ou prevenção de uma patologia em um indivíduo em necessidade de tal tratamento, compreendendo administrar ao indivíduo a composição farmacêutica compreendendo a partícula de bioxome e pelo menos um carreador. Em uma modalidade a composição é uma composição farmacêutica e o carreador é um carreador farmaceuticamente aceitável.

Em uma modalidade, a composição é apropriada para administração oral, intravenosa, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular, tópica, ocular, nasal, retal, vaginal, pulmonar, sublingual, transmucosa e transdérmica.

Em ainda outra modalidade, a composição é uma composição cosmecêutica e o carreador é um carreador cosmeceuticamente aceitável.

Em uma modalidade, a patologia é selecionada dentre o grupo consistindo de um distúrbio inflamatório, um distúrbio neurológico, um distúrbio infeccioso, uma malignidade, um distúrbio do sistema imune, e um distúrbio autoimune.

A lista não limitativa de distúrbios compreende distúrbios inflamatórios, tais como um distúrbio inflamatório da pele crônico ou agudo, doença inflamatória intestinal (IBD), artrite, distúrbio respiratório inflamatório, ou ferida ou lesão aguda ou crônica, distúrbio infeccioso é uma doença infecciosa causada por um patógeno bacteriano, um patógeno viral, ou um parasita; distúrbio proliferativo é um malignidade associada com níveis elevados de citocinas pro- inflamatórias e/ou níveis reduzidos de citocinas antiinflamatórias; um distúrbio metabólico, diabetes melitus tipo I, diabetes melitus tipo II, ou uma condição relacionada ao diabetes; inflamação mediada por elevação de citocinas pró-inflamatórias, tal como, sem limitação, IL-1 alfa, IL- 6, TNF-alfa, IL-17; inflamação mediada por elevação do nível de pelo menos uma citocina antiinflamatória, tal como, sem limitação, IL-13, IL-4, ou IL-10; rinossinusite crônica (CRS), rinite alérgica; COPD; polipose nasal (NP); rinite vasomotora, hiperrresponsividade das vias aéreas, fibrose cística; fibrose pulmonar; sinusite alérgica, IBD; doença de

Crohn; e colite ulcerativa.

[0047] No contexto da invenção, partículas de bioxome podem ser incorporadas em uma ampla faixa de formas de dosagem de medicina estética, cosmética, tópica incluindo mas não limitadas a géis, óleos, enchimentos dérmicos, emulsões e similares. Por exemplo, a suspensão contendo as partículas pode ser formulada e administrada como cremes, pastas, unguentos, géis, loções tópicas e similares. Em certas modalidades, a aplicação do medicamento estético pode ser feita por procedimentos tópicos, "abertos" ou "fechados". Por "tópico”, entende-se a aplicação direta da composição farmacêutica em um tecido exposto ao ambiente, tal como a pele. Procedimentos "abertos" são aqueles procedimentos que incluem incisão da pele de um paciente e visualização direta do tecido subjacente ao qual as composições farmacêuticas são aplicadas. Procedimentos "fechados" são procedimentos invasivos em que instrumentos penetram no tecido alvo interno diretamente no local da doença, por exemplo, em conjunto com preenchimento dérmico durante o procedimento estético, ou tópico local nas áreas da pele, feridas, rugas. A invenção prevê adicionalmente um método de melhorar uma condição da pele em um indivíduo em necessidade do mesmo compreendendo administrar ao indivíduo a composição compreendendo partículas de bioxome da invenção. Em uma modalidade, a invenção prevê adicionalmente o uso de partícula de bioxome como veículos de entrega para biomoléculas ativas. Biomoléculas ativas da invenção têm, sem limitação, atividade antiinflamatória; atividade antienvelhecimento; atividade anticâncer; atividade metabólica ou DNA genético ou material bioativo de RNA.

Em uma modalidade, as biomoléculas ativas são citocinas celulares.

Em uma modalidade ainda adicional, as biomoléculas ativas são fatores de crescimento.

Em uma modalidade, as biomoléculas ativas são oligonucleotídeos, compreendendo ou ácidos deoxirribonucleicos ou ácidos ribonucleicos.

Em uma modalidade, o comprimento do oligonucleotídeo é 2 a 100 nucleotídeos.

Em uma modalidade o oligonucleotídeo é natural, sintético, modificado ou não modificado.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo é RNAi; siRNA; miméticos de miRNA; anti-miR; ribozimas, aptâmeros, moléculas de salto de éxon, mRNA sintético, RNA curto em gancho de cabelo (shRNA). Em uma modalidade ainda adicional, a membrana da partícula de bioxome é modificada para fornecer liberação controlada da carga para o alvo.

Em uma modalidade, lipídeos sensíveis ao estresse oxidativo são embutidos na membrana de partículas de bioxome.

Em outra modalidade, as partículas de bioxome são carregadas com quelantes de metal e antioxidantes.

Em uma modalidade as partículas do tipo exossomas são usadas para introduzir fatores de pluripotência em células-tronco ou somáticas para obter, assim, células-tronco pluripotentes induzidas não virais- iPSC.

Em ainda outra modalidade as partículas de bioxome são usadas para tratar células.

O tratamento das células com as partículas de bioxome da invenção é realizado em temperaturas fisiológicas (cerca de 37°C). A duração do tratamento é 2 min a 72 horas.

A invenção prevê adicionalmente as partículas de bioxome da invenção para uso como um medicamento.

[0048] Nas modalidades da invenção, as especificações de controle de qualidade (QC) para caracterização de tamanho de partícula de partículas de bioxome incluem, sem limitação, as seguintes: tamanho de partícula; capacidade de penetração nos tecidos/células alvo; esterilidade; não imunogenicidade e segurança definidas pela ausência de proteínas e ácidos nucleicos. A distribuição de tamanho de partícula é medida em Malvern Nano Zetasizer e refinada pelo software Zetasizer. Os tamanhoss dos conjuntos de partículas de bioxome são manipulados com base na aplicação desejada, fazendo uso de técnicas de redução de tamanho comumente disponíveis. Os conjuntos podem ter o tamanho reduzido por extrusão através de membranas com dimensões de malha pré-selecionadas.

[0049] No contexto da invenção, as especificações de QC para caracterização de lipídeos de partículas de bioxome incluem, sem limitação, as seguintes: partículas de bioxome são qualificadas e quantificadas por composição e características dos lipídeos da membrana, tais como: (1) índice des/saturação de ácidos graxos-FA, (2) características de comprimento de cadeia FA, (métodos analíticos GC; HPLC) isto é, LC de cadeia longa- FA PUFA poliinsaturado/cadeia média-MC/; (3) polaridade (ensaio IZON); (4) composição de lipídeo, isto é, porcentagem de teor e/ou razão, por exemplo, composição de PL-fosfolipídeo e razão PC-PE/PI-PS ou razão/porcentagem entre vários grupos de lipídeos das membranas de Bioxome, por exemplo, PL/NL (lipídeo neutro)/CL/GL/TG/FFA (HPLC; TLC; LC-MS; MALDI; cromatografia em coluna; etc.); (5) lipídeo total (ensaio de vanilina, etc.); (6) teor opcional de lipídeos funcionais e derivados de lipídeos, por exemplo, prostaglandinas,

prostaciclinas, leucotrienos, tromboxanos (HPLC; MS-MS; ELISA; RIA; etc.), ou (7) metabólitos tais como índice de hidróxi (ensaio de iodo); e (8) oxidação mediada por ROS.

[0050] No contexto da invenção, as especificações de QC para a composição final compreendendo partículas de bioxome incluem, sem limitação, as seguintes: viscosidade e osmolaridade; pH; número de partículas por batelada; turbidez; parâmetros de especificação de estabilidade. Métodos de medições e caracterização de partícula que são fornecidos por IZON Ltd., também são aplicáveis para QC na produção de partículas de bioxome.

[0051] No contexto da invenção, as especificações de QC para a potência de produção de bioxome incluem, sem limitação, um ensaio para atividade desejada de bioxomes. Por exemplo, o ensaio de cultura de células para testar o efeito funcional de produtos à base de bioxome e redoxome in vitro. O efeito pode ser triado como ensaio de potência de QC por ensaio de riscos, ensaio de citotoxicidade, por exemplo, ensaio de citotoxicidade de fármacos quimioterapêuticos, ensaio de geração de ROS ou de indução de envelhecimento de hidroxiureia, ensaio de indução de TGF beta ou IL19 com inflamação. Exemplos Exemplo 1. Extração de lipídeo por solvente a partir de grânulos de células.

[0052] As amostras de células seguintes foram cultivadas: Amostra 1 - Células Endoteliais da Veia Umbilical Primária; Normal, Humana (HUVEC) (ATCC® PCS- 100-010™); Amostra 2 - Células Epiteliais Mamárias Primárias; Normal, Humana ATCC® PCS-600-010™; Amostra 3

- Fibroblastos de Prepúcio Humano HFF (primários- doados); Amostra 4 - Células-Tronco Mesenquimais Derivadas de Adiposo Humano; (ATCC® PCS-500-011). Todas as amostras de células foram passadas 3-6 passagens, cada amostra foi armazenada com células 2X10upp6 por frasco de criopreservação e grânulos foram coletados e armazenados em meio de criopreservação (GIBCO) em nitrogênio líquido. O grânulo foi lavado com PBS e a massa celular foi concentrada por centrifugação. O concentralizado de células foi misturado com mistura de solvente HIP composta de solventes Hexano:Isopropanol (3:2) e BHT a 0,02%. Os grânulos foram turbilhonados repetidamente a temperatura ambiente por 2-4 minutos por ciclo de vórtex. As amostras foram então centrifugadas e o sobrenadante foi coletado. O sobrenadante coletado foi submetido a evaporação até que um resíduo oleoso foi formado. Partículas de bioxome foram preparadas e encapsuladas adicionalmente. Exemplo 2. Formação e caracterização de partícula.

[0053] A formação de partículas de bioxome foi realizada usando ultrassonicação com ponta (vibra-cell Sonics): 3 ciclos de sonicação por amostra, cada ciclo de 3 segundos com intervalo de 10 segundos entre os ciclos. Durante o procedimento, amostras são mantidas a temperatura ambiente por resfriamento da amostra com gelo durante a sonicação (temperatura do Sonicador monitorada a 60°C) a fim de evitar aquecimento induzido por sonicação. pH do produto final foi medido e o tamanho de partícula foi identificado usando Nanosizer- Malvern como ilustrado por Figura 1A. As propriedades do produto formado caíram nas especificações de QC de medição de pH de 4,5-5, e tamanho médio de partícula de tamanho de 0,05-1,5 µm. Para o teste de estabilidade, as amostras obtidas foram armazenadas por um mês a 4°C Figura 1B. O tamanho médio de partícula observado, medido usando o Nanosizer-Malvern foi significativamente maior, indicando agregação/interfusão de partículas de Bioxome. Exemplo 3. Estabelecimento de um sistema experimental concebido para produzir bioxomes.

[0054] Protocolos para produção de bioxome a partir de lipídeos extraídos por solventes foram estabelecidos usando um grânulo de célula congelada ou cultura fresca da mesma fonte de células. As células usadas para o estabelecimento do protocolo eram células-tronco mesenquimais humanas (MSCs) derivadas de tecido adiposo; células da medula óssea, e linhagem de células do fígado HepG2. Membranas de lipídeo foram extraídas usando solventes Hexano:Isopropanol e secas por uma evaporação de gás nitrogênio ou liofilizador. Culturas de células frescas foram cultivadas com HBSS-HEPES para gerar meios de condição por 2 h antes da extração de lipídeos. Os meios de condição resultantes também foram coletados, e lipídeos e RNA foram extraídos e secos. As amostras de lipídeo seco produzidas a partir de grânulos de células ou culturas de células foram ultrassonicadas em HBSS para produzir bioxomes. A concentração do RNA extraído de cada amostra (usando

DDW) foi medida usando um espectrofotômetro NanoDrop Lite. Os bioxomes formados foram avaliados para seu tamanho e estabilidade usando o analisador de tamanho de partícula ZetaSizer nano (Malvern Panalytical Ltd.) e o analisador NanoSight (Malvern Panalytical Ltd.). As medições usando o ZetaSizer nano mostraram duas distribuições de tamanho de partículas com picos a 81 nm e 267 nm como representado em Figura 2A. Os resultados do NanoSight indicaram um tamanho médio de partícula de 248 nm Figura 2B. Exemplo 3. Exame de estabilidade do bioxome.

[0055] Para o exame de estabilidade de bioxome, uma amostra de bioxomes produzidos por sonicação da medula óssea hMSC descrito em Exemplo 2, foi dividida em 8 sub- amostras seguinte a produção de bioxome. Cada par de amostras foi exposto a um número diferente de ciclos de congelamento-descongelamento (0-3 ciclos). Metade das amostras (uma de cada par) foi liofilizada, o resto foi armazenado em um congelador a -80ºC. Medição do tamanho da partícula de bioxome usando o NanoSight indicou que todas as amostras eram estáveis independentemente do número de ciclos de congelamento- descongelamento, no entanto, a uniformidade do tamanho de partículas é dependente da condição Figura 3. Os resultados revelaram que uma adição de etapa de ultrassonicação (com ou sem liofilização) seguinte aos ciclos de congelamento-descongelamento, melhorou a uniformidade do tamanho do bioxome Figura 2A-C. Exemplo 4. Experimentos de fusão de bioxome.

[0056] Partículas de Bioxome foram carregadas com biomarcador de lipídeo fluorescente (BioDipy™ TR (D7540), ThermoFisher Scientific) para imitar o composto hidrofóbico ativo e visualizar o tráfego inter- e intracelular de Bioxome. Os fluoróforos BioDipy™ e NBD incorporados em esfingolipídeos fluorescentes têm propriedades espectroscópicas diferentes. O fluoróforo FL BioDipy™ produz maior saída de fluorescência do que NBD devido à sua alta absortividade molar e rendimento quântico de fluorescência. Também é mais fotoestável do que NBD. Os esfingolipídeos rotulados com NBD têm taxas mais altas de transferência através de fases aquosas do que sua contraparte BODIPY FL. Figura 4 demonstra a fusão de partículas de Bioxome fluorescentes. A concentração final de 5 µM de BioDipy foi fundida na membrana de células confluentes de Fibroblastos de Prepúcio Humano (HFF). Fluorescência foi visualizada usando microscópio fluorescente (com amplificação de 40 X) e câmara CDD e as imagens foram gravadas. A fusão de partículas de bioxome fluorescentes com células HFF foi rastreada durante 10- 35 min por amostra. Entre as medições, as células foram mantidas a 37°C. Todas as preparações de bioxome (exemplo 1, amostras 1 a 4) fundidas em células alvo em 15 min., Figura 4A-C. Exemplo 5. Extração de membrana celular por sistema HIP da camada de células aderentes em meio condicionado.

[0057] Extração de células de Fibroblastos de Prepúcio Humano (HFF) e meio condicionado foram separados como mostrado em Figura 5. A camada de células aderentes HFF foi lavada quatro vezes do meio com HBSS+HEPES. O tampão foi então removido e sistema solvente HIP incluindo BHT a 0,02% foi adicionado para cobrir a camada de células no multi-frasco. Extração foi realizada por agitação suave do frasco a temperatura ambiente durante 20 min. O conteúdo do frasco foi transferido para tubos de cultura de 50 ml e evaporação de água (36°C) sob Argônio foi realizada resultando na formação de resíduo do tipo película oleosa e seca. Exemplo 6. Modificação de partículas de bioxome com proteínas de membrana.

[0058] Células foram semeadas e coletadas de acordo com Exemplo 1. Extração dos lipídeos e proteínas de membrana da massa celular foi realizada em mistura de solvente suave compreendendo mistura de Hexano:Isopropanol 1:1. Seguinte a extração, o sobrenadante e os grânulos foram coletados, e a proteína total foi medida por ensaio de Bradford com padrão BSA. Um teor de proteína de 15% foi medido. Ácidos nucleicos foram removidos do extrato bruto por lavagem com NaCl e uma medição por espectrofotômetro a 280 nm foi realizada. Exemplo 6. Preparação de partículas do tipo exossoma encapsuladas com oligonucleotídeo.

[0059] Células são semeadas e coletadas de acordo com exemplo 1. A massa celular é dissolvida em sistema solvente HIP (3:2 volume/volume) ou sistema solvente hexano/etanol (2:1 volume/volume). Após 30 min., incubação a temperatura ambiente, etapa de extração com solvente adicional (cerca de 1/4 do volume original cada) é realizada. O extrato é então centrifugado a 3000 rpm por 10 min. usando uma centrífuga do tipo bancada e uma interface clara entre a fase aquosa e solvente é formada. O oligonucleotídeo é solubilizado em uma solução aquosa correspondente à das vesículas extrudadas (pH 4, etanol a 30%) e é adicionado em gotas ao extrato HIP de membrana celular. A fase solvente é submetida a sopro suave de N2 para remover o solvente. A amostra é colocada então em SpeedVac por 3 horas para evaporar solvente residual. Os recipientes contendo membrana-ácido nucleico são cheios com um tampão HBSS (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,2) e ultrassonicados.

[0060] Exemplo 7. Dinâmica da entrega de partículas de bioxome derivadas de fibroblastos para alvo de células de fibroblastos versus alvo de células gliais.

[0061] Fibroblastos 3T3 NIH foram pré-rotulados com C6-nbderitro-ceramida fluorescente ou 15 min a 37°C (a concentração final de C6-nbderitro-ceramida era 5 µM). O meio foi descartado, os pratos foram subsequentemente lavados duas vezes com PBS resfriado com gelo. Para as extrações, células foram incubadas com 1 ml de Hexano:Isopropanol (HIP) 2:1 (volume/volume) por 15 min a RT durante agitação. HIP foi coletado de 3 pratos de Petri em um tubo de vidro. Os pratos foram lavados uma vez com 1 ml de HIP cada, adicionando todas as lavagens ao tubo. HIP foi evaporado sob a corrente de N2. Após recolocada em suspensão em 300 µl de PBS, a massa celular foi sonicada. Para análise de liberação e incorporação de rótulo NBD, fibroblastos NIH 3T3 e células gliais cultivadas primárias foram semeadas em lamelas de vidro de 13 mm em pratos de cultura de 24 cavidades um dia antes do experimento. Partículas de bioxome preparadas a partir de fibroblastos NIH 3T3 foram adicionadas às células (10 µl da suspensão de bioxome em cada cavidade), as lamelas foram removidas das cavidades em intervalos de tempo indicados, lavadas para remover rótulo NBD não ligado, e foram submetidas à análise usando microscópio fluorescente Zeist (com ampliação de 40 x) e câmara CDD. As imagens foram gravadas no computador. O esquema para procedimento geral deste experimento é apresentado em Figura 6A. Resultados:

[0062] Resultados de formação de imagem são apresentados em Figura 6B. Rotulação significativa das células de fibroblasto pelas partículas de bioxome rotuladas foi observado em 4 min. Este sinal se tornou ainda mais intenso 30 min após a aplicação das partículas de bioxome. Em contraste, células gliais quase não mostraram ligação das partículas de bioxome rotuladas, mesmo após 30 min. Estes resultados indicam direcionamento específico das partículas de bioxome que foram originadas de fibroblastos, para as células alvo de fibroblasto. Exemplo 8. Modificação de Redoxomes

[0063] A representação esquemática de partícula de redoxome é demonstrada em Figura 7. Células liofilizadas de bactéria Lactobacillus foram usadas como uma fonte para extração de bioxome. Tocoferol e colesterol (0,5%) foram dissolvidos em uma solução de solvente consistindo de Hexano:Isopropanol (HIP) (3:2 volume/volume) com butil-hidroxitolueno (BHT) a 1,5% como um estabilizador.

Para aumentar a estabilidade/rigidez da membrana de bicamada de lipídeos, os antioxidantes lipofílicos alfa-tocoferol (~3%), DHA (~3%), colesterol como estabilizadores de rigidez (1,5%) foram usados.

Os solventes foram evaporados sob uma corrente de nitrogênio, e liofilizados por 2 horas a 4°C.

A dispersão de lipídeo resultante foi sonicada por 10-20 min em um ultrasSonicador tipo ponta até desaparecer a turbidez.

Captura por centrifugação de ressonância paramagnética de elétrons foi usada para detectar radicais livres derivados de lipídeos gerados por estresse oxidativo induzido por ferro em partícula do tipo exossoma.

Usando a captura por centrifugação de nitrona a-(4- piridil-1-óxido)-N-terc-butilnitrona (POBN), adutos de radicais centralizados em carbono foram detectados.

Ácido ascórbico e DFX ou EDTA foram adicionados ao tampão durante ultrassonicação.

Extração do material de membrana desejado de uma fonte selecionada de cultura de células foi realizada com uma mistura de solvente de extração compreendendo HIP que dissolveu reagentes ativos Redox-lipídeos selecionados (DHA/EPA - como sensor Redox ou/e alfa-tocoferol como estabilizador Redox). Extração de lipídeos por HIP foi realizada usando o procedimento seguinte: seguinte a etapa de evaporação, o diâmetro desejado de vesículas foi alcançado por ultrassonicação com ponta.

Exemplo 9: Sensibilidade EPR-Redox das partículas de Redoxome.

[0064] 50 e 100 µM de DHA foram incorporados na membrana de bicamada de lipídeos de partículas de redoxome Figura 8, dois espectros no meio. Um aduto de rotação centralizado em carbono foi observado, com um aumento na intensidade de sinal EPR do aduto de rotação observado com o aumento da concentração de DHA (indicando um aumento dependente da dose de DHA na formação de LR). Um espectro muito fraco (controle) foi obtido no espectro de topo em Figura 8, nas partículas de redoxome sem DHA (representando formação de aduto POBN basal). Quando o estabilizador alfa-tocoferol foi incorporado nas partículas do tipo exossoma enriquecidas com DHA, a formação de LR foi observada como sendo reduzida quase para níveis basais no espectro de fundo em Figura 8, indicando uma inibição de LPO pelo antioxidante incorporado na membrana de partículas do tipo exossoma. Exemplo 10: Estabilidade de partículas de redoxome sob condições normais.

[0065] Partículas de redoxome contendo calceína foram preparadas por adição de uma concentração de auto-extinção de 60 mM de calceína em 10 mM de TRIS a pH 8 (NaCl 100 mM) no material liofilizado, seguido por recolocação em suspensão em 0,2 ml de tampão por turbilhão. A calceína não encapsulada foi removida da suspensão de partícula de redoxome por filtração em gel, usando uma coluna Sephadex G-50 (Pharmacia). 30 µl da suspensão de redoxome foram injetados na coluna e eluídos em 10 mM de TRIS a pH 8 (NaCl 150 mM), e frações do eluente foram coletadas. A fluorescência foi monitorada em partículas de redoxome não tratadas, assim como em partículas de redoxome expostas ao detergente Triton X-100 na concentração final de 0,2%, por espectroscopia de fluorescência no comprimento de onda de excitação de 490 nm e comprimento de onda de emissão de 520 nm. Resultados:

[0066] Nenhuma mudança na liberação de calceína após adição de 100 µm H202 à suspensão de partículas de redoxome foi observada, Figura 9A. Após adição de 50 µm Fe2+ à suspensão, que age como um catalisador para produzir radicais hidroxila a partir de H2O2 através da reação de Fenton, um aumento significativo na taxa de mudança de fluorescência foi observado na população de partículas de redoxome contendo DHA ou α-tocoferol, mas não na população de controle. Quando Triton X-100 foi adicionado à solução Figura 9B, toda a calceína restante nas partículas de redoxome foi liberada, com cinética mais rápida do que a liberação observada após adição de H202 + Fe2+. Exemplo 11: Efeito de Redoxomes em danos cerebrais

[0067] Para testar o efeito de Redoxomes em danos cerebrais, camundongos (n = seis por grupo) foram sacrificados na idade pós-natal no Dia 8 após o nascimento, anestesiados com isoflurano e cetamina/pentobarbital de sódio, e conforme o Acordo de Helsinki para estudos em animais. Então, fatias de cérebro recentemente dissecadas foram submetida a reação de Fenton por incubação com 50 µM de sulfato ferroso heptahidratado (Sigma) por 15 minutos a 37°C em DMEM mais Hepes. Por tal estresse oxidativo induzido ex-vivo, fatias de cérebro foram expostas à produção de ROS que imitam doenças inflamatórias; estresse isquêmico; e outros distúrbios cerebrais, tais como a Síndrome de Down; alterações isquêmicas coronárias induzidas por aterosclerose. TBARS liberou a geração de ROS no meio de incubação por fatias de cérebro aumentadas de ~80-100 nM/mg peso úmido a 120-160 nM por mg/peso úmido. Tratamento com DFX mais alfa tocoferol (vE) a concentração de 1 µM, que não foi encapsulado em Redoxome, resultou em 20-30% de redução de liberação de TBARS. Quando as fatias foram co-incubadas com hAdTMSC-Redoxomes encapsulados com 0,5 mcM DFX e vE - a produção de TBARS foi reduzida em 50-60%. Exemplo 12: Ensaio de potência in vitro de Redoxomes

[0068] Células Progenitoras Neurais Derivadas de XCL-1 DCXp-GFP (ATCC® ACS-5005), foram incubadas com reagentes de Fenton induzindo ROS. Para medição LPO, como um marcador selecionado de dano celular/tecido, para avaliar a viabilidade de tratamento com Redoxome, as alíquotas de extratos de hexano isopropanol – HIP (3/2 em volume) foram evaporadas até a secura e dissolvidas em metanol para microdeterminação de peróxidos de lipídeos. Determinação de produtos de peroxidação de lipídeo aldeídico: malonaldeído e 4-hidroxinonenal. Para 0,5 ml de alíquotas do meio de incubação, um volume igual de ácido tiobarbitúrico (0,34% TBA em 50% acético ácido glacial) foi adicionado. Após fervura por 10 minutos em banho de água, a cor rosa se desenvolveu com fluorescência no comprimento de onda de excitação de 535 nm e comprimento de onda de emissão de 553. Uma curva padrão apropriada foi executada em paralelo (1,1,3,3-tetraetoxipropano, Sigma). Para medir os níveis de tecido de LPO após experimentos in vivo, fatias de tecido congelado do cérebro, fígado, pulmão, pele, rim, como relevante, armazenadas a -70°C após experimento in vivo, foram descongeladas em PBS a 4°C frio, em gelo; enxaguadas uma ou duas vezes dependendo da fonte de tecido. O extrato de tecido foi obtido por extração com TCA glacial frio a 10% contendo 0,01% peso/volume de hidróxi tolueno butilado (BHT, Sigma). O tecido foi homogeneizado adicionalmente por 30 s por um homogeneizador de alta velocidade em gelo e, então centrifugado por 10 minutos por 3500Xg. Alíquotas do sobrenadante de extratos de tecido foram testadas por LPO, medidas como produtos de malondialdeído liberados para o sobrenadante seguinte a extração. Nas amostras de tecido, LPO foi representado como TBA - substância reativa, (TBARS) por peso úmido. Resultados:

[0069] Níveis basais de TBARS em vários tecidos eram similares: em fatias de cérebro de rato 40-50 µmol/g peso úmido, o fígado - 60-80 µmol/g peso úmido. Liberação de LPO para o meio condicional aumentou 5 a 10 vezes após indução de ROS por reação de Fenton (sulfato ferroso heptahidratado (Sigma) 0,1 mM mais 0,2 mM H2O2 por 20 min) em precursores neuronais iPSC. Co-incubação com Redoxomes da medula óssea contendo sulfato ferroso heptahidratado (Sigma) inibiu o aumento de LPO entre 40-80%.

[0070] Tratamento com Concovalina A induziu um aumento de aproximadamente duas vezes de LPO no fígado, em que o tratamento concomitante com Redoxome derivado de tecido adiposo mesenquimal humano encapsulado com 5mcM de DFX e 5mcM de alfa-Tocoferol reduziu LPO para o nível basal. Exemplo 13: Encapsulação de RNA e experimentos de eletroporação. RBC:

[0071] Bioxomes foram preparados a partir de células de sangue vermelhas humanas (RBC). RBCs foram coletados preferivelmente do amostras de sangue do Grupo O, então foram separados do plasma e células de sangue brancas por centrifugação e filtros de leucodepleção (Terumo Japan). O procedimento de extração de bioxome foi realizado como descrito acima. Experimentos de eletroporação foram realizados usando um eletroporador Gene Pulser Xcell (BioRad), programa exponencial em uma capacitância fixa de 100 μF com cuvetas de 0,4 cm. Bioxomes E12 obtidos de E9 RBCs foram diluídos em OptiMEM (ThermoFisher Scientific) e foram misturados com 4 μg de Dextrano conjugado com AF647 (ThermoFisher Scientific) para um volume total de 200 μl, 100 µl de alíquotas de Bioxomes adicionados em cada cuveta e incubados em gelo por 15 min a 150-250 V. Em um caso em que agregado se formou, desagregação foi realizada por pulso único de sonicação adicional a 50% de redução de energia do que durante a formação de partícula de Bioxome. Para testar a eficácia de encapsulação, medição FACS de Dextrano-AF647 foi realizada após os Bioxomes eletroporados serem incubados durante a noite com 5 μg de contas de látex (ThermoFisher Scientific). Bioxomes derivados de tecido adiposo:

[0072] Bioxomes derivados de tecido adiposo encapsulados em RNA bruto foram preparados – Bioxomes E8 foram preparados a partir de cultura de células E6 de tecido adiposo humano e encapsulados por ultrassonicação suave com um único pulso de seis segundos e 40% de energia e 0,5 mcg de RNA (para preservar a integridade do RNA). O índice de polidispersidade PDI de bioxomes encapsulados em RNA obtidos era 548 nm. Bioxomes encapsulados em RNA foram diluídos adicionalmente dez vezes e, então, sonicados por outro pulso de 30 s resultaram em tamanho médio de partícula de 450 nm. Extrusão adicional pela extrusora Avant é opcional para alcançar o tamanho de 100 nm, especialmente se o direcionamento para o fígado é desejado. Exemplo 14: Bioatividade de tratamento com Bioxome/RNA em HFF - cultura de fibroblastos de prepúcio humano.

[0073] Ensaio de proliferação celular MTT-a 3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (Life Technologies) foi realizado para investigar o efeito de Bioxomes derivados de tecido adiposo carregados com 0,5 mcg de RNA interno/por Bioxomes derivados de células E8 como descrito acima na viabilidade celular seguinte ao estresse de privação (privação de soro). Resumidamente, 1×104 células/cavidade foram semeadas em placas de 96 cavidades e cultivadas por 18~24 h para alcançar 90% de confluência. Seguinte a fixação, as células foram lavadas duas vezes com PBS, então, meio isento de soro adicionado. Tanto as células privadas de soro como o controle (10% de soro) foram coletadas em 24 h. Os sobrenadantes da cultura de células foram descartados e 20 µl de solução de MTT foram adicionados em cada cavidade (0,5 mg/ml; Sigma Aldrich; Merck KGaA,

Darmstadt, Alemanha), então as células foram cultivadas por 4 horas adicionais. Os sobrenadantes foram então removidos e 200 µl de DMSO foram adicionados em cada cavidade, com agitação leve por 15 min. A absorbância a um comprimento de onda de 490 nm foi então detectada com 4 replicatas usadas para cada cavidade e um valor médio calculado. Após FBS, a privação de 10% DMEM FBS até 0% FBS foi realizada 24 horas antes do experimento e amostras tratadas com Bioxomes apresentaram o mesmo efeito proliferativo em HFF similar ao controle positivo (10% FBS) em comparação com amostras isentas de soro onde a viabilidade foi reduzida em quase 30%. Exemplo 15: Ensaio de arranhão in vitro em HFK.

[0074] Bioxomes foram preparados a partir de célula de queratinócitos de prepúcio - HFF pelo processo descrito acima. HFKs foram usados como células para ensaio funcional in vitro de modelo de cura de feridas. No dia 1 as células foram descongeladas de estoques primários (P0-1) e cultivadas P1-2 em meio regular suplementado com 5% de FBS (preferivelmente certificados como exossomas depletados), e 1% de Glutamax. No Dia 2-3, a subcultura foi expandida para alcançar confluência para o experimento. Em seguida, s células foram semeadas novamente em 1,5% de FBS por divisão em inserções em 12 cavidades com diâmetro de 1,4 cm tendo poros de 3 µm a uma densidade de 2×106/cm2 (Greiner), ou placa de 6 cavidades (Corning) dependendo do protocolo do kit de ensaio de arranhão, ou lâminas de 8 câmaras cada de 0,75 cm×0,95 cm (Nunc). No Dia 4 (~1 dia após a subcultura) FBS foi reduzido para 0,5% por 12 horas. Privação total de FBS foi realizada durante a noite em conjunto com os arranhões feitos por pipeta de vidro Pasteur ou por gabarito de formulário de kit (ensaio de cura de feridas Cytoselect, Cell Biolabs Incorporated, CBA-120). As células foram tratadas com FBS a 5% em quadruplicatas ou triplicatas e foram deixadas durante todo o procedimento de ajuste antes da privação de FBS como um controle positivo e o mesmo número de cavidades não tratadas por Bioxomes usados como um controle negativo. Bioxomes foram adicionados após lavagem com HBSS mais Hepes, após coleta de meios condicionados que foram usados como uma fonte de Bioxomes /exossomas ativos liberados durante a privação. Contagem de células foi realizada como porcentagem de contagem de células versus controle positivo. Resultados:

[0075] Controle positivo suplementado com FBS a 5% alcançou o fechamento total do arranhão em 24 horas. Células não tratadas sob privação total e estresse por arranhões pararam de crescer e sofreram apoptose em 24 horas. Células viáveis foram contadas 12 horas após cada arranhão. Tratamento com Bioxomes de HFF a 10sup5 alcançou 60-75% do controle positivo. Bioxomes na mesma dose preparados com HFF mais RNA de HFK de 4 passagens resultaram no mesmo número de células. Bioxomes HFF com HFK RNA em todas as doses fecharam o arranhão completamente em 24 horas na mesma taxa que o controle positivo. O traço de arranhão permaneceu visto em Bioxomes HFF sem HFK RNA em 10sup3 Bioxomes HFF com RNA de HFF realizado de modo similar ao HFF sem RNA em dose alta. Exemplo 16: Estudo piloto para testar biodistribuição e efeito hepatoprotetor de Redoxomes em modelo de fibrose hepática in vivo.

[0076] Para desenvolver Biioxomes e Redoxomes como tratamentos hepatoprotetores opcionais, necrose hepática induzida por Concovalina A (ConA) foi selecionada como um modelo patológico in vivo. Para testar a eficácia de Bioxomes e Redoxomes in-vivo, n = 36 de ratos SD com idade de 10-11 semanas no início do estudo foram divididos em 3 grupos, 12 ratos em cada grupo. Um grupo adicional de seis animais foi usado para estudo de biodistribuição piloto. O grupo de controle foi tratado por PBS, após injeção de ConA; e o efeito hepatoprotetor de Bioxomes e Redoxomes foi calculado e apresentado como uma porcentagem de controle. 20 mg/kg de ConA foram injetados intravenosamente em todos os animais para induzir danos no fígado em comparação com animais não tratados basais. Uma única dose de Bioxomes E5 com ceramida rotulada fluorescente BioDipy foi injetada IV seguinte a administração de ConA. Ceramida BioDipy foi selecionada como sensor de lipídeos devido ao fato de que a peroxidação de lipídeos no sítio de inflamação é conhecida por influenciar a liberação da carga no sítio alvo. Ratos do estudo de biodistribuição foram sacrificados oito horas após a injeção de ConA e Bioxome BioDipy. Resultados:

[0077] Fluorescência forte foi vista 2 horas pós injeção no fígado, rim e pulmões. O fígado era o órgão alvo principal para Bioxom BioDipy. Para monitorar parâmetros funcionais de dano hepático agudo, os níveis no sangue de alanine aminotransferase (ALT) foram medidos 8 horas após a injeção de ConA em todos os grupos. Os níveis de ALT nos grupos de controle ConA estavam na faixa de 300 a 1000 Unidades/Litro enquanto o nível basal de ALT era menor do que 100 Unidades/Litro. Necrose hepática foi examinada por coloração com hematoxilina e eosina (H&E). Para exame histológico, um pedaço de fígado de cada animal foi aparado e fixado por imersão em formalina tamponada a 10% por 24 horas, seguinte a desidratação gradativa de etanol. Os blocos foram incorporados adicionalmente em cera de parafina. Seções em série de 3 mm foram coradas com H&E. A pontuação histopatológica avaliada para simplificar por dois patologistas “cegos” em três graus: 0 basal/saudável; 1 dano baixo a moderado 3 necrótico tóxico para tecido. A maioria dos animais tratados com Redoxome e Bioxome foram avaliados na pontuação 2, provando a viabilidade hepatoprotetora para dependência adicional de dose e tempo em modelos de patologia hepática aguda e crônica. Exemplo 17: Robustez e reprodutibilidade de QC e eficiência de encapsulação de Bioxomes obtidos a partir de uma variedade de células, RNA co-isolado e Bioxomes enriquecidos

[0078] Várias culturas de células e matéria-prima de células de extração inicial (células 2E3 a E9) foram usadas para preparar Bioxomes de células-tronco, linhagens celulares, e células diferenciadas e células cultivadas de origem de células de plantas. O rendimento de partículas de bioxome foi verificado correlacionado com o número de células iniciais e variou de partículas de bioxome E6-E12. Vários métodos industriais de secagem foram usados incluindo, evaporação de rotor padrão, evaporação de gás nitrogênio e argônio e secagem por congelamento. Rendimento e distribuição de tamanho de partícula similares foram obtidos por vários métodos. Células foram cultivadas em culturas adesivas tal como todas as células-tronco, HFF, HFK, HepG2, primárias, células de tabaco, e Jurkat (ATCC; Clone E6-1), que são linfócitos T expressando CD3 cultivados em biorreatores. Carga relevante foi adicionada antes da etapa de sonicação ou durante extrusão como necessário, em tampão de excipiente hidrofílico. Para melhorar a eficiência de encapsulação, três ciclos de congelamento-descongelamento com pelo menos 24 horas de intervalo foram realizados, resultando no tamanho de partícula <500 nm, quando preparado a partir de células-tronco da medula óssea. Figura 10A demonstra dados de tamanho de partícula menos uniformes, mas ainda sob as especificações de QC.

[0079] Solventes do tipo farmacêutico, tipo US P, de pureza >90% ou do tipo analítico, foram usados. Partículas de bioxome foram extraídas de nitrogênio líquido coletado, acumulado, lavadas duas vezes para remover FBD, ou/e grânulos congelados em meio de criopreservação contendo DMSO. Extração de bioxome foi realizada a partir de grânulos frescos e por extração direta de várias camadas de células de culturas adesivas (para evitar estresse por tripsina), de células-tronco, células estromais e epiteliais e de linhagens celulares, primárias e imortalizadas. Partículas de bioxome >E9 com tamanho de partícula uniforme representativo foram obtidas de MSC isolado de tecido adiposo humano, como demonstrado em Figura 10B. HIP 3:2 foi verificado como sendo o sistema de solvente ideal. Foi usado com 2:1 com RNAsave ou água estéril isenta de RNAse para co- precipitar RNA em uma única etapa. RNA puro foi recuperado, concentração medida por Nanodrop para assegura a pureza e a integridade foi testada. Concentração típica de RNA isolado pelo processo correlacionado com a concentração de partícula de bioxome é apresentada na Tabela 1, padronizada por número de células e peso de células: Parâmetro de Extração total de RNA Número de partículas rendimento Número de células ~1-10 mcg/E6 E9/E6 Peso úmido de 1,2 mcg/mg wwt E8/mg wwt células

[0080] Bioxomes foram preparados a partir do meio condicionado por procedimento similar com uma etapa de lavagem opcional. Antes da coleta de Bioxomes, as células foram lavadas com HBSS mais Hepes. Em condições depletadas em FBS, alto rendimento de RNA foi coletado.

[0081] Várias moléculas foram usadas como uma carga: ácido ascórbico, desferrioxamina e EDTA - como modelos de carga hidrofílica de pequenas moléculas; RNA e proteína de fluoresceína verde - como uma molécula biológica; ceramidas, tocoferol, éster de ácido docoshexaenóico, esfingomielina e terpeno – como amostras de lipídeo bioativo. Tamanho de partícula representativo de redoxome encapsulado em lipídeo bioativo com modificação de biomembrana e carga complexa resultou tipicamente em tamanho de partícula entre tamanho médio de 0,5-3 mícrons. Exemplo 18: Encapsulação de RNA e experimentos de eletroporação.

[0082] Para provar que Bioxomes são carreadores viáveis para transfecção e entrega de RNA, Bioxomes foram preparados a partir de células de sangue vermelhas humanas RBC. RBCs foram coletados de amostras de sangue do Grupo O, então RBCs separados do plasma e das células de sangue brancas usando centrifugação e filtros de leucodepleção (Terumo Japan). O procedimento de extração de Bioxome foi realizado como descrito acima. Calibração de eletroporação foi feita para transferência futura de oligonucleotídeos purificados em Bioxomes por controle positivo validado. Os experimentos de eletroporação foram realizados usando um eletroporador Gene Pulser Xcell (BioRad), programa exponencial a uma capacitância fixa de 100 μF com cuvetas de 0,4 cm. Bioxomes E12 obtidos de RBCs E9 diluídos em OptiMEM (ThermoFisher Scientific) e misturados com 4 μg de Dextrano conjugado com AF647 (ThermoFisher Scientific) para um volume total de 200 μl, 100 µl de alíquotas de Bioxomes foram adicionados em cada cuveta e incubados em gelo por 15 min a 150-250 V. Em um caso em que agregado se formou, desagregação foi realizada por um único pulso de sonicação adicional a 50% de redução de energia do que durante a formação de partícula de Bioxome como acima. Para testar a eficácia de encapsulação, medição FACS de Dextrano-AF647 foi realizada após os Bioxomes eletroporados serem incubados durante a noite com 5 μg de contas de látex (ThermoFisher Scientific).

[0083] Em adição, Bioxomes derivados de tecido Adiposo encapsulados em RNA bruto foram preparados – Bioxomes E8 foram preparados a partir de cultura de células E6 de tecido adiposo humano e encapsulados por ultrassonicação suave com um único pulso de seis segundos e 40% de energia e 0,5 mcg de RNA (para preservar a integridade do RNA) e, então, encapsulados. O índice de polidispersidade PDI de Bioxomes encapsulados em RNA obtidos era 548 nm. Partículas de bioxome encapsuladas em RNA foram diluídas adicionalmente dez vezes e, então sonicadas por outro pulso de 30 s resultando em tamanho médio de partícula de 450 nm. Extrusão adicional pela extrusora Avant levou a um tamanho médio de partícula de 100 nm, particularmente para direcionamento do fígado. A robustez do processo foi validada pelo isolamento eficiente de RNA total na mesma etapa, e rendimento similar de RNA foi obtido a partir do meio condicionado.

[0084] Exemplo 19: Bioatividade de tratamento de Bioxome/RNA em cultura de fibroblastos de prepúcio humano com HFF.

[0085] Ensaio de proliferação de células MTT-a 3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (Life Technologies) foi realizado para investigar o efeito de Bioxomes derivados de tecido adiposo carregados com 0,5 mcg de RNA interno/por bioxomes derivados de células E8 como descrito acima na viabilidade celular seguinte ao estresse de privação (privação de soro). 1×104 células/cavidade foram semeadas em placas de 96 cavidades e cultivadas por 18~24 h para alcançar 90% de confluência. Após a fixação, as células foram lavadas duas vezes com PBS, então meio isento de soro adicionado. Tanto as células privadas de soro como as de controle (10% de soro) foram coletadas em 24 h. Os sobrenadantes da cultura de células foram descartados e 20 µl de solução de MTT foram adicionados em cada cavidade (0,5 mg/ml; Sigma Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha), então as células foram cultivadas por 4 h adicionais. Os sobrenadantes foram então removidos e 200 µl de DMSO foram adicionados em cada cavidade, com agitação leve por 15 min. A absorbância a um comprimento de onda de 490 nm foi então detectada com 4 replicatas usadas para cada cavidade e um valor médio calculado. Após FBS, privação de 10% DMEM FBS para 0% FBS foi realizada 24 horas antes do experimento e amostras tratadas com Bioxomes têm o mesmo efeito proliferativo em HFF similar ao controle positivo (10%FBS) em comparação com amostras isentas de soro onde a viabilidade foi reduzida em quase 30%. Exemplo 20: Resultados da prova de conceito de estabilidade.

[0086] A fim de testar a viabilidade para o projeto de estabilidade de Bioxomes, medula óssea e outras várias fontes de Bioxomes derivados de células foram preparadas como descrito acima e armazenados após sonicação em várias temperaturas, por 4oC por um dia, semana, e mês; armazenados em Revco -70oC. A concentração e distribuição de tamanho de EVs foram quantificados usando um sistema NanoSight Tracking Analysis NS300 (Malvern, UK). Figura 3A-C representa exemplos de tamanho de partícula. Foi mostrado que a concentração de partículas não foi afetada no armazenamento de curto prazo (menos do que uma semana), e agregada após um mês de armazenamento a 4oC. A estabilidade de amostras após congelamento a 70oC não foi afetada. De maneira notável, Bioxomes pré-sonicados também eram estáveis após -70oC no mesmo nível que aqueles que foram sonicados repetidamente antes da medição de tamanho de partícula.

[0087] A terminologia usada aqui é apenas para fins de descrição de modalidades particulares e não é destinada a ser uma limitação da invenção. Como usado aqui, as formas singulares "um”, "uma" e "o, a”, são destinadas a incluir também as formas plurais, salvo se o contexto indicar claramente em contrário. Será entendido adicionalmente que os termos "compreende" ou "compreendendo”, quando usados neste relatório, especificam a presença de características, números inteiros, etapas, operações, elementos componentes e/ou grupos relatados ou combinações dos mesmos, mas não excluem a presença ou adição de uma ou mais outras características, números inteiros, etapas, operações, elementos, componentes e/ou grupos ou combinações dos mesmos. Como usado aqui os termos "compreende", "compreendendo", "inclui", "incluindo", “tendo” e seus conjugados significam "incluindo, mas não limitado a". O termo “consistindo de” significa “incluindo e limitado a”.

[0088] Como usado aqui, o termo "e/ou" inclui qualquer uma e todas as combinações possíveis ou um ou mais dos itens listados associados, assim como, a falta de combinações quando interpretado na alternativa ("ou").

[0089] "Exossomas", como o termo é usado aqui, refere- se a microvesículas derivadas de membrana, que incluem uma faixa de vesículas extracelulares, incluindo exossomas, micropartículas e microvesículas secretadas, oncossomas, ectossomas, secretados por muitos tipos de células tanto sob condições fisiológicas como patológicas normais e podem ser aplicados em vesículas intracelulares, vesículas de secretoma de plantas, microbioma e partículas do tipo retrovirais de todos os tamanhos.

[0090] Salvo se definido em contrário, todos os termos (incluindo termos técnicos e científicos) usados aqui têm o mesmo significado que o comumente entendido pelos versados na técnica a qual esta invenção pertence. Será entendido adicionalmente que termos, tais como os definidos em dicionários comumente usados, devem ser interpretados como tendo um significado que é consistente com seu significado no contexto do relatório e reivindicações e não devem ser interpretados em um sentido idealizado ou excessivamente formal a menos que expressamente definido aqui. Funções ou construções bem conhecidas podem não ser descritas em detalhes por brevidade e/ou clareza.

[0091] Será entendido que quando um elemento é referido como estando "em" "fixado" a, "conectado" a, "acoplado" com, "em contato”, etc., com outro elemento, ele pode estar diretamente em, fixado a, conectado a, acoplado com e/ou em contato com outro elemento ou elementos intervenientes também podem estar presente. Em contraste, quando um elemento é referido como estando, por exemplo, "diretamente em”, "diretamente fixado" a, "diretamente conectado" a, "diretamente acoplado" com ou "diretamente em contato" com outro elemento, não existem elementos intervenientes presentes. Também será apreciado pelos versados na técnica que referências a uma estrutura ou característica que é disposto "adjacente" a outra característica pode ter porções que se sobrepõem ou sustentam a característica adjacente.

[0092] Será entendido que, embora os termos primeiro, segundo, etc., possam ser usados aqui para descrever vários elementos, componentes, regiões, camadas e/ou seções, estes elementos, componentes, regiões, camadas e/ou seções não devem ser limitados por estes termos. Em vez disso, estes termos são usados apenas para distinguir um elemento, componente, região, camada e/ou seção, e outro elemento, componente, região, camada e/ou seção.

[0093] Certas característica da invenção, que são, por clareza, descritas no contexto de modalidades separadas, também podem ser previstas em uma única modalidade.

Inversamente, várias característica da invenção, que são, por brevidade, descritas no contexto e uma única modalidade, também podem ser fornecidas separadamente ou em qualquer subcombinação apropriada ou como apropriado em qualquer outra modalidade descrita da invenção. Certos características descritas no contexto de várias modalidades não devem ser consideradas aspectos essenciais daquelas modalidades salvo se a modalidade for inoperante sem estes elementos.

[0094] Sempre que o termo “cerca de”, é usado, ele se destina a referir-se a um valor mensurável, tal como uma quantidade, uma duração temporal e similares, e se destina a encerrar variações de ±25%, ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, ou ±0,1% do valor especificado, uma vez que tais variações são apropriadas para realizar os métodos divulgados.

[0095] Em todo o presente pedido, várias modalidades desta invenção podem ser apresentadas em um formato de faixa. Deve ser entendido que, a descrição em formato de faixa é meramente por conveniência e brevidade e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível no escopo da invenção. Consequentemente, a descrição de uma faixa deve ser considerada como tendo divulgado especificamente todas as subfaixas possíveis, assim como, valores numéricos individuais dentro daquela faixa. Por exemplo, a descrição de uma faixa tal como de 1 a 6 deve ser considerada como tendo divulgado especificamente subfaixas tal como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., assim como, números individuais dentro daquela faixa, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, e 6. Isto se aplica independentemente da amplitude da faixa.

[0096] Sempre que uma faixa numérica é indicada aqui, ela destina-se a incluir qualquer numeral citado (fracionário ou integral) dentro da faixa indicada. A frases “estando na faixa/está na faixa entre” um primeiro número indicado e um segundo número indicado e “estando na faixa/está na faixa de” um primeiro número indicado “a” um segundo número indicado são usadas aqui de modo intercambiável e se destinam a incluir o primeiro e segundo números indicados e todos os numerais fracionários e integrais entre elas.

[0097] Como usado aqui o termo "método" refere-se a modos, meios, técnicas e procedimentos para realizar uma dada tarefa, mas não limitado a estas maneiras, meios, técnicas e procedimentos ou conhecidos para, ou rapidamente desenvolvidos a partir de maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos por praticantes das técnicas químicas, farmacológicas, biológicas, bioquímicas e médicas.

[0098] Por “paciente” ou “indivíduo” entende-se qualquer mamífero. Um “mamífero”, como usado aqui, refere- se a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo mas não limitado a, humanos, animais experimentais incluindo macacos, ratos, camundongos, e porquinhos-da-índia, animais domésticos e de criação, e animais de zoológico, esportes, ou estimação, tais como cães, cavalos, gatos, vacas, e similares.

[0099] Todas as publicações, pedidos de patente, patentes, e outras referências mencionadas aqui são incorporadas por referência em sua totalidade. No caso de conflito, o relatório da patente, incluindo definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a ser limitativos.

[00100] Será apreciado pelos versados na técnica que a presente invenção não está limitada ao que foi particularmente mostrado e descrito acima. Em vez disso, o escopo da presente invenção é definido pelas reivindicações em anexo e inclui tanto combinações como subcombinações das várias características descritas acima, bem como variações e modificações das mesmas, que podem ocorrer aos versados na técnica após a leitura da descrição precedente.

Claims

REIVINDICAÇÕES EMENDADAS

1. Partícula de bioxome artificial, caracterizada pelo fato de que compreende um componente de membrana celular e concebida para sofrer fusão com uma célula alvo, em que dito componente de membrana é derivado de uma fonte celular ou extracelular pré-definida e obtida por extração de lipídeo com um sistema solvente suave; e em que dita partícula de bioxome é modificada para transportar uma carga compreendendo pelo menos uma molécula ativa predeterminada; e em que dita carga pode ser liberada na célula alvo após a fusão da partícula de bioxome com a célula alvo.

2. Partícula de bioxome, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a carga compreende uma pluralidade de moléculas ativas.

3. Partícula de bioxome, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a fonte é selecionada dentre o grupo consistindo de fibroblastos, células-tronco mesenquimais, células-tronco, células do sistema imune, células dendríticas, ectoderma, queratinócitos, células de GI, células de cavidade oral, células mucosais nasais, células neuronais, células retinais, células endoteliais, cardioesferas, cardiomiócitos, pericites, células sanguíneas, melanócitos, células parenquimais, células de reserva do fígado, células- tronco neurais, células-tronco pancreáticas, células-tronco embrionárias, medula óssea, tecido da pele, tecido do fígado, tecido pancreático, fluidos biológicos, excrementos ou tecidos extraídos por cirurgia, leite, saliva, muco, plasma sanguíneo, urina, fezes, sebo, cordão umbilical pós-natal,

placenta, saco amniótico, tecido renal, tecido neurológico, tecido da glândula adrenal, epitélio mucosal, tecido de músculo liso, um célula bacteriana, uma cultura bacteriana, um microrganismo completo, meio condicional, fluido amniótico, lipoaspirado, subprodutos de lipossucção e um tecido de planta.

4. Partícula de bioxome, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a molécula ativa é selecionada dentre o grupo consistindo de ácido nucleico, peptídeo, aminoácido, polipeptídeo, nucleosídeo, fator de crescimento, molécula orgânica, polifenol, esteróide, fármaco lipofílico pouco solúvel, molécula inorgânica, anti-oxidante, hormônio, anticorpo, vitamina, citoquina, enzima, proteína de choque térmico, ou uma combinação dos mesmos.

5. Partícula de bioxome, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a molécula ativa é selecionada dentre canabinóide, ácido canabinóide, endocanabinóide, rapamicina e CoQ10.

6. Partícula de bioxome, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a molécula ativa tem um efeito terapêutico.

7. Bioxome, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser um redoxome, em que a carga compreende pelo menos um composto ativo redox removedor de radicais livres.

8. Redoxome, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de ser capaz de bloquear a reação de cadeia de LPO, tal como uma armadilha de radical de lipídeo/peróxido, tal como vitamina E, terpenóides,

polifenóis, flavonóide, ácidos fenólicos, canabinóides, retinóides, vitamina D, ácido lipóico, esteróis.

9. Redoxome, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de compreender um quelante de ferro selecionado dentre o grupo consistindo de desferrioxamina (DFX), ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA), rutina, EDTA dissódico, EDTA tetrassódico, EDTA dissódico de cálcio, ácido dietilenotriaminapentaacético (DTPA) ou um sal do mesmo, ácido hidroxietiletilenodiaminatriacético (HEDTA) ou um sal do mesmo, ácido nitrilotriacético (NTA), citrato de acetil trihexila, ácido aminotrimetileno fosfônico, ácido beta-alanina diacético, citrato de bismuto, ácido cítrico, ácido ciclohexanodiamina tetraacético, citrato de diamônio, oxalato de dibutila, oxalato de dietila, oxalato de diisobutila, oxalato de diisopropila, oxalato de dilítio, oxalato de dimetila, EDTA dipotássico, oxalato de dípotássio, oxalato de dipropila, EDTA dissódico-cobre, pirofosfato de dissódio, ácido etidrônico, HEDTA, metil ciclodextrina, ácido oxálico, pentapotássio, trifosfato, aminotrimetileno fosfonato de pentassódio, pentetato de pentassódio, trifosfato de pentassódio, ácido pentético, ácido dicarboxílico, ácido fítico, citrato de potássio, citrato de sódio, dihidroxietilglicinato de sódio, gluceptato de sódio, gluconato de sódio, hexametafosfato de sódio, metafosfato de sódio, metassilicato de sódio, oxalato de sódio, trimetafosfato de sódio, tea-EDTA, tetrahidroxipropil etilenodiamina, etidronato de tetrapotássio, pirofosfato de tetrapotássio, etidronato de tetrassódio, pirofosfato de tetrassódio, EDTA tripotássico, EDTA de trissódio, hedta trissódico, NTA trissódico, fosfato de trissódio, ácido málico, ácido fumárico, maltol, sucímero, penicilamina, dimercaprol, deferipron, um quelante de ferro à base de proteína natural, melatonina, sideróforo, cátion de zinco ou cobre, ou sal ou complexo, mesilato de desferrioxamina, detoxamina, deferoxamina, deferiprona, deferasirox, glutationa, metaloproteína, ferrochel (quelato de bis-glicinato), ceruloplasmina, penicilamina, cuprizona, trientina, ácido ferrúlico, acetato de zinco, e lipocalina 2 ou uma combinação dos mesmos.

10. Partícula de bioxome, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de ser um bioxome de lenta liberação e circulação longa, um bioxome de direcionamento seletivo, um bioxome imunogênico; ou qualquer combinação dos mesmos.

11. Composição, caracterizada pelo fato de compreender partícula de bioxome, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, e pelo menos um carreador.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a composição é uma composição farmacêutica e o carreador é um carreador farmaceuticamente aceitável.

13. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a composição é uma composição cosmecêutica e o carreador é um carreador cosmeceuticamente aceitável.

14. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a composição é uma composição comestível, e o carreador é carreador de tipo comestível.

15. Processo para a fabricação de uma amostra compreendendo uma pluralidade de partículas de bioxome, em que as partículas de bioxome são modificadas para transportar uma carga compreendendo pelo menos uma molécula ativa e concebida para sofrer fusão com uma célula alvo para liberar a carga; e em que ditas partículas de bioxome compreendem um componente de membrana celular derivado de uma fonte celular ou extracelular pré-definida; o processo caracterizado pelo fato de que compreende: a. realizar a extração de lipídeo da célula total a partir da fonte celular ou extracelular selecionada em um sistema solvente suave para obter um extrato de lipídeo; b. secar o extrato de lipídeo; e c. induzir auto-montagem das partículas de bioxome realizando pelo menos uma etapa de ultrassonicação e/ou extrusão; em que as partículas de bioxome resultantes na amostra são caracterizadas por um tamanho médio de partícula de cerca de 0,03 µm a 5 µm.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o tamanho médio de partícula é 0,05 µm a 3 µm.

17. Processo, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que a amostra compreendendo a partícula de bioxome tem o pH de 3,5 a 5,5.

18. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizado pelo fato de que o sistema solvente suave compreende uma mistura de solventes polares e não polares.

19. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, caracterizado pelo fato de que o sistema solvente compreende adicionalmente um estabilizador.

20. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 19, caracterizado pelo fato de que o sistema solvente compreende adicionalmente um antioxidante, um tensoativo, vitamina E, esqualeno, colesterol, ou uma combinação dos mesmos.

21. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 20, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de co-precipitação de um ácido nucleico.

22. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 21, caracterizado pelo fato de que a fonte celular ou extracelular para a extração de lipídeo total é selecionada dentre o grupo consistindo de fibroblastos, células-tronco mesenquimais, células-tronco, células do sistema imune, células dendríticas, ectoderma, queratinócitos, células de GI, células de cavidade oral, células mucosais nasais, células neuronais, células retinais, células endoteliais, cardioesferas, cardiomiócitos, pericites, células sanguíneas, melanócitos, células parenquimais, células de reserva do fígado, células- tronco neurais, células-tronco pancreáticas, células-tronco embrionárias, medula óssea, tecido da pele, tecido do fígado, tecido pancreático, cordão umbilical pós-natal, placenta, saco amniótico, tecido renal, tecido neurológico, tecido da glândula adrenal, epitélio mucosal, tecido de músculo liso, uma célula bacteriana, uma cultura bacteriana, um microrganismo completo, meio condicional, fluido amniótico, lipoaspirado, subprodutos de lipossucção e um tecido de planta.

23. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 22, caracterizado pelo fato de que a extração de lipídeo é realizada a partir de meio de célula condicionado, meio de célula condicionado liofilizado, grânulo celular, células congeladas, células secas, massa de células lavadas, suspensão de células não adesivas e camada de células adesivas.

24. Amostra, caracterizada pelo fato de que compreende uma pluralidade de partículas de bioxome, preparadas de acordo com o processo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 15 a 23.

25. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de ser para uso para tratamento ou prevenção de uma patologia em um indivíduo em necessidade de tal tratamento.

26. Partícula de bioxome, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de ser para uso como um veículo para a entrega de moléculas ativas para o sítio alvo.

27. Partícula de bioxome, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de ser para uso como um medicamento.

Dia de Produção Após Mês

Desvio Tamanho % Volume Pad.

Z Médio Pico 1: Pico 2: Intercepto: Pico 3: Resultado qualidade: Bom

Distribuição de tamanho por volume Volume (porcentagem)

Tamanho

Registro

Tamanho Tamanho

Células Colheita direta

Composição de lipídeos

Meio condicionado

Secagem QC – composição de lipídeos modificação e encapsulação de QC – processo de nanopartículas nanopartícula de BioxomeTM fibroblastos 3T3 lipossomas fibroblastos 3T3 células gliais fibroblastos 3T3 células gliais

Fosfatidilcolina

Colesterol

Antioxidante solúvel em lipídeo Redox Lipídeo/Fosfolipídeo sensível Desencadear ao estresse oxidativo

Vazamento de lipossoma (Fluorescência, A.U.)

Tempo (min)

Vazamento de calceína induzido por Triton de lipossomas

Concentração (partículas / ml)

Tamanho (nm) Concentração FTLA / Gráfico de tamanho para Experimento Concentração (partículas / ml) Concentração (partículas / ml)

Tamanho (nm) Tamanho (nm)