KR20200141080A

KR20200141080A - 바이옥솜 입자, 레독솜, 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR20200141080A
Application number: KR1020207032323A
Authority: KR
Inventors: 사비나 글로츠만
Original assignee: 오르제네시스 인코포레이티드
Priority date: 2018-04-09
Filing date: 2019-04-04
Publication date: 2020-12-17
Also published as: AU2019251449A1; CN112739332A; WO2019198068A1; BR112020020831A2; JP2021521141A; EP3773520A1; IL277728A; EP3773520A4; SG11202009788TA; US20210052506A1; CA3096448A1

Abstract

세포막 성분을 포함하고, 표적 세포와 융합되도록 설계된, 인공 바이옥솜(bioxome) 입자로서, 상기 바이옥솜 입자는, 하나 이상의 소정의 활성 분자를 포함하는 카고(cargo)를 운반하도록 조작되고; 상기 카고는 바이옥솜 입자와 표적 세포의 융합 후에 표적 세포 안으로 방출될 수 있고; 및 상기 세포막 성분은 선택된 세포성 공급원 또는 세포외 공급원으로부터 유래된 것인, 인공 바이옥솜 입자; 상기 입자의 사용 방법; 및 이의 제조 방법이 제공된다.

Description

바이옥솜 입자, 레독솜, 방법 및 조성물

본 발명은 활성 생체물질을 전달하도록 조작된 신규한 바이옥솜(bioxome) 입자, 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.

엑소좀(exosome)은 핵산과 단백질을 운반하는 자연적으로 발생하고 분비되는 지질막 미세소포로, 이들 물질을 세포 소기관 간에 및 세포 간에 전달하여 세포 간 신호전달을 가능하게 한다. 엑소좀은 원형질막과의 융합시 세포 외로 방출되는 엔도리소좀 소포의 함입에 의해 형성된다.

엑소좀은 항상성 조건에서 또는 질병 상태의 병리학 동안 다양한 생리적 기능을 가진다. 세포는 각각 엑소좀 및 미세소포 (micro-vesicle, MV)라고 지칭되는, 엔도좀 및 원형질막 기원의 다양한 유형의 막 소포를 세포외 환경으로 방출한다. 집합적으로 이들 세포외 소포(extracellular vesicle, EV)들은 막을 가진 세포 간에 세포질 단백질, 지질 및 RNA 를 운반하는 비히클로 작용하여 세포 간 신호전달의 중요한 방식을 나타낸다.

지질은 지방산, 특히 고도불포화지방산 (polyunsaturated fatty acid, PUFA)에 존재하는 다중 이중결합으로 인해 FR의 특히 중요한 기질이다. 지질 과산화 (lipid peroxidation, LPO)는 개시(initiation), 전파(propagation) 및 종결(termination)의 주요 세단계로 구성된 연쇄 과정이다. 천연 원형질막의 주성분은 PUFA로 구성된 극성 인지질 (polar phospholipid, PL)이어서 산화 스트레스에 취약하다. 전통적으로, LPO는 산소 라디칼로 인한 손상을 일으켜 막 파괴, 퇴화 과정 및 세포 사멸을 일으키는 주요 과정으로 간주되어 왔다.

천연 엑소좀내 유전 물질과 단백질이 존재한다는 것은 엑소좀이 그러한 생체 물질들의 비히클로 작용할 수 있음을 의미한다. 리포좀과 유사한, 막 이중층 및 수성 코어의 구조는 세포막을 통한 내용물의 전달을 가능하게 한다. 따라서, 엑소좀은 다양한 생체물질들에 대한 전달 시스템으로 작용할 수 있는 큰 잠재력을 가진다. 엑소좀의 다양한 적용 및 엑소좀 제조 방법은 US2004/0082511; US5,428,008, US5,165,938; US 2004/0082511; US9/119,974; US2013/0143314; US2011/0014251; US2013/0052647; WO2015110957; WO/2015/138878; US20130209528; WO2009105044; US8,138,147; US8,518,879; US8,138,147; US2011/0003008; US2013/0209528; US2011/0003008; US2013/0209528 에 기술되어 있다.

엑소좀은, 막 융합 및 세포 내 표적화 기능을 기반으로, 현재 사용되는 최신 약물전달시스템(Drug Delivary System, DDS)에서 미해결된 다음의 요구를 극복하기 위한 DDS 로서 적용될 가능성이 있다: (i) 세포외 효소로 인한 네이키드 유전자 및 핵산 전달의 불안정성; (ii) 바이러스 및 리포좀 DDS가 숙주 면역계에 의해 외부 입자로 인식되어 이들에 대한 항체가 생성됨으로써 전달 및 안전성을 감소시킴; (iii) 대부분의 활성 천연 및 치료 약물들이 본질적으로 소수성이어서, LPO에 취약하고 생체이용률이 낮음. 상기한 것들은 모두 단백질과 DNA를 포함한, 생산수율, 제어 로딩, 안정성 및 조성의 개선이라는, 엑소좀-DDS(약물 전달 시스템)의 가능성을 충족하기 위해 극복해야할 주요 과제들이다. 또한, 현재 알려진 엑소좀 생산 방법은 복잡하고 다단계로 인해 치료용 카고 (cargo)의 운반 비히클로서의 임상적 적용을 제한한다. 따라서, 최대한의 막 온전성, LPO 연쇄 반응에 대한 안정성, 및 치료제; 운반 비히클; 및 연구도구로 사용하는데 필요한 자연적 특성들을 유지하는, 엑소좀을 유사하게 구현하는 인공 막 소포의 대규모 생산을 위한 간단하고, 견고하고, 비용 효율적인 산업적 방법이 여전히 필요하다.

발명의 요지

따라서, 본 발명의 주요 목적은, 최대한의 막 온전성을 유지하고 활성 생체분자의 전달을 위한 비히클로서 또는 다양한 산업적 적용을 가진 독립형 제제로서 사용하기 위해 조작된, 엑소좀-유사 인공 입자의 산업-규모 생산을 위해, 종래 방법 및 시스템들의 단점을 극복하는 것이다.

본 발명은 세포막 성분을 포함하고 표적 세포와 융합되도록 설계된 인공 바이옥솜 입자를 제공하며, 상기 바이옥솜 입자는, 하나 이상의 소정의 활성 분자를 포함하는 카고(cargo)를 운반하도록 조작되고; 상기 카고는 바이옥솜 입자와 표적 세포의 융합 후에 표적 세포 안으로 방출될 수 있고; 및 상기 세포막 성분은 선택된 세포성 공급원 또는 세포외 공급원으로부터 유래된다.

본 발명은 또한 세포막 성분을 포함하고 표적 세포와 융합되도록 설계된 인공 바이옥솜 입자를 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 바이옥솜 입자는, 하나 이상의 소정의 활성 분자를 포함하는 카고(cargo)를 운반하도록 조작되고; 상기 카고는 바이옥솜 입자와 표적 세포의 융합 후에 표적 세포 안으로 방출될 수 있고; 및 상기 세포막 성분은 선택된 세포성(cellular) 공급원 또는 세포외(extracellular) 공급원, 및 하나 이상의 담체로부터 유래된다.

본 발명은 또한 복수의 바이옥솜 입자를 포함하는 샘플의 제조 방법을 제공하며, 상기 바이옥솜 입자는 하나 이상의 활성 분자를 포함하는 카고(cargo)를 운반하도록 조작되고, 표적 세포와 융합하여 카고를 방출하도록 설계되고; 상기 바이옥솜 입자는 선택된 세포성 공급원 또는 세포외 공급원으로부터 유래된 세포막 성분을 포함하고; 상기 방법은 다음을 포함하며:

a. 약용매(mild solvent) 시스템에서, 선택된 세포성 공급원 또는 세포외 공급원으로부터 전체 세포 지질 추출을 수행하여 지질 추출물을 얻는 단계;

b. 상기 지질 추출물을 건조하는 단계; 및

c. 초음파 처리를 한 단계 이상 수행하여 바이옥솜 입자의 자가-조립을 유도합는 단계;

샘플에서 생성된 바이옥솜 입자는 약 0.03㎛ 내지 5㎛의 평균 입자 크기를 특징으로 한다.

본 발명은 또한 세포막 성분을 포함하고 표적 세포와 융합되도록 설계된 인공 바이옥솜 입자 및 하나 이상의 담체를 포함하는 약학 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 치료가 필요한 개체에서 병리를 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 바이옥솜 입자는, 하나 이상의 소정의 활성 분자를 포함하는 카고(cargo)를 운반하도록 조작되고; 상기 카고는 바이옥솜 입자와 표적 세포의 융합 후에 표적 세포 안으로 방출될 수 있고; 및 상기 세포막 성분은 선택된 세포성 공급원 또는 세포외 공급원으로부터 유래된다.

본 발명은 또한 세포막 성분을 포함하고 표적 세포와 융합되도록 설계된 인공 바이옥솜 입자 및 하나 이상의 담체를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 필요한 개체에서 피부 상태를 개선하는 방법을 제공하며, 상기 바이옥솜 입자는, 하나 이상의 소정의 활성 분자를 포함하는 카고(cargo)를 운반하도록 조작되고; 상기 카고는 바이옥솜 입자와 표적 세포의 융합 후에 표적 세포 안으로 방출될 수 있고; 및 상기 세포막 성분은 선택된 세포성 공급원 또는 세포외 공급원으로부터 유래된다.

도 1. Malvern 기기로 측정한 바이옥솜 입자의 입자 크기 분포: A. 분리 직후 B. 분리하고 한 달 후;
도 2. 바이옥솜 입자 크기 분포. A. ZetaSizer 나노 분석기로 측정한 바이옥솜의 입자 크기 분포. 분석기에 의한 측정값은 히스토그램 상에 두 개의 피크로 표시된다 (x 축은 입자 크기를 나타냄). B. NanoSight 입자 크기 분석기에 의해 검출된 바이옥솜의 입자 크기 분포. X 축은 nm 단위의 입자 크기를 나타내고, y 축은 ml 당 입자 수를 나타낸다. 왼쪽 패널은 동일한 샘플의 3개 측정값을 나타낸다. 오른쪽 패널은 왼쪽 패널에서 수행된 3회 측정의 평균을 나타낸다.;
도 3. 바이옥솜 안정성 및 입자 크기 분포. 3 가지 다른 샘플에서 생산된 바이옥솜의 크기 분포 프로파일을 제시한다. A. 재-초음파 처리가 없는 샘플. B. 재-초음파 처리된 샘플. C. 동결건조 및 초음파 처리 후 샘플;
도 4. BioDipy 표지된 바이옥솜을 인간 포피 섬유아세포(Human Foreskin Fibroblast, HFF) 일차 배양물에 융합한 공초점 현미경 이미지. 세가지 다양한 세포 공급원에서 생성된 바이옥솜 및 실험 24시간 전에 측정된 입자 크기의 평균 직경. A. 원발성 인간 탯줄 정맥 내피 세포 (HUVEC)-ATCC® PCS-100-010™ 입자 크기: >90% ~1,4 mcn; B. 원발성 인간 유방 상피 세포; ATCC® PCS-600-010™. 실험 24시간 전에 측정된 입자 크기: 40% ~ 300nm; 60%: 600 입자 크기; 실험 24 시간 전에 측정 -1 mcn nm. C. NIH3T3 섬유아세포; ATCC® CRL-1658; 입자 크기: >90% ~750 nm.
도 5. 부착 세포에서 바이옥솜 입자 분리의 일반적인 개요;
도 6. 기원-표적 조직에 대한 바이옥솜 입자의 특이성. A. 실험공정의 개략도. B. 실험 데이터;
도 7. 레독솜 입자의 개략도;
도 8. 두 가지 다른 농도의 DHA 및 α-토코페롤의 존재하에 POBN 부가물 형성에 의해 측정된(EPR 스펙트럼) 레독솜 입자의 레독스 감도;
도 9. A. 레독솜 입자에서 하이드록실 라디칼에 의한 누출의 동역학. B. 레독솜 입자로부터의 트리톤에 의해 유도된 칼세인 누출; 및
도 10. RNA 캡슐화 용량. 골수 유래 인간 중간엽 줄기세포 (MSC) (PromoCell, C-12974)에서 생성된 공동-추출된 RNA 로 캡슐화된 바이옥솜, NanoSight 분석기에 의해 수행된 크기 측정. A. 로딩 향상 접근 방식으로서 반복적인 (3 회) 동결-해동 안정성, 균일성이 소실되었으나 1,5 mcn 미만의 사양이 유지됨. B. 단일 동결-해동주기 후 RNA 균일 캡슐화 및 C-동결 해동 주기없이-초음파/RNA 캡슐화 후 신선하게 측정됨.

본 발명은, 본 발명의 실시예가 도시된 첨부 도면을 참조하여 이하에서 보다 완전하게 설명된다. 그러나 본 발명은 여러가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 본 발명이 본원에 설명된 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 오히려 이들 실시예는 본 개시가 철저하고 완전하게 통상의 기술자에게 본 발명의 범위를 충분히 전달할 수 있도록 제공된다.

본 발명은 세포막 성분을 포함하고, 표적 세포와 융합되도록 설계된, 인공 바이옥솜(bioxome) 입자를 제공하며, 상기 바이옥솜 입자는, 하나 이상의 소정의 활성 분자를 포함하는 카고(cargo)를 운반하도록 조작되고; 상기 카고는 바이옥솜 입자와 표적 세포의 융합 후에 표적 세포 안으로 방출될 수 있고; 및 상기 세포막 성분은 선택된 세포성(cellular) 공급원 또는 세포외(extracellular) 공급원으로부터 유래된다. 본원에서 사용되는 용어 "바이옥솜(bioxome)"은, 천연 세포외 소포 (EV)와 유사한 인공 서브마이크론 나노-입자를 제한없이 지칭한다. 본 발명의 바이옥솜의 입자 크기는 0.03 μm 내지 5 μm 범위이다. 일 구체예에서, 바이옥솜의 크기는 0.1-0.7 μm; 0.1-0.5μm, 0.2-0.5μm; 0.3-0.5μm 이다. 또 다른 구체예에서, 평균 입자 크기는 5 ㎛ 이하; 1.5μm 이하; 0.7μm 이하; 0.5μm 이하; 0.3μm 이하; 0.15μm 이하이다. 일 구체예에서, 평균 입자 크기는 0.5 μm 내지 1.5 μm 이다. 일 구체예에서, 평균 입자 크기는 0.4 μm 내지 0.8 μm 이다. 다른 구체예에서, 평균 입자 크기는 0.3 μm 내지 0.5 μm 이다. 또 다른 구체예에서, 평균 입자 크기는 제조 후 몇 시간 내에 입자 크기를 측정했을 때, 0.4 μm 내지 1.5 μm 이다. 또 다른 구체예에서, 입자 크기는 제조후 바이옥솜 입자들을 0℃ 내지 4℃에서 보관한 후 1 개월 이내에 입자 크기를 측정했을 때, 0.8 μm 내지 5 μm 이다.

일 구체예에서, 바이옥솜 입자는 로딩된 것이 없다(free of load). 또 다른 구체예에서, 입자는 하나 이상의 활성 분자를 포함하는 카고(cargo)를 운반한다. 일 구체예에서, 카고는 2 이상의 활성 분자를 포함한다. 다른 구체예에서, 카고는 복수의 활성 분자를 포함한다. 본원에 사용 된 용어 "활성 분자"는, 신호 분자, 생체 분자; 유전적 및 번역 변형 핵산 물질; 데옥시리보핵산 (DNA); 리보핵산 (RNA); 유기 분자; 무기 분자; 아미노산; 비타민; 폴리페놀, 스테로이드, 친유성 난용성 약물, 혈관 조절제; 펩티드; 신경 전달 물질 및 이의 유사체; 뉴클레오시드; 성장 인자, 호르몬, 압타머, 항체, 사이토카인, 효소 및 열충격 단백질을 포함 하나 이에 제한되지 않는 단백질; 또는 생물학적 기능을 발휘할 수 있는 다른 분자를 제한없이 지칭한다. 일 구체예에서, 활성 분자는 칸나비노이드, 칸나비노이드 산 및 엔도칸나비노이드이다. 또 다른 구체예에서, 칸나비노이드 또는 칸나비노이드 산은 테트라하이드로칸나비놀산 (THCa), 칸나비디올산 (CBDa), 칸나비놀산 (CBNa), 칸나비크로멘산 (CBCa), 테트라하이드로칸나비놀 (THC), 칸나비놀 (CBN), 칸나비놀 (CBN), 칸나비디올 (CBD), 및 칸나비크로멘 (CBC), 및 엔도칸나비노이드 및 이들의 유사체로 이루어진 군에서 선택된다. 일 구체예에 따르면, 핵산은 리보핵산 (RNA) 또는 데옥시리보핵산 (DNA)이다. 추가 구체예에 따르면, 핵산은 RNA이고, siRNA, 안티센스 RNA, iRNA, 마이크로 RNA, 안타고미르, 압타머 및 리보자임 mRNA, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구체예에 따르면, 활성 분자는 치료 효과를 갖는다. 본원에 사용 된 용어 "치료 효과"는, 임의의 종류의 치료 후, 그 결과가 유용하거나 유리한 것으로 판단되는 반응(들)을 제한없이 의미한다. 결과가 예상되었든, 예상치 못하였든, 심지어는 의도하지 않은 결과이든 마찬가지이다. 일 구체예에서, 치료 효과는 항-염증 효과, 항-섬유화 효과, 항-종양 효과 및 신경 보호 효과로 이루어진 군에서 선택된다. 염증, 섬유증, 당뇨병성 신증과 같은 고혈당증을 퇴치하기 위해 선택된 카고의 비제한적인 예는, 천연 유래 유비쿼터스 페놀 화합물, 예를 들어 페룰산, 천연 페놀, 예컨대 레스베라트롤, 루틴, 케르세틴, 페놀산, 비타민 및 알리신, 테트라하이드로칸나비놀산 (THCa), 칸나비디올산 (CBDa), 칸나비놀산 (CBNa) 칸나비크로멘산 (CBCa), 테트라하이드로칸나비놀 (THC), 칸나비놀 (CBN), 칸나비디올 (CBD) 및 칸나비크로멘, 및/또는 이들의 유도체, 합성 유사체, 덱스메데토미딘, (α2-AR) 작용제, 대사 보호제 (빌다글립틴, 프리스티메린, 메트포르민, 피리독사민, 바소모듈레이터, 에피네프린, 루틴, 이속수프린을 포함하나 이에 제한되지 않음)를 포함한다. 항-종양 효과를 발휘하는 카고의 비제한적인 예는, 시스플라틴, 카보플라틴, 클로람부실, 멜팔란, 네다플라틴, 옥살리플라틴, 트리플라틴 테트라니트레이트, 사트라플라틴, 이마티닙, 닐로티닙, 다사티닙 및 라디시콜을 포함하나 이에 제한되지 않는 화학요법제; 면역 조절제, 항혈관신생제, 유사분열 억제제, 뉴 클레오시드 유사체, DNA 삽입제, 항-노화제, 디펩티드, 후성유전 인자 및 조절제, 메트포르민, 라파마이신, 발프로산 또는 염, 워트만닌, 폴리아민 스페르미딘, HDAC 억제제 소듐 부티레이트, 부티르산, 시르투인 활성화제, 레스베라트롤, 코-엔자임 CoQ10, 작은(small) 디카르복실산, 아스피린, 살리실산, 벤조산, 카르니틴 유사체, 인간 성장 호르몬, 토포이소머라제 유사체, 항체, 사이토카인, 엽산 항대사산물, 항-해당제(anti-glycolisis agent), 인간 발암성 또는 원-발암성 전사 인자에 대한 억제자 올리리고뉴클레오티드; 또는 화학요법제, 면역조절제, 항혈관신생제, 유사분열 억제제, 뉴클레오시드 유사체, DNA 삽입제, 토포이소머라제 유사체, 항체, 사이토카인, 또는 엽산 항대사산물, 헥소키나제 억제제, 락테이트 데히드로게나제 억제제, 포스포프룩토키나제 2 또는 포스포프룩토-2-키나제/프룩토스-2,6-비스포스파타제 억제제, 피루베이트 키나제 M2 억제제, 트랜스케톨라제 억제제, 피루베이트 데히드로게나제 억제제, 피루베이트 데히드로게나제 키나제 억제제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 억제제, GLUT 억제제 , 양성자 수송 억제제, 모노카르복실레이트 수송체 억제제, 저산소증-유발 인자 1 알파 억제제, AMP-활성화 단백질 키나제 억제제, 글루타민 억제제, 아스파라긴 억제제, 아르기닌 억제제, 지방산 신타제 억제제, ATP-시트레이트 리아제 억제제, 디메틸 말레이트 및 말산효소 2 억제제, 또는 이들의 임의의 조합물을 제한없이 포함한다.

본 발명의 일 구체예에서, 세포성 또는 세포외 공급원은 섬유아세포, 중간엽 줄기세포, 줄기세포, 면역계 세포, 수지상 세포, 외배엽, 케라티노사이트, GI의 세포, 구강 세포, 비강 점막 세포, 신경 세포, 망막 세포, 내피 세포, 심장구체(cardiosphere), 심근 세포, 혈관주위세포(pericyte), 혈액 세포, 멜라노사이트, 실질 세포(parenchymal cell), 간 예비 세포(liver reserve cell), 신경 줄기세포, 췌장 줄기세포, 배아 줄기세포, 골수, 피부 조직, 간 조직, 췌장 조직, 체액, 배설물 또는 수술 추출 조직, 우유, 타액, 점액, 혈장, 소변, 대변, 피지, 산후 탯줄, 태반, 양막, 신장 조직, 신경 조직, 부신 조직, 점막 상피, 평활근 조직, 박테리아 세포, 박테리아 배양, 전체 미생물(whole microorganism), 조건 배지, 양수, 지질흡인물, 지방흡입 부산물, 및 식물 조직으로 이루어진 군에서 선택된다.

일 구체예에서, 바이옥솜은 레독솜(redoxome)이다. 본원에 사용된 용어 "레독솜"은, 하나 이상의 레독스 활성 자유-라디칼 소거 화합물(redox active free-radicals scavenging compound)을 포함하는 카고를 운반하는 바이옥솜 입자를 제한없이 지칭한다. 일 구체예에서, 레독솜 입자로부터 패키징된 복합체의 방출은 LPO 연쇄 반응을 차단한다. 또 다른 구체예에서, 레독솜 입자로부터 패키징된 복합체의 방출은 산화적 스트레스 부위에서 우선적으로 자극된다. 일 구체예에서, 레독솜은 비타민 E, 테르페노이드, 폴리페놀, 플라보노이드, 페놀산, 칸나비노이드, 레티노이드, 비타민 D, 리포산, 스테롤과 같은 지질 라디칼/ 과산화지질 트랩(lipid radical/ peroxide trap)에 의해, 그러나 이에 제한되지 않고, LPO 연쇄 반응을 차단할 수 있다. 일 구체예에 따르면, 레독솜은 펜톤 반응 복합체 차단제, 하이드록실 라디칼 트랩, 철 킬레이터 및 지질 라디칼 트랩을 포함한다. 일 구체예에서, 라디칼 트랩은 아스코르브산, 산화질소 공여체 (S-니트로소글루타티온) 또는 이의 유도체이다. 본 발명에서 철 킬레이터의 비-제한적 예시는, 데스페리옥사민 (DFX), 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 루틴, 디소듐 EDTA, 테트라소듐 EDTA, 칼슘 디소듐 EDTA, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA) 또는 이의 염, 하이드록시에틸렌디아민트리아세트산 (HEDTA) 또는 이의 염, 니트릴로트리아세트산 (NTA), 아세틸트리헥실시트레이트, 아미노트리메틸렌 포스폰산, 베타-알라닌 디아세트산, 비스무트 시트레이트, 시트르산, 시클로헥산디아민 테트라아세트산, 디암모늄 시트레이트, 디부틸 옥살레이트, 디에틸 옥살레이트, 디이소부틸 옥살레이트, 디이소프로필 옥살레이트, 디리튬 옥살레이트, 디메틸 옥살레이트, 디포타슘 EDTA, 디포타슘 옥살레이트, 디프로필 옥살레이트, 디소듐 EDTA-구리, 디소듐 파이로포스페이트, 에티드론산, HEDTA, 메틸 시클로덱스트린, 옥살산, 펜타포타슘, 트리포스페이트, 펜타소듐 아미노트리메틸렌 포스포네이트, 펜타소듐 펜티테이트, 펜타소듐 트리포스페이트, 펜테틴산, 디카르복시산, 피트산, 포타슘 시트레이트, 소듐 시트레이트, 소듐 디하이드록시메틸글리시네이트, 소듐 글루셉테이트, 소듐 글루코네이트, 소듐 헥사메타포스페이트, 소듐 메타포스페이트, 소듐 메타실리케이트, 소듐 옥살레이트, 소듐 트리메타포스페이트, tea-EDTA, 테트라하이드록시프로필 에틸렌디아민, 테트라포타슘 에티드로네이트, 테트라포타슘 파이로포스페이트, 테트라소듐 에티드로네이트, 테트라소듐 파이로포스페이트, 트리포타슘 EDTA, 트리소듐 EDTA, 트리소듐 hedta, 트리소듐 NTA, 트리소듐 포스페이트, 말산, 푸마르산, 말톨, 숙시머, 페니실라민, 디메르카프롤, 디페리프론, 천연 단백질 기반의 철 킬레이터, 멜라토닌, 시더포어, 아연 또는 구리 양이온, 또는 염 또는 착물, 및 데스페리옥사민 메실레이트, 또는 이들의 조합물을 제한없이 포함한다. 또 다른 구체예에서, 철 킬레이터는 EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산), DTPA (디에틸렌트리아민펜타아세트산), NTA (니트릴로트리아세트산), 데톡사민, 데페록사민, 데페리프론, 데페라시록스, 글루타티온, 메탈로프로테인, 페로첼 (비스-글리시네이트 킬레이트), 세룰로플라스민, 페니실라민, 쿠프리존, 트리엔틴, 페룰산, 아세트산아연, 리포칼린 2, 및 디메르카프롤로 이루어진 군에서 선택된다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 레독솜 입자의 성분은 천연 킬레이터 및 승인된 식이 보충제이다. 본 발명의 천연 킬레이터는 시트르산, 아미노산 (예: 카르노신), 단백질, 다당류, 핵산, 글루탐산, 히스티딘, 유기 이-산(organic di-acids), 폴리펩티드, 피토킬라틴, 헤모글로빈, 클로로필, 휴믹산, 포스포네이트, 및 트랜스페린이나, 이에 제한되지 않는다. 일 구체예에서, 킬레이터는 플라본 및 플라보노이드와 같은 폴리페놀 그룹에 속한다. 일 구체예에서, 폴리페놀은 루틴, 케르세틴, 루테인 및 EGCG이나, 이에 제한되지 않는다.

일 구체예에 따르면, 레독솜 입자는 항산화제, 예를 들어 디부틸하이드록시톨루엔 (BHT) (IUPAC 명: 2,6-비스(1,1-디메틸에틸)-4-메틸페놀) 과 같은 페놀 산화 방지제; 디부틸화 히드록시아니솔 (BHA); 프로필 갈레이트; 소듐 설페이트; 시트르산; 소듐 메타부설파이트; 아스코르브산; 토코페롤; 토코페롤 에스테르 유도체; 2-머캅토벤지미다졸 또는 이들의 조합이 로딩될 수 있다. 일 구체예에서, 사용되는 항산화제의 양은 0.1 내지 20 질량%이다. 또 다른 구체예에서, 사용되는 항산화제의 양은 필름 투여 조성물의 총 질량 당 질량%로서 0.5% 내지 10%; 0.7% 내지 10%; 1% 내지 8%; 3% 내지 8%; 2% 내지 5%; 5% 내지 10%; 3% 내지 10%; 및 2.5 내지 10%이다. 일 구체예에서, 레독솜 입자는 LC-PUFA, 도코사헥사에노익산 (DHA) 또는 에탄올아민 플라스마로젠 또는 이의 유도체로 농축된다. 추가 구체예에서, 레독솜 입자는 노화-매개 콜라겐 단편화를 억제하는 DFX를 전달한다. 일 구체예에서, 레독솜 입자는 히알루론산 분해를 억제하는 아스코르브산 또는 이의 유도체를 전달하여, 콜라겐 및 세포외 기질 손실을 지연시킨다. 본 발명의 일 구체예에서, 레독솜 입자는 상처 치유; 미용의학(aesthetic medicine); 및 피부 필러 시술에 유용 할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 레독솜은 인간 포피/피부 섬유아세포, 케라티노사이트, 지방 유래 줄기세포, 및 피부 마이크로비옴 세포로부터 유래된다.

본 발명의 구체예에 따르면, 바이옥솜 입자는 카고 또는 물리적 속성에 따라 분류된다. 일 구체예에서, 바이옥솜 입자는 pH-민감성 바이옥솜이다. 일 구체예에서, 바이옥솜 입자는 핵산 형질감염 바이옥솜이다. 본원에서 사용되는 용어 "핵산 형질감염 바이옥솜"은, 바이옥솜에 의해 캡슐화되고 표적 폴리 뉴클레오티드 또는 폴리 펩티드의 발현을 조절하기 위해 표적 세포, 조직, 기관으로 전달되는 뉴클레오티드를 제한없이 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "조절하는"은 내인성 핵산 또는 유전자 또는 대응되는 단백질의 발현을 증가; 강화; 감소; 제거하는 것을 제한없이 지칭한다. 일 구체예에서, 이러한 캡슐화된 폴리뉴클레오티드는 완전히 천연 또는 재조합적일 수 있고, 센스 또는 안티센스 작용 기전을 사용하여 치료 활성을 발휘할 수 있다. 일 구체예에서, 핵산 형질감염 바이옥솜은 합성 양이온성 지질로 보충된다. 또 다른 구체예에서, 바이옥솜 입자는 장기 순환성의 서방출 바이옥솜이다. "장기 순환성의 서방출 바이옥솜"이라는 표현은, 바이옥솜 코어 중합체 또는 단백질 또는 다당류 변형에 의해 카고의 지속적인 전달을 제공하고 이에 따라 혈액 순환 또는 표적 조직에서 약물의 치료학적 수준을 연장하도록 조작된 바이옥솜을 지칭한다. 본 발명의 장기 순환성의 서방출 바이옥솜은 코어-PEG 접합된 지질, 알부민, 히알루론산; 고정 금속 이온(anchoring metal ion); 또는 이들의 조합의 첨가에 의해 제조되나, 이에 제한되지 않는다. 코어 바이옥솜 막의 친수성 변형은, 비-변형 바이옥솜과 비교하여 표적 장기 또는 혈액에서 바이옥솜의 체류 시간을 증가시킨다. 연장된 순환 시간은 PEG화된 입자의 표면에서 혈장 단백질의 흡수 속도가 감소했기 때문이다.

일 구체예에서, 바이옥솜 입자는 선택적 표적화 바이옥솜(selective targeting bioxome)이다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "선택적 표적화 바이옥솜"은 특이적 표적화 리간드 또는 호밍(homing) 모이어티에 대해 설계된 바이옥솜 입자를 제한없이 지칭한다. 본 발명의 선택적 표적화 바이옥솜에서, 리간드 또는 호밍 모이어티는 글리코사미노글리칸; 단일특이적 또는 이중특이적 항체; 압타머; 수용체; 융합 단백질; 융합 펩티드; 또는 이의 합성 미메틱; 암 표적화-엽산; 특정 인지질; 사이토카인, 성장 인자; 또는 이들의 조합이나, 이에 제한되지 않는다.

추가 구체예에서, 바이옥솜 입자는 면역원성 바이옥솜이다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "면역원성 바이옥솜"은 병원체 세포 배양물로부터 유래된 바이옥솜 입자, 또는 공동-추출되거나 외부적으로 매립된 면역원성 모이어티를 갖는 바이옥솜 입자를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "면역원성"은, 인간 및 다른 동물의 신체에서 면역 반응을 유발하는, 항원 또는 에피토프와 같은 특정 물질의 능력을 제한없이 지칭한다. 즉, 면역원성은 체액성 및/또는 세포-매개 면역 반응을 유도하는 능력이다.

일 구체예에서, 본 발명의 바이옥솜 입자의 막은 미리 정의된 세포 배양 조건에서 배양된 세포 공급원으로부터 수득된 세포막의 50% 이상을 포함한다. 일 구체예에서, 상이한 공급원으로부터 유래된 바이옥솜 입자는, 원형질막과 비교하여 지질 조성의 차이를 나타낼 수 있다.

본 발명은 추가로 바이옥솜 입자 및 하나 이상의 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일 구체예에서 조성물은 약학 조성물이고 담체는 약학적으로 허용되는 담체이다. 일 구체예에서, 조성물은 경구, 정맥내, 피하, 복강 내, 근육 내, 국소, 안구, CNS 전달을 위한 후구(olfactory bulb)에 직접적인 투여를 포함한, 비강 내, 직장, 질, 폐, 설하, 경점막, 초음파 유도, 내시경에 의한, 조직 삽입 임플란트 투여를 통한, 조직내, 척추강내 및 경피 투여에 적합하다. . 또 다른 구체예에서, 조성물은 화장품용 조성물이고 담체는 화장품용으로 허용되는 담체이다. 또 다른 실시예에서, 담체는 식품등급 담체이다. 일 구체예에서, 조성물은 식용 조성물이고 담체는 식품등급 담체이다. 일 구체예에서, 조성물은 부형제, 안전성 테스트된 활성 화합물, 시약 또는 이들의 조합물을 추가로 포함한다. 일 구체예에서, 조성물 중 바이옥솜 입자의 농도는 전체 조성물의 0.005% 내지 80%이다. 또 다른 구체예에서 농도는 0.005% 내지 25%이다. 일 구체예에서, 바이옥솜 입자는 적합한 부형제 및 담체와 함께 제제화되고; 세포 뱅킹 목적, 세포 치료 목적, 이미징 또는 약물 전달 목적을 위해 포장 및 보관되며, 형질감염용 시약 또는 연구키트 용 시약으로 사용된다. 바이옥솜 입자를 포함하는 조성물은 고체, 액체, 반고체, 동결보존, 냉장 또는 건조된 즉시-사용가능 형태(ready-to-use)이나, 이에 제한되지 않는다.

b. 상기 지질 추출물을 건조하는 단계; 및

샘플에서 생성된 바이옥솜 입자는 약 0.03μm 내지 5μm의 평균 입자 크기를 특징으로 한다. 본원에 사용 된 용어 "약용매"는 https://www.fda.gov/downloads/drugs/guidances/ucm073395.pdf 에 따라 PDE >2.5 mg/day 및 농도 한계>250ppm 을 갖는 Class 3 또는 Class 2의 임의의 용매를 제한없이 지칭한다.

일 구체예에서, 평균 입자 크기는 0.05 μm 내지 3 μm 이다. 또 다른 구체예에서, 평균 입자 크기는 0.08 μm 내지 1.5 μm 이다. 추가 구체예에서 평균 입자 크기는 0.1-0.7 ㎛; 0.1-0.5μm, 0.2-0.5μm; 0.3-0.5μm이다. 또 다른 구체예에서, 평균 입자 크기는 5μm 이하; 1.5μm 이하; 0.7μm 이하; 0.5μm 이하; 0.3μm 이하; 0.15μm 이하이다. 일 구체예에서, 평균 입자 크기는 0.5 μm 내지 1.5 μm 이다. 일 구체예에서, 평균 입자 크기는 0.4 μm 내지 0.8 μm 이다. 다른 구체예에서, 평균 입자 크기는 0.3 μm 내지 0.5 μm 이다. 일 구체예에서, 바이옥솜 입자를 포함하는 샘플은 4.5 내지 5의 pH를 갖는다. 또 다른 구체예에서, 바이옥솜 입자를 포함하는 샘플은 pH가 4.5 내지 5이다. 일 구체예에서, 용매 시스템은 극성 및 비극성 용매의 혼합물을 포함한다. 일 구체예에서, 용매 시스템의 극성 용매는 이소프로판올, 에탄올, n-부탄올 및 수-포화 n-부탄올로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구체예에서, 용매 시스템의 비극성 용매는 헥산 및 테르펜 그룹로부터의 용매로부터 선택된다. 일 구체예에서, 용매 시스템의 비극성 용매는 n-헥산이다. 일 구체예에서, 헥산은 초임계 이산화탄소 (scCO²)를 사용하는 초임계 유체 추출에 의해 완전히 또는 부분적으로 현탁될 수 있다. "녹색" 약용매는 기체-유사 점도, 기체-유사 밀도를 포함한 많은 유리한 특성을 포함하여 주변 조건에서 유기 용매보다 확산율이 약100 배 더 빠르고 상대적으로 낮은 온도에서 작동한다. 테르펜/플라보노이드는 알파-피넨, d-리모넨, 리날로올, 유칼립톨, 테르피네올-4-올, p-시멘, 보르네올, 델타-3-카렌, 베타-시토스테롤, 베타-미르센, 베타-카리오필렌, 칸플라빈 A, 아피게닌, 케르세틴 및 풀레곤에서 추가적으로 선택될 수 있다. 일 구체예에서, 테르펜 그룹으로부터의 용매는 d-리모넨, α-피넨 및 파라-시멘으로 이루어진 군에서 선택된다.

일 구체예에서, 용매 시스템에서 극성 용매는 이소프로판올이고 비극성 용매는 n-헥산이다. 또 다른 구체예에서, 용매는 헥산-이소프로판올 3:2 저독성 용매 혼합물이다. 일 구체예에서, 용매 시스템은 안정화제를 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 안정화제는 부틸-하이드록시톨루엔 (BHT)이다. 일 구체예에서, 용매 시스템은 항산화제, 계면활성제, 비타민 E, 스쿠알렌, 콜레스테롤 또는 이들의 조합물을 추가로 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 방법은 핵산의 공침 단계를 추가로 포함한다. 일 구체예에서, 핵산은 리보핵산 (RNA) 또는 데옥시리보핵산 (DNA) 이다. 일 구체예에서, 핵산은 RNA이다. RNA 전달은 주요 과제 중 하나이다. 일 구체예에서, 바이옥솜 엔지니어링은 친수성 비히클에서 공동화 초음파 (cavitation ultrasonication) 절차 동안 친수성-소수성 자가조립을 통해 세포성 또는 세포외 공급원으로부터 수집된 세포막을 사용하여 달성된다. 일 구체예에서, 바이옥솜 입자는 초음파 처리 후 지질막 분리 후에 압출된다. 일 구체예에서, 활성 분자를 포함하는 카고는 친수성이고, 초음파 처리 동안 또는 압출 동안 친수성 비히클에 안에 포획된다. 또 다른 구체예에서, 카고는 소수성 카고이고, 추출 동안, 건조/용매 증발 공정 동안, 초음파 처리 동안, 압출 동안 용매 시스템으로 추출하기 전에 포획된다. 반복적인 동결 해동은 건조 후 및 초음파 처리 후 친수성 카고의 캡슐화 속도를 향상시킬 수 있다. 캡슐화 로딩(loading) 수준은 각각의 특정 치료 또는 연구 모이어티에서 사전설계된 선택된 카고의 감도, 안정성 및 원하는 로딩 용량을 기반으로 한 엔지니어링 파라미터의 선택에 영향을 받는다. 일 구체예에서, 활성 분자는 안전성 문제로서 바이러스 유전자 벡터 불순물에 대한 위험 없이 미리 정의된 농도로 바이옥솜 코어에 혼합될 수 있다. 일 구체예에서, 바이옥솜 입자는 전기천공되거나 미세주입될 수 있다. 일 구체예에서, RNA 또는 DNA는 치료학적 전달을 위한 핵산 물질의 온전성을 유지하기 위해 임의의 적합한 보호 완충액의 존재하에 4℃에서 부드러운 초음파 처리를 통해 바이옥솜 입자에 혼입 될 수 있다. 본 발명의 구체예에 따르면, 제조 공정은 LNP 및 리포좀의 가장 알려진 산업적 특징을 준수한다.

일 구체예에서, 전체 지질 추출을 위한 세포성 또는 세포외 공급원은, 섬유아세포, 중간엽 줄기세포, 줄기세포, 면역계 세포, 수지상 세포, 외배엽, 케라티노사이트, GI의 세포, 구강 세포, 비강 점막 세포, 신경 세포, 망막 세포, 내피 세포, 심장구체(cardiosphere), 심근 세포, 혈관주위세포(pericyte), 혈액 세포, 멜라노사이트, 실질 세포(parenchymal cell), 간 예비 세포(liver reserve cell), 신경 줄기세포, 췌장 줄기세포, 배아 줄기세포, 골수, 피부 조직, 간 조직, 췌장 조직, 체액, 배설물 또는 수술 추출 조직 (예를 들어, 우유, 타액, 점액, 혈장, 소변, 대변, 양수, 피지), 산후 탯줄, 태반, 양막, 신장 조직, 신경 조직, 부신 조직, 점막 상피, 평활근 조직, 박테리아 세포, 박테리아 배양, 전체 미생물(whole microorganism), 조건 배지, 양수, 지질흡인물, 지방흡입 부산물, 및 식물 조직으로 이루어진 군에서 선택된다. 또 다른 구체예에서, 지질 추출은 세포-조건화 배지, 동결건조된 조건화 세포 배지, 세포 펠렛, 동결된 세포, 건조 세포, 세척된 세포 벌크, 비-부착성 세포 현탁액 및 부착성 세포층으로부터 수행된다. 또 다른 구체예에서, 세포층은 (다중)플라스크, 디쉬, 스캐폴드, 비드 및 생물반응기로부터 선택된, 세포외 매트릭스 또는 합성 매트릭스에 의해 코팅되거나 코팅되지 않은 세포 배양 플라스틱웨어에서 성장된다. 본 발명의 한 구체예에 따르면, 막 추출물은 동결 또는/및 분무/동결건조에 의해 건조된다. 또 다른 구체예에서, 막 추출물은 증발에 의해 건조된다. 증발은 속도-진공 원심분리, 아르곤/질소 블로우다운, 나선형 기류, 및 제어된 온도 환경에서 용매증발법이 가능한 그밖의 것, 예를 들어 마이크로파 또는 로터 증발, 속슬렛 추출기, 원심농축기를 포함하나 이에 제한되지 ㅇ낳는 임의의 적절한 기술에 의해 수행될 수 있다. 추가 구체예에서, 막 추출물은 바람직한 활성 분자가 로딩된 완충액에서 팁 초음파 장치에 의해 초음파 처리된다. 일 구체예에서, 평균 입자 크기는 제조 후 몇 시간 내에 입자 크기 측정시 0.4㎛ 내지 1.5μm이다. 또 다른 구체예에서, 입자 크기는 제조 및 바이옥솜 입자를 0℃ 내지 -4℃에서 보관한 후 1 개월 이내에 입자 크기 측정시 0.8μm 내지 5μm이다.

일 구체예에서, 바이옥솜 입자는 세포성 또는 세포외 공급원의 막으로부터 유래된다. 일 구체예에서, 바이옥솜 입자는 미리-정의된 공급원으로부터 주문형(on-demand)으로 조작된다. 일 구체예에서, 세포 공급원은 자가유래(autologous)이다. 용어 "자가유래(autologous)"는 공여자와 수여자가 동일한 상황을 말한다. 일 구체예에서, 세포 공급원은 비-자가유래(non-autologous)이다. 일 구체예에서 공여자 공급원은 섬유아세포, 중간엽 줄기세포, 다능성 및 분화된 줄기세포, 면역계 세포, 수지상 세포, 외배엽, 케라티노사이트, GI 및 구강 세포, 비강 점막 세포, 신경 및 망막 세포, 내피 세포, 심장구체(cardiosphere), 심근 세포, 혈관주위세포(pericyte), 및 혈액 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일 구체예에서, 바이옥솜 입자의 공급원은 기질 세포(stromal cell), 케라티노사이트, 멜라노사이트, 실질 세포(parenchymal cell), 중간엽 줄기세포 (계통이 정해진 또는 정해지지 않은 전구 세포(lineage committed or uncommitted progenitor cell)), 간 예비 세포(liver reserve cell), 신경 줄기세포, 췌장 줄기세포 및/또는 배아 줄기세포, 골수, 피부, 간 조직, 췌장, 신장 조직, 신경 조직, 부신, 점막 상피 및 평활근이다.

본 발명의 방법에서, 바이옥솜 입자는 선택된 활성 분자가 로딩(loading)될 수 있다. 일 구체예에서, 로딩는 추출동안 수행된다. 또 다른 구체예에서, 로딩은 추출 전 또는 후 건조 동안 수행된다. 일 구체예에서, 수득된 바이옥솜 입자는 압출될 수 있다.

본 발명의 HIP 추출 시스템의 장점은, 고전적인 클로로포름-메탄올 지질 추출과는 달리, 최소한의 리파제 활성으로 및 클로로포름-가용성 성분들 로부터/상에서 직접 막 지질을 추출할 수 있다는 것으로, 이러한 성분은 플라스틱, 세포 배양 멸균 표면 웰, 예를 들어 중공 섬유, 비드, 핵기공, 및 폴리카보네이트 필터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, HIP는 이러한 용매에서 폴리카보네이트로부터의 직접 추출이 안정하도록 허용한다. HIP 추출은 동일한 세포 배양 또는 조직 샘플에서 RNA 또는 단백질의 공동추출과 병행하여 세포 또는 조건화 배지에서 바이옥솜을 통합하는데 사용할 수 있다. 세포층 또는 세포 펠렛 또는 동결건조된 배지 또는 조직 추출물에 대한 이러한 공정을 위해, HIP는 물 완충액 또는 RNA 또는 DNA 또는 단백질 안정화 용액 (예를 들어, RNAsave bioind1.com 또는 Trhaloze 또는 RNAse 억제제 함유 완충액)의 부피당 약 1/4 -1/5 th로 미리혼합될 수 있다. 수상 완충액 또는 안정화 용액은 공동추출된 핵산 또는 단백질 추출물을 추출하며, 상기 공동추출된 핵산 또는 단백질 상은 예를 들어 원심분리 또는 동결 구배 등에 의해 분리될 수 있다. 이러한 RNA 또는/및 DNA 또는/및 단백질 함유 상은 바이옥솜 입자의 소수성 상으로 입자 형성 중에 추가로 이루어질 수 있으며, 이어서 바이오치료제 또는 바이오마커 진단 또는 연구 시약 사용을 위해 사용될 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명의 방법은 GMP 및 GLP 지침에 부합한다. 일 구체예에서, 본 발명의 방법에 따라, 바이옥솜 입자는 세포 바이오매스; 세포 펠렛; 부착성 세포층; 배지; 또는 이들의 조합으로부터 수확된다. 일 구체예에서, 바이옥솜 입자는 OECD 승인된-용매 추출 공정을 허용하는 단일 저독성 단계에 의해 추출된다.

일 구체예에서, 공급원 세포는 더 많은 친유성 항산화제를 발현하기 위해 경미한 산화 스트레스, 기아(starvation), 방사선, 또는 배양물 중 세포의 기타 시험관내 변형에 노출됨으로써 추출 전에 변형될 수 있다. 일 구체예에서 친유성 항산화제는 루틴, 스쿠알렌, 토코페롤, 레티놀, 엽산 및 이의 유도체이다. 일 구체예에서, 지질 용액 성분은 필터-살균된다. 또 다른 구체예에서, 지질 용액 성분은 -20℃ 내지 -80℃의 온도에서 질소 또는 아르곤에 저장될 수 있다.

추가 구체예에서, 용매는 디터전트 계면활성제(detergent surfactant)를 추가로 포함한다. 일 구체예에서, 디터전트는 폴락소머(Polaxomer)이다. 일 구체예에서, 공정은 HIP 용매 부분을 동결건조/증발시켜 바이옥솜 입자-핵산 복합체를 형성하는 단계; 및 친수성 담체/완충액에서 초음파 처리, 및/또는 원하는 입자 크기로 선택적 압출하는 단계를 포함한다.

본 발명은 본 발명의 방법에 따라 제조된 복수의 바이옥솜 입자를 포함하는 샘플을 추가로 제공한다.

본 발명은 바이옥솜 입자 및 하나 이상의 담체를 포함하는 약학 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료가 필요한 대상체에서 병리를 치료 또는 예방하는 방법을 추가로 제공한다. 일 구체예에서 조성물은 약학 조성물이고 담체는 약학적으로 허용되는 담체이다. 일 구체예에서, 조성물은 경구, 정맥 내, 피하, 복강 내, 근육 내, 국소, 안구, 비강, 직장, 질, 폐, 설하, 점막 및 경피 투여에 적합하다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 화장품용 조성물이고 담체는 화장품용으로 허용되는 담체이다. 일 구체예에서, 병리는 염증성 장애, 신경 장애, 감염성 장애, 악성 종양, 면역계 장애 및 자가면역 장애로 이루어진 군으로부터 선택된다. 비-제한적인 질환 목록은, 염증성 장애, 예를 들어, 만성 또는 급성 염증성 피부 장애, 염증성 장 질환 (IBD), 관절염, 염증성 호흡기 장애, 또는 급성 또는 만성 상처 또는 부상을 포함한다. 감염성 장애는 세균성 병원체, 바이러스성 병원체 또는 기생충에 의해 유발된 감염성 질환이다. 증직성 장애는 증식 성 장애는 증가 된 수준의 전염증성 사이토카인 및/또는 감소된 수준/의 항-염증성 사이토카인과 관련된 악성 종양이다. 또한 대사성 장애, 당뇨병 I 형, 당뇨병 II 형, 또는 당뇨병 관련 질환; 비제한적으로 IL-1 알파, IL-6, TNF-알파, IL-17과 같은 전염증성 사이토카인의 상승에 의해 매개되는 염증; 비제한적으로 IL-13, IL-4 또는 IL-10과 같은 하나 이상의 항-염증성 사이토카인의 수준 상승에 의해 매개되는 염증; 만성 비부비동염 (CRS), 알레르기성 비염; COPD; 비용종증 (NP); 혈관운동성 비염, 기도 과민 반응, 낭포성 섬유증; 폐 섬유증; 알레르기성 부비동염, IBD; 크론병; 및 궤양성 대장염을 포함한다.

본 발명의 맥락에서, 바이옥솜 입자는 겔, 오일, 진피 충전제, 에멀젼 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 광범위한 미용의학, 화장품, 국소 투여 형태에 포함될 수 있다. 예를 들어, 입자를 함유하는 현탁액은 국소 크림, 페이스트, 연고, 겔, 로션 등으로 제형화되고 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 미용의학 응용은 국소, "개방(open)" 또는 "폐쇄(closed)" 시술에 의해 이루어질 수 있다. "국소"란 피부와 같은 환경에 노출된 조직에 약학 조성물을 직접 적용하는 것을 의미한다. "개방" 시술은 환자의 피부 절개 및 약학 조성물이 적용되는 기저 조직을 직접 시각화하는 절차를 포함한다. "폐쇄" 시술은, 예를 들어 미적 시술 중 피부 필러와 함께, 또는 피부 부위, 상처, 주름에 국소로, 내부 표적 조직기구를 질병 부위에 직접 삽입하는 침습적 시술이다. 본 발명은 본 발명의 바이옥솜 입자를 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 필요한 개체에서 피부 상태를 개선하는 방법을 추가로 제공한다. 일 구체예에서, 본 발명은 활성-생체분자들에 대한 전달 비히클로서의 바이옥솜 입자의 용도를 추가로 제공한다. 본 발명의 활성 생체 분자는 항-염증 활성; 노화 방지 활성; 항암 활성; 대사 활성을 가지거나 유전적 DNA 또는 RNA 생물활성 물질을 가지나, 이에 제한되지 않는다. 일 구체예에서, 활성 생체분자는 세포성 사이토카인이다. 또 다른 구체예에서, 활성 생체 분자는 성장 인자이다. 일 구체예에서, 활성 생체분자는 데옥시리보핵산 또는 리보핵산을 포함하는 올리고뉴클레오티드이다. 일 구체예에서, 올리고뉴클레오티드의 길이는 2 내지 100 개의 뉴클레오티드이다. 일 구체예에서 올리고뉴클레오티드는 천연, 합성, 변형 또는 비변형이다. 일 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 RNAi; siRNA; miRNA 미메틱; 항-miR; 리보자임, 압타머, 엑손 스키핑 분자, 합성 mRNA, 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)이다. 또 다른 구체예에서, 바이옥솜 입자의 막은 표적에 대한 카고의 제어 방출을 제공하도록 조작된다. 일 구체예에서, 산화 스트레스 민감성 지질은 바이옥솜 입자의 막에 매립된다. 또 다른 구체예에서, 바이옥솜 입자는 금속 킬레이터 및 항산화제로 로딩된다. 일 구체예에서, 엑소좀-유사 입자는 다능성 인자를 체세포 또는 줄기세포에 도입하여 비-바이러스 성 유도 다능성 줄기세포-iPSC를 수득하는 데 사용된다. 또 다른 구체예에서, 바이옥솜 입자는 세포를 치료하는데 사용된다. 본 발명의 바이옥솜 입자로 세포를 처리하는 것은 생리학적 온도 (약 37℃)에서 수행된다. 치료 기간은 2 분에서 72 시간이다. 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 바이옥솜 입자를 추가로 제공한다.

본 발명의 구체예에서, 바이옥솜 입자의 입자 크기 특성화를 위한 QC 사양은 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 입자 크기; 표적 조직/세포에 대한 침투 능력; 불임; 단백질과 핵산의 부재로 정의되는 비-면역원성 및 안전성. 입자 크기 분포는 Malvern Nano Zetasizer에서 측정되고 Zetasizer 소프트웨어로 정제된다. 바이옥솜 입자 어셈블리의 크기는 원하는 응용 분야에 따라 조작되며 일반적으로 사용 가능한 다운-사이징 기술을 사용한다. 어셈블리는 미리선택된 메쉬 치수로 멤브레인을 통해 압출하여 크기를 줄일 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 바이옥솜 입자 지질 특성화를 위한 QC 사양은 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 바이옥솜 입자는 다음과 같은 막 지질 조성 및 특성에 의해 검증되고 정량화된다: (1) 지방산-FA의 탈포화/포화 지수, (2) FA 사슬 길이 특성, (GC; HPLC 분석 방법) 즉, 장쇄 LC-다중불포화 FA PUFA/ 중쇄-MC/; (3) 극성 (IZON 분석); (4) 지질 조성, 즉 함량 백분율 및/또는 비율, 예를 들어, PL-인지질 조성 및 비율 PC-PE/PI-PS 또는 바이옥솜 막의 다양한 지질 그룹들 간의 비율/백분율, 예를 들어, PL/NL (중성 지질)/CL/GL/TG/FFA (HPLC; TLC; LC-MS; MALDI; 컬럼 크로마토그래피 등); (5) 총 지질 (바닐린 분석 등); (6) 선택적 기능성 지질 및 지질 유도체 함량, 예를 들어, 프로스타글란딘, 프로스타사이클린, 류코트리엔, 트롬복산 (HPLC; MS-MS; ELISA; RIA 등), 또는 (7) 하이드록시 지수- 와 같은 대사산물 (요오드 분석); 및 (8) ROS 매개 산화.

본 발명의 맥락에서, 바이옥솜 입자를 포함하는 최종 조성물에 대한 QC 사양은 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 점도 및 삼투압; pH; 배치당 입자 수; 탁도; 안정성 사양 파라미터. IZON Ltd.에서 제공하는 입자 측정 및 특성화 방법은 바이옥솜 입자 생산의 QC에도 적용 할 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 바이옥솜 생산 효능에 대한 QC 사양은, 원하는 바이옥솜 활성에 대한 분석을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 시험관 내에서 바이옥솜 및 레독솜 기반 제품 기능 효과를 테스트하기 위한 세포 배양 분석. 효과는 스크래치 분석, 세포독성 분석, 예를 들어 화학요법 약물 세포독성 분석, ROS 생성 또는 수산화요소 노화 유도 분석, 염증 IL19 또는 TGF 베타 유도 분석에 의해 QC 효능 분석으로 스크리닝 될 수 있다.

실시예

실시예 1. 세포 펠렛에서 용매에 의한 지질 추출.

다음 세포 샘플들을 배양하였다: 샘플 1- 원발성(Primary) 탯줄 정맥 내피 세포; 정상, 인간 (HUVEC) (ATCC® PCS-100-010™); 샘플 2-원발성 유방 상피 세포; 정상, 인간 ATCC® PCS-600-010™; 샘플 3-인간 포피 섬유아세포 HFF (primary-donated); 샘플 4-인간 지방 유래 중간엽 줄기세포; (ATCC® PCS-500-011). 모든 세포 샘플은 3-6회 계대배양하였고, 각 샘플은 동결보존 바이알 당 2X10⁶ 세포로 저장하였으며, 펠렛을 수집하여 액체 질소의 동결보존 배지 (GIBCO)에 저장하였다. 펠렛을 PBS로 세척하고 세포 덩어리(cellular mass)를 원심분리에 의해 농축시켰다. 세포 농축물을 헥산:이소프로판올 (3:2) 용매 및 0.02% BHT로 구성된 HIP 용매 혼합물과 혼합했다. 펠렛을 볼텍스 사이클당 2-4 분으로 실온에서 반복적으로 볼텍스하였다. 그런 다음 샘플을 원심분리하고 상청액을 수집했다. 수집된 상청액을 유성 잔류물이 형성될 때까지 증발시켰다. 바이옥솜 입자를 추가로 제조하고 캡슐화했다.

실시예 2. 입자 형성 및 특성화.

바이옥솜 입자 형성은 팁 초음파 처리 (vibra-cell Sonics)를 사용하여 수행하였다: 샘플 당 3회의 초음파 처리주기, 각 주기 3 초, 주기 사이 10 초 간격. 공정 중에 초음파 처리로 인한 가열을 방지하기 위해 초음파 처리 동안 샘플을 얼음으로 냉각하여 샘플을 주변 온도로 유지했다 (60℃에서 모니터링되는 초음파 처리기 온도). 최종 제품의 pH를 측정하고 입자 크기는 도 1A에 표시된대로 Nanosizer-Malvern을 사용하여 확인했다. 형성된 산물의 특성은 pH 4.5-5의 QC 사양과 0.05-1.5μm 크기의 평균 입자 크기에 속하였다. 안정성 테스트를 위해, 수득한 샘플을 4℃에서 한 달 동안 보관했다 (도 1B). Nanosizer-Malvern을 사용하여 측정된 관찰된 평균 입자 크기는 훨씬 더 컸는데, 이는 바이옥솜 입자의 응집/혼합(aggregation/interfusion)을 나타낸다.

실시예 3. 바이옥솜을 생산하도록 설계된 실험 시스템 확립.

용매에 의해 추출된 지질로부터 바이옥솜을 생산하기 위한 프로토콜은 동결된 세포 펠렛 또는 동일한 세포 공급원의 신선 배양을 사용하여 확립하였다. 프로토콜 확립에 사용된 세포는 지방 조직에서 유래된 인간 중간엽 줄기세포 (MSC); 골수 세포, 및 HepG2 간 세포주였다. 지질막은 헥산:이소프로판올 용매를 사용하여 추출하고 질소 가스 증발 또는 동결건조기로 건조했다. 신선한 세포 배양물은 지질 추출 전에 2시간 동안 조건 배지를 생성하기 위해 HBSS-HEPES로 배양하였다. 생성된 조건 배지도 수집하고 지질과 RNA를 추출하고 건조시켰다. 세포 펠렛 또는 세포 배양물에서 생산된 건조된-지질 샘플을 HBSS에서 초음파 처리하여 바이옥솜을 생성했다. 각 샘플에서 추출된 RNA의 농도는(DDW 사용) NanoDrop Lite 분광광도계를 사용하여 측정하였다. 형성된 바이옥솜은 ZetaSizer nano (Malvern Panalytical Ltd.) 입자 크기 분석기 및 NanoSight 분석기 (Malvern Panalytical Ltd.)를 사용하여 크기 및 안정성을 평가하였다. 도 2A에 나타낸 것처럼, ZetaSizer nano 를 사용한 측정은 81nm 및 267nm에서 피크를 갖는 두 가지 입자 크기 분포를 보여주었다. NanoSight 결과는 248 nm의 평균 입자 크기를 나타냈다 (도 2B).

실시예 3. 바이옥솜 안정성 검사.

바이옥솜 안정성 검사를 위해, 실시예 2에 기술된 골수 hMSC로부터 초음파 처리에 의해 생성된 바이옥솜 샘플을, 바이옥솜 생산 후 8 개의 하위 샘플로 분할하였다. 각 샘플 쌍은 서로 다른 수의 동결-해동주기 (0-3주기)에 노출시켰다. 샘플의 절반 (각 쌍 중 하나)을 동결건조하고 나머지는 -80℃ 냉동고에 보관했다. NanoSight를 사용한 바이옥솜 입자 크기의 측정 결과, 동결-해동주기 횟수에 관계없이 모든 샘플이 안정적인 것으로 나타냈지만, 입자 크기의 균일성은 조건에 따라 다르다(도 3). 실험결과, 동결-해동주기 후 초음파 처리 단계의 추가 (동결건조와 함께 또는 동결건조 없이)로 바이옥솜 크기의 균일성이 향상되었다 (도 2A-C).

실시예 4. 바이옥솜 융합 실험.

바이옥솜 입자에 형광 지질 바이오마커 (BioDipy™ TR (D7540), ThermoFisher Scientific)를 로딩하여 활성 소수성 화합물을 모방하고 바이옥솜의 세포 간 및 세포 내 이동(trafficking) 을 시각화했다. 형광 스핑고지질에 통합된 BioDipy™ 및 NBD 형광단은 상이한 분광 특성을 가진다. BioDipy™ FL 형광단은 높은 몰 흡수율과 형광 양자 수율로 인해 NBD보다 더 큰 형광 출력을 생성한다. 이는 또는 NBD보다 광-안정적이다. NBD-표지된 스핑고지질은 BODIPY FL 대응물보다 수상을 통한 전달 속도가 더 빠르다. 도 4는 형광 바이옥솜 입자의 융합을 보여준다. 최종 농도 5μM의 BioDipy를 인간 포피 섬유아세포 (HFF) 세포의 막에 융합시켰다. 형광현미경 (X40 배율)과 CDD 카메라를 사용하여 형광을 시각화하고 이미지를 기록했다. 형광 바이옥솜 입자와 HFF 세포의 융합은 샘플당 10 ~ 35 분 동안 추적되었다. 측정 사이에 세포는 37℃에서 유지하였다. 모든 바이옥솜 제제 (실시예 1, 샘플 1 내지 4)는 15 분 이내에 표적 세포에 융합되었다 (도 4A-C).

실시예 5. 조건화 배지에서 부착 세포층에서 HIP 시스템에 의한 세포막 추출.

추출 인간 포피 섬유아세포 (HFF) 세포와 조건화 배지는 도 5에 나타낸 바와 같이 분리되었다. 부착된 HFF 세포층은 HBSS+HEPES로 성장 배지로부터 4회 세척하였다. 그런 다음 완충액를 제거하고 0.02% BHT를 포함하는 HIP 용매 시스템을 추가하여 다중-플라스크에서 세포층을 커버하였다. 20 분 동안 주위 온도에서 플라스크를 부드럽게 흔들어 추출을 수행하였다. 플라스크의 내용물을 50ml 배양 튜브로 옮기고 아르곤 하에서 물 (36℃) 증발을 수행하여, 건조한, 유성 필름과 유사한 잔류물을 형성했다.

실시예 6. 막 단백질을 이용한 바이오 엑솜 입자의 엔지니어링.

실시예 1에 따라 세포를 시딩하고 수집하였다. 세포 덩어리로부터 지질 및 막 단백질의 추출은 헥산:이소프로판올 1: 1 혼합물을 포함하는 약용매 혼합물에서 수행하였다. 추출 후, 상청액과 펠렛을 수집하고, 총 단백질을 Bradford assay에 의해 BSA 표준으로 측정하였다. 15%의 단백질 함량이 측정되었다. NaCl로 세척하여 조 추출물에서 핵산을 제거하고 280 nm에서 분광광도계로 측정을 수행했다.

실시예 6. 올리고뉴클레오티드로 캡슐화된 엑소좀-유사 입자의 제조.

실시예 1에 따라 세포를 시딩하고 수집하였다. 세포 덩어리는 HIP (3:2 v/v) 용매 시스템 또는 헥산/에탄올 (2:1 v/v) 용매 시스템에 용해시켰다. 30 분 후 실온에서 인큐베이션하고, 추가 용매 추출 단계 (각각 원래 부피의 약 1/4)를 수행하였다. 그 후 벤치형 원심 분리기를 사용하여 추출물을 3000rpm에서 10분 동안 원심분리하였고, 수성 상과 용매 상 사이에 명확한 계면이 형성되었다. 올리고뉴클레오티드를 압출된 소포와 매칭되는 수용액에 용해시키고(pH 4, 30% 에탄올), 세포막의 HIP 추출물에 한 방울씩 첨가하였다. 용매상에 약하게 질소가스를 불어(N₂ blow) 용매를 제거하였다. 그런 다음 샘플을 SpeedVac에 3 시간 동안 두어 잔류 용매를 증발시켰다. 막-핵산 함유 용기를 HBSS 완충액 (20mM HEPES, 150mM NaCl, pH 7.2)으로 채우고 초음파 처리하였다.

실시예 7. 섬유아세포-유래 바이옥솜 입자를 섬유아세포 표적 대 아교세포 표적으로 전달하는 동역학.

3T3 NIH 섬유아세포를 37℃에서 15분 동안 형광 C6-nbd 에리스로-세라마이드(C6-nbderythro-ceramide)로 사전 표지하였다 (C6-nbd 에리스로-세라마이드의 최종 농도는 5μM였다). 배지를 버리고, 디쉬를 얼음처럼 차가운 PBS로 두 번 세척했다. 추출을 위해, 세포를 1ml 헥산:이소프로판올 (HIP) 2:1 (v/v)과 함께 실온에서 15 분 동안 흔들면서 배양했다. HIP는 3 개의 페트리 디쉬로부터 하나의 유리관으로 수집되었다. 디쉬는 각각 1ml HIP로 한 번 세척하였고, 모든 세척물을 튜브에 추가했다. HIP는 N₂ 스트림 하에서 증발시켰다. 300μl PBS에 재-현탁한 후, 세포 덩어리를 초음파 처리했다. NBD 라벨 방출 및 혼입의 분석을 위해, NIH 3T3 섬유아세포 및 1차 배양된 아교세포(glial cell)를 실험 하루 전에 24 웰 배양 디쉬에서 13mm 유리 커버 슬립에 시딩했다. NIH 3T3 섬유아세포로부터 제조된 바이옥솜 입자를 세포에 첨가하고 (각 웰에 10μl의 바이옥솜 현탁액), 커버 슬립을 지정된 시간 간격으로 웰에서 제거하고, 세척하여 결합되지 않은 NBD-표지물을 제거하고, 형광 Zeist 현미경(x40 배율)를 사용하여 분석했다. 이미지를 컴퓨터에 기록하였다. 이 실험의 일반적인 절차에 대한 계획은 도 6A에 제시되어 있다.

결과:

이미징 결과는 도 6B에 제시되어 있다. 표지된 바이옥솜 입자에 의한 섬유아세포의 현저한 표지가 4분 이내에 관찰되었다. 이 신호는 바이옥솜 입자를 적용한지 30 분 후에 더욱 강해졌다. 대조적으로, 아교세포는 30 분 후에도 표지된 바이옥솜 입자의 결합이 거의 없는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 섬유아세포에서 유래된 바이옥솜 입자의, 섬유아세포 표적 세포에 대한 특이적 표적화를 나타낸다.

실시예 8. 레독솜의 엔지니어링

레독솜 입자의 개략도를 도 7에 나타내었다. 락토바실러스 박테리아의 동결건조된 세포를 바이옥솜 추출을 위한 공급원으로 사용하였다. 안정화제로서 토코페롤과 콜레스테롤(0.5%)을 1.5% 부틸-하이드록시톨루엔 (BHT)과 함께 헥산:이소프로판올 (HIP) (3:2 v/v)로 구성된 용매 용액에 용해시켰다. 지질 이중층 막의 안정성/강도를 높이기 위해, 강도 안정화제로서 친유성 항산화제인 알파-토코페롤 (~3%), DHA (~3%), 콜레스테롤 (1.5%)을 사용했다. 용매를 질소 스트림 하에서 증발시키고 4 ℃에서 2 시간 동안 동결건조시켰다. 생성된 지질 분산액을 탁도가 제거될 때까지 팁형 초음파 처리기에서 10-20 분 동안 초음파 처리했다. EPR (Electron Paramagnetic Resonance) 스핀 트래핑을 사용하여 엑소좀-유사 입자에서 철에 의해 유도된 산화 스트레스에 의해 생성된 지질-유래 자유 라디칼을 검출하였다. 니트론 스핀 트랩 a-(4-피리딜-1-옥사이드)-N-tert-부틸니트론 (POBN)을 사용하여 탄소-중심 라디칼 부가물을 검출했다. 초음파 처리 동안 아스코르브산과 DFX 또는 EDTA를 완충액에 첨가했다. 선택된 지질-레독스 활성 시약 (레독스-센서로서 DHA/EPA- 또는/및 레독스 안정화제로서 알파-토코페롤)을 용해시킨 HIP를 포함하는 추출 용매 혼합물을 사용하여 세포 배양 선택된 공급원으로부터 원하는 막 물질을 추출하였다. HIP에 의한 지질 추출은 다음 절차를 사용하여 수행하였다: 증발 단계 후, 팁 초음파 처리에 의해 원하는 소포 직경을 달성하였다.

실시예 9: 레독솜 입자의 EPR-레독스 감도.

50 및 100 μM DHA를 레독솜 입자의 지질 이중층 막에 통합하였다 (도 8, 두 개의 중간 스펙트럼). 탄소-중심의 스핀 부가물이 관찰되었고, DHA 농도가 증가함에 따라 스핀 부가물 EPR 신호 강도의 증가가 관찰되었다 (LR 형성의 DHA 용량-의존적 증가를 나타냄)가 관찰되었다. 도 8의 상단 스펙트럼은 DHA가 없는 레독솜 입자에서 매우 약한 (대조군) 스펙트럼을 나타낸다(기저 POBN 부가물 형성을 나타냄). 안정화제 알파-토코페롤이 DHA-농축된 엑소좀-유사 입자에 통합되었을 때, LR 형성은 거의 기저 수준으로 감소하는 것으로 관찰되었다(도 8 하단 스펙트럼). 이는 엑소좀-유사 입자 막에 항산화제의 통합에 의한 LPO 의 저해를 나타낸다.

실시예 10: 정상 조건에서 레독솜 입자 안정성.

pH8 (NaCl 100mM)에서 10mM TRIS 중의 자가-??칭 농도 60mM의 칼세인을 동결건조된 물질에 첨가한 다음 0.2ml 완충액에 볼텍싱으로 재현탁함으로써, 칼세인-함유 레독솜 입자를 제조하였다. 캡슐화되지 않은 칼세인은 Sephadex G-50 컬럼 (Pharmacia)을 사용하여 겔 여과에 의해 레독솜 입자 현탁액에서 제거하였다. 30μl의 레독솜 현탁액을 컬럼에 주입하고 pH8 (NaCl 150mM)에서 10mM TRIS 중에서 용리하고 용리액의 분획을 수집했다. 490nm의 여기 파장 및 520nm의 방출 파장에서 형광 분광법에 의해, 최종 농도 0.2%에서 디터전트 Triton X-100 에 노출된 레독솜 입자, 및 처리되지 않은 레독솜 입자에서 형광을 모니터링하였다.

결과:

레독솜 입자 현탁액에 100μm H₂0₂를 첨가시 칼세인 방출의 변화는 관찰되지 않았다 (도 9A). 펜톤 반응을 통해 H₂0₂로부터 하이드록실 라디칼을 생성하는 촉매 역할을 하는 50μm Fe²⁺를 현탁액에 첨가시, DHA 또는 알파-토코페롤을 함유하는 레독솜 입자 집단에서 형광의 변화 속도가 크게 증가하는 것이 관찰되었으나, 대조군에서는 그렇지 않았다. Triton X-100을 용액에 첨가시(도 9B), 레독솜 입자에 남아있는 모든 칼세인이 방출되었으며, H₂0₂ + Fe²⁺의 첨가시 관찰된 방출보다 더 빠른 동역학을 나타냈다.

실시예 11: 뇌 손상에 대한 레독솜의 효과

뇌 손상에 대한 레독솜의 효과를 테스트하기 위해, 동물 연구에 대한 헬싱키 규정을 준수하여, 이소플루란 및 케타민/펜토바르비탈 나트륨으로 마취된, 출생후 연령(postnatal age)으로 생후 8 일에 마우스 (그룹당 6 마리)를 희생시켰다. 그후 신선하게 해부된 뇌 절편을 DMEM + Hepes에서 37℃에서 15 분 동안 50 μM의 황산제일철7수화물 (Sigma)과 함께 배양하여 펜톤 반응을 실시했다. 이러한 생체 외(ex-vivo) 유도된 산화 스트레스에 의해, 뇌 절편이 염증성 질환; 허혈성 스트레스; 및 다운 증후군과 같은 기타 뇌 장애; 죽상경화증 유발 관상동맥 허혈성 변화를 모방하는, ROS 생성에 노출되었다. TBARS는 뇌 절편에 의해 ROS 생성을 배양 배지로 방출하여, 습윤 중량이 ~80-100 nM/mg 에서 mg/wet 중량 당 120-160 nM으로 증가했다. 레독솜에 캡슐화되지 않은, 1μM 농도의 DFX와 알파 토코페롤 (vE)로 처리시, TBARS 방출이 20-30% 감소했다. 절편을 0,5 mcM DFX 및 vE로 캡슐화된 hAdTMSC-레독솜과 공동배양시, TBARS 생산이 50-60% 감소했다.

실시예 12: 레독솜의 시험관내 효능 분석

XCL-1 DCXp-GFP (ATCC® ACS-5005)에서 유도된 신경 전구 세포를 ROS 유도 펜톤 시약과 함께 인큐베이션했다. 레독솜 치료가능성을 평가하기 위한 세포/조직 손상의 선택된 마커로서 LPO 측정을 위해, 헥산 이소프로판올 - HIP (부피 기준으로 3/2) 추출물의 분취량을 증발시켜 건조시키고 메탄올에 용해시켜 과산화지질을 미세 측정하였다. 알데히드 지질 과산화 생성물의 측정: 말론알데히드 및 4-히드록시노네날. 0.5ml 분취량의 배양 배지에, 동일한 부피의 티오바르비투르산 (50% 아세트산(acetic acid glacial) 중 0.34% TBA)을 첨가 하였다. 수조에서 10분간 끓인 후, 535nm 여기 파장과 553- 발광 파장에서 형광으로 장미색이 발색되었다. 적절한 표준 곡선을 병렬로 실행하였다 (1,1,3,3-테트라에톡시프로판, Sigma). 생체내 실험 후 LPO의 조직 수준을 측정하기 위해, 생체내 실험 후 -70℃에서 보관된, 관련된 뇌, 간, 폐, 피부, 신장 동결된 조직 절편들을 차가운 4℃ PBS, 얼음 위에서 해동하고; 조직 공급원에 따라 1회 또는 2회 헹구었다. 조직 추출물은 0.01% w/v 부틸화 하이드록시톨루엔 (BHT, Sigma)을 함유하는 차가운 빙하 10% TCA로 추출하여 얻었다. 조직을 얼음 위에서 고속 균질화기로 30 초 동안 추가로 균질화한 다음 3500Xg 동안 10 분 동안 원심분리했다. 조직 추출물의 상청액 분취량을 LPO에 대해 테스트했으며, 추출 후 상청액으로 방출된 말론디알데히드 생성물로 측정했다. 조직 샘플에서, LPO는 습윤 중량 당 TBA-반응성 물질 (TBARS)로 표시되었다.

결과:

다양한 조직에서 TBARS의 기저 수준은 유사했다: 랫트 뇌 절편에서 40-50 pmol/g 습윤 중량, 간에서 60-80 pmol/g 습윤 중량. 조건화 배지로의 LPO 방출은 iPSC 신경세포 전구체에서 펜톤 반응 (황산제일철7수화물 (Sigma) 0.1mM + 0.2mM H₂O₂, 20 분)에 의한 ROS 유도 후 5 내지 10 배 증가했다. 황산제일철7수화물 (Sigma)을 함유하는 골수 레독솜과의 공동 배양은 LPO 증가를 40-80% 억제했다.

콘카나발린 A 처리는 간에서 LPO를 약 2배 증가시켰으며, 5mcM의 DFX 및 5mcM 알파-토코페롤로 캡슐화된 인간 중간엽 지방 조직에서 유래한 레독솜을 동시에 처리시 LPO가 기저 수준으로 감소했다.

실시예 13: RNA 캡슐화 및 전기천공 실험.

RBC:

바이옥솜을 인간 적혈구 (RBC)로부터 제조하였다. RBC는 바람직하게는 그룹 O 혈액 샘플에서 수집한 다음, 원심분리 및 백혈구제거 필터 (Terumo Japan)에 의해 혈장 및 백혈구로부터 분리했다. 바이옥솜 추출 절차는 위에서 설명한대로 수행하였다. 전기천공 실험은 Gene Pulser Xcell 전기천공기 (BioRad)를 사용하여 수행하였으며, 0.4cm 큐벳을 사용하여 100μF의 고정 커패시턴스에서 지수 프로그램을 사용했다. E9 RBC에서 얻은 E12 바이옥솜을 OptiMEM (ThermoFisher Scientific) 중에 희석하고, AF647 (ThermoFisher Scientific)과 결합된 4μg 덱스트란과 혼합하여 총 부피를 200μl로 하고, 100μl의 바이옥솜 분취량을 각 큐벳에 추가하고 얼음에서 150-250V 에서 15동안 배양했다. 응집이 형성된 경우, 바이옥솜 입자 형성 동안보다 50% 에너지 감소로 추가적인 초음파 처리 단일 펄스에 의해 응집 제거를 수행하였다. 캡슐화 효능을 테스트하기 위해, 전기천공된 바이옥솜을 5μg 라텍스 비드 (ThermoFisher Scientific)로 밤새 인큐베이션한 후 덱스트란-AF647의 FACS 측정을 수행했다.

지방 조직 유래 바이옥솜:

조(crude) RNA 캡슐화 지방 조직 유래 바이옥솜을 제조하였다- E8 바이옥솜은 인간 지방 조직의 E6 세포 배양으로부터 제조하였으며 단일 6 초 펄스와 40%의 에너지 및 0.5mcg RNA (RNA 온전성을 유지하기 위해)로 부드러운 초음파 처리에 의해 캡슐화하였다. 수득된 RNA 캡슐화된 바이옥솜의 다분산지수 PDI는 548 nm였다. RNA 캡슐화된 바이옥솜을 추가로 10 배 희석한 다음 추가 30초 펄스 동안 초음파 처리하여 평균 입자 크기가 450nm가 되었다. 특히 간 표적화가 바람직한 경우에는 선택적으로 Avant 압출기에 의한 추가 압출로 100nm 크기에 도달할 수 있다.

실시예 14: HFF-인간 포피 섬유아세포 배양에 대한 바이옥솜/RNA 처리의 생물 활성.

MTT-a 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 세포 증식 분석 (Life Technologies)을 수행하여, 전술한 바와 같이 E8 세포에서 유래한 바이옥솜 당 0.5mcg의 내부 RNA가 로딩된 지방 조직 유래 바이옥솜의, 기아 스트레스 (혈청 결핍)에 대한 효과를 조사했다. 간략하게 말하면, 1x10⁴ 세포/웰을 96-웰 플레이트에 시딩하고 90% 컨플루언시에 도달하도록 18 ~ 24 시간 동안 배양하였다. 부착 후, 세포를 PBS로 2 회 세척한 다음 무혈청 배지를 첨가하였다. 혈청이 결핍된 세포와 대조군 (10% 혈청) 세포를 모두 24 시간에 수확했다. 세포 배양 상청액을 버리고 각 웰 (0.5 mg/ml; Sigma Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Germany)에 20 μl MTT 용액을 첨가한 다음, 세포를 추가로 4 시간 동안 배양했다. 그후 상청액을 제거하고 200 μl DMSO를 각 웰에 15 분 동안 약간 교반하면서 첨가하였다. 그다음 490 nm의 파장에서 흡광도를 각 웰에 대해 4개의 반복(4 replicate)을 사용하여 검출하였고 평균값을 계산하였다. 실험 24 시간 전에 10% DMEM FBS에서 0% FBS로 FBS 를 고갈(starvation)시켰고, 생존성이 거의 30%로 감소된 무혈청 샘플과 비교하여 바이옥솜으로 처리함 샘플은 HFF에 대해 양성 대조군 (10% FBS)와 동일한 증식 효과를 보였다.

실시예 15: HFK에 대한 시험관내 스크래치 분석.

바이옥솜은 원발성 인간 포피 케라티노사이트 - HFF 세포로부터 전술한 공정에 의해 제조하였다. HFK는 상처 치유 모델의 시험관내 기능 분석을 위한 세포로 사용되었다. 1 일째 세포를 1 차 스톡 (P0-1)에서 해동하고 5% FBS (바람직하게는 엑소좀 고갈로 인증됨) 및 1% 글루타맥스가 보충된 일반 배지에서 P1-2를 배양했다. 2-3 일째에, 계대배양을 확장하여 실험을 위한 컨플루언스에 도달했다. 그후 세포를, 3μm 직경의 구멍을 가진 1.4cm 직경의 12-웰 인서트(Greiner)에 2Х10⁶/cm² 의 밀도로 분할하거나, 스크래치 분석 키트 프로토콜에 따라 6-웰 플레이트(Corning)에 분할하거나, 각 0.75 cmХ0.95 cm (Nunc)의 8-챔버 슬라이드에 분할함으로써 1.5%의 FBS에 재시딩하였다. 4 일째 (계대 배양 후 ~ 1 일)- FBS는 12 시간 동안 0.5%로 감소했다. 전체 FBS 고갈(starvation)은 유리 파스퇴르 피펫 또는 키트 형태 템플릿 (Cytoselect 상처 치유 분석, Cell Biolabs Incorporated, CBA-120)에 의해 수행된 스크래치와 함께 밤새 수행하였다. 세포를 4중(quadruplicate) 또는 3중(triplicate)으로 FBS 5%로 처리하고, 양성 대조군으로서 FBS 고갈 이전의 모든 조정 절차 동안 남겨두었고, 음성 대조군으로서 바이옥솜으로 처리되지 않은 동일한 수의 웰을 남겨두었다.

고갈 동안 방출된 활성 바이옥솜/엑소좀의 공급원으로 사용된 조건화 배지의 수집후에 HBSS와 Hepes로 세척한 후 바이옥솜을 첨가하였다. 세포 계수는 세포 계수 대 양성 대조군의 백분율로 수행하였다.

결과:

FBS 5% 보충된 양성 대조군은 24 시간에 스크래치가 완전히 닫혔다. 완전 고갈 및 스크래치 스트레스 하에서 미처리된 세포는 성장을 멈추고 24 시간에 세포 사멸을 겪었다. 생존 세포는 스크래치 12 시간 후에 계수하였다. 10⁵에서HFF의 바이옥솜 처리는 양성 대조군의 60-75%에 이른다. HFF 로부터 제조된 동일 용량의 바이옥솜 플러스 4회 계대의 HFK로부터의 RNA은 동일한 세포 수를 유발하였다. HFK RNA가 있는 HFF 바이옥솜은 모든 용량에서 양성 대조군과 동일한 속도로 24 시간에 스크래치를 완전히 닫았다. 10³에서HFK RNA가 없는 HFF 바이옥솜에서는 스크래치 흔적이 남아있었고, HFF RNA 가 있는 HFF 바이옥솜은 고용량에서 RNA 가 없는 HFF과 유사하게 수행하였다.

실시예 16 : 생체내 간 섬유증 모델에서 레독솜의 생체분포 및 간 보호 효과를 시험하기위한 파일럿 연구.

선택적 간 보호 치료제로 바이옥솜 및 레독솜을 개발하기 위해 콘카나발린 A (ConA) 유도 간 괴사를 병리학적인 생체내 모델로 선택했다. 생체 내에서 바이옥솜 및 레독솜의 효능을 테스트하기 위해, 연구 시작 시점에 10-11 주령의 SD 랫트 n = 36을 각 그룹에 12 마리씩 3 개 그룹으로 나누었다. 6 마리의 동물로 구성된 추가 그룹을 파일럿 생체분포 연구에 사용하였다. 대조군은 ConA 주사 후 PBS로 처리하였다; 바이옥솜 및 레독솜의 간 보호 효과를 계산하여 대조군의 백분율로 표시했다. 20mg/kg의 ConA를 모든 동물에 정맥 주사하여 기저 비처리 동물(basal nontreated animal)에 비해 간 손상을 유도했다. ConA 투여 후 형광 표지된 세라마이드 BioDipy와 함께 단일 용량의 E5 바이옥솜을 IV 주사하였다. 염증 부위의 지질 과산화가 표적 부위의 카고 방출에 영향을 미치는 것으로 알려져 있기 때문에, BioDipy 세라마이드를 지질 센서로 선택하였다. 생체분포 연구의 랫트는 ConA와 바이옥솜 BioDipy 주사 후 8 시간 후에 희생되었다.

결과:

강한 형광이 간, 신장 및 폐에 주사 후 2 시간에 보였다. 간은 바이옥솜 BioDipy의 주요 표적 기관이었다. 급성 간 손상의 기능적 파라미터를 모니터링하기 위해, 모든 그룹에서 ConA 주입 후 8 시간에 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT)의 혈중 농도를 측정했다. ConA 대조군의 ALT 수준은 300 내지 1000 Units/Liter 범위였고 ALT의 기저 수준은 100 Units/Liter보다 낮았다. 간 괴사는 헤마톡실린과 에오신 (H&E) 염색으로 시험했다. 조직학적 검사를 위해, 각 동물의 간 조각을 잘라내어 10% 완충된 포르말린에 24 시간 동안 담근 후 단계적 에탄올 탈수 후 고정시켰다. 블록은 파라핀 왁스에 추가로 매립하였다. 일련의 3mm 섹션을 H&E로 염색하였다. 조직병리학적 점수는 2 명의 "맹검"병리학자에 의해 3 가지 등급으로 단순화하여 평가하였다 : 0 기저/건강(basal/healthy); 1 낮음 내지 중간 정도의 손상(low-to-moderate damage)/ 3 독성 내지 조직 괴사(toxic-to-tissue necrotic). 대부분의 레독솜 및 바이옥솜 처리된 동물은 점수 2로 평가되어 급성 및 만성 간 병리 모델에서 추가 용량 및 시간 의존성에 대한 간 보호 타당성을 입증했다.

실시예 17: 생체내 모델에서 간 섬유증에서 레독솜의 간보호 효과를 테스트하기 위한 파일럿 연구

식물 세포 기원의 줄기세포주, 분화된 세포 및 배양 세포로부터 바이옥솜을 제조하기 위하여, 다양한 세포 배양물 및 시작 추출 세포 원료 (형태 2E3 내지 E9 세포)를 사용하였다. 바이옥솜 입자의 수율은 시작 세포(starting cell) 수와 상관관계가 있으며 E6-E12 바이옥솜 입자에서 다양했다. 표준 로터 증발, 질소 및 아르곤 가스 증발 및 동결건조를 포함한 다양한 산업적 건조 방법이 사용되었다. 유사한 수율 및 입자 크기 분포가 다양한 방법으로 얻어졌다. 세포는 사용된 모든 줄기세포, HFF, HFK, HepG2, 1차 세포, 담배 세포, 및 생물반응기에서 성장한 CD3 발현 T-림프구인 Jurkat (ATCC; 클론 E6-1)과 같은 부착 배양물에서 성장했다. 초음파 처리 단계 전 또는 필요에 따라서는 압출 중에, 친수성 부형제 완충액에서 관련된 카고를 첨가했다. 캡슐화 효율을 개선하기 위해, 최소 24 시간 간격으로 3 회의 동결 해동 주기를 수행한 결과, 골수 줄기세포에서 제조했을 때 입자 크기가 500nm 미만이 되었다. 도 10A는 덜 균일하지만 여전히 QC 사양, 입자 크기 데이터 하에 있음을 보여준다.

용매 제약 등급, USP 등급, 순도 90% 초과 또는 분석 등급이 사용되었다. 바이옥솜 입자를 수집물로부터 추출하고, 액체 질소를 저장하고, 두 번 세척하여 FBD, 또는/및 DMSO-함유 동결보존 배지, 해동된 펠렛을 제거했다. 다양한 부착 배양 세포층 (트립신 스트레스를 피하기 위함), 줄기세포, 기질 및 상피세포, 및 원발성, 불멸화 세포주로부터 직접 추출에 의하여, 그리고 신선한 펠렛으로부터 바이옥솜을 추출하였다. 도 10B에서 입증 된 바와 같이, 대표적인 균일한 입자 크기를 가진 >E9 바이옥솜 입자가 인간 지방 조직 분리된 MSC에서 수득되었다. HIP 3:2가 최적의 용매 시스템으로 확인되었다. RNAsave 또는 RNAse가없는 멸균수와 함께 2:1로 사용하여 단일 단계에서 RNA를 공동 침전시켰다. 순수 RNA를 회수하고 Nanodrop으로 측정하여 순도와 온전성을 확인했다. 바이옥솜 입자 농도와 상관관계가 있는 공정에 의해 분리된 RNA의 일반적인 농도는 표 1에 나타내었고, 세포 수 및 세포 중량별로 표준화되어 있다.

수율 파라미터	RNA 총 추출	입자수(Number of Particles)
세포수	~1-10 mcg/E6	E9/E6
세포 습윤 중량(Cell wet weight)	1.2 mcg/mg wwt	E8/mg wwt

추가 세척 단계와 유사한 절차에 의해 조건화 배지로부터 바이옥솜을 제조하였다. 바이옥솜을 수집하기 전에 세포를 HBSS + Hepes로 세척했다. FBS 고갈된 조건에서 높은 수율의 RNA가 수집되었다.

다양한 분자가 카고로 사용되었다: 소분자 친수성 카고 모델로서, 아스코르브산, 데스페리옥사민 및 EDTA; 생물학적 분자로서, RNA 및 녹색 플루오레세인 단백질; 생체활성 지질 샘플로서, 세라마이드, 토코페롤, 도코사헥사에노익산 에스테르, 스핑고미엘린 및 테르펜. 생체막 변형 및 복잡한 카고를 갖는 생체활성 지질 캡슐화된 레독솜의 대표적인 입자 크기는, 일반적으로 평균 크기 0.5-3 마이크론의 입자 크기를 나타내었다.

실시예 18: RNA 캡슐화 및 전기천공 실험.

바이옥솜이 RNA 형질감염 및 전달을 위한 가능한 운반체임을 증명하기 위해, 바이옥솜을 인간 적혈구 RBC로부터 제조하였다. RBC는 그룹 O 혈액 샘플에서 수집한 다음, 원심분리 및 백혈구제거 필터 (Terumo Japan)에 의해 혈장 및 백혈구로부터 분리했다. 바이옥솜 추출 절차는 위에서 설명한대로 수행하였다. 향후 검증된 양성 대조군에 의해 정제된 올리고뉴클레오티드를 바이옥솜으로 전달하기 위해 전기 천공 보정(calibration)을 수행했다. 전기천공 실험은 Gene Pulser Xcell 전기천공기 (BioRad)를 사용하여 수행하였으며, 0.4cm 큐벳을 사용하여 100μF의 고정 커패시턴스에서 지수 프로그램을 사용했다. E9 RBC에서 얻은 E12 바이옥솜을 OptiMEM (ThermoFisher Scientific) 중에 희석하고 AF647 (ThermoFisher Scientific)과 결합된 4μg 덱스트란과 혼합하여 총 부피를 200μl로 하고, 100μl의 바이옥솜 분취량을 각 큐벳에 추가하고 얼음에서 150-250V 에서 15동안 배양했다. 응집이 형성된 경우, 바이옥솜 입자 형성 동안보다 50% 에너지 감소로 추가적인 초음파 처리 단일 펄스에 의해 응집 제거를 수행하였다. 캡슐화 효능을 테스트하기 위해, 전기천공된 바이옥솜을 5μg 라텍스 비드 (ThermoFisher Scientific)로 밤새 인큐베이션한 후 덱스트란-AF647의 FACS 측정을 수행했다.

또한, 조(crude) RNA 캡슐화 지방 조직 유래 바이옥솜을 제조하였다- E8 바이옥솜은 인간 지방 조직의 E6 세포 배양으로부터 제조하였으며 단일 6 초 펄스와 40%의 에너지 및 0.5mcg RNA (RNA 온전성을 유지하기 위해)로 부드러운 초음파 처리에 의해 캡슐화하였다. 수득된 RNA 캡슐화된 바이옥솜의 다분산지수 PDI는 548 nm였다. RNA 캡슐화된 바이옥솜을 추가로 10 배 희석한 다음 추가 30초 펄스 동안 초음파 처리하여 평균 입자 크기가 450nm가 되었다. 특히 간 표적화의 경우 Avant 압출기에 의한 추가 압출로 평균 입자 크기가 100nm가 되었다. 공정의 견고성은 동일한 단계에서 효율적인 총 RNA 분리에 의해 검증되었으며, 조건화 배지에서 유사한 RNA 수율을 얻었다.

실시예 19: HFF-인간 포피 섬유아세포 배양에 대한 바이옥솜/RNA 처리의 생물 활성.

MTT-a 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 세포 증식 분석 (Life Technologies)을 수행하여, 전술한 바와 같이 E⁸ 세포에서 유래한 바이옥솜 당 0.5mcg의 내부 RNA가 로딩된 지방 조직 유래 바이옥솜의, 기아 스트레스 (혈청 결핍)에 대한 효과를 조사했다. 1x10⁴ 세포/웰을 96-웰 플레이트에 시딩하고 90% 컨플루언시에 도달하도록 18 ~ 24 시간 동안 배양하였다. 부착 후, 세포를 PBS로 2 회 세척한 다음 무혈청 배지를 첨가하였다. 혈청이 결핍 된 세포와 대조군 (10% 혈청) 세포를 모두 24 시간에 수확했다. 세포 배양 상청액을 버리고 각 웰 (0.5 mg/ml; Sigma Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Germany)에 20 μl MTT 용액을 첨가한 다음, 세포를 추가로 4 시간 동안 배양했다. 그후 상청액을 제거하고 200 μl DMSO를 각 웰에 15 분 동안 약간 교반하면서 첨가하였다. 그다음 490 nm의 파장에서 흡광도를 각 웰에 대해 4개의 반복(4 replicate)을 사용하여 검출하였고 평균값을 계산하였다. 실험 24 시간 전에 10% DMEM FBS에서 0% FBS로 FBS 를 고갈(starvation)시켰고, 생존성이 거의 30%로 감소된 무혈청 샘플과 비교하여 바이옥솜으로 처리함 샘플은 HFF에 대해 양성 대조군 (10% FBS)와 동일한 증식 효과를 보였다.

실시예 20: 안정성 개념 증명 결과.

바이옥솜의 안정성 설계에 대한 타당성을 테스트하기 위해, 골수 및 기타 다양한 공급원 세포 유래의 바이옥솜을 전술한 바와 같이 제조하고, 다양한 온도에서 초음파 처리 후 1일, 1주 및 1개월 동안 4℃에서 보관하고; Revco에서 -70℃로 보관하였다. NanoSight Tracking Analysis NS300 system (Malvern, UK)을 사용하여 EV의 농도 및 크기 분포를 정량화했다. 도 3A-C는 입자 크기의 예를 나타낸다. 입자 농도는 단기간 (1 주일 미만) 보관시 영향을 받지 않았으며 4℃에서 한 달 보관 후 응집되는 것으로 나타났다. 70℃에서 동결 후 샘플의 안정성은 영향을 받지 않았다. 특히, 사전 초음파 처리된 바이옥솜은 입자 크기 측정 전에 반복적으로 초음파 처리된 것과 동일한 수준에서 -70℃ 후에도 안정적이었다.

본원에서 사용된 용어는 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하려는 의도가 아니다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 달리 명시하지 않는한 복수형도 포함하는 것으로 의도된다. 용어 "포함하다" 또는 "포함하는"은 본 명세서에서 사 용되는 경우, 언급한 특징, 정수, 단계, 연산, 구성요소, 성분 및/또는 이들의 그룹 또는 이들의 조합의 존재를 명시하지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계, 연산, 구성요소, 성분 및/또는 이들의 그룹 또는 이들의 조합의 존재 또는 추가를 배제하지 않는 것으로 부가적으로 이해될 것이다. 본원에 사용된 용어 "포함하다(comprises)", "포함하는(comprising)", "포함하다(includes)", "포함하는(including)", "갖는" 및 이들의 동근어(conjugate)는 "포함하나, 이에 제한되지는 않음"을 의미한다. 용어 "이루어진"은 "포함하고, 이에 제한되는"을 의미한다.

본원에서 사용된 용어 "및/또는"은 연관된 열거 항목들 중 하나 이상 또는 임의의 모든 가능한 조합을 말하고, 대안적 ("또는")으로 해석되는 경우 조합의 부재를 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "엑소좀"은 세포외 소포의 범위를 포함하는, 막-유래 미세소포를 지칭하며, 이는 정상적인 생리학 및 병리학적 조건 하에서 많은 세포 유형에 의해 분비되는, 엑소좀, 미세입자 및 분비성 미세소포(shed microvesicle), 온코좀(oncosome), 엑토좀(ectosome)을 포함하며, 모든 크기의 세포내 소포(intracellular vesicle), 식물 세크레톰 (secretome) 소포, 마이크로바이옴(microbiome) 및 레트로바이러스 유사 입자 (retroviral-like particle)에 적용될 수 있다.

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개별 구체예의 맥락에서, 명확함을 위하여 설명된, 본 발명의 특정한 특징들은 또한 단일 구체예에서 조합적으로 제공될 수 있다. 반대로, 단일 구체예의 맥락에서, 간결함을 위해 설명된 본 발명의 다양한 특징들은 본 발명의 임의의 다른 설명된 구체예에서 개별적으로 또는 임의의 적절한 하부 조합으로 또는 적절하게 제공될 수 있다 다양한 구체예의 맥락에서 설명된 특정 특징들은, 구체예가 그러한 요소없이 작동하지 않는 한, 이러한 구체예의 필수 특징으로 간주되지 않는다.

용어 "약"이 사용될 때마다 이는 양, 시간적 기간 등과 같은 측정 가능한 값을 의미하며, 지정된 값에서 ±25%, ±20%, ±10%, ±5%, ±1% 또는 ±0.1%의 변동을 포함하는 것을 의미하는데, 이는 이러한 변동이 개시된 방법을 수행하는 데 적합하기 때문이다.

본 출원 전체에 걸쳐, 본 발명의 개시의 다양한 구현예가 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 기재는 단지 편의 및 간결성을 위한 것이며, 본 발명의 개시의 범위에 대한 완고한 제한으로 해석되어선 안되는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 범위의 기재는 모든 가능한 하위범위 뿐만 아니라 그 범위 내의 개별적 수치 값을 구체적으로 개시하는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 기재는 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등뿐만 아니라 그 범위 내의 개별적 수, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 및 6을 구체적으로 개시하는 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭에 관계 없이 적용된다.

수치 범위가 본원에 지시될 때마다, 지시된 범위 내의 임의의 인용된 숫자(분수 또는 정수)를 포함하는 것을 의미한다. 첫 번째 표시 수와 두 번째 표시 수 "사이"의 어구 "범위" 및 첫 번째 표시 수로부터 두 번째 표시 수"까지"의 "범위"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 첫 번째 및 두 번째 표시된 수 및 그 사이의 모든 분수 및 정수를 포함하는 것을 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "방법"은 화학, 약리학, 생물학, 생화학 및 의학 분야의 실무자에게 공지되거나 이들에 의해 공지된 방식, 수단, 기술 및 절차로부터 용이하게 개발되는 방식, 수단, 기술 및 절차를 포함하나 이에 제한되지는 않는 제공된 작업을 수행하기 위한 방식, 수단, 기술 및 절차를 말한다.

"환자" 또는 "개체"는 임의의 포유 동물을 포함하는 것을 의미한다. 본원에 사용된 "포유동물"은 포유류로 분류되는 임의의 동물을 지칭하며, 이는 인간, 실험동물, 예를 들어 원숭이, 랫트, 마우스 및 기니피그, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예를 들어 개, 말, 고양이, 소 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 그 전체가 참고로 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 포함한 특허 명세서가 우선한다. 또한 재료, 방법 및 실시예는 예시일 뿐이며 제한하려는 의도가 아니다.

당업자는 본 발명이 상기에 특별히 도시되고 설명된 것에 제한되지 않는다는 것을 이해할 것이다. 오히려, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해 정의되고, 전술한 다양한 구성의 조합 및 하위 조합뿐만 아니라, 전술한 설명을 읽을 때 당업자에게 일어날 수 있는, 그의 변형 및 수정을 모두 포함한다.

Claims

세포막 성분을 포함하고, 표적 세포와 융합되도록 설계된, 인공 바이옥솜(bioxome) 입자로서,
상기 바이옥솜 입자는, 하나 이상의 소정의 활성 분자를 포함하는 카고(cargo)를 운반하도록 조작되고; 상기 카고는 바이옥솜 입자와 표적 세포의 융합 후에 표적 세포 안으로 방출될 수 있고; 및 상기 세포막 성분은 선택된 세포성(cellular) 공급원 또는 세포외(extracellular) 공급원으로부터 유래된 것인, 인공 바이옥솜 입자.
제1항에 있어서, 상기 카고가 2 이상의 활성 분자를 포함하는 것인, 바이옥솜 입자.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 카고가 복수의 활성 분자를 포함하는 것인, 바이옥솜 입자.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공급원이 섬유아세포, 중간엽 줄기세포, 줄기세포, 면역계 세포, 수지상 세포, 외배엽, 케라티노사이트, GI의 세포, 구강 세포, 비강 점막 세포, 신경 세포, 망막 세포, 내피 세포, 심장구체(cardiosphere), 심근 세포, 혈관주위세포(pericyte), 혈액 세포, 멜라노사이트, 실질 세포(parenchymal cell), 간 예비 세포(liver reserve cell), 신경 줄기세포, 췌장 줄기세포, 배아 줄기세포, 골수, 피부 조직, 간 조직, 췌장 조직, 체액, 배설물 또는 수술 추출 조직, 우유, 타액, 점액, 혈장, 소변, 대변, 피지, 산후 탯줄, 태반, 양막, 신장 조직, 신경 조직, 부신 조직, 점막 상피, 평활근 조직, 박테리아 세포, 박테리아 배양, 전체 미생물(whole microorganism), 조건 배지, 양수, 지질흡인물, 지방흡입 부산물, 및 식물 조직으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 바이옥솜 입자.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 분자가 핵산, 펩티드, 아미노산, 폴리펩티드, 뉴클레오시드, 성장 인자, 유기 분자, 폴리페놀, 스테로이드, 친유성 난용성 약물, 무기 분자, 항산화제, 호르몬, 항체, 비타민, 사이토카인, 효소, 열충격 단백질, 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 바이옥솜 입자.
제5항에 있어서, 활성 분자가 칸나비노이드(cannabinoid), 칸나비노이드 산(cannabinoid acid), 엔도칸나비노이드(endocannabinoid)로부터 선택되는 것인, 바이옥솜 입자.
제5항 또는 제6항에 있어서, 칸나비노이드, 칸나비노이드 산 및 엔도칸나비노이드는 테트라하이드로칸나비놀산 (THCa), 칸나비디올산 (CBDa), 칸나비놀산 (CBNa), 칸나비크로멘산 (CBCa), 테트라하이드로칸나비놀 (THC), 칸나비놀 (CBN), 칸나비놀 (CBN), 칸나비디올 (CBD), 칸나비크로멘 (CBC), 및 아실에탄올아미드로 구성된 군에서 선택되는, 바이옥솜 입자.
제5항에 있어서, 핵산이 리보핵산 (RNA) 또는 데옥시리보핵산 (DNA) 인, 바이옥솜 입자.
제8항에 있어서, 핵산이 RNA이고, siRNA, 안티센스 RNA, iRNA, 마이크로 RNA, 안타고미르, 압타머 및 리보자임 mRNA로 구성된 군으로부터 선택되는, 바이옥솜 입자.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 분자가 치료 효과를 갖는, 바이옥솜 입자.
제10항에 있어서, 치료 효과가 항-염증 효과, 항-섬유화 효과, 항-종양 효과 및 신경보호 효과로 이루어진 군에서 선택되는, 바이옥솜 입자.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 바이옥솜이 레독솜(redoxome)이며, 카고가 하나 이상의 레독스 활성 자유-라디칼 소거 화합물(redox active free-radicals scavenging compound)을 포함하는, 바이옥솜 입자.
제12항에 있어서, 펜톤 반응 복합체 차단제, 하이드록실 라디칼 트랩, 철 킬레이터 및 지질 라디칼 트랩을 포함하는, 레독솜.
제12항 또는 제11항에 있어서, LPO 연쇄 반응을 차단할 수 있는, 예를 들어 지질 라디칼/ 과산화지질 트랩(lipid radical/ peroxide trap), 예를 들어 비타민 E, 테르페노이드, 폴리페놀, 플라보노이드, 페놀산, 칸나비노이드, 레티노이드, 비타민 D, 리포산, 스테롤인, 레독솜.
제13 항 또는 제14항에 있어서, 라디칼 트랩이 아스코르브산, 산화질소 공여체 (S-니트로소글루타티온) 또는 이의 유도체인, 레독솜.
제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 철 킬레이터가 데스페리옥사민 (DFX), 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 루틴, 디소듐 EDTA, 테트라소듐 EDTA, 칼슘 디소듐 EDTA, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA) 또는 이의 염, 하이드록시에틸렌디아민트리아세트산 (HEDTA) 또는 이의 염, 니트릴로트리아세트산 (NTA), 아세틸트리헥실시트레이트, 아미노트리메틸렌 포스폰산, 베타-알라닌 디아세트산, 비스무트 시트레이트, 시트르산, 시클로헥산디아민 테트라아세트산, 디암모늄 시트레이트, 디부틸 옥살레이트, 디에틸 옥살레이트, 디이소부틸 옥살레이트, 디이소프로필 옥살레이트, 디리튬 옥살레이트, 디메틸 옥살레이트, 디포타슘 EDTA, 디포타슘 옥살레이트, 디프로필 옥살레이트, 디소듐 EDTA-구리, 디소듐 파이로포스페이트, 에티드론산, HEDTA, 메틸 시클로덱스트린, 옥살산, 펜타포타슘, 트리포스페이트, 펜타소듐 아미노트리메틸렌 포스포네이트, 펜타소듐 펜티테이트, 펜타소듐 트리포스페이트, 펜테틴산, 디카르복시산, 피트산, 포타슘 시트레이트, 소듐 시트레이트, 소듐 디하이드록시메틸글리시네이트, 소듐 글루셉테이트, 소듐 글루코네이트, 소듐 헥사메타포스페이트, 소듐 메타포스페이트, 소듐 메타실리케이트, 소듐 옥살레이트, 소듐 트리메타포스페이트, tea-EDTA, 테트라하이드록시프로필 에틸렌디아민, 테트라포타슘 에티드로네이트, 테트라포타슘 파이로포스페이트, 테트라소듐 에티드로네이트, 테트라소듐 파이로포스페이트, 트리포타슘 EDTA, 트리소듐 EDTA, 트리소듐 hedta, 트리소듐 NTA, 트리소듐 포스페이트, 말산, 푸마르산, 말톨, 숙시머, 페니실라민, 디메르카프롤, 디페리프론, 천연 단백질 기반의 철 킬레이터, 멜라토닌, 시더포어, 아연 또는 구리 양이온, 또는 염 또는 착물, 및 데스페리옥사민 메실레이트, 또는 이들의 조합물로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 레독솜.
제16항에 있어서, 철 킬레이터가 EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산), DTPA (디에틸렌트리아민펜타아세트산), NTA (니트릴로트리아세트산), 데톡사민, 데페록사민, 데페리프론, 데페라시록스, 글루타티온, 메탈로프로테인, 페로첼 (비스-글리시네이트 킬레이트), 세룰로플라스민, 페니실라민, 쿠프리존, 트리엔틴, 페룰산, 아세트산아연, 리포칼린 2, 및 디메르카프롤로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 레독솜.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 장기 순환성의 서방출 바이옥솜인, 바이옥솜 입자.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 선택적 표적화 바이옥솜인, 바이옥솜.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 바이옥솜인, 바이옥솜.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 바이옥솜 입자 및 하나 이상의 담체를 포함하는 조성물.
제21항에 있어서, 상기 조성물이 약학 조성물이고, 담체가 약학적으로 허용되는 담체인, 조성물.
제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 조성물은 경구, 정맥내, 피하, 복강 내, 설하, 조직 삽입 임플란트를 통한, 조직 내, 척추강내, 근육 내, 국소, 안구, 비강 내, 직장, 질, 폐, 경점막 및 경피 투여에 적합한 것인, 조성물.
제21항에 있어서, 상기 조성물이 화장품용 조성물이고, 담체는 화장품용으로 허용되는 담체인, 조성물.
제21항에 있어서, 상기 조성물이 식용 조성물이고, 담체가 식품등급 담체인, 조성물.
복수의 바이옥솜 입자를 포함하는 샘플의 제조 방법으로서,
상기 바이옥솜 입자는 하나 이상의 활성 분자를 포함하는 카고(cargo)를 운반하도록 조작되고, 표적 세포와 융합하여 카고를 방출하도록 설계되고; 상기 바이옥솜 입자는 선택된 세포성 공급원 또는 세포외 공급원으로부터 유래된 세포막 성분을 포함하고; 상기 방법은 다음을 포함하며:
a. 약용매(mild solvent) 시스템에서, 선택된 세포성 공급원 또는 세포외 공급원으로부터 전체 세포 지질 추출을 수행하여 지질 추출물을 얻는 단계;
b. 상기 지질 추출물을 건조하는 단계; 및
c. 초음파 처리를 한 단계 이상 수행하여 바이옥솜 입자의 자가-조립을 유도합는 단계;
샘플내 생성된 바이옥솜 입자는 약 0.03㎛ 내지 5㎛의 평균 입자 크기를 특징으로 하는, 제조 방법.
제26항에 있어서, 평균 입자 크기가 0.05㎛ 내지 3㎛ 인, 방법.
제27항에 있어서, 평균 입자 크기가 0.08㎛ 내지 1.5㎛ 인, 방법.
제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 바이옥솜 입자를 포함하는 샘플의 pH가 3.5 내지 5.5 인, 방법.
제29항에 있어서, 바이옥솜 입자를 포함하는 샘플의 pH가 4.5 내지 5 인, 방법.
제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 약용매 시스템이 극성 및 비극성 용매의 혼합물을 포함하는, 방법.
제31항에 있어서, 용매 시스템에서 극성 용매가 이소프로판올, 에탄올, n-부탄올, 및 수-포화 n-부탄올로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.
제31항 또는 제32항에 있어서, 용매 시스템에서 비극성 용매가 헥산, 테르펜 그룹로부터의 용매, 및 초임계 CO₂ 추출물로부터 선택되는 것인, 방법.
제33항에 있어서, 용매 시스템에서 비극성 용매가 n-헥산인, 방법.
제33항에 있어서, 테르펜 그룹로부터의 용매가 d-리모넨, α-피넨 및 파라-시멘으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.
제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 용매 시스템에서 극성 용매가 이소프로판올이고, 비극성 용매가 n-헥산인, 방법.
제26항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 용매 시스템이 안정화제를 추가로 포함하는, 방법.
제37항에 있어서, 안정화제가 부틸-하이드록시톨루엔 (BHT) 또는 지질 라디칼 트랩인, 방법.
제26항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 용매 시스템이 항산화제, 계면활성제, 비타민 E, 스쿠알렌, 콜레스테롤 또는 이들의 조합물을 추가로 포함하는 것인, 방법.
제26항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산의 공침 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제40항에 있어서, 핵산이 리보핵산 (RNA) 또는 데옥시리보핵산 (DNA) 인, 방법.
제41항에 있어서, 핵산이 RNA 인, 방법.
제26항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 전체 지질 추출을 위한 세포성 또는 세포 외 공급원이, 섬유아세포, 중간엽 줄기세포, 줄기세포, 면역계 세포, 수지상 세포, 외배엽, 케라티노사이트, GI의 세포, 구강 세포, 비강 점막 세포, 신경 세포, 망막 세포, 내피 세포, 심장구체(cardiosphere), 심근 세포, 혈관주위세포(pericyte), 혈액 세포, 멜라노사이트, 실질 세포(parenchymal cell), 간 예비 세포(liver reserve cell), 신경 줄기세포, 췌장 줄기세포, 배아 줄기세포, 골수, 피부 조직, 간 조직, 췌장 조직, 체액, 배설물 또는 수술 추출 조직, 우유, 타액, 점액, 혈장, 소변, 대변, 피지, 산후 탯줄, 태반, 양막, 신장 조직, 신경 조직, 부신 조직, 점막 상피, 평활근 조직, 박테리아 세포, 박테리아 배양, 전체 미생물(whole microorganism), 조건 배지, 양수, 지질흡인물, 지방흡입 부산물, 및 식물 조직으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.
제26항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 추출이 세포-조건화 배지, 동결건조된 조건화 세포 배지, 세포 펠렛, 동결된 세포, 건조 세포, 세척된 세포 벌크, 비-부착성 세포 현탁물, 및 부착성 세포층으로부터 수행되는 것인, 방법.
제44항에 있어서, 부착성 세포층이 (다중)플라스크, 디쉬, 스캐폴드, 비드 및 생물반응기로부터 선택되는 세포 배양 플라스틱웨어에서 성장되는 것인, 방법.
제26항 내지 제45항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된, 복수의 바이옥솜 입자를 포함하는 샘플.
제21항 내지 제23항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 치료가 필요한 개체에서 병리를 치료 또는 예방하는 방법.
제47항에 있어서, 병리가 염증성 장애, 신경 장애, 감염성 장애, 악성 종양, 면역계 장애 및 자가면역 장애로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
제21항 내지 제24항 중 어느 한 항의 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 필요한 개체의 피부 상태를 개선하는 방법.
제49항에 있어서, 조성물이 국소 투여되는 방법.
표적 부위에 활성 분자를 전달하기 위한 비히클로서 제19항 내지 제31항 중 어느 한 항의 바이옥솜 입자의 용도.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로 사용하기 위한 바이옥솜 입자.
제19항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 염증성 장애, 신경 장애, 감염성 장애, 악성 종양, 면역계 장애 및 자가면역 장애의 치료에 사용하기 위한 바이옥솜 입자.