KR20200044806A - 변형된 유령 세포를 포함하는 생물분자 복합체 - Google Patents

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KR20200044806A
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웨이 지앙 고
지오르지아 파스토린
슈이 조우
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내셔널 유니버시티 오브 싱가포르
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Abstract

본 발명은 핵 및 핵 내용물을 포함하고, 바람직하게는 외인성 양친매성 분자로 추가로 융합된 세포의 세포질 내용물의 모두 또는 실질적으로 모두가 비워진 유령 세포인 생물분자 복합체를 제공하며, 여기서 상기 복합체는 6 μm 미만의 유체역학적 직경을 갖는다. 생물분자 복합체는 적하 분자를 함유할 수 있으며 세포 또는 조직을 표적화할 수 있다. 또한 유령 세포를 제조하는 방법, 생물분자 복합체를 제조하는 방법 및 이의 사용 방법이 제공된다.

Description

변형된 유령 세포를 포함하는 생물분자 복합체
발명의 분야
본 발명은 세포로의 외인성 물질의 전달에 적합한 생물분자 복합체(biomolecular composite)에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 표적 세포 또는 조직으로 적하물(cargo)을 전달할 수 있는 변형된 유령 세포(cell ghost)를 제공한다.
배경
본 명세서에서 명백하게 이미 발표된 문서의 목록 또는 논의는 이러한 문서가 당해 분야의 기술 중 일부이거나 일반적인 지식임을 인지하는 것으로 필수적으로 간주되어서는 안된다.
세포로의 외인성 물질의 전달, 예를 들면, 치료제의 전달에 있어서 주요한 과제(challenge)는 표적 세포에 의한 치료제의 흡수에 있다. 리포좀 제형은 표적 부위에서 독성을 감소시키고 세포 흡수를 증가시키려는 희망으로 시험되어 왔으나, 그 결과는 이들의 콜로이드적 및 생물학적 불안전성으로 인하여 만족스럽지 않았다. 리포좀의 제조 및 로딩(loading)은 기술되어 있다(예를 들면, Kooijmans, et al 2012, Xu et al, 2016). 그러나, 리포좀 시스템의 주요 단점은 표적 세포에 의한 나노입자의 비교적 낮은 세포 흡수이다. 연구된 다른 약물 전달 시스템(예컨대, 문헌 Tan et al, 2015에 의함)은 세포막-유래된 소낭(cell-membrane-derived vesicle), 막 소낭, 예컨대, 미세소낭 및 엑소좀, 및 나노소낭을 포함한다.
현재의 형질감염 기술에서 주요 과제는 형질감염하기 어려운(Hard-To-Transfect: HTT) 세포내로의 형질감염이다. 현재의 비-바이러스 방법, 예를 들어, 전기천공 또는 양이온성 화학물질에 의한 화학적 형질감염은 낮은 형질감염율 또는 높은 세포 독성의 문제에 직면한다. 바이러스 형질감염 방법은 임상 실시로 전환되는 경우 안전성 문제를 제기하며 사용 전 추가의 안전 프로토콜 및 교육을 필요로 한다.
따라서, 약물 전달 및 세포 형질감염에서와 같이 세포로의 외인성 물질의 전달을 위한 보다 우수한 비히클(vehicle)을 개발할 필요가 있다.
발명의 요약
제1 양태에서 본 발명은 핵 및 핵 내용물(content)을 포함하는 세포의 세포질 내용물의 모두 또는 실질적으로 모두가 비워진 유령 세포를 포함하는 생물분자 복합체를 제공하며, 여기서 상기 복합체는 유체역학적 직경이 약 6 μm 미만이다.
바람직한 구현예에서 본 발명은 생물분자 복합체를 제공하며, 여기서 상기 유령 세포는 복합체를 목적한 세포 또는 조직에 대해 표적화하는데 적합한 내인성 리간드를 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서 본 발명은 유령 세포를 지질 및/또는 소낭 구조(vesicular structure)와 융합시킴으로써 상기 복합체 내로 혼입된 지질을 추가로 포함하는 본 발명의 다른 양태에 따른 생물분자 복합체를 제공한다.
다른 바람직한 구현예에서 본 발명은 본 발명의 임의의 양태에 따른 생물분자 복합체를 제공하며, 여기서 상기 지질 및/또는 소낭 구조는 적어도 하나의 융합생성 지질 및/또는 적어도 하나의 융합생성 펩타이드, 예컨대, 센다이 바이러스(Sendai virus) 융합 단백질을 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서 본 발명은 적하 분자(cargo molecule)를 추가로 포함하는 본 발명의 임의의 양태에 따른 생물분자 복합체를 제공한다.
바람직하게는 적하 분자는 영상화제, 치료제 또는 이의 조합물이다.
제2 양태에서 본 발명은 생물분자 복합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하며, 여기서 상기 적하 분자는 치료제이다.
제3 양태에서, 본 발명은
(A) (i) 적하 분자를 포함하는 생물분자 복합체(여기서 상기 적하 분자는 치료제 또는 약제학적 조성물이다) 및 (ii) 사용을 위한 설명서; 또는
(B) (i) 생물분자 복합체 및 (ii) 적하 분자 및 (iii) 사용을 위한 설명서; 또는
(C) (i) 유령 세포, (ii) 지질 및/또는 소낭 구조 또는 이의 구성성분, (iii) 적하 분자 및 (iv) 사용을 위한 설명서를 포함하는 키트(kit)를 제공한다.
제4 양태에서 본 발명은 적하 분자를 포함하는 생물분자 복합체의 유효량을 이러한 치료가 필요한 환자에게 투여함을 포함하는, 이러한 환자에서 질환 또는 상태의 치료 방법을 제공하며, 여기서 상기 적하 분자는 상기 질환 또는 상태의 치료를 위한 치료제이다.
제5 양태에서 본 발명은 치료요법에서 사용하기 위한, 본 발명의 임의의 양태에 따른 생물분자 복합체를 제공한다.
제6 양태에서 본 발명은 치료요법에서 사용하기 위한 의약의 제조시 본 발명의 임의의 양태에 따른 생물분자 복합체의 용도를 제공한다.
제7 양태에서 본 발명은 적하 분자를 포함하는 생물분자 복합체를 대상체에게 투여함을 포함하는, 대상체에서 질환의 진단 방법을 제공하며, 여기서 상기 적하 분자는 영상화제이다. 바람직하게는 생물분자 복합체는 유령 세포와 지질 및/또는 소낭 구조의 융합에 의해 상기 복합체 내로 혼입된 지질을 추가로 포함한다.
제8 양태에서 본 발명은 단리된 세포와 본 발명의 임의의 양태에 따른 적하 분자를 포함하는 생물분자 복합체를 접촉시킴을 포함하는, 단리된 세포내로 외인성 물질을 도입시키는 방법을 제공한다.
제9 양태에서 본 발명은:
(a) 적어도 하나의 세포를 제공하는 단계;
(b) 세포를 당해 세포에 대해 저장성(hypotonic)인 삼투적으로 활성인 용액에 노출시킴으로써 핵 및 핵 내용물을 포함하는 세포의 세포질 내용물 모두 또는 실질적으로 모두를 제거하는 단계;
(c) 저장성 용액 속에 세포를 재-밀봉(re-sealing)시켜 유령 세포를 형성시키는 단계;
(d) 6 μm, 바람직하게는 약 5 μm 내지 약 50 nm의 범위의 유체역학적 직경까지 크기를 감소시키는 조건 하에서, 상기 유령 세포를 전단(shearing)시키거나, 유령 세포를 압출시키거나, 유령 세포를 동결 해동 또는 초음파처리함으로써 생물분자 복합체를 형성시키는 단계를 포함하는, 생물분자 복합체를 제조하는 방법을 제공한다.
제10 양태에서 본 발명은 제9 양태에 따른 생물분자 복합체를 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 생물분자 복합체는 상기 복합체 내로 혼입된 추가의 외인성 지질을 추가로 포함하며, 상기 방법은:
(a) 제9 양태의 단계 (c)로부터 적어도 하나의 유령 세포를 제공하는 단계;
(b) 적어도 하나의 유령 세포를 지질 및/또는 소낭 구조와 접촉시키는 단계; 및
(c) 6 μm 미만, 바람직하게는 약 5 μm 내지 약 50 nm의 범위의 유체역학적 직경까지 크기를 감소시키는 조건 하에서 유령 세포, 지질 및/또는 소낭 구조를 전단시키거나, 압출시키거나, 또는 동결 해동 및 초음파처리시킴에 의해 지질 및/또는 소낭 구조를 유령 세포와 융합시키는 단계를 포함한다.
제11 양태에서 본 발명은:
(a) 세포에 대해 저장성인 삼투압적으로 활성인 용액 속에서 생존가능한 세포(viable cell)의 현탁액을 제공하는 단계;
(b) 저장성 세포 현탁액을 일정 기간 동안 온화하게 교반함으로써 삼투압이 막 투과성이 되고 세포질 및 핵의 내용물이 생존가능한 세포로부터 누출되도록 함으로써, 적어도 부분적으로 고갈된 세포를 생성하는 단계;
(c) 적어도 부분적으로 고갈된 세포로부터 세포질 및 핵의 내용물을 포함하는 세포 부스러기를 분리하는 단계;
(d) 필요한 경우, 적어도 부분적으로 고갈된 세포가 세포질 및 핵의 내용물을 고갈시킬 때까지 단계 (b) 및 (c)를 반복하는 단계;
(e) 고갈된 세포를 등장성 매질 속에 일정 기간 동안 현탁시킴으로써 세포막을 재밀봉시켜 유령 세포를 생산하는 단계;
(f) 유령 세포를 단리하는 단계를 포함하는, 세포막, 시토졸(cytosol) 및 핵을 포함하는 생존가능한 세포로부터 유령 세포를 생산하는 방법을 제공한다.
미세 치수인 생물분자 복합체는 본원에서 미세 세포 소낭 기술(micro cell vesicle technology: mCVT)로 명명되며 나노 치수인 생물분자 복합체는 본원에서 나노 세포 소낭 기술(nano cell vesicle technology: nCVT)로 명명된다. 전형적으로 mCVT는 직경이 300nm 이상, 일반적으로 300 nm 내지 5 μm, 보다 흔히 300 내지 800 nm의 범위이다. 전형적으로, nCVT는 직경이 300nm 미만, 일반적으로 50 내지 250nm, 보다 흔히 100 내지 200 nm의 범위이다. 미셀(micelle)로부터 유래된 생물분자 복합체는 직경이 50nm 미만이다. 용어 "CVT"는 본원에서 입자 크기에 대한 제한을 필수적으로 암시하지 않고 본 발명에 따른 생물분자 복합체를 기술하기 위해 사용된다. CVT가 마이크로 또는 나노 규모인 것이 필요한 맥락에서 용어 "CVT"가 사용되는 경우에만 크기에 대한 이러한 제한이 유추되어야 한다.
본 개시내용이 용이하게 이해되고 실제로 실행되도록 하기 위하여, 첨부되는 도면을 참고로 나타낸 바와 같은 구현예에 대한 참고가 이제 이루어질 것이다. 설명과 함께 도면은 본 발명의 구현예를 추가로 나타내고 다양한 원리와 장점을 설명하기 위한 것이다.
도 1은 (A) U937 단핵구에 대한 유령 세포 생산 방법을 나타낸다. (B) U937 세포, 1x PBS 0.06% 슈크로즈에서 항온처리된 U937 및 0.25x PBS 0.06% 슈크로즈 속에서 항온처리된 U937 세포의 형광 현미경 영상. 기준자(scale bar)는 100 μm를 나타낸다. 모든 샘플은 1 x 106개의 세포로 출발하였고 비우기 진행(emptying progress)을 추적하기 위해 CellTrackerTM Green CMFDA로 염색하였다. (C) 유령 세포 프로토콜에서 세포 내용물이 비워지는 것을 입증하기 위한 CellTrackerTM Green CMFDA의 상대적인 형광성의 정량화. (D) 트립판 블루 염색을 사용한 염색 전 및 후에 U937 유령 세포의 광 현미경 영상. 트립판 블루는 살아있는 세포에 의해 활성적으로 제거되는 반면 생존가능하지 않은 세포는 이러한 특성을 나타내지 않는다. 기준자는 100 μm을 나타낸다. (E) 5일에 걸쳐 총 수(total count)로 수행된, U937 세포 및 유령 세포의 세포 생존능 시험.
도 2는 상이한 PBS 농도를 사용하여 다양한 세포주로부터 생산된 유령 세포의 수율 퍼센트 및 유령 세포의 핵 제거를 나타낸다.
도 3은 5일의 동결 해동 주기로부터 제조된 mCVT의 물리적 특성화를 나타낸다. DOTAP 필름(film)과 유령 세포 사이의 융합 결과로서, mCVT는 각각의 동결 해동 주기로 점진적으로 더 커진다.
도 4는 mCVT 생산의 개략적 도해이다. U937 유령 세포를 10 mg의 DOTAP의 박 필름(thin film)에 가하고, 60분 동안 초음파처리한다. 이후에, 혼합물을 5회의 동결 해동 주기에 적용시켜 mCVT를 생산한다.
도 5는 포켓용 압출기(handheld extruder)를 사용하여, 압출로부터 제조된 mCVT의 물리적 특성화를 나타낸다. 3 또는 5회 통과 후 (A) 유체역학적 직경 및 (B) 제타 전위(zeta potential).
도 6은 압출기를 사용하여, 압출로부터 제조된 nCVT의 물리적 특성화를 나타낸다. nCVT는 2개의 세포주, 즉, 저캣(Jurkat) 세포 및 U937 세포로부터 유래된 유령 세포로부터 제조하였다.
도 7은 (A) 박층 수화에 의해 제조된 유령 세포와 리포좀의 융합을 포함하는, nCVT 생산의 도식적 묘사를 나타낸다. (B) nCVT의 크기 분포(nm). (C) 리포좀의 크기 분포(nm). (D) 스핀 컵(spin cup)을 통과하기 전 및 후의 nCVT 및 리포좀의 단백질 농도. 비교를 위해, 동일한 과정을 겪는 유령 세포 구성성분이 없는 지질 제형이 제공된다. (E) nCVT 및 리포좀을 필름 수화 방법에 의해 모델 약물인, 알부민-FITC로 로딩시키고, 유사한 로딩 효능을 입증한다.
도 8은 (A) 리포좀 및 (B) nCVT에 위치하는 형광단(Rhodamine 및 NBD)의 도식 표현이다. 형광단을 리포좀내에 서로 근접하게 위치시키지만, 유령 세포 및 지질의 융합은 지질 막을 구성하는 지질 사이에 유령세포 막 구성성분을 삽입시켜서 형광단 사이의 거리를 증가시킨다. (C) 2 mg의 지질이 사용된 경우 로다민 및 RBD 형광단(1 mol%)의 FRET 분석. (D) 5 mg의 지질을 사용한 경우 로다민 및 NBD 형광단(1 mol%)의 FRET 분석.
도 9는 공업용 시약인, Lipofectamine® 3000(LF3000)과 비교하여, mCVT의 예비 형질감염 결과를 나타낸다. 형질감염은 녹색 형광성 단백질(GEP)을 암호화하는 플라스미드 5 μg을 mCVT 및 LF3000에 가함으로써 수행하였다. 혼합물을 48시간 형질감염을 위해, 3T3-L1 세포, 형질감염시키기 어려운 세포에 첨가하기 전에 10분 동안 정치시켰다. 살아있는 세포를 염색시키는, 명 시야(bright field) 및 Hoechst 33342, 영상은 LF3000과 비교하여 mCVT의 경우 상당히 더 오래 살고 건강한 세포를 나타내었다. 형질감염의 정도(GFP)는 유사한 것으로 나타난다.
도 10은 (A-B) 저 용량 및 고 용량에서, 2시간 동안 항온처리 후 HeLa 및 CT26 세포에 의한 Cy5.5 표지된 nCVT의 세포 흡수를 나타낸다. 리포좀 및 nCVT 둘 모두는 최저의 일반적인 Cy5.5 형광 강도로 표준화되었다. 이는 저 용량을 구성한다. 최저의 일반적으로 표준화된 Cy5.5 형광 강도의 5x의 농도는 고 용량을 구성한다. 세포 막을 CellMask Orange로 염색하여 세포 흡수를 나타내었다. 비교를 위해, 유령 세포가 없는 nCVT를 제조하고(표지된 Cy5.5-리포좀) HeLa 및 CT26 세포에서 시험하였다. 기준자는 10 μm를 나타낸다. (C-D) HeLa 및 CT26 세포에 의한 Cy5.5 표지된 nCVT 및 리포좀의 2시간째 FACS 정량적 흡수. 샘플을 사용 전에 동일한 상대적 형광 강도로 표준화하였다. 2개의 샘플 농도, 1x의 표준화된 형광에 상응하는 저 용량 및 5x의 형광 강도에 상응하는 고 용량을 제조하였다.
도 11은 (A) 전체 마우스에서 종양의 대표적인 IVIS 형광을 나타낸다. 종양은 화살표로 나타낸다. 복사 효율은 [(p/sec/cm2/sr)/(μW/cm2)]이다. nCVT를 사용한 영상에 대한 색상 규모는 3.32e7(분) 내지 3.82e7의 범위이다. 리포좀을 사용한 영상에 대한 색상 규모(color scale)는 6.94e7(분) 내지 7.79e7의 범위이다. 유리 염료(free dye)를 사용한 영상에 대한 색상 규모는 2.58e7(분) 내지 2.68e7의 범위이다. (B) IVIS에 의해 정량화된 절개된 기관의 상대적인 형광 강도. (C) 절개된 종양의 상대적인 형광 강도. *는 P<0.05를 나타낸다.
도 12는 (A) 유령 세포 생산 개략도를 나타낸다. (B) 5일에 걸쳐 배양 배지 속에서 세포와 비교한(vis-a-vis) 3T3-L1 CG의 생존능 연구.
도 13은 (A) 3T3-L1 세포 및 관련된 유령 세포의 DNA 겔 전기영동 영상. 좌측에서 우측으로: 100Bp DNA 래더(ladder), 3T3-L1 세포 및 3T3-L1 CG. (B) 3T3-L1 세포 및 CG의 Hoechst 33342 염색. 기준자는 100 μm를 나타낸다. (C) NanoDrop을 통한 3T3-L1 및 U937로부터 CG의 DNA 농도의 정량화.
도 14는 (A) DOTAP 리포좀과 비교하여 플라스미드를 지닌 상이한 mCVT 및 mCVT3T3-L1의 크기를 나타낸다. 모든 mCVT의 크기는 500 nm보다 더 작다. (B) DOTAP 리포좀과 비교하여 플라스미드를 지닌 상이한 mCVT 및 mCVT3T3-L1의 제타 전위. 모든 mCVT의 제타 전위는 플라스미드 DNA를 지닌 mCVT3T3-L1을 제외하고는, + 30 mV 초과이며, 플라스미드 DNA와의 상호작용으로 인하여 음성 제타 전위를 나타낸다. (C) mCVT3T3-L1의 Z-평균 크기 분포. (D). 강도에 의한 DOTAP 리포좀의 Z-평균 크기 분포. 모든 실험에 대해 3회 수행하였다.
도 15는 (A) 융합이 발생하여야 하는, 가정된 실험 결과를 나타낸다. CG3T3-L1 및 DOTAP 리포좀 샘플 둘 다는 단일 형광단의 존재 만을 나타내야 하지만 mCVT는 2개의 형광단(NBD 및 Cy5.5 둘 모두)의 존재를 나타내어야 한다. (B) 단일 색상 채널을 사용한 샘플의 유동 세포분석법. (C) 이중 색상 채널을 사용한 샘플의 유동 세포분석법.
도 16은 (A) DOTAP 리포좀, CG의 1x 표준 배취(batch)를 지닌 mCVT(mCVT 1x) 및 CG의 2x 표준 배취를 지닌 mCVT(mCVT 2x)의 형광 스펙트럼을 나타낸다. 제2 피크의 형광성의 저하는 2개의 형광단(로다민 & NBD)이 CG 막 구성성분에 의해 떨어졌음을 나타내었으며, 융합을 시사한다. (B) 1 x 107 CG에서 설정된 표준 양(1x)으로 사용된 CG의 양을 변화시키는, mCVT3T3-L1(0.5x), mCVT3T3-L1(1x), mCVT3T3-L1(2x) & mCVT3T3-L1(1x 세포)의 크기. (C) mCVT3T3-L1(0.5x) mCVT3T3-L1(1x), mCVT3T3-L1(2x) 및 mCVT3T3-L1(1x 세포)의 제타 전위. (D) mCVT3T3-L1(0.5x) mCVT3T3-L1(1x), mCVT3T3-L1(2x) 및 mCVT3T3-L1(1x 세포)의 단백질 농도.
도 17은 3T3-L1 세포내로 mCVT3T3-L1, DOTAP 리포좀 및 CG3T3-L1의 흡수를 나타낸다. (A) 유동 세포분석법 분석을 위한 CG3T3-L1, DOTAP 리포좀 및 mCVT3T3-L1의 도트 플롯(dot plot). (B) 3T3-L1 세포내로 DOTAP 리포좀, CG3T3-L1 및 mCVT3T3-L1의 흡수. 분석을 1, 3, 6, 24 및 48 시간 동안 수행하였다.
도 18은 유동 세포분석법을 사용하여 분석한, Lipofectamine® 3000과 비교하여, mCVT3T3-L1을 사용한 3T3-L1에 대한 형질감염 효능 및 3T3-L1의 세포 생존능을 나타낸다. (A) LF3000, mCVT3T3-L1 및 mCVTU937을 사용한 3T3-L1에 대한 형질감염 효능. 대조군으로서 사용한 치료는 없었다. ^ 80 μl의 LF3000는 너무 세포독성이어서 형질감염 효능을 측정할 수 없다. (B) LF3000, mCVT3T3-L1 및 mCVTU937을 사용한 3T3-L1의 세포 생존능. 대조군으로서 사용한 치료는 없었다. ^ 세포독성은 너무 높아서 세포 생존능을 측정할 수 없었다. 데이타는 평균 ± SEM (n=3)을 나타낸다, * P < 0.1, *** P < 0.001, **** P < 0.0001(일원 분산 분석(one-way ANOVA)).
도 19는 증가하는 용량의 mCVT3T3-L1을 사용한 형질감염의 형광 현미경 영상을 나타낸다. 성공적으로 형질감염된 세포는 eGFP를 발현할 수 있다. Hoechst 33342는 핵 가시화를 위해 사용하였다. 기준자는 100μm를 나타낸다.
도 20은 마우스 배아 섬유아세포인, 3T3-L1에 대한 상이한 mCVT의 형질감염 효능 및 세포 생존능을 나타낸다. 3T3-L1 세포는 암 기원하지 않는다. (A) 3T3-L1에 대한 LF3000, CG3T3-L1, DOTAP 리포좀 및 상이한 mCVT에 대한 형질감염 효능. 대조군으로서 사용한 치료는 없었다. (B) 3T3-L1에 대한 LF3000, CG3T3-L1, DOTAP 리포좀 및 상이한 mCVT의 세포 생존능. 데이타는 평균± SEM (n=3), ***, P < 0.001을 의미한다. 형질감염 효능 및 세포 생존능 둘 다의 경우 mCVT3T3-L1과 mCVTU937 사이에 유의적인 차이는 발견되지 않았다.
도 21은 사람 배아 세포인, HEK293 세포에 대한 상이한 mCVT의 형질감염 효능 및 세포 생존능을 나타낸다. HEK293 세포는 상피 세포이며 암 기원하지 않는다.
도 22는 사람 각질세포(HaCaT)에 대한 상이한 mCVT의 형질감염 효능 및 세포 생존능을 나타낸다. HaCaT 세포는 각질세포이며 암 기원하지 않는다.
도 23은 사람 피부 섬유아세포(HDF)에 대한 상이한 mCVT의 형질감염 효능 및 세포 생존능을 나타낸다. HDF 세포는 암 기원하지 않는다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 핵 및 핵 내용물을 포함하는 이의 세포질 내용물의 모두 또는 실질적으로 모두가 비워진 유령 세포일 수 있는 생물분자 복합체를 제공하며, 여기서 상기 복합체는 유체역학적 직경이 약 6 μm 미만이거나, 상기 생물분자 복합체는 외인성 양친매성 분자, 예컨대, 지질 및/또는 소낭 구조와 융합되는 상기 유령 세포에 의해 내인성 막 물질을 또한 포함할 수 있다. 생물분자 복합체는 적하 분자를 또한 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "유령 세포"는 핵 및 핵 내용물을 포함하는 세포의 세포질 내용물의 모두 또는 실질적으로 모두가 비워진 세포이다. 유령 세포는 이로부터 이들이 유래되지만 생존가능하지 않은 세포와 비슷하며 훨씬 감소된 세포질을 갖는다. 유령 세포의 세포막은 지질 및 단백질을 포함하며 일반적으로 세포의 특징을 보유한다. 예를 들면, 단핵구 세포주로부터 유래된 유령 세포는 염증 부위를 향한 단핵구 고유한 표적화 특성을 보유한다.
바람직한 구현예에서 상기 생물분자 복합체는 약 5 μm 내지 약 50 nm의 범위에서 선택된 유체역학적 직경을 갖는다. 생물분자 복합체의 목적한 크기는 상기 유령 세포를 전단(shearing)시키거나, 유령 세포를 압출시키거나, 바람직하게는 목적한 유체역학적 직경으로 크기를 감소시키는 조건 하에서 외인성 양친매성 분자의 존재하에서, 유령 세포를 동결 해동시키고 초음파처리하는 것과 같은 방법을 사용하여 수득할 수 있다.
바람직한 구현예에서 유령 세포는 단핵구, 대식구, T 세포, B 세포, 천연 킬러 세포, 줄기 세포, 적혈구 세포, 지방 세포, 포말 세포(foam cell) 및 종양 세포를 포함하는 그룹으로부터 선택된 세포로부터 유래된다.
다른 바람직한 구현예에서 유령 세포는 사람 단핵구, 사람 T 세포, 마우스 결장 암종, 사람 경부암 세포, 사람 신장 내피 세포, 마우스 지방선구세포(mouse preadipocyte) 및 사람 간엽 줄기 세포로부터 유래된다.
다른 바람직한 구현예에서 유령 세포는 RAW264.7(마우스 대식구), HaCaT(사람 각질세포), HDF(사람 피부 섬유아세포) 및, 보다 특히 U937(사람 단핵구), 저켓(Jurkat)(사람 T 세포), CT26(마우스 결장 암종), HeLa(사람 자궁경부 암), HEK293(사람 신장 상피), 3T3-L1(마우스 지방선구세포) 및 HMSC(사람 간엽 줄기 세포)를 포함하는 그룹으로부터 선택된 세포주로부터 유래된다.
다른 바람직한 구현예에서 유령 세포는 단핵구의 세포주로부터 유래된다.
다른 바람직한 구현예에서 유령 세포는 사람 단핵구의 세포주로부터 유래된다.
다른 바람직한 구현예에서 유령 세포는 U937 사람 단핵구의 세포주로부터 유래된다.
생물분자 복합체 바람직하게는 고유한 표적화 특성을 지닌 세포로부터 유래된 유령 세포의 선택적인 포함으로 인하여 표적화 능력을 갖는다. 구현예에서, 단핵구 세포주는 염증 부위를 향한 단핵구의 고유한 표적화 특성으로 인하여 유령 세포 형성을 위해 선택된다.
특이적인 종양 표현형을 향해 활성화된 T 세포주는 특이적인 표현형을 발현하는 종양을 향한 T 세포의 고유한 표적화 특성으로 인하여 유령 세포 형성을 위해 선택될 수 있다. 대안적으로, 다양한 종양 표현형을 향해 활성화된 T 세포주는 단일 표적 부위를 표적화하는 것과는 대조적으로, 종양을 향한 T 세포의 고유한 표적화 특성으로 인하여 유령 세포 형성을 위해 선택된다.
유사하게, 바이러스에 의해 감염된 세포내에서 발현된 특이적인 표현형을 향해 활성화된 T 세포주는 감염된 세포를 향한 T 세포의 고유한 표적화 특성으로 인하여 유령 세포 형성을 위해 선택된다.
형질감염 목적인 세포주는 형질감염을 촉진시키는 고유한 자가-표적화 특성으로 인하여 유령 세포 형성을 위해 선택될 수 있었다.
종양 세포는 CVT의 표면에서 종양 리간드를 발현시키기 위하여 유령 세포 형성을 위해 선택될 수 있다. 이는 궁극적으로 면역치료요법의 형태로서 T 세포의 활성화 및 확장을 자극시키기 위한 생체외(ex vivo) 또는 생체내 설정에서 사용될 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서 상기 유령 세포는 복합체를 목적한 세포 또는 조직에 대해 표적화시키기에 적합한 리간드를 포함한다. 대안적으로, 목적한 세포 또는 조직에 대해 복합체를 표적화하기에 적합한 리간드는 리간드를 포함하는 지질 및/또는 소낭 구조와의 융합에 의해 유령 세포내로 혼입시킬 수 있었다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "양친매성 분자"는 "친수성 헤드(hydrophilic head)"로서 일반적으로 지칭된 친수성 부위, 및 "소수성 테일(hydrophobic tail)"로서 일반적으로 지칭된 소수성 부위로 구성된 분자를 지칭한다. 이러한 분자는 소수성 테일이 회합(associating)되어 소수성 코어를 생성하고 친수성 헤드는 외부의, 수성 환경과 회합하는 소낭을 형성할 수 있다. 한가지 이러한 구조는 리포좀이며 여기서 인지질 이층(phospholipid bilayer)은 일반적으로 원형/구형의 구조로 배향됨으로써 하나의 층의 친수성 헤드는 수성 코어를 둘러싸고 있는 반면 다른 층의 친수성 헤드는 벌크(bulk) 수성 상과 상호작용한다. 다른 이러한 구조는 미셀(micelle)이며 여기서 단층은 자체적으로 소수성 코어내에 회합된 소수성 테일 및 벌크 수성 상과 상호작용하는 친수성 헤드로 배열된다. 또한 지질 및 계면활성제가 포함된다.
다른 바람직한 구현예에서 소낭 구조는 인지질, 스핑고지질, 세라마이드(ceramide) 및 글리고스핑고지질, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물을 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서 소낭 구조는 리포좀이다.
다른 바람직한 구현예에서 리포좀은 융합생성 리포좀이다.
본원에 사용된 바와 같은 "융합생성 리포좀"은 세포막과 상호작용함으로써 표적 세포의 막과 융합하여, 표적 세포의 세포질내로 리포좀 내 소낭의 내용물을 직접 방출시키는 향상된 능력을 나타내는 리포좀이다. 융합생성 리포좀은 융합생성 지질 또는 융합생성 펩타이드를 리포좀내에 혼입시킴으로써 생산할 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서 리포좀은 적어도 하나의 융합생성 지질을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "융합생성 지질"은 세포막과 상호작용함으로써 리포좀내에 혼입되는 경우 표적 세포의 막과 융합하는 리포좀의 능력을 향상시키는 지질이다. 융합생성 지질은 일반적으로 소낭을 내부에 혼입되는 경우 보다 유체가 되도록 하는 양이온성 지질이지만(Karanth et al, Boomer, et al, Csiszar et al) 다른 지질은 융합생성일 수 있는데, 예를 들면, DOPE(1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민)은 이의 원뿔 형태의 결과로서 지질의 혼합을 촉진시킨다.
다른 바람직한 구현예에서 융합생성 지질은 양이온성 지질이다.
다른 바람직한 구현예에서 융합생성 지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), L-α-포스파티딜콜린(HSPC), (N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸아민)(DOTMA) 및 (디메틸-디옥타데실-암모늄-브로마이드(DDAB), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 디스테아로포스포에탄올아민 폴리에틸렌글리콜 2000(DSPE-PEG2000), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌 글리콜)-2000](DSPE-PEG2000 아민) 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[바이오티닐(폴리에틸렌글리콜)-2000](DSPE-PEG2000 바이오틴), 또는 이의 조합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
다른 바람직한 구현예에서 리포좀은 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC)을 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서 리포좀은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)을 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서 리포좀은 10 내지 100%의 융합생성 지질을 포함한다.
구현예에서, 하이브리드 분자는 40 내지 99% 융합생성 지질을 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서 리포좀은 60 내지 95%의 융합생성 지질을 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서 리포좀은 융합생성 펩타이드를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "융합생성 펩타이드"는 리포좀내로 혼입되는 경우 세포 막과 상호작용함으로써 표적 세포의 막과 융합하는 리포좀의 능력을 향상시키는 펩타이드이다. 예로서, 불활성화된 센다이 바이러스(Sendai virus) 엔벨로브 구성성분(Nakanishi et al, Kunisawa et al) 뿐만 아니라 다른 융합생성 펩타이드는 이러한 목표를 달성할 수 있다(Shim et al).
다른 바람직한 구현예에서 융합생성 펩타이드는 불활성화된 센다이 바이러스 엔벨로프 구성성분을 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서 융합생성 펩타이드는 지질에 접합된다. 예로서, 융합생성 펩타이드는 DSPE(1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민)에 접합될 수 있으며 콜레스테롤과 95:5 몰비로 공-제형화되어 리포좀을 형성할 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서 소낭 구조는 미셀이다.
소낭 구조는 포화된 글리세라이드, 스테로이드, 합성 인지질, 트리글리세라이드, 왁스, 테르펜, 비타민 및 이의 조합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물을 추가로 포함할 수 있다. 임의로, 생물분자 복합체는 개질된 지질을 추가로 포함하며, 여기서 개질된 지질은 바이오틴, 아비딘, 스트렙타비딘, 아지드 그룹, 알킨 그룹, 폴리에틸렌 글리콜 쇄, 폴레이트, 또는 이의 조합물을 포함한다. 예로서, DPPC 및 콜레스테롤과 함께 (0.15:1.85:1)의 몰비로 공-제형화된 클릭 화학 구성성분(click chemistry component), 예컨대, DSPE-PEG(2000)-DBCO (1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[디벤조사이클로옥틸(폴리에틸렌 글리콜)-2000])을 포함하도록 개질된 지질을 사용하여 리포좀을 형성할 수 있다. 아지드 그룹의 첨가로 변형된 융합생성 펩타이드는 클릭 화학을 사용하여 첨가할 수 있다. 임의로, 생물분자 복합체는 표지된 지질을 추가로 포함하며, 여기서 표지된 지질은 형광성 표지, 발광성 표지, 생물발광성 표지, 화학발광성 표지 및 방사활성 표지, 또는 이의 조합물을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "표지" 또는 "검출가능한 모이어티(moiety)"는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 화학적 또는 다른 물리적 수단에 의해 검출가능한 조성물이다. 예를 들면, 유용한 표지는 32P, 형광성 염료, 전자-밀도 시약, 효소(예컨대, ELISA에서 일반적으로 사용된 바와 같음), 바이오틴, 디곡시게닌, 또는 합텐 및 단백질 또는 검출가능하도록 제조될 수 있는 다른 실체이다.
다른 바람직한 구현예에서 리포좀은 스테로이드를 추가로 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서 리포좀은 콜레스테롤을 추가로 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서 리포좀은 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC) 및 콜레스테롤을 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서 리포좀은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE) 및 콜레스테롤을 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서 리포좀은 스테로이드 대 지질의 0.01:99.9의 몰비와 스테로이드 대 지질의 20:80 몰비 사이들 갖는다. 유리하게는, 리포좀은 스테로이드 대 지질의 1:99 몰비와 스테로이드 대 지질의 10:90 몰비 사이를 갖고, 전형적으로 스테로이드 대 지질의 5:95 몰비를 갖는다.
다른 바람직한 구현예에서 생물분자 복합체는 적하 분자를 추가로 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, "적하 분자" 또는 "적하물"은 세포의 막을 가로질러 또는 표적 세포의 세포질내로 이러한 전달 시스템에 의해 전달될 수 있는 전달 시스템내에 또는 이와 회합된 분자이다. 막-기반 전달 시스템, 예컨대, 리포좀은 리포좀의 내부 속, 지질 막 내 및 리포좀의 외부에 외인성 물질의 캡슐화(encapsulation)를 허용한다. 유사하게, 본 발명의 생물분자 복합체는 내부 속에, 지질 막 내에 및 이의 외부에 적하 분자의 캡슐화를 허용한다. 캡슐화 기술은 리포좀 약물 전달 시스템에서 기술자에 의해 잘 이해되며 동일한 원리가 본 발명의 생물분자 복합체에 적용된다. 적하 분자의 특성은 이것이 전달되는 목적에 의존한다. 따라서, 및 목적에 따라서, 적하 분자는 작은 분자, 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 핵산, 핵산을 포함하는 발현 카세트, 항체, 실리카, 탄소 나노튜브, 금 나노입자, 은 나노입자, 산화철, 압타머(aptamer), 덴드리머(dendrimer), 영상화제, 전자 밀도 물질, 치료제, 천연 생성물 및 백신을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 생물분자 복합체내에 봉입되거나 이와 회합된 적하 분자는 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)에서 표적 세포에 전달될 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서 적하 분자는 폴리펩타이드이다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 당해 용어는 아미노산 중합체(여기서 하나 이상의 아미노산 잔기는 상응하는 천연적으로 존재하는 아미노산의 화학적 모사체(chemical mimetic)이다) 뿐만 아니라 천연적으로 존재하는 아미노산 중합체 및 비-천연적으로 존재하는 아미노산 중합체에도 적용된다.
바람직한 구현예에서 적하 분자는 항체 또는 이의 단편이다. "항체"는 면역글로불린 유전자로부터의 골격 영역을 포함하는 폴리펩타이드 또는 항원에 특이적으로 결합하고 이를 인식하는 이의 단편을 지칭한다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론, 및 뮤 불변 영역 유전자(mu constant region gene) 뿐만 아니라 미리아드(myriad) 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로 분류되며, 이는 궁극적으로 면역글로불린 부류, 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 정의한다. 전형적으로, 항체의 항원 결합 영역은 결합의 특이성 및 친화성에 있어서 가장 중요할 것이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체의 단편은 상이한 유기체, 예컨대, 사람, 마우스, 랫트, 햄스터, 낙타 등으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 항체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 변형되거나 돌연변이되어 항체의 목적한 기능(예컨대, 글리코실화, 발현, 항원 인식 효과기 기능, 항원 결합, 특이성 등)을 개선시키거나 조절하기 위한 항체를 포함할 수 있다. 임의로, 적하 분자는 항체 접합체(conjugate)이다. 항체를 표지에 접합시키기 위한 당해 분야에 공지된 임의의 방법도 예를 들면, Hermanson, Bioconjugate Techniques 1996 Academic Press, Inc., San Diego에 기술된 방법을 사용하여 사용할 수 있다.
바람직한 구현예에서 적하 분자는 핵산 분자이다. 구현예에서, 적하 분자는 억제성 핵산이다. 구현예에서 억제성 핵산 분자는 siRNA, shRNA 또는 miRNA이다.
본원에 사용된 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오타이드" 또는 "폴리뉴클레오타이드" 또는 문법적 등가물은 함께 공유결합으로 연결된 적어도 2개의 뉴클레오타이드를 의미한다. 용어 "핵산"은 단일-, 이중-, 또는 다중-가닥 DNA, RNA 및 이의 유사체(유도체)를 포함한다.
올리고뉴클레오타이드는 길이가 전형적으로 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 25, 30, 40, 50개 이상의 뉴클레오타이드 내지 길이가 약 100개의 뉴클레오타이드이다. 핵산 및 폴리뉴클레오타이드는 임의의 길이, 예컨대, 보다 긴 길이, 예를 들면, 200, 300, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 7000, 10,000개 등의 중합체이다. 특정의 구현예에서, 본원의 핵산은 포스포디에스테르 결합을 함유한다. 다른 구현예에서, 예컨대, 포스포르아미데이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 또는 O-메틸포스포로아미디트 연결을 포함하는, 대안적 골격(참고: Eckstein, Oligonucleotide and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press); 및 펩타이드 핵산 골격 및 연결을 가질 수 있는 핵산 유사체가 포함된다. 다른 유사체 핵산은 양성 골격; 비-이온성 골격, 및 비-리보스 골격을 지닌 것들, 예컨대, 미국 특허 제5,235,033호 및 제5,034,506호, 및 문헌(Chapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Sanghui & Cook, eds.)에 기술된 것을 포함한다. 하나 이상의 카보사이클릭 당을 함유하는 핵산은 또한 핵산의 하나의 정의내에 포함된다. 리보스-포스페이트 골격의 변형은 예컨대, 생리학적 환경에서 이러한 분자의 안전성 및 반감기를 증가시키거나 바이오칩 상의 프로브(probe)로서의 다양한 이유로 수행할 수 있다. 천연적으로 존재하는 핵산 및 유사체의 혼합물이 제조될 수 있으며; 대안적으로, 상이한 핵산 유사체의 혼합물, 및 천연적으로 존재하는 핵산 및 유사체의 혼합물이 제조될 수 있다.
"억제성 핵산"은 표적 핵산(예컨대, PTPRS내로 해독가능한 mRAN)에 결합할 수 있고 표적 핵산(예컨대, DNA로부터의 mmRNA)의 전사를 감소시키거나 표적 핵산(예컨대, mRNA)의 해독을 감소시키거나 전사 스플라이싱(예컨대, 단일 가닥 모르폴리노 올리고)를 변경시킬 수 있는 핵산(예컨대, DNA, RNA, 뉴클레오타이드 유사체의 중합체)이다. "모르폴리노 올리고"는 "모르폴리노 핵산"으로 대안적으로 지칭될 수 있으며 당해 분야에 일반적으로 공지된 모르폴리노-함유 핵산 분자(예컨대, 포스포르아미데이트 모르폴리노 올리고 또는 "PMO")를 지칭한다. 참고: Marcos, P (2007). 일부 구현예에서, "억제성 핵산"은 표적 핵산(예컨대, 단백질로 해독가능한 mRNA)에 결합할 수 있고 표적 핵산의 해독을 감소시킬 수 있는 핵산이다. 표적 핵산은 억제성 핵산이 결합하는(예컨대, 하이브리드화되는) 하나 이상의 표적 핵산 서열이거나, 이를 포함한다. 따라서, 억제성 핵산은 전형적으로 표적 핵산 서열에서 표적 핵산의 적어도 하나의 부위에 하이브리드화할 수 있는 서열(또한 "안티센스 핵산 서열"로서 본원에 지칭됨)이거나 이를 포함한다. 억제성 핵산의 예는 안티센스 핵산이다. 억제성 핵산의 다른 예는 siRNA 또는 RNAi(이들의 유도체 또는 전구체, 예컨대, 뉴클레오타이드 유사체 포함)이다. 추가의 예는 shRNA, miRNA, shmiRNA, 또는 특정의 이들의 유도체 또는 전구체를 포함한다. 용어 "miRNA"는 유전자 조절에 포함된 진핵세포내에서 발견된 마이크로RNA 분자를 지칭한다. 참고: 예를 들면, Carrington et al. (2003). 일부 구현예에서, 억제성 핵산은 단일 가닥이다. 다른 구현예에서, 억제성 핵산은 이중 가닥이다.
"안티센스 핵산"은 특이적인 표적 핵산(예컨대, 표적 핵산 서열)의 적어도 일부분, 예컨대, mRNA 분자(예컨대, 표적 mRNA 분자(참고: 예컨대, Weintraub (1990)), 예를 들면, 안티센스, siRNA, shRNA, shmiRNA, miRNA (microRNA)에 대해 적어도 부분적으로 상보성인 핵산(예컨대, DNA, RNA 또는 이의 유사체)이다. 따라서, 안티센스 핵산은 표적 핵산(예컨대, 표적 mRNA)에 하이브리드화(예컨대, 선택적으로 하이브리드화)될 수 있다. 일부 구현예에서, 안티센스 핵산은 엄격한(stringent) 하이브리드화 조건 하에서 표적 핵산(예컨대, mRNA)에 하이브리드화한다. 안티센스 핵산은 천연적으로 존재하는 뉴클레오타이드 또는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 및 아노머성 당 포스페이트, 골격-변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산일 수 있다.
세포에서, 안티센스 핵산은 표적 mRNA에 하이브리드화하여, 이중-가닥의 분자를 형성할 수 있다. 안티센스 핵산은 세포가 이중 가닥인 mRNA를 해독하지 않을 것이므로, mRNA의 해독을 방해한다. 유전자의 시험관내 해독을 억제하기 위한 안티센스 방법의 용도는 당해 분야에 잘 알려져 있다(Marcus-Sakura (1988). DNA에 직접 결합하는 안티센스 분자가 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서 적하 분자는 실리카, 탄소 나노튜브, 덴드리머, 압타머, 알부민, 항체-약물 접합체 또는 이의 조합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서 적하 분자는 영상화제, 치료제 또는 이의 조합물이다.
바람직한 구현예에서 치료제는 진통제, 마취제, 흥분제, 코르티코스테로이드, 항콜린성 제제, 항콜린에스테라제, 항경련제, 화학치료제, 알로스테릭 억제제, 단백동화 스테로이드(anabolic steroid), 항류마티스제, 정신치료제, 신경 차단제, 소염제, 구충제, 항생제, 항응고제, 항진균제, 항히스타민제, 항무스카린제, 항마이코박테리아제, 항원생생물제, 항바이러스제, 도파민작용제(dopaminergics), 혈액학적 제제, 면역학적 제제, 무스카린제(muscarinics), 프로테아제 억제제, 비타민, 성장 인자, 및 호르몬으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
예로서, 적하 분자는 화학치료제, 예컨대, 독소루비신, 분해성 펩타이드 또는 siRNA 또는 shRNA일 수 있다. 임의로, 적하 분자는 암 백신, 예컨대, 종양 세포의 인식을 상향-조절하거나, 종양 세포의 인식을 방지하는 인자를 하향-조절하는 분자를 암호화하는 플라스미드일 수 있다. 임의로, 적하 분자는 염증 질환에서 염증 과정을 조절하는 소염 치료제이다. 임의로, 적하 분자는 종양 덩어리 또는 염증 조직을 가시화할 수 있는 영상화제이다.
바람직한 구현예에서 영상화제는 방사활성 동위원소, 산화철 나노입자, 금 나노입자, 형광성 염료 및 근적외선 염료로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
임의로, 적하 분자는 치료제와 영상화제의 조합물이다. 치료제와 영상화제는 별개이거나 접합될 수 있는데, 예컨대, 형광 표지된 치료학적 항체일 수 있다.
바람직한 구현예에서 적하 분자는 예방접종의 목적을 위한 면역학적 반응을 유도하도록 설계된, 적절한 보조제(adjuvant)의 존재 또는 부재하의 항원이다.
본 발명의 생물분자 복합체는 전형적으로 내부 공간을 포함한다. 구현예에서, 적하물은 생물분자 복합체의 내부 공간내로 국재화된다. 구현예에서 적하물은 생물분자 복합체의 막 내에 국재화된다. 구현예에서 적하물은 생물분자 복합체의 막 표면에 국재화된다. 유령 세포는 또한 내부 공간을 함유한다. 구현예에서 적하물은 유령 세포의 내부 공간 내로 국재화된다.
유령 세포의 내부 공간 내로의 적하물의 국재화는 유령 세포의 제조에 사용된 저장성 용액 속에 용해된 고 적하물 농도의 용액 속에 침지함으로써 유령 세포 내로의 적하물의 첨가에 의해 수행될 수 있다. 임의로, 적하물은 지질에 첨가하기 전에 유령 세포에 가할 수 있다.
예비-형성된 리포좀 내로의 적하물의 로딩은 리포좀 문헌에 확립된 방법, 예를 들면, 박 필름 수화 및 원격 로딩 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
적하물을 로딩하는 박 필름 수화 방법은 다양한 방식으로 적용할 수 있다. 예를 들면, 친지성 약물 또는 적하물을 유기 용매 속에 용해된 지질에 가하고 증발건조시킴으로써 지질 및 약물의 박 필름을 남길 수 있다. 이후에, 박 필름을 압출 전에 유령 세포의 현탁액으로 수화시켜 CVT를 형성시킬 수 있다. 대안적으로, 지질을 포함하는 박 필름을 생산한 후 CVT를 형성하기 위해 압출시키기 전에, 유령 세포와 친수성 적하물의 현탁액 속에 수화시킬 수 있다.
박 필름 수화 방법을 통한 로딩을 위한 다른 예에서, 지질로 이루어진 박 필름을 생산한다. 유령 세포는 유령 세포 형성 동안 고 농도의 상기 친수성 적하물을 함유하는 용액 속에 침지시킴으로써 친수성 적하물로 로딩시킨다. 이러한 과정에서 생산된 적하물로 로딩된 유령 세포의 현탁액을 사용하여 지질 박 필름을 수화시키고, 수화된 박 필름을 압출시켜 CVT를 형성시킨다.
원격 로딩 방법을 통한 로딩의 예에서, 지질의 박 필름이 우선 생산된다. 유령 세포는 인산암모늄의 용액(전형적으로 250 mM) 속에 현탁시킨다. 이러한 현탁액을 사용하여 압출 전에 지질 박 필름을 수화시켜 CVT를 형성시킨다. CVT는 막횡단(transmembrane) pH 구배로 인하여, CVT 내에 침전될 적하 분자, 예컨대, 독소 루비신 하이드로클로라이드의 첨가 전에, 완충제 교환을 위해 PBS의 용액 속에서 투석된다. CVT 내로 로딩되지 않은 적하 분자는 이후에 추가의 투석을 통해 제거한다.
구현예에서 생물분자 복합체는 적하 분자의 용액 속에 침지시켜 이를 로딩시킬 수 있다. 임의로, 비어있는 생물분자 복합체는 음이온성 적하물, 예컨대, 플라스미드, 펩타이드, 뉴클레오타이드 또는 유전 물질로 막 표면에 대한 흡착에 의해 로딩될 수 있다. 특히, 양이온성 지질 구성성분, 예컨대, DOTAP(1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판)을 지닌 CVT를 이러한 방식으로 로딩할 수 있다. 플라스미드, 펩타이드, 뉴클레오타이드 또는 유전 물질과 같은 음이온성 적하물을 CVT에 가하고, 혼합시키고 적어도 10분 동안 정치시켜 음이온성 적하물과 양이온성 CVT의 복합체형성(complexation)을 허용한다. CVT의 표면 상으로의 로딩의 다른 예에서, 클릭 화학 구성성분, 예컨대, DSPE-PEG(2000)-DBCO(1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[디벤조사이클로옥틸(폴리에틸렌 글리콜)-2000])을 지닌 CVT를 사용할 수 있다. 아지드 구성성분으로 표지된 적하 분자를 이후 CVT에 가하고 CVT 상으로 클릭할 수 있다.
CVT의 표면 상으로 로딩하는 것의 여전히 추가의 예에서, 바이오틴 작용화(functionalization)를 지닌 CVT, 예를 들면 바이오틴(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(바이오티닐))로 작용화된 지질을 사용할 수 있다. 스트렙타비딘 구성성분으로 표지된 치료제는 이후에 CVT에 가하고 스트렙타비딘에 결합하는 바이오틴에 대한 강력한 경향성으로 인하여 CVT에 결합시킬 수 있다.
CVT의 표면 상으로의 로딩의 여전히 다른 예에서, CVT는 카보디이미드 화학을 통해 단백질 또는 펩타이드와 가교 결합시킬 수 있다. 유령 세포 막으로부터 유래된 단백질 상에 카복실산 그룹을 지닌 CVT는 카보디이미드 결합 형성을 통해 1급 아민 그룹을 지닌 적하 분자와 가교결합할 것이다. 대안적으로, 유령 세포막으로부터 유래된 단백질 상에 1급 아민 그룹을 지닌 CVT는 카보디이미드 결합 형성을 통해 카복실산 그룹을 지닌 적하 분자와 가교결합할 것이다.
본 발명에서 언급된 생물분자 복합체는 적하 분자로서 치료제를 수반하는 경우 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 생물분자 복합체를 포함하고, 치료제인 적하 분자, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
"약제학적으로 허용되는 담체"는 생물학적으로가 아니거나 달리는 목적하지 않은 물질을 의미하며, 즉, 물질은 목적하지 않는 생물학적 효과를 유발하지 않거나 이것이 함유된 약제학적 조성물의 다른 구성성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않으면서 대상체에게 투여된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "약제학적으로 허용되는"은 "생리학적으로 허용되는" 및 "약리학적으로 허용되는"과 동의어로 사용된다. 약제학적 조성물은 일반적으로 저장시 완충 및 보존을 위한 제제를 포함할 것이며, 투여 경로에 따라서, 적절한 전달을 위한 완충제 및 담체를 포함할 수 있다.
약제학적으로 허용되는 담체는 의도된 투여 경로 및 표준 약제학적 실시와 관련하여 선택될 수 있다. 적합한 약제학적 제형은 예를 들면, 문헌: Remington The Science and Practice of Pharmacy, 19th ed., Mack Printing Company, Easton, Pennsylvania (1995)에서 찾을 수 있다. 적합한 제형의 제조는 통상의 기술을 사용하고/하거나 표준 및/또는 허용된 약제학적 실시에 따라 기술자에 의해 통상적으로 달성될 수 있다.
구현예에서 약제학적으로 허용되는 담체는 수성 담체이다. 다양한 수성 담체, 예컨대, 완충된 염수 등을 사용할 수 있다. 이러한 용액은 멸균성이며 일반적으로 목적하지 않은 물질을 함유하지 않는다. 이러한 조성물은 통상의 잘 공지된 멸균 기술로 멸균시킬 수 있다. 조성물은 적절한 생리학적 조건에 요구되는 약제학적으로 허용되는 보조 물질, 예컨대, pH 조절제 및 완충제, 독성 조절제 등, 예를 들면, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 락트산나트륨 등을 함유할 수 있다. 이러한 제형 속의 활성제의 농도는 광범위하게 변할 수 있으며 선택된 특수한 투여 방식 및 대상체의 요구에 따라서 유액 용적, 점도, 체중 등을 기반으로 주로 선택될 것이다.
비경구 투여를 위해, 비경구적으로 허용되는 수용액을 사용할 수 있으며, 이는 발열원이 없고 필요한 pH, 등장성, 및 안전성을 갖는다. 예를 들면, 용액은 적합하게 완충되어야 하고 충분한 염수 또는 글루코즈로 우선 등장성이 되도록 하는 액체 희석제이어야 한다. 수용액, 특히, 멸균 수성 매질이 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여용으로 특히 접합하다. 적합한 용액은 문헌에 기술된 다수의 방법과 함께, 기술자에게 잘 공지될 것이다. 또한, 약물 전달의 방법의 간단한 고찰은 예컨대, 문헌(Langer, Science (1990) 249, 1527)에서 찾을 수 있다.
비경구 제형(예컨대, 주사용 액제 또는 현탁제 또는 주입용 액제)은 1 내지 50%(w/w)의 활성 성분; 및 50%(w/w) 내지 99%(w/w)의 액체 또는 반고체 담체 또는 비히클(예컨대, 물과 같은 용매); 및 0 내지 20%(w/w)의 하나 이상의 다른 부형제, 예컨대, 완충제, 항산화제, 현탁 안정화제, 강직성 조절제 및 보존제를 함유할 수 있다.
장애, 및 치료될 환자 뿐만 아니라, 투여 경로에 따라서, 본 발명의 제형은 이를 필요로 하는 환자에게 다양한 치료학적 유효 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명에 따라 사용된 임의의 약제학적 제형 속의 생물분자 복합체 및/또는 적하 분자의 양은 다양한 인자, 예컨대, 적하 분자의 특성, 치료될 장애의 특성, 치료될 상태의 중증도, 치료될 특수한 환자 뿐만 아니라 적하물로서 사용되는 화합물(들)에도 의존할 것이다. 어떠한 상황에서도, 제형 속의 적하 분자의 양은 기술자에 의해 통상적으로 측정될 수 있다.
그러나, 본 발명의 맥락에서, 포유동물, 특히 사람에게 투여된 용량은 적절한 기간에 걸쳐 포유동물에서 치료학적 반응을 달성하기에 충분하여야 한다. 당해 분야의 기술자는 정확한 용량 및 조성물의 선택 및 가장 적절한 전달 요법이 또한 특히 제형의 약리학적 특성, 치료되는 상태의 특성 및 중증도, 및 수용체(recipient)의 육체 상태 및 정신적 예민함 뿐만 아니라 구체적인 화합물의 효능, 치료될 환자의 연령, 상태, 체중, 성별 및 반응, 및 질환의 단계/중증도에 의해서도 영향받을 것임을 인식할 것이다.
화합물의 제형은 단위-용량 또는 다중-용량의 밀봉된 용기, 예컨대, 앰플 및 바이알(vial) 속에 존재할 수 있다. 따라서, 조성물은 단위 투여량 형태일 수 있다. 이러한 형태에서 제제는 적절한 양의 활성 구성성분을 함유하는 단위 용량으로 소분된다. 따라서, 조성물은 투여 방법에 따라 다양한 단위 투여형으로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 생물분자 복합체는 키트(kit)의 형태로 제공될 수 있다. 이러한 키트는 (a) 본원에 기술된 바와 같은 생물분자 복합체 또는 생물분자 복합체를 포함하는 약제학적 조성물(여기서 생물분자 복합체는 적하 분자를 추가로 포함한다) 및, 바람직하게는, (b) 사용 설명서를 포함할 수 있다.
구현예에서, 키트는 보다 긴 저장 수명이 가능하도록 하는 생물분자 복합체의 동결-건조된 버젼으로 구성된다. 동결-건조된 생물분자 복합체는 적합한 완충제의 첨가를 통해 활성화되고 이의 재-구성된 형태로 사용된다.
구현예에서 키트는 질환의 하나 이상의 증상을 치료하거나 예방하기 위한 하나 이상의 추가의 제제를 포함한다.
구현예에서 키트는 조성물을 투여하는 수단, 예컨대, 주사기, 침, 튜빙(tubing), 카테터(catheter), 패치(patch) 등을 포함한다. 키트는 또한 사용 전에 멸균 및/또는 희석을 필요로 하는 제형 및/또는 물질을 포함할 수 있다.
대안적으로, 본 발명에 따른 키트는 (a) 본원에 기술된 바와 같은 생물분자 또는 생물분자 복합체를 포함하는 약제학적 조성물, (b) 적하 분자 및, 바람직하게는, (c) 사용을 위한 설명서를 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서 키트는 생물분자 복합체내로 적하 분자를 로딩하기 위한 수단을 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서 키트는 질환의 하나 이상의 증상을 치료하거나 예방하기 위한 하나 이상의 추가의 제제를 포함한다.
구현예에서 키트는 조성물을 투여하는 수단, 예를 들면, 주사기, 침, 튜빙, 카테터 등을 포함한다. 키트는 또한 사용 전에 멸균 및/또는 희석을 필요로 하는 제형 및/또는 물질을 포함할 수 있다.
대안적으로, 본 발명에 따른 키트는 (a) 유령 세포, (b) 지질 및/또는 소낭 구조 또는 이의 성분, (c) 적하 분자 및 (d) 사용을 위한 설명서를 포함할 수 있다.
바람직하게는 b)에서 지질 및/또는 소낭 구조는 융합생성 지질 및/또는 구형 배치의 지질 이층을 포함하는 융합생성 리포좀이다.
바람직한 구현예에서 키트는 유령 세포를 융합생성 리포좀과 융합시키는 수단을 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서 키트는 적하 분자를 생물분자 복합체 내로 로딩하기 위한 수단을 포함한다.
다른 구현예에서 키트는 예를 들면, 적하 분자를 세포 표적으로 전달하기 위한 형질감염 시약으로서 작용할 수 있는 본원에 기술된 바와 같은 생물분자 복합체의 형태의 실험실 시약을 제공한다. 이와 관련하여, 적하 분자는 발현 작제물 또는 벡터, 단백질, 핵산 또는 형질감염에 적합한 임의의 다른 분자일 수 있다.
다른 구현예에서, 키트는 질환의 하나 이상의 증상을 치료하거나 예방하기 위한 하나 이상의 추가의 제제를 포함한다.
다른 구현예에서 키트는 조성물을 투여하기 위한 수단, 예를 들면, 주사기, 침, 튜빙, 카테터, 패치 등을 포함한다. 키트는 사용 전에 멸균 및/또는 희석을 필요로 하는 제형 및/또는 물질을 또한 포함할 수 있다.
본 발명의 생물분자 복합체는 적하 분자로서 치료제를 수반하는 경우에 의학 치료 방법에서 활용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 이러한 치료가 필요한 환자에게 유효량의 본원에 기술된 바와 같은 생물분자 복합체를 투여함을 포함하는, 상기 환자에서 질환 또는 상태의 치료 방법을 제공하며, 여기서 상기 생물분자 복합체는 상기 질환 또는 상태의 치료를 위한 치료제인 적하 분자를 추가로 포함한다.
의구심을 피하기 위해, 본 발명의 맥락에서, 용어 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 이러한 치료가 필요한 환자의 치료학적 또는 일시적인 치료뿐만 아니라 관련 질환 상태에 민감한 환자의 예방학적 치료 및/또는 진단에 대한 참고도 포함한다.
용어 "환자" 및 "환자들"은 포유동물(예컨대, 사람) 환자에 대한 참고를 포함한다.
용어 "유효량"은 화합물의 양을 지칭하며, 이는 치료된 환자에게 치료학적 효과(예컨대, 질환을 치료하거나 예방하기에 충분한)를 부여한다. 이러한 효과는 객관적(즉, 일부 시험 또는 마커에 의해 측정가능한)이거나 주관적(즉, 환자는 효과의 징후를 제공하거나 효과를 느낀다)일 수 있다. 용어 "유효량" 및 "유효 투여량"은 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 생물분자 복합체를 또한 제공하며, 여기서 상기 생물분자 복합체는 치료요법에서 사용하기 위한, 치료제인 적하 분자를 추가로 포함한다.
본 발명은 본원에 기술된 생물분자 복합체의 용도를 추가로 제공하며, 여기서 상기 생물분자 복합체는 치료요법에서 사용하기 위한 의약의 제조시, 치료제인 적하 분자를 추가로 포함한다.
본 발명은 여전히 본원에 기술된 바와 같은 생물분자 복합체를 추가로 제공하며, 여기서 상기 생물분자 복합체는 치료요법에서 사용되는 경우, 치료제인 적하 분자를 추가로 포함한다.
치료제로 로딩된 생물분자 복합체의 투여는 환자에서 질환, 또는 하나 이상의 증상을 치료한다. 구현예에서 질환은 자가면역 질환, 발달 장애, 염증 질환, 대사 장애, 심혈관 질환, 간 질환, 장 질환, 감염성 질환, 내분비 질환, 신경학적 장애, 및 암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
구현예에서, 생물분자 복합체는 암의 치료를 위한 치료제로 로딩된다. 구현예에서 암은 부신 암, 항문 암, 담즙관 암, 방광 암, 골 암, 뇌 종양, CNS 종양, 유방 암, 캐슬맨 질환(Castleman disease), 경부 암, 결장 암, 직장 암, 내막 암, 식도 암, 눈 암, 방광 암, 위장 유암종 종양, 위장 기질 종양(GIST), 위장 영양막 질환, 호지킨 질환(Hodgkin disease), 카포시 육종(Kaposi sarcoma), 신장 암, 후두암, 식도 암, 백혈병(예컨대, 급성 림프구성, 금성 골수성, 만성 림프구성, 만성 골수성, 만성 골수단핵구성), 간 암, 폐 암(예컨대, 소 세포 또는 비-소 세포), 폐 유암종 종양, 림프종(예컨대, 피부의), 악성 중피종, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 비강 암, 부비동 암, 비인두 암, 신경아세포종, 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma), 구강 암, 구인두 암, 골육종, 난소 암, 췌장 암, 음경 암, 뇌하수체 종양, 전립선 암, 망막아종, 횡문근육종, 침샘 암, 육종, 피부 암(기저 및 평편 세포, 흑색종, 메르켈 세포(Merkel cell)), 소장 암, 위 암, 고환 암, 흉선 암, 갑상선 암, 자궁 육종, 질 암, 외음부 암, 발덴스트롬마크로글로불린혈증(Waldenstrom macroglobulinemia) 및 윌름스 종양(Wilms tumour)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
구현예에서 생물분자 복합체는 감염성 질환의 치료를 위한 치료제로 로딩된다. 특히 치료제는 세균, 원생동물, 바이러스, 프리온(prion), 진균 또는 장내기생충(helminth)에 의한 감염에 의한 유발시 감염성 질환의 치료이다. 특히 세균, 바이러스, 프리온, 진균 및 장내기생충에 의해 감염되어, 감염된 세포 표면에 단백질 마커 또는 물질을 발현하는 세포는 약물 로딩된 CVT에 대한 표적이다. 예로서, B형 간염으로 감염된 간 세포는 CVT에 의해 표적화될 수 있는 B형 간염 바이러스로부터의 단백질 마커를 발현한다.
치료제는 다음을 포함하는 세균 감염 또는 원생생물 감염을 치료하기 위해 선택될 수 있다: 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 엔테로코쿠스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 이. 파에시움(E. faecium), 이. 카쎌플라부스(E. casselflavus), 에스. 에피더미디스(S. epidermidis), 에스. 헤몰라이티쿠스(S. haemolyticus), 또는 펩토스트렙토코쿠스 종(Peptostreptococcus spp.)에 의한 감염과 관련된 폐렴, 중이염, 부비동염, 기관지염, 편도염, 및 유양돌기염(mastoiditis); 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 그룹 C 및 G 스트렙토콕시(streptococci), 코리네박테리움 디프테리아에(Corynebacterium diphtheriae), 또는 악티노바실루스 헤몰리티쿰(Actinobacillus haemolyticum)에 의한 감염과 관련된 인두염, 류마티스 열, 및 사구체신염; 마이코플라즈마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 또는 클라미디아 뉴모니아에(Chlamydia pneumoniae)에 의한 감염과 관련된 호흡기 감염; 에스. 아우레우스(S. aureus), 에스. 헤몰리티쿠스(S. haemolyticus), 이. 파에칼리스(E. faecalis), 이. 파에시움(E. faecium), 이. 두란스(E. durans)에 의해 유발된 혈액 및 조직 감염, 예컨대, 심장내막염 및 골수염; 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 코아글라제-음성 스타필로콕키(coagulase-negative staphylococci)(즉, 에스. 에피더미디스(S. epidermidis), 에스. 헤몰리티쿠스(S. hemolyticus) 등), 스트렙토코쿠스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 아갈락티아에, 스트렙토코쿠스 그룹 C-F(극미한-콜로니 스트렙토콕시(minute-colony streptococci)), 비리단스 스트렙토콕시(viridans streptococci), 코리네박테리움 미누티씨움(Corynebacterium minutissimum), 클로스트리디움 종(Clostridium spp.), 또는 바르토넬라 헨셀라에(Bartonella henselae)에 의한 감염과 관련된 단순한 피부 및 연질 조직 감염 및 종기, 및 산욕열; 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 코아글라제-음성 스타필로코쿠스 종(coagulase-negative staphylococcal species), 또는 엔테로코쿠스 종(Enterococcus spp.)에 의한 감염과 관련된 단순화된 급성 뇨관 감염; 요도염 및 자궁경관염; 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 헤모필루스 두크레이이(Haemophilus ducreyi), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 우레아플라스마 우레알리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 또는 나이세리아 고노레아에(Neiserria gonorrheae)에 의한 감염과 관련된 성적으로 전파되는 질환; 에스. 아우레우스(S. aureus)(식중독 및 독성 쇼크 증후군), 또는 그룹 A, B, 및 C 스트렙토코쿠스에 의한 감염과 관련된 독소 질환; 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)에 의한 감염과 관련된 궤양; 보렐리아 레쿠렌티스(Borrelia recurrentis)에 의한 감염과 관련된 열성 증상 증후군(systemic febrile syndrome); 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi)에 의한 감염과 관련된 라임 질환(Lyme disease); 결막염, 각막염, 및 클라마이디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 나이쎄리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae), 에스. 아우레우스(S. aureus), 에스. 뉴모니아에(S. pneumoniae), 에스. 피오게네스(S. pyogenes), 에이치. 인플루엔자에(H. influenzae), 또는 리스테리아 종(Listeria spp.)에 의한 감염과 관련된 누낭염; 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 또는 마이코박테리움 인트라셀룰라레(Mycobacterium intracellulare)에 의한 감염과 관련된 유포된 마이코박테리움 아비움 복합체(disseminated Mycobacterium avium complex: MAC) 질환; 마이코박테리운 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 엠. 레프라에(M. leprae), 엠. 파라투베르쿨로시스(M. paratuberculosis), 엠. 칸사시이(M. kansasii), 또는 엠. 첼로네이(M. chelonei)에 의해 유발된 감염; 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)에 의한 감염과 관련된 위장염; 크립토스포리디움 종(Cryptosporidium spp.)에 의한 감염과 관련된 장 원생생물; 비리단스 스트렙토콕시(Viridans streptococci)에 의한 감염과 관련된 치아형성 감염; 보르데텔라 페르투씨스(Bordetella pertussis)에 의한 감염과 관련된 지속적인 기침; 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens) 또는 박테로이데스 종(Bacteroides spp.)에 의한 감염과 관련된 가스 괴저(gas gangrene); 및 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 또는 클라마이디아 뉴모니아에(Chlamydia pneumoniae)의한 감염과 관련된 죽상경화증 또는 심혈관 질환.
동물에서 치료되거나 예방될 수 있는, 세균 감염 및 원생생물 감염, 및 이러한 감염과 관련된 장애는 다음을 포함한다: 피, 헤몰리티카(P. haemolytica), 피. 물토시다(P. multocida), 마이코플라스마 보비스(Mycoplasma bovis), 또는 보르데텔라 종(Bordetella spp.)에 의한 감염과 관련된 소 호흡기 질환; 이. 콜라이(E. coli) 또는 원생생물(즉, 콕시디아(coccidia), 크립토스포리디아(cryptosporidia) 등)에 의한 감염과 관련된 소(cow) 장 질환; 에스. 아우레우스(S. aureus), 스트렙. 우베리스(Strep. uberis), 스트렙토코쿠스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코쿠스 디스갈락티아에(Streptococcus dysgalactiae), 클렙시엘라 종(Klebsiella spp.), 코리네박테리움(Corynebacterium), 또는 엔테로코쿠스 종(Enterococcus spp.)에 의한 감염과 관련된 젖소 유방염; 에이. 플레우로(A. pleuro.), 피. 물토시다(P. multocida), 또는 마이코플라즈마 종(Mycoplasma spp.)에 의한 감염과 관련된 돼지 호흡기 질환; 이. 콜라이, 라우소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis), 살모넬라(Salmonella), 또는 세르풀리나 효다이신테리아에(Serpulina hyodysinteriae)에 의한 감염과 관련된 돼지 장 질환; 푸소박테리움 종(Fusobacterium spp.)에 의한 감염과 관련된 소 부제병(cow footrot); 이. 콜라이에 의한 감염과 관련된 소 자궁근염; 푸소박테리움 네크로포룸(Fusobacterium necrophorum) 또는 박테로이데스 노도수스(Bacteroides nodosus)에 의한 감염과 관련된 소 털 사마귀(cow hairy wart); 모락셀라 보비스(Moraxella bovis)에 의한 감염과 관련된 소 핑크색-눈(cow pink-eye); 원생생물(즉, 네오스포리움(neosporium))에 의한 감염과 관련된 소 조기 유산; 이. 콜라이에 의한 감염과 관련된 개 및 고양이에서 뇨관 감염; 에스. 페피더미디스(S. epidermidis), 에스. 인테르메디우스(S. intermedius), 코아굴라제 음성 스타필로코쿠스(coagulase neg. Staphylococcus) 또는 피. 물토시다(P. multocida)에 의한 감염과 관련된 개 및 고양이에서 피부 및 연질 조직 감염; 및 알칼리게네스 종(Alcaligenes spp.), 박테로이데스 종(Bacteroides spp.), 클로스트리디움 종(Clostridium spp.), 엔테로박터 종(Enterobacter spp.), 유박테리움(Eubacterium), 펩토스트렙토코쿠스(Peptostreptococcus), 포르피로모나스(Porphyromonas), 또는 프레보텔라(Prevotella)에 의한 감염과 관련된 개 및 고양이에서 치아 또는 구강 감염을 포함한다.
치료제는 헤르페스비리다에((Herpesviridae)에 속하는 바이러스, 예컨대, 헤르페스 단성 바이러스(herpes simplex virus type) 제1형(HSV-1), 헤르페스 단성 바이러스 제2형(HSV-2), 바리셀라-조스터 바이러스(varicella-zoster virus (VZV), 및 사이토메갈로바이러스(CMV)(총칭하여 헤르페스 바이러스로 불림), 오르토믹소비리다에에 속하는 바이러스, 예컨대, 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스 및 인플루엔자 C 바이러스(총칭하여 인플루엔자 바이러스로 불림), 레트로비리다에(Retroviridae)에 속하는 바이러스, 예컨대, 사람 면역결핍성 바이러스(HIV), 파라믹소비리다에(Paramyxoviridae)에 속하는 바이러스, 예컨대, 홍역 바이러스 및 볼거리 바이러스, 피코르나비리다에(Picornaviridae)에 속하는 바이러스, 예컨대, 폴리오바이러스(poliovirus), 리노바이러스(rhinovirus), 및 A형 간염 바이러스, 헤파드나비리다에(Hepadnaviridae)에 속하는 바이러스, 예컨대, B형 간염 바이러스, 플라비비리다에(Flaviviridae)에 속하는 바이러스, 예컨대, C형 간염 바이러스, 일본 뇌염(Japanese encephalitis) 바이러스, 및 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus), 아데노비리다에(Adenoviridae)에 속하는 바이러스, 예컨대, 사람 아데노바이러스(human adenovirus) C, 코로나비리다에(Coronaviridae)에 속하는 바이러스, 예컨대, 코로나 바이러스 및 SARS 바이러스, 토가비리다에(Togaviridae)에 속하는 바이러스, 예컨대, 루벨라 바이러스(rubella virus), 라브도비리다에(Rhabdoviridae)에 속하는 바이러스, 예컨대, 라비에스 바이러스(rabies virus) 및 수포성 구내염 아형 바이러스(vesicular stomatitis alagoas virus), 필로비리다에(Filoviridae)에 속하는 바이러스, 예컨대, 에볼라 바이러스(Ebola virus), 및 파포바비리다에(Papovaviridae)에 속하는 바이러스, 예컨대, 사람 파필로마바이러스(human papillomavirus: HPV)를 포함하는 바이러스에 의한 감염의 치료를 위해 선택될 수 있다.
치료제는 다양한 해면모양 뇌병증을 포함하는 프리온에 의해 유발된 감염의 치료를 위해 선택될 수 있다. 동물에서 대표적인 프리온 질환은 스크래피(scrapie)이며, 이는 양 및 염소에서 발생한다. 사람 프리온 질환은 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 거스트만-슈트라우슬러-쉔커(Gerstmann-Straussler-Scheinker) 증후군, 쿠루병(Kuru) 및 치명적 가족성 불면증(fatal familial insomnia)을 포함한다.
치료제는 칸디다 종(Candida spp.), 크립토코쿠스 종(Cryptococcus spp.), 아스페르길루스 종(Aspergillus spp.), 노카르디아 종(Nocardia spp.), 및 사카로마이세스 종(Saccharomyces spp.)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 진균에 의해 유발된 것들을 포함하는 진균 감염의 치료를 위해 선택될 수 있다. 진균 감염은 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 파랍실로시스(Candida parapsilosis), 칸디다 두블리엔시스(Candida dubliensis), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 칸디다 루시타니아에(Candida lusitaniae), 칸디다 슈도구일레리몬디(Candida pseudoguillerimondi), 및 칸디다 크루세이(Candida krusei)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 칸디다 종(Candida spp.)의 구성원에 의해 유발될 수 있다. 임의로, 진균 감염은 크립토코쿠스 종, 예를 들면, 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans)의 구성원에 의해 유발될 수 있다.
치료제는 촌충: 예컨대, 아나플로세팔라 종(Anaplocephala spp.), 디필리디움 종(Dipylidium spp.), 디필로보트리움 종(Diphyllobothrium spp.), 에키노코쿠스 종(Echinococcus spp.), 모이에지아 종(Moniezia spp.) 또는 태니아 종(Taenia spp.); 흡충류, 예컨대, 디크로코엘리움 종(Dicrocoelium spp.), 파스키올라 종(Fasciola spp.), 파람피스토뭄 종(Paramphistomum spp.) 또는 스키스토소마 종(Schistosoma spp.); 또는 선충류, 예컨대, 안실로스토마 종(Ancylostoma spp.), 아네카토르 종(Anecator spp.), 아스카리디아 종(Ascaridia spp.), 브루기아 종(Brugia spp.), 부노스토뭄 종(Bunostomum spp.), 카필라리아 종(Capillaria spp.), 차베르티아 종(Chabertia spp.), 쿠페리아 종(Cooperia spp.), 시아토스토뭄 종(Cyathostomum spp.), 실리코시클루스 종(Cylicocyclus spp.), 실리코돈토포루스 종(Cylicodontophorus spp.), 실리코스테파누스 종(Cylicostephanus spp.), 크라테로스토뭄 종(Craterostomum spp.), 딕티오카울루스 종(Dictyocaulus spp.), 디프탈로네마 종(Dipetalonema spp), 디로필라리아 종(Dirofilaria spp.), 드라쿤쿨루스 종(Dracunculus spp.), 엔테로비우스 종(Enterobius spp.), 필라로이데스 종(Filaroides spp.), 하브로네마 종(Habronema spp.), 해몬쿠스 종(Haemonchus spp.), 헤테라키스 종(Heterakis spp.), 효스트론길루스 종(Hyostrongylus spp.), 메타스트론길루스(Metastrongylus spp.), 메울레리우스 종(Meullerius spp.), 네카토르 종(Necator spp.), 네마토디루스 종(Nematodirus spp.), 니포스트론길루스 종(Nippostrongylus spp.), 오에소파고스토뭄 종(Oesophagostomum spp.), 온초케르카 종(Onchocerca spp.), 오스테르타기아 종(Ostertagia spp.), 옥시우리스 종(Oxyuris spp.), 파라스카리스 종(Parascaris spp.), 스테파누루스 종(Stephanurus spp.), 스트론길루스 종(Strongylus spp.), 신가무스 종(Syngamus spp.), 톡소카라 종(Toxocara spp.), 스트론길로이데스 종(Strongyloides spp.), 텔라도르사기아 종(Teladorsagia spp.), 톡사스카리스 종(Toxascaris spp.), 트리키넬라 종(Trichinella spp.), 트리쿠리스 종(Trichuris spp.), 트리초스트롱길루스 종(Trichostrongylus spp.), 트리오돈토포러스 종(Triodontophorous spp.) 또는 운키나리아 종(Uncinaria spp)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 기생충에 의해 유발된 것들을 포함하는 기생충 감염의 치료를 위해 선택될 수 있다.
본원에 제공된 방법에 따라서, 환자에게 유효량의 하나 이상의 본원에 제공된 제제를 투여한다. 유효량 및 제제를 투여하기 위한 스케쥴은 당해 분야의 기술자에 의해 실험적으로 측정될 수 있다. 투여를 위한 투여량 범위는 목적한 효과를 생산하기에 충분히 큰 것들이며 여기서 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상이 영향받는다(예컨대, 감소되거나 지연된다). 투여량은 실질적인 부작용, 예컨대, 원치않은 교차-반응, 아나필락시 반응 등을 유발하도록 너무 크기 않아야 한다. 일반적으로, 투여량은 연령, 상태, 성별, 질환의 유형, 질환 또는 장애의 정도, 투여 경로, 또는 다른 약물이 요법에 포함되는지의 여부에 따라 변할 것이며, 당해 분야의 기술자에 의해 측정될 수 있다. 투여량은 임의의 사용 금지 사유인 경우 개개 주치의에 의해 조절될 수 있다. 투여량은 변할 수 있으며 매일 하나 이상의 용량 투여로 1일 또는 수일 동안 투여될 수 있다. 안내서는 약제학적 제품의 제공된 부류에 대해 적절한 투여량에 대한 문헌에서 찾을 수 있다. 예를 들면, 주어진 매개변수의 경우, 유효량은 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 90%, 1000%의 증가 또는 감소를 나타낼 것이다. 효능은 또한 "- 배" 증가 또는 감소로 표현될 수 있다. 예를 들어, 치료학적 유효량은 대조군보다 적어도 1.2배, 1.5배, 2배, 5배 이상의 효과를 가질 수 있다. 정확한 용량 및 제형은 치료 목적에 의존할 것이며, 공지된 기술을 사용하여 당해 분야의 기술자에 의해 확인될 수 있을 것이다(참고: 예컨대, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Gennaro, Editor (2003), 및 Pickar, Dosage Calculations (1999)).
본 발명에 따른 생물분자 복합체의 적용은 로딩될 물질의 특성에 따라 다수이다. 요법에서 다수의 가능한 적용은 본원에서 설명 목적으로만 논의되며, 기술자는 적하물 전달 비히클 또는 형질감염 시약으로서 실험실에서와 같은, 다른 적용도 가능하며, 배제되지 않음을 인식할 것이다.
예로서, 화학치료제는 본 발명에 따라 생물분자 복합체 내에서 로딩될 수 있다. 이들은 소 분자, 예컨대, 독소루비신, 단백질/펩타이드 기반한 치료제, 예컨대, 분해성 펩타이드 또는 유전 물질, 예컨대, siRNA 또는 shRNA일 수 있다. nCVT의 나노 치수의 결과로서, 화학치료제로 로딩된 nCVT는 EPR 효과를 사용하여 종양 부위에서 축적될 수 있다. 종양 부위에서, nCVT는 종양 세포를 고유하게 표적화하는 유령 세포로부터의 세포 유래된 구성성분의 존재로 인하여, 종양 세포에 의한 개선된 세포 흡수 프로파일 및 종양 세포에 대한 향상된 표적화를 가져서, 달리 건강한 세포에 대한 이차적인 독성을 감소시킨다.
구현예에서, 생물분자 복합체는 암 백신을 전달할 수 있다. 종양 세포의 인식을 상향-조절하거나, 종양 세포의 인식을 방지하는 인자를 하향-조절하기 위한 지시사항을 암호화하는 플라스미드는 CVT 상으로 로딩될 수 있다. 이러한 방식으로 천연의 면역요법을 향상시킴으로써, 신체의 천연 면역계는 암 세포의 보다 효과적인 제거를 증가시킬 수 있다.
생물분자 복합체는 면역치료요법에 또한 유용하다. 이의 표면에 종양 리간드가 존재하는 종양 세포로부터의 유령 세포가 생산될 수 있다. 바이러스 또는 세균에 상관없이, 이의 표면에 병원성 리간드를 나타내는, 병원체에 의해 감염된 세포로부터의 유령 세포가 또한 생산될 수 있다. 이러한 유령 세포는 CVT 내로 추가로 변형되어 이러한 리간드의 인식시 T 세포 집단의 활성화 및 확장을 위한 T 세포의 혼주물(pool)에 가하기 전에, 이러한 리간드 또는 단백질의 표면 발현을 증가시킬 수 있다. 확장된 T 세포는 이후 정제되어 면역치료요법을 위해 환자에게 다시 재도입될 수 있다.
대안적으로, CVT는 nCVT로 될 수 있으며, 면역치료요법을 위한 환자에게 재도입되기 전에 적하물로서의 치료제와 함께 로딩될 수 있다.
생물분자 복합체는 유전자 치료요법에 유용할 수 있다. CVT는 적합한 플라스미드와 함께 로딩시킴으로써 유전 물질의 전달을 위해 채택될 수 있다.
생물분자 복합체는 염증의 조절에 유용할 수 있다. 염증성 창자병, 류마티스 관절염, 복막염, 죽상경화증 및 근질환을 포함하나, 이에 한정되지 않는 염증성 질환은 소염 생물치료제 또는 염증 과정을 조절하기 위한 치료제로 치료될 수 있다. 이러한 질환 상태는 염증을 표적화하는 고유 능력을 지닌 세포로부터 유래된 유령 세포로부터 생산된 CVT를 사용하고 이를 염증용 치료제와 함께 로딩함으로써 이차적인 독성이 거의 없이 보다 효율적으로 치료할 수 있다.
치료되는 질환을 치료하는데 적합한 추가의 치료제는 생물분자 복합체에서 로딩된 치료제와 함께 사용될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 제공된 치료 방법은 대상체에게 제2의 치료제를 투여함을 추가로 포함한다. 적합한 추가의 치료제는 진통제, 마취제, 강장제, 코르티코스테로이드, 항콜린제, 항콜린에스테라제, 항경련제, 항신생물제, 알로스테릭 억제제(allosteric inhibitor), 아나볼릭 스테로이드(anabolic steroid), 항류마티스제, 정신치료제, 신경 차단제, 소염제, 구충제, 항생제, 항응고제, 항진균제, 항히스타민제, 항무스카린제, 항마이코박테리아제, 항원생생물제, 항바이러스제, 도파민제(dopaminergics), 혈액학적 제제, 면역학적 제제, 무스카린제, 프로테아제 억제제, 비타민, 성장 인자, 및 호르몬으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치료제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 제제 및 용량의 선택은 주어진 치료되는 질환을 기반으로 하여 당해 분야의 기술자에 의해 용이하게 측정될 수 있다.
제제의 조합물 또는 조성물은 함께(예컨대, 혼합물로서), 별도로 그러나 동시에(예컨대, 별도의 정맥내 라인을 통해) 또는 순차적으로(예컨대, 하나의 제제가 먼저 투여된 후 제2 제제가 투여됨) 투여될 수 있다. 따라서, 용어 조합물을 2개 이상의 제제 또는 조성물의 함께, 동시에 또는 순차적으로 투여함을 지칭하는데 사용된다. 치료 과정은 환자의 특수한 특징 및 선택된 치료 유형에 따라서 개인 기준으로 가장 잘 측정된다.
본원에 개시된 것들과 같은, 치료제는 환자에게 매일, 격일, 2주마다, 매달 또는 치료학적으로 효과적인 임의의 적용가능한 기준으로 투여될 수 있다. 치료제는 단독으로 또는 본원에 개시되거나 당해 분야에 공지된 임의의 다른 치료와 함께 투여될 수 있다. 추가의 치료제는 제1 치료제와 동시에, 상이한 시점에서, 또는 전체적으로 상이한 치료 스케쥴로(예컨대, 제1 치료제는 매일일 수 있는 반면, 추가의 치료제는 매주일 수 있다) 투여될 수 있다.
본 발명에 언급된 생물분자 복합체는 적하 분자로서 영상화제를 수반하는 경우에 의학적 진단 방법에 활용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 대상체에게 본원에 기술된 바와 같은 생물분자 복합체를 투여함을 포함하여, 대상체에서 질환을 진단하는 방법을 제공하며 여기서 상기 생물분자 복합체는 영상화제인 적하 분자를 추가로 포함한다.
용어 "진단"은 질환(예컨대, 자가면역, 염증성 자가면역, 암, 감염성, 면역, 또는 다른 질환)이 대상체내에 존재할 상대적인 가능성을 지칭한다. 유사하게, 용어 "예후"는 특정의 미래의 결과가 질환 상태와 관련하여 대상체에서 발생할 수 있는 상대적 가능성을 지칭한다. 예를 들면, 본 발명의 맥락에서, 예후는 개인이 질환(예컨대, 자가면역, 염증성 자가면역, 암, 감염성, 면역, 또는 다른 질환), 또는 질환의 가능한 중증도(예컨대, 질환의 기간)을 지칭할 수 있다. 이러한 용어는 의학 진단 분야의 임의의 기술자에 의해 인식될 바와 같이, 절대적임을 의도하지 않는다.
진단 방법은 시험 샘플로부터의 생물마커, 예컨대, 질환의 세포내 표적의 수준 또는 활성을 대조군 샘플로부터의 것과 비교함을 일반적으로 포함한다. 대조군 샘플 또는 값은 시험 샘플과 비교하기 위해, 참고, 일반적으로 공지된 참고로서 제공되는 샘플을 지칭한다. 대조군은 또한 유사한 개인의 집단, 예컨대, 유사한 의학적 배경, 동일한 연령, 체중 등을 지닌 암 환자 또는 건강한 개인으로부터 수집된 평균 값을 나타낼 수 있다. 대조군 값은 또한 동일한 개인으로부터, 예컨대, 조기 수득된 샘플로부터 질환 전, 또는 치료 전에 수득될 수 있다. 질환 위험 인자의 측정과 관련하여, 용어 "비교하는", "관련시키는" 및 "관련된"은 개인에서 위험 인자의 존재 또는 양(예컨대, 질환의 세포내 표적의 양)을 질환을 앓고 있는 것으로 공지되거나, 질환의 위험이 있는 것으로 공지된 개인에서의 이의 존재 또는 양과 비교하고, 검정 결과(들)을 기반으로 하여 개인에게 질병을 가질/질병이 발달할 증가된 또는 감소된 가능성을 지정함을 지칭한다.
진단 방법에서 다수의 가능한 적용은 설명 목적으로만 본원에서 논의되어 있으며, 기술자는 다른 적용이 가능하며 배제되지 않음을 인식할 것이다.
이에 도입될 수 있는 영상화 물질은 본 발명에 따라 생물분자 복합체내에 포함될 수 있는 대조 물질, 방사활성 동위원소, 산화철 나노입자, 금 나노입자, 형광성 염료 및 근적외선 염료를 포함하나 이에 한정되지 않는다. CVT의 고유한 표적화 능력을 활용하여, 종양 덩어리 또는 염증 조직의 가시화는 정밀하게 및 보다 낮은 독성으로 수행할 수 있다. CVT 내의 영상화 물질의 캡슐화는 영상 물질과 신체의 천연 방어 시스템의 접촉을 감소시켜, 관련된 면역원성 위험을 감소시켰다. 또한, CVT는 일단 가시화가 달성되면 이러한 영상화 물질을 제거하고, 체내의 생물-축적의 쟁점을 피하는 데 도움을 줄 수 있다.
본 발명에 따른 생물분자 복합체 속의 영상화 구성성분과 생물치료제 또는 치료제의 조합물은 질환 상태의 치료를 향한 써라노스틱 접근법(theranostic approach)을 허용한다. 예를 들면, 종양은 가시화될 수 있고 동시에 치료됨으로써, 주치의가 선택된 치료요법의 진행 및 효능을 모니터링할 수 있었다.
본 발명의 언급된 생물분자 복합체는 다른 목적, 예컨대, 이에 한정되지 않는 세포 형질감염을 위해 외인성 물질을 세포 내로 운반하기 위해 활용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 단리된 세포를 본원에 기술된 바와 같은 적하 분자를 포함하는 생물분자 복합체와 접촉시킴을 포함하여, 단리된 세포에 외인성 물질을 도입하는 방법을 제공한다.
바람직한 구현예에서 생물분자 복합체는 mCVT이다.
바람직한 구현예에서 적하 분자는 핵산이고 목적은 단리된 세포를 안정하게 또는 일시적으로 형질감염시키기 위한 것이다.
예로서, 양이온성 지질과 함께 생산된 mCVT는 음으로 하전된 적하물과 회합된다. 따라서, 전형적으로 실온에서 10분 동안 이러한 mCVT와 플라스미드, 핵산, siRNA, 또는 shRNA의 항온처리는 생물분자 복합체를 로딩한다. 생물분자 복합체는 이후에 형질감염을 위해 세포에 첨가된다. 이는 전형적으로 혈청 유리된 배양 배지 속에서 6 내지 8시간에 걸쳐 발생한다. 혈청 유리된 배양 배지는 이후에 완전 배양 배지로 교체된다. 형질감염된 세포는 24 내지 48시간 내에 사용하기 위해 준비된다. 대안적으로, 양이온성 지질로 생산된 mCVT는 자기 나노입자, 예컨대, 산화철 나노입자와 함께 로딩된다. mCVT는 이후에 플라스미드, 핵산, siRNA 또는 shRNA와 함께, 전형적으로 실온에서 10분 동안 항온처리된다. 로딩된 mCVT는 이후에 형질감염을 위해 세포에 첨가된다. 자석을 세포 배양 플라스크 아래에 위치시켜 자성의 mCVT를 세포 배양 플라스크의 바닥으로 끌어낼 수 있으며, 여기서 세포는 부착성이므로, 세포와의 접촉을 증가시키고 형질감염을 증진시킨다. 추가의 대안은 세포를 mCVT와 함께 미세유동성 장치에 가해지도록 하는 것이며, 여기서 세포는 미세채널 압축으로 짜지고(squeeze) 후속적으로 완화된다. 완화 단계 후 세포의 확장은 세포막의 증가된 다공성을 야기하여, mCVT의 도입을 촉진함으로써 형질감염을 증가시킨다. 여전히 또한, 세포를 mCVT와 함께 전기천공 장치에 첨가할 수 있으며, 이러한 장치에서 내용물은 전기천공된다. 전기천공 동안, 세포막 다공성에 있어서의 일시적인 증가는 mCVT의 도입을 촉진시켜, 세포의 형질감염을 추가로 증진시킨다. 여전히 추가의 대안에서, 세포는 mCVT와 함께 소노포레이션 장치(sonoporation device)에 첨가되며, 여기서 내용물은 소노포레이션된다. 소노포레이션 동안, 세포 막 다공성에 있어서의 일시적인 증가는 mCVT의 도입을 촉진하여, 세포의 형질감염을 추가로 증진시킨다.
형질감염될 수 있는 세포는 이들의 암 형태를 포함하는, 뇌, 눈, 혈액, 연결조직, 지방, 폐, 간, 비장, 신장, 위, 결장, 장, 재생 기관, 피부, 치아, 모공, 골, 골수, 근육 및 줄기 세포, 및 특히 지방선구세포, 대식구, 단핵구 줄기 세포 및 차이니즈 햄스터 난소(Chinese hamster ovary(CHO) 세포로부터의 원시 및 무한증식 세포주를 형질감염시킬 수 있다.
본 발명의 관련된 양태는:
(a) 적어도 하나의 세포를 제공하는 단계;
(b) 세포를 세포에 대해 저장성인 삼투압적으로 활성인 용액에 노출시킴으로써 핵 및 핵 내용물을 포함하는 세포의 세포질 내용물의 모두 또는 실질적으로 모두를 제거하는 단계;
(c) 등장성 용액 속에서 세포를 재-밀봉시켜 유령 세포를 형성시키는 단계;
(d) 6 μm 미만, 바람직하게는 약 5 μm 내지 약 50 nm의 범위의 유체역학적 직경까지 크기를 감소시키는 조건 하에서, 상기 유령 세포를 전단하고, 유령 세포를 압출시키거나, 유령 세포를 동결 해동시키고 초음파처리함으로써 생물분자 복합체를 형성시키는 단계를 포함하는, 상술한 바와 같은 생물분자 복합체를 제조하는 방법을 제공한다.
바람직한 구현예에서 생물분자 복합체는 상기 복합체내로 혼입된 지질을 추가로 포함하며, 상기 방법은:
(a) 상기 단계 (c)에서 정의한 적어도 하나의 유령 세포를 제공하는 단계;
(b) 적어도 하나의 유령 세포를 지질 및/또는 소낭 구조와 접촉시키는 단계; 및
(c) 6 μm 미만, 바람직하게는 약 5 μm 내지 약 50 nm의 범위의 유체역학적 직경까지 크기를 감소시키는 조건 하에서 유령 세포, 지질 및/또는 소낭 구조를 함께 전단, 압출, 또는 동결 해동 및 초음파 처리함으로써 지질 및/또는 소낭 구조를 유령 세포와 융합시키는 단계를 포함한다.
바람직한 구현예에서 재-밀봉 또는 융합은 등장성 매질 속에서 수행된다.
바람직한 구현예에서, 상기 복합체 내로 혼입된 지질은 하나 이상의 분자, 예컨대, 이에 제한되지 않는, 펩타이드, 단백질, DNA, miRNA, siRNA, 탄수화물, 바이오틴, 스트렙타비딘, 아비딘, 형광성 프로브, 아지드 그룹, 알킨 그룹 및 카보디이미드 화학의 구성성분과 접합된다.
바람직한 구현예에서 상기 복합체 내로 혼입된 지질은 표지 또는 태그(tag)를 포함한다.
바람직한 구현예에서 본 발명은: (a) 양친매성 분자 또는 이의 구성성분으로 구성된 적어도 하나의 소낭 구조를 제공하는 단계; (b) 적어도 하나의 유령 세포를 제공하는 단계; 및 (iii) 양친매성 분자 또는 이의 구성성분으로 구성된 소낭 구조를 유령 세포와 융합을 유도하는 조건 하에서 혼합함으로써 생물분자 복합체를 형성시키는 단계를 포함하는, 생물분자 복합체를 제조하는 방법을 제공한다.
이러한 방법의 바람직한 구현예에서, 상기 유령 세포 및/또는 상기 소낭 구조는 적하 분자를 함유한다.
구현예에서, 미세 세포 소낭 기술(Cell Vesicle Technology(mCVT)이 생성된다. 이는 직경이 일반적으로 500nm 보다 크다. mCVT에 대해 나타낸 크기 범위는 직경이 1 μm 내지 5μm이다. 구현예에서, mCVT에 대한 크기 범위는 전형적으로 동결 해동과 같은 방법을 사용하여 생산된 바와 같이, 직경이 3 μm 내지 4μm이다. 구현예에서, mCVT의 크기 범위는 전형적으로 이러한 압출 방법을 사용하여 생산된 바와 같이, 직경이 1 μm 내지 2 μm이다.
구현예에서, 유령 세포는 예비-형성된 리포좀에 첨가된다. 대안적인 구현예에서, 유령 세포는 자이언트 리포좀(giant liposome) 내에 캡슐화된다. 이는 본원에 기술된 바와 같이 지질 박 필름 수화를 사용하여 달성할 수 있다. 여전히 추가의 구현예에서 유령 세포는 리포좀으로 조립할 수 있는 지질의 혼합물에 단순히 첨가된다.
구현예에서, 유령 세포는 리포좀과의 융합 전에 정제될 수 있다. 임의로, 정제는 크기 배제 컬럼 크로마토그래피, 투석, 고 성능 액체 크로마토그래피, 초-고 성능 액체 크로마토그래피, 친화성-기반 컬럼, 또는 이의 조합을 포함한다.
제공된 방법의 구현예에서, 리포좀 및 유령 세포는 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 및 1:10의 질량 : 질양 비로 제공될 수 있다.
구현예에서 융합은 전기천공, 압출, 원심분리력, 미세-채널(micro-channel)을 통한 통과 및 동결 해동 주기를 포함하나, 이에 한정되지 않는 방법에 의해 유도된다.
구현예에서 혼합물은 유령 세포를 리포좀을 형성할 수 있는 지질의 혼합물에 첨가한 후 초음파처리한다.
구현예에서 혼합물은, 임의로 다수의 주기 동안 동결 해동된다. 전형적으로 이는 액체 질소 속의 침전과 실온 사이에서, 바람직하게는 3 내지 7회 주기, 전형적으로 5회 주기로 주기화된다.
구현예에서 혼합물은 점진적으로 감소하는 세공 크기(pore size)를 지닌 막으로 이루어진 압출기를 통해 통과된다. 예로서, 압출은 세공 크기가 3 내지 7 μm, 바람직하게는 5 μm인 막을 통할 수 있다. 임의로, 혼합물은 수회, 바람직하게는 3 내지 7회, 전형적으로 5회 압출된다. 구현예에서, 혼합물은 이후에 세공 크기가 1 μm인 막으로 이루어진 압출기를 통해 통과된다. 임의로, 혼합물은 다수 회, 바람직하게는 3 내지 9회, 전형적으로 7회 압출된다.
구현예에서 혼합물은 점진적으로 감소하는 세공 크기를 지니거나 동일한 세공 크기를 갖는 막으로 이루어진 압출기를 통해 통과된다. 예로서, 압출은 세공 크기가 3 내지 10 μm, 바람직하게는 8 μm인 단일 막을 통할 수 있다. 이러한 구현예에서, 혼합물은 다수 회, 바람직하게는 3 내지 9회, 전형적으로 5 내지 7회 압출될 수 있다.
구현예에서 나노 세포 소낭 기술(nano Cell Vesicle Technology: nCVT)이 생성된다. 이러한 구현예에서, mCVT는 압출, 원심분리력, 미세-채널을 통한 통과, 동결 해동 및/또는 초음파 주기를 포함하나, 이에 한정되지 않는 방법에 의해 나노 치수로 된다. nCVT의 나타낸 크기 범위는 직경이 500 nm 미만, 일반적으로 50 nm 내지 250 nm이다. 구현예에서, nCVT는 직경이 100 내지 200 nm이다.
예로서, 압출 기술을 사용하여 제조된 mCVT는 0.5 μm의 막 세공 크기로 이루어진 추가의 압출기를 통과한다. 임의로, 혼합물은 다수 회, 바람직하게는 3 내지 9회, 전형적으로 7회 압출된다. 혼합물은 이후에 0.2 μm의 막 세공 크기로 이루어진 압출기를 통과한다. 임의로, 혼합물은 다수 회, 바람직하게는 3 내지 9회, 전형적으로 7회 압출된다. 수득되는 융합된 생물분자는 nCVT로 명명된다.
구현예에서, 유령세포 및 리포좀의 초음파처리된 혼합물의 입자 크기는 점진적으로 감소하는 세공 크기를 지닌 스핀 컵을 통한 원심분리에 의해 감소된다. 구현예에서, 혼합물은 10 μm의 막 세공 크기 여과기를 여과기가 장착된 스핀 컵에 첨가된다. 혼합물은 원심분리된다. 바람직하게는, 혼합물은 약 14,000 G 내지0 약 15,000 G의 범위의 g 힘(g force)으로 원심분리된다. 구현예에서, 유동 통과물(flow through)은 스핀 컵으로 재도입되며 상술한 과정이 반복된다. 혼합물은 이후 8 μm 막 세공 크기 여과기를 지닌 스핀 컵에 첨가된다. 혼합물은 원심분리된다. 유동 통과물은 스핀 컵으로 재도입된다. 구현예에서 상술한 과정은 반복된다. 구현예에서 유동 통과물은 이후 크기 배출 컬럼에 첨가된다. 정제된 분획을 함유하는 분획이 수집되었다.
구현예에서 소낭 구조는 미셀(micelle)이다. 미셀과의 융합은 직경이 50 nm 미만인 생물분자 복합체를 생성한다.
이론에 얽메이지는 않지만, 유령 세포 막 구성성분은 소낭 구조로부터 유래된 지질 구성성분 내에 분산된다. 유령 세포 막 구성성분은 단독으로 또는 서로 회합된, 개개 인지질 또는 당지질, 전체(integral) 또는 말초 막 단백질, 또는 단독으로 또는 서로 회합된 및 인지질 또는 당지질과 함께 회합된, 전체 또는 말초 막 단백질을 다양하게 포함할 수 있다. 예를 들면, 리포좀이 유령 세포와 융합되는 경우 이러한 유령 세포 막 구성성분의 일부 또는 모두는 리포좀으로부터 유래된 지질 이층 속에 분산된다.
본 발명은 또한:
(a) 세포에 대해 저장성인 삼투압적으로 활성인 용액 속에 생존가능한 세포의 현탁액을 제공하는 단계;
(b) 저장성 세포 현탁액을 일정 기간 동안 온화하게 교반하여 삼투압이 막을 투과될 수 있도록 하고 세포질과 핵의 내용물이 생존가능한 세포로부터 유출되도록 함으로써, 적어도 부분적으로 고갈된 세포를 생성하도록 하는 단계;
(c) 적어도 부분적으로 고갈된 세포로부터 세포질 및 핵의 내용물을 포함하는 세포 부스러기를 분리하는 단계;
(d) 필요할 경우 적어도 부분적으로 고갈된 세포가 세포질 및 핵의 내용물을 고갈시킬 때까지 단계 (b) 및 (c)를 반복하는 단계;
(e) 고갈된 세포를 등장성 매질 속에서 일정 기간 동안 현탁시켜 세포 막을 재밀봉시킴으로써 유령 세포를 생산하는 단계;
(f) 유령 세포를 단리하는 단계를 포함하는, 세포막, 세포질 및 핵을 포함하는 생존가능한 세포로부터 유령 세포를 생산하는 방법을 제공한다.
구현예에서, 목적한 세포를 항온처리하기에 적합한 삼투압적으로 활성인 용액은 포스페이트 완충된 염수(PBS), 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES) 완충제, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(TRIS) 완충제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 구현예에서, 이들은 증류수의 첨가로 저장성이 된다. 예로서, PBS는 0.5x PBS, 0.25x PBS, 0.1x PBS 및 1x PBS에 상응하는 1:2, 1:4, 1:10 및 1:0의 비까지 증류수와 혼합함으로써 등장성이 되도록 할 수 있다.
구현예에서, 생존가능한 세포는 세포에 대해 저장성인 삼투압적으로 활성인 용액 속에 침지된 후 재현탁되어 현탁액 중 생존가능한 세포를 제공한다.
구현예에서 삼투압적으로 활성인 용액은 세포의 외부 환경의 점성을 변형시켜 세포 막의 붕괴에 대하여 보호하는 세포 보호제를 추가로 포함한다. 구현예에서 세포 보호제는 삼투압적으로 활성인 당, 단백질 또는 중합체이다. 특히 당, 예컨대, 슈크로즈, 프럭토즈, 락토즈, 또는 갈락토즈, 중합체, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 또는 이의 유도체, 피콜 용액(Ficoll Solution) 또는 알부민이 사용될 수 있다. 그러나, 슈크로즈가 바람직하게 사용된다. 슈크로즈 농도의 범위는 0.01% w/v 내지 0.1% w/v일 수 있으며, 최적 농도는 0.06% w/v이다.
구현예에서, 세포는 완충제, 전형적으로 PBS 완충제, 전형적으로 0.25x PBS로 희석된 0.06% w/v 슈크로즈 용액 속에 실온에서 침지된다.
구현예에서 세포는 진탕기에 12 내지 48, 전형적으로 24 시간 동안 유지시킨다. 후속적으로, 세포를 원심분리하여 세포를 아래로 펠렛화시킨다. 슈크로즈, 부스러기 물질 및 세포내 내용물로 이루어진 상층액을 제거한다.
구현예에서, 세포를 이후 완충제, 전형적으로 PBS 완충제, 전형적으로 0.1x PBS로 희석시킨 0.06% w/v 슈크로즈 용액 속에 실온에서 침지시킨다. 세포를 진탕기에서 30분 내지 4시간, 전형적으로 1시간 동안 유지시킨다.
후속적으로, 세포를 원심분리하여 세포를 펠렛화한다. 슈크로즈, 부스러기 물질 및 세포내 내용물로 이루어진 상층액을 제거한다.
구현예에서 세포를 이후 완충제, 전형적으로 PBS 완충제, 전형적으로 0.25x PBS로 희석시킨 0.06% w/v 슈크로즈 용액 속에 실온에서 침지시킨다. 세포는 진탕기에서 12 내지 48 시간, 전형적으로 24 시간 동안 유지시킨다.
후속적으로, 세포를 원심분리하여 세포를 펠렛화한다. 슈크로즈, 부스러기 물질 및 세포내 내용물로 이루어진 상층액을 제거한다.
세포를 이후에 완충제, 전형적으로 1x PBS로 희석시킨 0.06% w/v 슈크로즈 용액 속에 실온에서 침지시킨다. 세포는 사용 전 4℃에서 최종적으로 저장하기 전에 1 내지 8 시간 동안, 전형적으로 4 시간 동안 진탕기에 유지시킨다. 최종 생성물은 유령 세포로 명명된다.
상술한 방법에 의해 생산된 유령 세포의 나타내는 수율은 40% 내지 50% 사이에 있다.
본 명세서 및 청구범위 전체에서, 단어 "포함하다(comprise, comprises)" 및 "포함하는"은 문맥이 달리 필요로 하는 경우를 제외하고는, 비-배타적인 의미로 사용된다. 이러한 방식으로 사용되는 경우, 이들은 그럼에도 불구하고 용어 "로 이루어진" 또는 "로 필수적으로 이루어진"으로 일반적으로 나타낸 배타적인 의미에서의 용도를 포함하는 것으로 인식될 것이며, 따라서 후자의 용어는 전자를 대체할 수 있다.
실시예
물질 및 방법
물질
1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP), 1-올레오일-2-[6-[(7-니트로-2-1,3-벤조-사디아졸-4-일)아미노]헥사노일]-3-트리메틸암모늄 프로판(NBD-DOTAP) 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(리싸민 로다민 B 설포닐)(리쓰 로다민(Liss Rhodamine))은 Avanti Polar Lipids로부터 구입하여 -20℃로 유지시켰다. 트리판 블루 염색 용액 및 BCA 단백질 검정은 Thermo Fisher Scientific으로부터 구입하였다. 8μm 막 여과기는 Merck Millipore로부터 구입하고 공급된 상태로 사용하였다. 시아닌 5.5 모노에스테르 염료는 Kerafast로부터 구입하여 제조업자의 추천에 따라 사용하였다.
세포 배양
섬유아세포-유사 마우스 지방선구세포인, 3T3-L1을 10% v/v 소태아 혈청(FBS, HyClone™, GE) 및 1% v/v MEM 비-필수 아미노산 용액(NEAA, Life Technologies)을 함유하는 둘베코 고 글루코즈 변형된 이글 배지(Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium)/고 글루코즈(DMEM/고 글루코즈, HyClone™, GE) 속에서 배양하였다. HEK293(사람 배아 신장 세포), RAW264.7(마우스 대식구), HaCaT(사람 각질세포) 및 HDF(사람 피부 섬유아세포)를 10% FBS가 보충된 DMEM/고 글루코즈 속에서 배양하였다. U937(종양유전자성 사람 단핵구)은 10% FBS가 보충된 RPMI-1640(HyClone™, GE) 속에서 배양하였다. 모든 세포를 습윤화된 항온처리기 속에서 5% CO2에서 유지시키고 37℃에서 유지시켰다.
실시예 1
유령 세포 생산
유령 세포 생산의 개략적인 도해를 도 1a에 나타낸다. 사람 단핵구인, U937 세포 10을 유령 세포 생산을 위한 모델로서 사용하였다. U397 세포 10을 단계 20에서 순차적으로 0.25x, 0.1x 및 0.25x PBS 중 0.06% w/v 슈크로즈 속에 밤새 진탕함으로써 적용시켜 "누출성(leaky)" 막(30)을 지닌 U937 세포를 형성시켰다. 다음에 단계 40에서, "누출성" 막(30)을 지닌 U937 세포를 1x PBS 중 0.06% w/v 슈크로즈 속에 밤새 진탕시켜 재밀봉된 U937 유령 세포(50)를 형성시켰다. 유령 세포 생산은 하기에 상세히 기술된다.
1 x 107개 내지 2 x 107개 사이의 U937 단핵구를 테이블톱 진탕기(tabletop shaker) 상에 12 웰 플레이트(12 well plate) 속에서 실온에서 0.25x PBS로 희석시킨 0.06% w/v 슈크로즈 용액 2 ml 속에 침지시켰다. 상업적으로 구입한, 프로테아제 억제제 칵테일(cocktail)을 10 μl의 비로 2 ml의 세포 현탁액에 가하였다. 세포를 진탕기 속에서 24시간 동안 유지시킨다.
후속적으로, 세포를 6000 G에서 10분 동안 4℃에서 원심분리시켜 세포를 펠렛화한다. 슈크로즈, 부스러기 물질 및 세포내 내용물로 이루어진 상층액을 제거하였다. 세포를 이후에 테이블톱 진탕기 상에서 12 웰 플레이트 속에서 실온에서 0.1x PBS로 희석시킨 0.06% w/v 슈크로즈 용액 2 ml 속에 침지시켰다. 상업적으로 시판되는 프로테아제 억제제 칵테일을 20 μl의 비로 2 ml의 세포 현탁액에 가하였다. 세포를 진탕기 상에 1시간 동안 유지시킨다.
후속적으로, 세포는 6000 G에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하여 세포를 펠렛화하였다. 슈크로즈, 부스러기 물질 및 세포내 내용물로 이루어진 상층액을 제거하였다. 이후에 세포를 테이블톱 진탕기 상에서 12웰 플레이트 속에서 실온에서 0.25x PBS로 희석시킨 0.06% w/v 슈크로즈 용액 2 ml 속에 침지시켰다. 상업적으로 구입한, 프로테아제 억제제 칵테일을 10 μl의 비로 2 ml에 가하였다. 세포를 진탕기 상에 24시간 동안 유지시켰다.
후속적으로, 세포를 6000 G에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하여 세포를 펠렛화하였다. 슈크로즈, 부스러기 물질 및 세포내 내용물로 이루어진 상층액을 제거하였다. 세포를 이후에 테이블톱 진탕기 상에서 12 웰 플레이트 속에 실온에서 1x PBS로 희석시킨 0.06% w/v 슈크로즈 용액 2 ml 속에 침지시켰다. 상업적으로 구입한 프로테아제 억제제 칵테일을 10 μl의 비로 2 ml의 세포 현탁액에 가하였다. 세포를 사용 전에 4℃에서 최종적으로 저장하기 전에 4시간 동안 진탕기 속에서 유지시켰다. 유령 세포를 40% 내지 50%의 수율로 단리하였다.
유령 세포는 추가의 사용을 위해 요구될 때까지 4℃에서 0.06% w/v 슈크로즈 1 x PBS 속에 유지시켰다.
저장성 용액은 세포 내용물을 비우기 위하여 세포 막을 확장시켜 막 내에 일시적인 개구부(opening)를 생성하는데 필요한 삼투압을 제공하였지만(도 1a), 0.06% w/v 슈크로즈 용액 속에서의 침지는 세포 파열을 방해하기에 충분한 점도를 생성한다.
실시예 2
유령 세포 비움(emptying)
세포 비움 과정은 유령 세포 생산 전에 세포 내에 CellTrackerTM 그린 CMFDA 염료를 혼입시킴으로써 설명되었다. 염료는 일단 이것이 세포막을 통과하면 막을 투과성 형태로 변환시키며, 유령세포 생산 공정에서 세포 성분이 비워진 것을 입증하기 위한 지시인자로서 사용된다.
1 x 107 개의 U937 세포를 제조업자의 추천에 따라 CellTrackerTM 그린 CMFDA 염료로 염색하였다. 염색된 세포를 유령 세포의 제조시 사용하였다. U937 세포를 70% 합치율(confluency)까지 배양하고 세포를 500 G x 10분에서 원심분리하고, 인산염 완충된 염수(PBS)로 1회 세척하고 실온에서 밤새 진탕기 상에서 0.25x PBS 중 0.06% w/v 슈크로즈 속에 현탁시켰다. 현탁액을 1% v/v 페니실린 스트렙토마이신 항생제 및 0.5% v/v 프로테아제 억제제 칵테일로 보충하였다. 세포 현탁액을 후속적으로 6000 G x 10분 에서 원심분리하고 실온에서 밤새 진탕기 상에서 1x PBS 중 0.06% w/v 슈크로즈 속에 현탁시켰다. 비교기(comparator)로서, 염색된 세포를 6000 G x 10분에서 원심분리하고 0.06% w/v 슈크로즈 1x PBS 속에 직접 현탁시키고, 0.06% 슈크로즈 w/v 0.25x PBS 속에서의 항온처리를 포함하는 단계를 제외하였다. 모든 샘플은 니콘 형광 현미경(Nikon Fluorescence Microscope)으로 영상화하고 형광 강도를 미세플레이트 판독기로 정량화(quantification)하였다.
공정이 완료된 후 세포의 각각의 그룹의 형광 강도는 도 1b에 나타낸 현미경사진에서 찾을 수 있으며 도 1c에 정량화되어 있다. 세포를 1x PBS 용액 중 0.06% w/v 슈크로즈 속에 진탕시키는 경우 유의적인 형광이 남지만, 세포를 0.25x PBS 용액 중 0.06% w/v 슈크로즈 속에 진탕시키는 경우 형광이 최소임이 데이타로부터 명백하다. 이는 세로를 0.25 x PBS 용액 속에서 교반하는 경우 세포 내용물이 비워지는 것을 명백하게 나타낸다. 세포를 1x PBS 용액 속에서 배양하였으므로, 세포 중 일부는 생존가능하지 않게 된다. 이는 PBS가 세포 배양을 위한 최적의 환경이 아니므로, 생존가능하지 않은 세포가 세포막 누출 증가를 나타내는 경향이 있으므로, 형광에 있어서의 약간의 감소가 관찰된다. 모든 샘플을 니콘 형광 현미경으로 영상화하고 형광 강도를 미세플레이트 판독기로 정량화하였다.
3개의 유령 세포 유형, 3T3-L1, U937 및 저켓 유령 세포(Jurkat ghost cell)를 상이한 처리 요법에 노출시켜 핵을 제거하고 수율 퍼센트 및 핵 제거는 도 2에 나타낸다. 50% 수율 및 99% 핵 제거는 0.25x(24 h); 0.1x(1 h); 0.25x(24h) 및 1x(24 h)의 순차적인 PBS 단계를 U937 유령 세포에서 사용한 경우 달성되었다.
유령 세포 생존능 연구
유령 세포를 트립판 블루로 염색하고 이들의 생존능을 5일의 기간에 걸쳐 U937 세포에 대해 비교하였다. 유령 세포를 이러한 실시예에서 상기와 같이 제조하고 10% FBS가 보충된 RPMI-1640 배양 배지 10 ml에 가하였다. 비교를 위해, 동일한 수의 U937 세포를 동일한 방식으로 배양하였다. 샘플을 트립판 블루 용액으로 1, 2, 3 및 5일 째에 염색함으로써 총 세포수를 계수하였다. 트립판 블루 염색의 보유는 유령 세포가 트립판 블루 염색을 펌핑할 수 없으므로 더 이상 생존가능하지 않음을 시사한다(도 1d). 또한, 배양 배지 속의 유령 세포의 총 수는 5일의 기간에 걸쳐 증가하지 않았지만, 비교시 U937 세포는 일반적이지 않은 성장율을 나타내었다.
실시예 3
mCVT의 제조(동결 해동 주기)
mCVT 생산의 개략적인 도해를 도 4에 나타낸다. 생물분자 복합체는 1 x 107개의 유령 세포를 10 mg의 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP) 지질에 첨가하여 거대 다중라멜라 리포좀(60) 속에 캡슐화된 유령 세포를 형성함으로써 생산하였다. DOTAP를 먼저 칭량하고 1ml의 클로로포름 속에 용해한 후 건조시켜 회전 증발기를 사용하는 진공 하에 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube) 속에 박 필름을 생성시켰다. 1 x 107개의 유령 세포를 박 필름에 가하고 욕 속에서 1시간 동안 초음파처리하고 혼합물을 액체 질소와 실온 사이에서 공정(70)에서 5주기까지 동안 각각 주기화함으로서 동결 해동시켰다. 수득되는 융합된 생물분자(80)를 mCVT로 특성화하고 이의 물리적 특성을 도 3에 및 도 4에 개략적으로 나타낸다. DOTAP 필름과 유령 세포의 융합 결과로서, mCVT는 각각의 동결 해동 주기로 점진적으로 더 커졌다. 예를 들면, 1 주기 후 mCVT는 평균 유체역학적 직경이 약 1 μm인 반면 5 주기 후 평균 직경이 약 4 μm이었다.
실시예 4
mCVT의 제조(압출)
생물분자 복합체는 1 x 107 개의 유령 세포를 10 mg의 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP) 지질을 첨가함으로써 생산하였다. 필요한 DOTAP를 우선 칭량하고, 1ml의 클로로포름 속에 용해하고 후속적으로 건조시켜 회전 증발기를 사용하여 진공 하에서 에펜도르프 튜브 속에 박막을 생성시켰다. 이후에, 1 x 107 개의 유령 세포를 박 필름에 가하고, 욕 속에서 1시간 동안 초음파처리하였다. 후속적으로, 혼합물을 세공 크기가 5 μm인 막으로 이루어진 압출기에 5회 통과시켰다. 크기 측정은 Malvern zetasizer™ ZS로 수행하였다. 수득되는 융합된 생물분자는 mCVT로 특성화한다. 3 및 5회 통과 후, 포켓용 압출기를 사용하여 압출로부터 제조된 mCVT의 물리적 특성화는 도 5에 나타낸다.
실시예 5
nCVT의 제조(압출)
생물분자 복합체는 1 x 107개의 유령 세포를 95:5의 몰 비의 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC) 및 콜레스테롤로 이루어진 지질 2 mg에 가함으로써 생산하였다. 지질을 우선 칭량하고, 1ml의 클로로포름 속에 용해하고 후속적으로 건조시켜 회전 증발기를 사용하여 진공하에 5 ml의 환저 플라스크 속에서 박 필름을 생성시켰다. 저켓 세포 또는 U937 세포로부터 제조된 유령 세포를 본 실시예에서 사용하였다. 1 x 107/ml의 유령 세포를 박 필름에 가하고, 1시간 동안 초음파처리된 욕 속에서 초음파처리하였다. 후속적으로, 혼합물을 세공 크기가 8 μm인 막으로 이루어진 압출기를 5회 통과시켰다. 이후에 혼합물을 세공 크기가 5 μm인 막으로 이루어진 압출기를 5회 통과시켰다. 이후에 혼합물을 막 세공 크기가 0.2 μm인 막으로 이루어진 압출기를 5회 통과시켰다. 이후에, 혼합물을 세공 크기가 0.1 μm인 막으로 이루어진 압출기를 5회 통과시켰다. 수득되는 융합된 생물분자는 nCVT로 특징화된다. 크기 데이타는 도 7에 나타낸다.
실시예 6
nCVT의 제조(스핀 컵(Spin Cup))
nCVT 유령 세포의 개략적인 도해를 도 7a에 나타낸다. 거대 다중라멜라 리포좀(90) 속에 캡슐화된 U397 유령 세포를 단계(100)에서 20분 동안 초음파처리에 적용시킨 후, 단계(110)에서 10 μm의 막 세공 크기 여과기 다음에 8 μm 막 세공 크기 여과기가 장착된 스핀 컵에 가하여 U937 유령 세포 및 리포좀으로부터의 막의 융합을 생성하는 세포 전단을 수행하여 nCVT(120)을 형성시켰다. 스핀 컵을 사용한 nCVT의 제조는 하기에 상세히 기술되어 있다.
생물분자 복합체는 1 x 107개의 유령 세포를 1.95 mg의 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC) 및 0.05 mg의 콜레스테롤(Chol)로 이루어진 지질 10 mg에 가함으로써 생산하였다. 지질을 1ml의 클로로포름 속에 용해시키고 증발시켜 지질 박 필름을 형성시켰다. 필요한 지질을 우선 칭량하고, 1ml의 클로로포름에 용해시키고 후속적으로 건조시켜 회전 증발기를 사용하여 진공 하에서 에펜도르프 튜브 속에 박 필름을 생성시켰다. 1 x 107/ml의 유령 세포를 박 필름에 가하고, 욕 속에서 20분 동안 초음파처리하였다. 후속적으로 혼합물을 10 μm의 막 세공 크기 여과기를 설치된 스핀 컵에 가하였다. 혼합물을 14,000 G에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 유동 통과물을 스핀 컵에 재도입하고 상술한 과정을 반복한다. 이후에 혼합물을 8 μm 막 세공 크기 여과기를 지닌 스핀 컵에 가하였다. 혼합물을 14,000 G에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 유동 통과물을 스핀 컵에 재도입시키고 상술한 과정을 반복한다. 유동 통과물을 이후에 Sephadex® G50 비드(bead)로 이루어진 크기 배제 컬럼에 가하였다. 정제된 분획을 함유하는 분획을 수집하였다. 크기 측정은 Malvern zetasizer™ ZS으로 수행하였다. 크기 데이타는 도 7b에 나타낸다. 융합된 생물분자는 nCVT로서 특징화된다.
실시예 7
nCVT 생산
1.95 mg의 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC) 및 0.05 mg의 콜레스테롤(Chol)을 1ml의 클로로포름 속에 용해하고 증발시켜 지질 박 필름을 형성시켰다. 형광성 표지가 필요한 경우, 시아닌 5.5 또는 시아닌 7 NHS 모노에스테르를 증발 전에 클로로포름 층 속에 용해시켰다. 1 x 107개의 유령 세포를 필름에 가하고 적어도 30분 동안 욕 초음파처리기 속에서 초음파처리하였다. 수득되는 현탁액을 10 μm 여과기 스핀 컵에 가하고 15,000 G x 10분으로 2회 원심분리한 후, 8 μm 여과기 스핀 컵에 가하고 15,000 G x 10분에서 2회 원심분리하였다. 이러한 공정은 도 7a에 나타낸다. 지질 및 유령 세포의 융합은 nCVT로서 특성화된다.
실시예 8(비교 실시예)
리포좀 생산
실시예 7과 동일한 지질 제형의 리포좀을 비교를 위해 생산하였다. 리포좀은 1.95 mg의 DPPC 및 0.05 mg의 콜레스테롤을 사용하여 로딩 및 시험관내 실험을 위해 제조하였다. 리포좀을 200 nm LipX 압출기를 사용하여 11회 압출시켰다. 생체내 실험을 위해, 2.61mg의 DPPC, 1.61 mg의 DSPE-PEG2000 및 0.78 mg의 콜레스테롤로 이루어진 페길화된(PEGylated) 리포좀을 사용하였고 200 nm LipX 압출기를 사용하여 11회 압출시켰다. 크기 데이타는 도 7c에 나타낸다.
실시예 9
nCVT 및 리포좀의 크기 분포 및 단백질 농도
시험관내 실험을 위한 실시예 7의 nCVT 및 실시예 8에서 제조한 리포의 크기(유체역학적 직경)를 동적 광 산란(Dynamic Light Scattering: DLS)에 의해 Malvern Zetasizer™ 나노시리즈(Nanoseries)를 사용하여 측정하였다. 단백질 정량화는 표준 BCA 단백질 키트로 검정하였다. 사이토킨 5.5 정량화는 미세플레이트 판독기에 의해 673/700 nm의 Ex/Em에서 검정하였다. nCVT의 크기 분포(도 7b)는 리포좀의 크기 분포와 비교가능하였으며(도 7c) 둘 다는 약 180 nm의 평균 크기를 나타내었다. 표준 단백질 BCA 키트를 사용하여 nCVT를 정량화하였다. 단백질 농도를 스핀 컵에 통과시키기 전 및 후에 검정하였으며 nCVT로부터 정량화한 평균 단백질 농도는 공정에서 최소의 손실과 함께 약 400 μg/ml이었다(도 7d).
실시예 10
융합의 증명 검정(Proof-of-Fusion Assay)
형광단 NBD 및 로다민과 접합된 지질을 리포좀 및 nCVT의 지질 성분에 가하여 리포좀과 유령 세포의 융합을 입증하였다. 원칙적으로, 460 nm에서 NBD 형광단의 여기(excitation)는 535 nm에서의 방출을 야기한다. 이는 궁극적으로 로다민 형광단을 560 nm에서 여기시켜, 585 nm에서의 방출을 야기한다. 2개의 형광단에 근접할 수록, 585 nm에서 관찰된 방출이 더 커진다.
리포좀 및 nCVT를 시험관내 실험을 위한 실시예 8 및 실시예 7에 각각 기술된 바와 같이, 1 mol%의 NBD 및 로다민 지질을 첨가하여 제조하였다. 형광단의 용량 효과를 점검하기 위해, 2mg 및 5mg의 총 지질을 리포좀 nCVT 각각의 제조에 사용하였다. 리포좀 및 nCVT 샘플을 이후에 460 nm에서 검정하고 300 nm 내지 700 nm에서 방출 스펙트럼을 미세플레이트 판독기를 사용하여 기록하였다.
리포좀의 경우에, 형광단은 서로 근접하게 위치한다(도 8a). 유령 세포가 지질과 융합되는 경우, 유령 세포 막을 형광단 사이에 삽입시켜, 이들 사이의 거리를 증가시킨다(도 8b). 그 결과, 585nm에서 관찰된 방출의 감소가 존재한다. 2 mg의 지질을 리포좀과 nCVT 둘 모두에 사용하는 경우 리포좀은 보다 높은 방출을 나타낸다(도 8c). 5 mg의 지질을 제형 속에 대신 사용하는 경우 형광성 판독에 있어서 보다 큰 차이가 관찰되었다. 585 nm에서의 방출은 nCVT보다 리포좀에 있어서 현저히 보다 큰 것으로 관찰되었다. 방출 형광성 판독이 리포좀보다 nCVT에서 더 낮다는 사실은 유령 세포 구성성분이 형광단 사이에 삽입되었음을 시사하며(도 8d), 이는 궁극적으로 유령 세포와 지질 사이의 융합이 일어났음을 입증한다.
실시예 11
알부민-FITC 로딩
모델 약물인, 알부민-FITC를 nCVT 내로 로딩하였다. 알부민-FITC는 소 분자 또는 펩타이드에 대한 대리물로서 사용될 수 있는 거대 단백질 분자이다. FITC의 접합은 로딩 효능의 정량화 시 도움을 준다.
알부민-FITC 로딩된 nCVT는 유령 세포를 6000 G x 10분에서 원심분리하고 제조된 지질 필름에 가하기 전에 1 mg/ml의 알부민-FITC 속에 현탁시킨 것을 제외하고는, 실시예 7에 기재된 바와 같이 제조하였다. 비교를 위해, 알부민-FITC 로딩된 리포좀을 유령 세포를 첨가하지 않는 것을 제외하고는 동일한 방식으로 제조하였다. 샘플 둘 다를 1 리터의 PBS에 대해 4℃에서 가라앉는 조건을 유지하기 위해 투석 유체를 1회 변화시키면서 투석하여 캡슐화되지 않은 알부민-FITC를 제거하였다. 알부민-FITC 로딩 퍼센트는 공지된 표준물에 대해 490/525 nm에서 Ex/Em를 측정함으로써 정량화하였다.
nCVT의 로딩 효능은 이러한 방법으로 로딩한 경우의 리포좀의 것과 유사하였음이 밝혀졌다(도 7e). 필름 수화 방법은 단순하면서도 복잡하지 않으며, nCVT에 로딩될 수 있는 상이한 약물 모이어티에 대해 채택할 수 있다(Akbarzadeh et al, 2013).
실시예 12
시험관내 세포 흡수
mCVT의 세포 흡수 프로파일을 공업용 시약, Lipofectamine® 3000(LF3000)의 세포 흡수 프로파일과 비교하였다. 형질감염은 5 μg의 녹색 형광성 단백질(GFP)을 암호화하는 플라스미드를 U937 유령 세포-유래된 mCVT 및 LF3000에 가함으로써 수행하였다. 혼합물을 10분 동안 정치시킨 후 3T3-L1 세포, 형질감염시키기 어려운 세포에 48시간 형질감염을 위해 첨가하였다. 살아있는 세포를 염색하는 Brightfield 및 Hoechst 33342 영상은 LF3000보다 mCVT에 의해 상당히 더 많은 살아있고 건강한 세포를 나타내었다(도 9). 형질감염의 정도(GFP)는 유사한 것으로 나타난다.
nCVT의 세포 흡수 프로파일을 리포좀의 세포 흡수 프로파일과 비교하였다. 2개의 암 세포주인, HeLa 및 CT26을 시험하였으며, 전자는 통상적으로 시험하는 암 세포주 모델이고 후자는 CT26 마우스 결장 암종 모델에서 사용될 모델이며, 종양은 마우스의 등에 피하 형성시켰다.
시아닌 5.5 NHS 모노에스테르로 표지한 nCVT 및 리포좀을 시험관내 실험을 위해 실시예 7 및 8에 기술된 바와 같이 제조하였다. 샘플을 이들의 형광성 수준에 대해 표준화하고 저 용량(1x의 표준화된 형광성 수준) 및 고 용량(5x의 표준화된 형광성 수준)으로 2x 105 HeLa 및 CT26 세포 각각에 가하고 37℃에서 2시간 동안 항온처리하였다. 이후에 샘플을 PBS로 3회 세척하고 트립신처리한 후 FACS로 BD LSR Fortessa™ 유동 세포분석 분석기를 사용하여 검정하였다.
공초점 현미경관찰 영상은 CellMask™ 오렌지 염료로 경계표시된 혈장 막내에 녹색 형광으로 나타난 바와 같이, 2시간 항온처리 후 시아닌 5.5 표지된 리포좀 및 nCVT 둘 다의 명확한 흡수를 나타내었다(도 10a-b). 보다 근접한 실험은 흡수가 세포주 둘 다에 대해 리포좀 보다 nCVT의 경우 더 컸음을 시사하였다. 이러한 실험적 관찰은 보다 큰 우측으로의 이동을 나타내는, 유동 활성화된 세포 분류(FACS)의 사용에 의해 입증되었으며, 이는 리포좀보다 nCVT에 대해 보다 큰 세포 흡수를 나타낸다(도 10c-d). 세포 흡수는 또한 보다 큰 농도(녹색 선에 의해 구별됨)의 nCVT 및 리포좀을 사용한 경우 증가하였으며, 용량 효과를 추가로 입증한다.
U937 단핵구 세포주를 염증 부위를 향한 단핵구의 고유한 표적화 특성으로 인하여 nCVT에서 사용하기 위해 선택하였다. 본 발명자들은 시조(originator) U937 세포의 막 단백질이 nCVT의 생산시 보유되었다고 가설을 세웠다. 후속적으로 본 발명자들은 nCVT가 표적 세포에 의해 인식되어 흡수될 수 있다고 가설을 세웠다. nCVT의 향상된 세포 흡수는 치료학적 용량 감소 뿐만 아니라 오프-표적 이차적인 효과에 있어서의 감소를 허용하므로 적절하며, 또한 부작용의 위험을 최소화한다. 따라서, nCVT는 낮은 약물 농도가 부작용을 최소화하고 여전히 표적 부위에서 충분히 높은 국소 농도를 달성하기 위해 요구되는 항-암 전략에서의 잠재적인 적용됨이 발견될 수 있다. nCVT의 나노 치수로 인하여, 이러한 효과는 나노입자의 EPR 효과와 nCVT의 고유한 표적화 특성 사이에서의 상승적인 상호작용으로부터 2배일 수 있다.
실시예 13
nCVT의 생체내 동시-국재화
실시예 7의 시아닌 7 NHS 모노에스테르 염료(Cy7)로 표지한 nCVT를 동일한 지질 구성의 유사하게 표지된 리포좀과 비교하였다(로딩 및 시험관내 시험을 위해 생산한 리포좀은 1.95 mg의 DPPC 및 0.05 mg의 콜레스테롤로 제조하였다. 생체내 실험을 위해 생산한 리포좀은 페길화하고, 2.61 mg의 DPPC, 1.61 mg의 DSPE-PEG2000 및 0.78 mg의 콜레스테롤을 사용하여 제조하였다.) 이후에 샘플을 종양이 마우스의 등에 피하 형성된, CT26 마우스 결장 암종 모델의 꼬리 정맥을 통해 주사하였다.
마우스 3개 그룹에게 Cy7 표지된 nCVTs, Cy7 표지된 리포좀 및 유리 염료를 주사하였다. 24시간 후, 마우스를 생체내 영상화 시스템(In Vivo Imaging Systems: IVIS) 스펙트럼을 사용하여 영상화하였다. 종양 부위에서 형광 표지된 나노입자의 선명한 축적이 nCVT 및 리포좀에 대해 관찰되지만, 유리 염료를 사용한 경우에는 그렇지 않다(도 11a). 유리 Cy7 염료는 수용성이므로, 이는 신속하게 청소되며 종양 내에 축적되지 않는다.
종양을 후속적으로 절개하여 별도로 영상화함으로써 각각의 그룹으로부터 형광 강도를 정량화하였다(도 11b). nCVT 및 리포좀 둘 다에 대한 종양에서 상대적인 형광 강도는 유리 염료의 경우 유의적으로 더 높았다. 비교시, 상대적인 형광 강도는 nCVT 및 리포좀 둘 다에 대해 유사하였다. 사용된 리포좀을 페길화하고 오래 순환시킨 경우, 결과는 nCVT가 페길화되지 않았음에도 불구하고, 생체내 시스템에서 유사하게 길게 순환하였음을 시사한다. 이러한 현상에 대한 타당한 가설은 nCVT의 생산시 사용된 유령 세포와 관련된 단백질 마커가 면역계에 의한 인식 및 페길화와 동일한 방식으로의 후속적인 제거를 지연시키는데 작용한다는 것이다. 또한, 페길화된 리포좀과 비교될 수 있는 nCVT의 연장된 생체내 순환 시간은 감소된 투여 빈도가 요구되므로 용량 절약 효과(dose sparing effect)에 기여함을 시사한다.
그룹 각각에 대한 절개된 기관에 대한 상대적인 형광 강도를 실험하였다(도 11c). 유리 염료 그룹은 청소에 관여하는 기관, 즉, 간 및 신장에 대해 감소된 형광 강도를 나타내었다. 이는 유리 염료가 24시간 내에 마우스로부터 이미 크게 제거되었음을 시사한다. 비교시, nCVT 및 리포좀 그룹은 간 및 신장에서 상승된 형광 강도를 나타내었으며, nCVT는 리포좀보다 간에서 더 많은 축적을 나타내었다. 한편, 보다 높은 형광 강도가 nCVT보다는 리포좀의 경우 신장에서 관찰되었다. 타당한 가설은 나노입자가 간에서 보다 수용성인 생성물로 대사될 수 있지만 nCVT내 유령 세포 구성성분의 존재의 결과로서 속도가 상이하다는 것이다.
실시예 14
유령 세포(CG) 생산
유령 세포를 0.1% w/v 슈크로즈(PBS/슈크로즈)가 들어있는 중성 인산염 완충제 염수(PBS, pH 7.4)를 사용하여 삼투압을 변화시킴을 통해 생산하였다. 세포를 수거하고 0.25x PBS/슈크로즈 속에서 실온에서 1일 동안 진탕기 상에서 항온처리한 후, 유령 세포를 0.1x PBS/슈크로즈 속에서 다양한 일 수 동안 항온처리하였다. 삼투압의 변화로 인한 세포 파열을 방지하기 위하여, 저장성 완충제를 점성 시약과 혼합하였으며, 이러한 시약은 과도한 세포 확장을 지연시키기 위한 점도를 제공한다. 유령 세포를 1× PBS/슈크로즈에 수거하고 추가의 실험을 위해 4℃에 저장하였다. 이러한 공정은 예로서 3T3-L1 세포를 사용하여 도 12a에 나타낸다. 요약하면, 3T3-L1 세포 (130)을 수거하고 저장성 완충제(140) 속에서 항온처리하여, 단계(150)에서 세포 막에 일시적인 세공을 생성하였다. 세포를 이후에 저장성 용액(160) 속에서 항온처리하여 유령 세포(170)를 형성시켰다.
프로테아제 억제제 칵테일(Abcam)을 실험 전체에서 제조업자의 설명서에 따라 사용하였다. 핵의 존재는 Hoechst 33342 염색으로 점검하였다. 유령 세포 속에서 나머지 DNA를 단리하고 DNA 겔 전기영동으로 점검하였다.
실시예 15
유령 세포 비-생존능 연구
실시예 14를 기반으로 제조한, 동일한 수의 3T3-L1 세포 및 유령 세포를 DMEM/고 글루코즈 완전 배양 배지 속에서 제조하였다. 샘플을 수집하고 1, 2, 3, 4 및 5일째에 트립판 블루 용액으로 염색함으로써 총 세포 또는 유령 세포 수를 계수하였다.
시험한 유령 세포는 더 이상 생존가능하지 않은 것으로 밝혀졌으며 치료 후 세포 성장을 야기하지 않는다. 유령 세포를 5일의 기간에 걸쳐 살아있는 3T3-L1 세포와 비교하고 세포 수를 플롯팅하였다(도 12b). 유령 세포가 사용 전에 더 이상 생존가능하지 않도록 보증함으로써 생존가능한 세포로부터 임의의 세포 오염을 방지하는 것이 중요하다.
실시예 16
유령 세포 비움
실시예 14를 기반으로 제조한 3T3-L1 유령 세포는 3개 실험을 통해 세포내 비움을 겪는 것으로 입증되었다:
1) 세포 및 유령 세포를 포획하고 DNA 겔 전기영동에 통과시켰다. 결과는 도 13a에 나타낸다.
2) Hoechst 33342, dsDNA 염색을 세포 및 유령 세포 둘 다에 적용시키고 형광 현미경관찰 하에서 가시화하였다. 결과는 도 13b에 나타낸다.
3) 세포 및 3T3-L1 유령 세포를 파열시키고 DNA 농도를 NanoDrop™를 사용하여 정량화하였다. U937 단핵구 유령 세포를 실시예 14를 기반으로 제조하고 시험하였다. DNA의 74.9% 및 48.5% 이상이 3T3-L1 및 U937 세포 각각으로부터 비워졌다. 결과는 도 13c에 나타낸다.
도 13a 내지 도 13c로부터 알 수 있는 바와 같이, 모든 3회의 실험에서, 유령 세포는 실질적인 세포 비움을 겪은 것으로 입증되었다.
실시예 17
mCVT의 생산 및 특성화
2.5 mg의 DOTAP를 칭량하고 5 ml의 환저 플라스크내 1 ml의 클로로포름 속에 용해시켰다. 무수 박 지질 필름을 환저 플라스크 상에서 진공 하에 35℃에서 적어도 1시간 동안 형성시켰다. 실시예 14를 기반으로 하여 제조한 유령 세포를 무수 지질 필름에 가하고 교반하였다. 혼합물을 8 μm의 막 여과기에 리포좀 압출기(Genizer™)를 사용하여 통과시켰다. 수득되는 융합된 생물분자를 mCVT로서 특성화한다.
DOTAP 리포좀을 유령 세포를 첨가하지 않고 유사한 방식으로 제조하였다. mCVT3T3-L1을 pEZX-MR04를 함유하는 플라스미드 DNA(miRNA 과발현 스크램블된 대조군 클론, GeneCopoeia)으로 Lipofectamine® 3000(LF3000, Life Technologies)을 사용하여 제조업자의 설명서에 따라 형질감염시켰다.
샘플을 크기, 다분산 지수(poly dispersity index: PDI) 및 제타 전위의 측정을 위해 취하였다. 모든 크기 및 제타 전위 측정을 25℃에서 Zetasizer™ 나노 ZS(영국 맬버른 소재)에서 동적 광 산란으로 측정하였다. 데이타는 Zetasizer™이 공급한 소프트웨어를 사용하여 분석하고 결과는 샘플당 수행된 10회 이상의 실시에 대해 1회 실시당 적어도 3회의 상이한 측정을 나타내었다. 단백질 농도를 각각의 샘플에 대해 비신초닌산(bicinchoninic acid: BCA) 검정을 사용하여 시험하였다. 상이한 mCVT(mCVT3T3-L1, mCVTU937, mCVTHEK293, mCVTRAW264.7)의 크기, DOTAP 리포좀과 비교한 플라스미드를 지닌 mCVT를 도 5a에 나타낸다.
상이한 세포주에 대한 제타 전위는 또한 양이온성 DOTAP의 존재로 인하여 유사하게 양성이었다. 비교시, mCVT3T3-L1 & DOTAP 리포좀의 크기 분포는 도 14a 및 14b에 각각 나타낸다. 강도에 의한 mCVT3T3-L1 및 DOTAP 리포좀의 Z-평균 크기 분포는 각각 도 14c 및 14d에 나타낸다.
이론에 얽메일 필요없이, 8 μm 막 여과기의 사용은 적어도 특정의 세포형의 경우 더 작은 세공 크기를 지닌 막 여과기보다 더 우수한 mCVT 재생산성 및 더 적은 단백질 응집을 제공할 수 있는 것으로 간주된다.
실시예 18
융합의 입증 검정(Proof-of-Fusion Assay)
리포좀 및 mCVT3T3-L1을 실시예 17을 기반으로 0.1 mol% NBD-DOTAP 및 리싸민 로다민 지질을 첨가하여 제조하였다. CG3T3-L1로부터 mCVT3T3-L1까지 세포 막의 혼입을 입증하기 위해, 0.5 × 107, 1 × 107 및 2 × 107개의 CG3T3-L1을 사용하여 mCVT3T3-L1을 생산하는 한편 DOTAP 지질의 양을 일정하게 유지시켰다. 리포좀 및 mCVT를 이후에 460 nm에서 미세플레이트 판독기를 사용하여 측정하고 300 nm 내지 700 nm의 방출 스펙트럼을 기록하였다.
융합을 입증하기 위해 사용된 다른 방법은 동일한 소낭 속에서 세포 막 구성성분 및 DOTAP 지질 구성성분의 존재를 검출하는 것이었다. 0.1 mol% NBD-DOTAP를 리포좀과 mCVT3T3-L1의 생산 동안 지질 구성성분에 가하였다. 시아닌 5.5 NHS 모노에스테르를 mCVT의 생산을 위해 CG의 표지를 위해 사용하였다. mCVT3T3-L1에 대한 유령 세포를 제조업자의 설명서에 따라 시아닌 5.5 NHS 모노에스테르로 표지하였다.
샘플(CG3T3-L1, DOTAP 리포좀 및 mCVTs3T3-L1)을 BD LSR Fortessa™ 유동 세포분석 분석기를 사용하여 Cy 5.5(Ex/Em: 675 nm/694 nm) 및 NBD(Ex/Em: 460 nm/535 nm) 각각에 대해 단일 색상(도 15b) 및 이중 색상 채널(도 15c)을 사용하여 분석하였다. 단지 mCVT는 2개의 형광단의 단일 집단의 존재를 입증하며, 유령 세포 막과 지질 사이의 융합을 나타낸다.
융합의 입증은 또한 실시예 10에 기술된 바와 같은 FRET 검정을 채택하여 입증하였다. 리포좀 및 mCVT3T3-L1은 실시예 17일 기반으로 리싸민 로다민(Ex/Em: 560/583) 및 NBD(Ex/Em: 465/535)와 접합된 DOTAP 지질을 첨가하여 제조하였다. DOTAP 리포좀의 후속적인 생산 시, 로다민과 NBD 형광단의 밀접한 근접성은 460 nm에서 여기하는 경우 형광성을 증가시킨다.
융합의 경우에도, 2개의 형광단은 CG 막 구성성분을 첨가함으로써 떨어뜨릴 수 있으며 형광 강도의 감소가 예측된다. 이러한 감소는 도 16a에서 찾을 수 있다. 이러한 효과는 보다 많은 CG를 사용한 경우 증가하는 것으로 관찰되었으며(mCVT 2x), 지질과 CG 막의 융합을 시사한다.
일반적으로, mCVT 제형에서 CG 농도의 증가는 약 400 nm의 최적의 유체역학적 크기가 관찰될 때까지 제조된 mCVT의 유체역학적 크기를 감소시켰다(mCVT 0.5x 내지 mCVT 1x). 이후에, mCVT의 유체역학적 크기는, 가능하게는 보다 높은 응집 경향성을 야기하는 과도한 CG로 인하여 증가하였다(도 16b). 한편, 제타 전위는 일반적으로 양이온성 DOTAP의 혼입으로 인하여 양성이었지만 더 많은 CG3T3-L1를 mCVT(2x)로 관찰된 바와 같이 사용한 경우 감소하였으며, 이는 순(net) 음성 제타 전위를 나타낸다. 이는 세포내 내용물, 예컨대, mCVT 속의 단백질성 물질이 양이온성 DOTAP 지질과 응집하여 순 제타 전위를 순 음성으로 환원시킴을 시사한다(도 16c). 이는 또한 mCVT3T3-L1(1× 세포) 속의 단백질 농도에 의해 뒷받침되며, 여기서 mCVT와 비교하여 훨씬 더 높은 단백질 농도가 CG로부터 생산되었음을 나타낸다(도 16d). 흥미롭게도, mCVT3T3-L1(2×)은 mCVT3T3-L1(1×)와 비교하여 더 높은 단백질 농도를 나타내지 않으며 여기서 더 낮은 농도의 CG가 사용되었고, 이는 mCVT(2x)로부터 관찰된 더 낮은 단백질 수율은 압출 동안 형성됨으로써 손실된 단백질 응집에 기인하였음을 시사한다. 실제로, 이러한 현상은 보다 많은 CG가 사용되는 경우 mCVT의 유체역학적 크기에 있어서의 감소에서 더 먼저 용출된 경향으로 입증되며, 이후 유체역학적 크기는 과도한 CG의 결과로서 가능한 단백질 응집으로 인하여 감소한다.
실시예 19
mCVT의 세포 흡수
실시예 8을 기반으로 제조한 형광단-표지된 DOTAP 리포좀, 실시예 14를 기반으로 제조한 3T3-L1 유령 세포(CG3T3-L1) 및 실시예 17을 기반으로 제조한 mCVT3T3-L1을 세포 흡수 실험을 위해 생산하였다. 0.1 mol% NBD-DOTAP를 DOTAP 리포좀 및 mCVT 속의 지질 성분을 표지하기 위해 사용하였다. 시아닌 5.5-표지된 CG3T3-L1을 사용하여 CG의 외부 막 층을 표지하였으며, 이는 압출에 의해 mCVT 내로 혼입시켰다. 60-70% 합치율을 지닌 3T3-L1 세포를 형광단-표지된 DOTAP 리포좀, CG3T3-L1 및 mCVT3T3-L1으로 처리하였다.
도 17a에 나타낸 바와 같이, 상이한 소낭 집단을 유동 세포분석법을 통해 분석하고 형광단으로 표지한 명백한 집단을 관찰하였으며, mCVT3T3-L1은 융합된 프로파일을 입증한다.
도 17b에 나타낸 바와 같이, 형광단-표지된 mCVT3T3-L1을 3T3-L1 세포에 가하여 세포 흡수 및 후속적인 세포내 운명을 관찰하였다. 3T3-L1 세포를 1, 3, 6, 24 및 48 시간 동안 유동 세포분석법을 통해 각각의 형광단에 대해 분석하였다. mCVT3T3-L1의 유체역학적 크기는 400 nm보다 더 컷으므로, 내부화 속도는 느린 것으로 관찰되었으며, 단지 25시간 후 내부화를 나타낸다. CG로부터의 Cy5.5 염색 및 지질 구성성분으로부터의 NBD 둘 다로부터의 형광단 판독물의 조합은 내재화를 의미하기 위해 취한다.
실시예 20
LF3000 및 mCVT를 사용한 세포의 형질감염
60 내지 70% 세포 합치율을 지닌 3T3-L1, HEK293, HaCaT 및 HDF를 형질감염을 위해 제조하였다. 세포를 pEZX-MR04(miRNA 과발현 스크램블된 대조군 클론, GeneCopoeia)을 함유하는 플라스미드 DNA로 Lipofectamine® 3000(LF3000, Life Technologies)을 사용하여 제조업자의 설명서에 따라 형질감염시켰다. 실시예 17을 기반으로 제조한 mCVT를 사용한 형질감염의 경우, 플라스미드는 mCVT와 함께 실온에서 10분 동안 항온처리한 후, 혈정 유리된 배지와 함께 표적 세포에 가하였다. 혈청 유리된 배지 속에서 6시간 동안 항온처리한 후, mCVT를 제거하고 세포를 PBS로 세정하고 배양 배지를 완전 배지로 교체하였다. CG 및 DOTAP 리포좀은 대조군으로서 사용하였다. 요오드화 프로피듐을 샘플에 가하여 세포 생존능을 측정하였다. 형질감염 효능 퍼센트 및 세포 생존능은 향상된 녹색 형광 단백질(GFP, 플라스미드의 리포터) 및 요오드화 프로피듐 각각을 BD LSR Fortessa™ 유동 세포분석 분석기를 사용하여 검출함으로써 측정하였다. 모든 형광 영상은 Olympus BX51 형광 현미경을 사용하여 취하였다.
mCVT를 일반적으로 사용된 산업 표준 형질감염 시약인, Lipofectamine® 3000(LF3000)에 대해 유동 세포분석법을 사용하여 시험하였다. 비교는 용량 의존적 방식으로 수행하였다. LF3000의 추천된 용량은 3 μl로부터 출발한다. 형질감염을 3T3-L1 지방전구세포, 형질감염시키기 어려운 세포주에서 eGFP를 암호화하는 플라스미드를 사용하여 수행하였다. 세포 배양 합치율은 50 내지 70%이었다.
도 18a에 나타낸 바와 같이, 형질감염 효능은 80 μl의 mCVT3T3-L1 또는 40 μl의 of mCVTU937을 각각 사용한 경우 대략 최대 30%인 것과 비교하여, 10 μl가 사용된 경우 LF3000에 대해 15%에서 최고이었다.
일반적으로, 형질감염 시약 농도가 증가하는 경우 세포 생존능이 감소한다. 세포 생존능 시험에 대한 결과는 도 18b에 나타낸다. 그러나, LF3000은 20 μl를 사용한 경우 세포 생존능에 있어서의 유의적인 감소를 입증하였으며, 40 μl에서의 생존능은 거의 0이었다. 이는 이러한 용량에서 낮은 형질감염 효능을 설명할 수 있다. 비교시, mCVT3T3-L1 및 mCVTU937 둘 모두는 높은 세포 생존능을 입증하였으며, 80 μl의 시약을 사용한 경우 대략 68%이었다.
통계적 분석
실시예 1 내지 13에 대한 모든 통계적 분석을 IBM SPSS 버젼 21을 사용하여 수행하였다. 실시예 14 내지 20에 대한 모든 통계적 분석은 GraphPad Prism®을 사용하여 일원 분산분석(one-way ANOVA)을 사용 한 후 본페로니 사후 시험(Bonferroni post hoc test)으로 수행하였으며, 여기서 P < 0.05는 유의적인 것으로 고려하였다. 생체내 실험의 복사 효율은 일원 분산 분석 통계 시험을 사용하고, 본페로니 사후 시험을 사용하여 비교하였다. 0.05 미만의 P 값은 유의적인 것으로 고려하였다.
참고문헌
본원에 인용된 참고문헌은 다음 페이지에 나열되어 있으며 이러한 참고문헌에 의해 본원에 포함된다.
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Claims (33)

  1. 핵 및 핵 내용물(content)을 포함하는 세포의 세포질 내용물의 모두 또는 실질적으로 모두가 비워진 유령 세포(cell ghost)를 포함하는 생물분자 복합체(biomolecular composite)로서, 상기 복합체가 6 μm 미만의 유체역학적 직경을 갖는 생물분자 복합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 복합체가 약 5 μm 내지 약 50 nm의 범위에서 선택된 유체역학적 직경을 갖는 생물분자 복합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 유령 세포가 단핵구, 대식구, T 세포, B 세포, 천연 킬러 세포, 줄기 세포, 유핵 적혈구 세포(nucleated red blood cell), 지방 세포, 포말 세포(foam cell) 및 종양 세포를 포함하는 그룹으로부터 선택된 세포로부터 유래된 생물분자 복합체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 유령 세포가 RAW264.7(마우스 대식구), HaCaT(사람 각질세포), HDF(사람 피부 섬유아세포), U937(사람 단핵구), 저켓(Jurkat)(사람 T 세포), CT26(마우스 결장 암종), HeLa(사람 자궁경부 암), HEK293(사람 신장 상피), 3T3-L1(마우스 지방선구세포) 및 HMSC(사람 간엽 줄기 세포)를 포함하는 그룹으로부터 선택된 세포주로부터 유래된 생물분자 복합체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유령 세포가 목적한 세포 또는 조직에 대해 복합체를 표적화시키기에 적합한 리간드를 포함하는 생물분자 복합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 유령 세포를 외인성 양친매성 분자, 예컨대, 지질 및/또는 소낭 구조와 융합시킴으로써 상기 복합체내로 혼입된 지질을 추가로 포함하는 생물분자 복합체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 및/또는 소낭 구조가 인지질, 스핑고지질, 세라미드 및 당스핑고지질(glycosphingolipid), 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물을 포함하는 생물분자 복합체.
  8. 제7항에 있어서, 소낭 구조가 리포좀 또는 미셀(micelle)인 생물분자 복합체.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 및/또는 소낭 구조가 적어도 하나의 융합생성 지질 및/또는 적어도 하나의 융합생성 펩타이드, 예컨대, 센다이 바이러스(Sendai virus) 융합 단백질을 포함하는 생물분자 복합체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 또는 각각의 융합생성 지질이 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄프로판(DOTAP), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), L-α-포스파티딜콜린(HSPC), (N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸아민)(DOTMA) 및 (디메틸-디옥타데실-암모늄-브로마이드(DDAB), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 디스테아로포스포에탄올아민 폴리에틸렌글리콜 2000(DSPE-PEG2000), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌 글리콜)-2000](DSPE-PEG2000 아민) 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[바이오티닐(폴리에틸렌글리콜)-2000](DSPE-PEG2000 바이오틴), 또는 이의 조합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 생물분자 복합체.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 소낭 구조가 포화된 글리세라이드, 스테로이드, 합성 인지질, 트리글리세라이드, 왁스, 테르펜, 비타민, 개질된 지질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물을 추가로 포함하며, 여기서 개질된 지질이 바이오틴, 아비딘, 스트렙타비딘, 아지드 그룹, 알킨 그룹, 폴리에틸렌 글리콜 쇄, 폴레이트, 다른 세포형으로부터의 다른 세포 막의 단편, 펩타이드, 효소, 유전 물질, 표지된 지질을 포함하고, 여기서 표지된 지질은 형광성 표지, 발광성 표지, 생물발광성 표지, 화학발광성 표지 또는 방사활성 표지, 또는 이의 조합물을 포함하는 생물분자 복합체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 생물분자 복합체가 적하 분자(cargo molecule)를 추가로 포함하는 생물분자 복합체.
  13. 제12항에 있어서, 적하 분자가 영상화제, 형질감염 시약 및 치료제 중 하나 이상인 생물분자 복합체.
  14. 제13항에 있어서, 치료제가 진통제, 마취제, 흥분제, 코르티코스테로이드, 항콜린성 제제, 항콜린에스테라제, 항경련제, 화학치료제, 알로스테릭 억제제, 단백동화 스테로이드(anabolic steroid), 항류마티스제, 정신치료제, 신경 차단제, 소염제, 구충제, 항생제, 항응고제, 항진균제, 항히스타민제, 항무스카린제, 항마이코박테리아제, 항원생생물제, 항바이러스제, 도파민작용제(dopaminergics), 혈액학적 제제, 면역학적 제제, 무스카린제(muscarinics), 프로테아제 억제제, 비타민, 성장 인자, 및 호르몬으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 생물분자 복합체.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 영상화제가 방사활성 동위원소, 산화철 나노입자, 금 나노입자, 형광성 염료 및 근적외선 염료로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 생물분자 복합체.
  16. 제12항에 따른 생물분자 복합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 적하 분자가 치료제인 약제학적 조성물.
  17. (A) (i) 제12항에 따른 생물분자 복합체로서, 상기 적하 분자는 치료제, 또는 제16항에 따른 약제학적 조성물인 생물분자 복합체 및 (ii) 사용을 위한 설명서; 또는
    (B) (i) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 생물분자 복합체 및 (ii) 적하 분자 및 (iii) 사용을 위한 설명서; 또는
    (C) (i) 유령 세포, (ii) 지질 및/또는 소낭 구조 또는 이의 구성성분, (iii) 적하 분자 및 (iv) 사용을 위한 설명서를 포함하는 키트(kit).
  18. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 생물분자 복합체의 유효량을 질환 또는 상태의 치료가 필요한 환자에게 투여함을 포함하는, 상기 환자에서의 질환 또는 상태의 치료 방법으로서, 상기 적하 분자가 상기 질환 또는 상태의 치료를 위한 치료제인 방법.
  19. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적하 분자가 치료요법에서 사용하기 위한 치료제인 생물분자 복합체.
  20. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 생물분자 복합체의 용도로서, 상기 적하 분자가 치료요법에서 사용하기 위한 의약의 제조시, 치료제인 용도.
  21. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적하 분자가, 치료요법에서 사용된 경우, 치료제인 생물분자 복합체.
  22. 대상체에게 제12항에 따른 생물분자 복합체를 투여함을 포함하는, 대상체에서의 질환의 진단 방법으로서, 상기 적하 분자가 영상화제인 방법.
  23. 단리된 세포를 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 생물분자 복합체와 접촉시킴을 포함하여, 외인성 물질을 단리된 세포 내로 도입시키는 방법.
  24. (a) 적어도 하나의 세포를 제공하는 단계;
    (b) 세포를 당해 세포에 대해 저장성(hypotonic)인 삼투적으로 활성인 용액에 노출시킴으로써 핵 및 핵 내용물을 포함하는 세포의 세포질 내용물의 모두 또는 실질적으로 모두를 제거하는 단계;
    (c) 저장성 용액 속에 세포를 재밀봉(resealing)시켜 유령 세포를 형성시키는 단계;
    (d) 6 μm 미만 내지 약 50 nm의 범위의 유체역학적 직경까지 크기를 감소시키는 조건 하에서, 상기 유령 세포를 전단(shearing)시키거나, 유령 세포를 압출시키거나, 유령 세포를 동결 해동 및 초음파처리함으로써 생물분자 복합체를 형성시키는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 생물분자 복합체의 제조 방법.
  25. 제24항에 있어서, 생물분자 복합체가 상기 복합체 내로 혼입된 지질을 추가로 포함하는, 생물분자 복합체의 제조 방법으로서, 상기 방법이:
    (a) 제24항의 단계 (c)로부터 적어도 하나의 유령 세포를 제공하는 단계;
    (b) 적어도 하나의 유령 세포를 지질 및/또는 소낭 구조와 접촉시키는 단계; 및
    (c) 6 μm 미만 내지 약 50 nm의 유체역학적 직경까지 크기를 감소시키는 조건 하에서 유령 세포, 지질 및/또는 소낭 구조를 함께 전단시키거나, 압출시키거나, 또는 동결 해동 및 초음파처리시킴으로써 지질 및/또는 소낭 구조를 유령 세포와 융합시키는 단계를 포함하는 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 재밀봉 또는 융합이 1x PBS 중 0.06% w/v 슈크로즈에서와 같은 등장성 매질 속에서 수행되는, 생물분자 복합체의 제조 방법.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 및/또는 혈관 구조가 표지 또는 태그(tag)를 포함하는, 생물분자 복합체의 제조 방법.
  28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유령 세포 및/또는 상기 소낭 구조가 적하 분자를 함유하는, 생물분자 복합체의 제조 방법.
  29. 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전단 또는 융합이 압출, 막 세공(membrane pore)을 통한 통과, 동결 해동 및 초음파 주기를 포함하는 그룹으로부터 선택된 기술을 사용하여 실시되는, 생물분자 복합체의 제조 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 막 세공을 통한 통과가 일련의 10 μm 및 8 μm 막 여과기를 통한 통과를 포함하는, 생물분자 복합체의 제조 방법.
  31. 제29항에 있어서, 상기 막 세공을 통한 통과가 세공 크기가 3 내지 10 μm, 예컨대, 8 μm인 막 여과기를 통한 통과를 포함하며, 임의로 여기서 통과가 1 내지 9회, 예컨대, 3 내지 8회, 예컨대, 5 내지 7회 일어나는, 생물분자 복합체의 제조 방법.
  32. 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 리포좀 내부의 상기 적어도 하나의 유령 세포의 캡슐화(encapsulation)를 포함하는, 생물분자 복합체의 제조 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 적어도 하나의 유령 세포의 캡슐화가 지질 박 필름 수화(lipid thin film hydration)에 의해 시행되는, 생물분자 복합체의 제조 방법.
    [청구항 33]
    (a) 세포에 대해 저장성인 삼투압적으로 활성인 용액 속에서 생존가능한 세포의 현탁액을 제공하는 단계;
    (b) 저장성 세포 현탁액을 일정 기간 동안 온화하게 교반함으로써 삼투압이 막 투과성으로 되고 세포질 및 핵의 내용물이 생존가능한 세포로부터 누출되도록 함으로써, 적어도 부분적으로 고갈된 세포를 생성하는 단계;
    (c) 적어도 부분적으로 고갈된 세포로부터 세포질 및 핵의 내용물을 포함하는 세포 부스러기를 분리하는 단계;
    (d) 필요한 경우, 적어도 부분적으로 고갈된 세포가 세포질 및 핵의 내용물을 고갈시킬 때까지 단계 (b) 및 (c)를 반복하는 단계;
    (e) 고갈된 세포를 등장성 매질 속에 일정 기간 동안 현탁시킴으로써 세포막을 재밀봉시켜 유령 세포를 생산하는 단계;
    (f) 유령 세포를 단리하는 단계를 포함하는, 생존가능한 세포로부터 유령 세포를 생산하는 방법.
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