KR102396026B1 - 하이브리도좀, 이를 포함하는 조성물, 이의 제조 방법 및 이의 용도 - Google Patents

하이브리도좀, 이를 포함하는 조성물, 이의 제조 방법 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하나 이상의 생체적합성 전달 모듈 (BDM) 및 하나 이상의 가변 융합유도 모이어티를 포함하는 하나 이상의 가공된 약물 봉입 모듈 (EDEM)로부터 유래한 구조적 생물활성 구성성분들을 포함하는 하이브리드 생체적합성 담체 (하이브리도좀)를 제공한다. 본 발명은 상기 하이브리도좀을 포함하는 제약상 조성물, 이의 제조 방법, 뿐만 아니라 이에 기초한 제약상 용도 및 제약상의 방법들을 추가로 제공한다.

Description

하이브리도좀, 이를 포함하는 조성물, 이의 제조 방법 및 이의 용도 {HYBRIDOSOMES, COMPOSITIONS COMPRISING THE SAME, PROCESSES FOR THEIR PRODUCTION AND USES THEREOF}
발명의 분야
본 발명은 치료적, 예방적, 영상화, 및 진단적 적용을 위한 제약상 생체적합성 담체 및 활성제들의 표적화 전달 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 자연적으로 분비되는 생체적합성 전달 모듈 (BDM) 및 가공된 약물 봉입 모듈 (EDEM)의 제어된 일체화(unification)로부터 생성되는 생체적합성 하이브리드 담체에 관한 것이다.
발명의 배경
현대의 약물 치료 접근법들은 주로 새로운 치료 분자들의 개발 뿐만 아니라 병용 치료 일정의 진보에 기반한다. 그러나, 이러한 접근법들의 임상적 효능은 본질적으로 의도한 작용 부위에서의 제한된 농도 및 광범위한 전체적 생체-분포로부터 우연히 발생하는 물리-화학, 약리역학 및 교차-반응성 특성에 의해 제한된다.
이러한 과제를 해결하고자 하는 노력에 있어서, 최근 떠오르고 있는 나노기술에 대한 지식은 건강하지 않은 기관, 조직 및/또는 세포들로의 약물 분자들의 전달을 가능하게 하고 있다. 가장 진보된 나노기술에 영향을 받은 약물 전달 플랫폼들은 합성 지질계 담체 시스템에 치료적 활성 분자들을 포집하는 것에 주안점을 두고 있다. 봉입은 생체내 환경으로부터 약물을 고립시켜, 이로써 제한된 용해도, 혈청 안정성, 순환 반감기 및 생체분포를 비롯한 약물의 비-이상적 물성들을 극복하는 것을 용이하게 한다.
비-독성 구성성분들로 구성되고 표적 세포들에 의해 특이적으로 유입되는 이상적인 합성 나노담체는 현재까지 찾아보기 힘들다. 그러므로, 이러한 시스템들은 나노기술이 제공할 수 있는 잠재성을 최대한 이용하고 있지 않다. 어떻게 분자들을 그대로 전달하는가에 대한 통찰은 생체적합성인 약물 전달 운반체에 대한 청사진을 제공할 수 있다.
세포들이 가용성 인자들의 분비를 통해 또는 직접적인 상호작용에 의해 정보를 교환함은 공지이다. 최근의 연구들은 세포들이 인근 및 원거리 세포들 모두에 영향을 미치는 막-유래 소포들도 방출한다는 결론에 이르렀다(Marcus & Leonard, 2013). 이러한 세포외 소포들은 대부분의 세포들에 의해 분비되며, 대부분의 생물학적 체액들의 생리학적 구성성분들이다 (Vlassov, Magdaleno, Setterquist, & Conrad, 2012). 세포외 소포들은 아형 세포고사체, 미세소포, 및 엑소좀을 포함한다 (EL Andaloussi, Mㅴger, Breakefield, & Wood, 2013)
어떻게 세포외 소포들이 세포간 신호전달의 매개체로서 작용할 수 있는지에 대한 연구가 아직은 초기 단계에 있지만, "공여체" 세포들로부터 "수용체" 세포들로의 생물작용성 카고(cargo)를 전달함에 있어서 세포외 소포들의 본질적인 역할을 연구하는 것은 최적의 약물 전달의 복잡성을 통찰하게 하는 것이다. 다양한 연구들은 세포외 소포들이 치료적 담체로서 기능할 수 있는지에 있어 몇가지 조건들을 밝혀 내었다. 이들 담체들이 합성 약물 담체보다 제약상으로 우위에 있게 하는 뚜렷한 특징들을 가진다는 증거가 늘어나고 있다. 이러한 우수성 중 특히 중요한 것은 세포외 소포의 표면 조성에 집약되는 막 단백질 및 별도의 지질의 수집이다.
효율적인 약물 전달 시스템을 위해 천연의 담체를 이용하는 것 또는 모방하는 것을 저해하는 몇가지 장애물들이 존재한다. 가장 뚜렷하게는, 메시지 운반자로부터 약물 담체로 세포외 소포들이 변형되려면 "공여체" 세포에 대해 외인성인 치료적 또는 진단적 분자들이 도입될 필요가 있다. 현재까지 제시된 각각의 가공 방법들에는 "공여체" 세포들에 대한 생명공학적 절차들 (즉, 유전자 조작, 바이러스성 형질주입, 독성 양이온성 리포펙션 등)의 이용 뿐만 아니라 단리된 소포들에 적용되는 격렬하거나 유해한 조작 기전 (즉, 전기천공법, 공액 화학 등)의 이용이 포함된다. 이러한 방법들은 궁극적으로 안정성 뿐만 아니라 확장성 문제들을 유발하며, 진료에의 응용을 어렵게 한다. 여전히 해결되어야 할 필요가 있는 그 외 다른 중요한 문제들은 담체의 구조적 통합(integrity)에 대한 제어, 활성 카고(cargo)의 효율적인 봉입 및 추가적인 표적 모이어티의 혼입을 포함한다.
이상적으로, 온전한 세포외 소포 막들이 개발되는 경우 수많은 생물활성 막 성분들을 합성 나노담체 내부로 혼입시키는 것을 필요로하는 복잡한 생체모방적 기능화 접근법들을 사용하지 않을 수 있을 것이다. 역으로, 생명공학적 프로토콜의 비참한 결과를 극복하기 위하여, 세포외 소포에 대해 외인성인 성분들을 치료적으로 도입하는 것 뿐만 아니라 표적화하는 전략은 바람직하게는 세포 조작과 독립적이어야 한다. 이러한 전제들에 기초할 때, 생명공학적 기술들을 현대의 나노-특이적인(nano-particular) 약물 전달 시스템에서 이용되는 나노기술 전략들로 대체하는 것이 유리할 수 있다.
상기 언급한 결점들을 고려하여, 선행 기술 담체의 결점들은 없는 반면 생체외 생성된 합성 나노담체 및 생체내 발생하는 세포외 소포들의 이점들을 극대화시킨 매우 두드러진 특성을 가진 신규한 제약상 담체를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
상기 신규한 제약상 담체를 포함하는 제약상 조성물을 제공하는 것이 본 발명의 또다른 목적이다.
질병 또는 병태의 치료, 모니터링, 예방, 병기결정(staging) 및/또는 진단을 위한, 상기 신규한 제약상 담체에 기초한 용도 및 방법들 또는 신규한 제약상 담체를 포함하는 약제를 제공하는 것이 본 발명의 또다른 목적이다.
자극-반응성 모듈을 수반하는 제어가능한 방식으로 상기 신규한 제약상 담체를 제조하는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 또다른 목적이다.
하나 또는 그 이상의 생물활성제들을 세포들로, 보다 구체적으로는 백혈구, 신경아교세포 및 줄기 세포로부터 선택된 세포로 전달하는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 또다른 목적이다.
자극-반응성 모듈을 수반하는 제어가능한 방식으로 상기 제약상 담체를 제조하는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 또다른 목적이다.
본 발명의 또다른 목적들 및 이점들은 하기 상세한 설명에서 언급될 것이다.
발명의 요약
본 발명은 하나 이상의 생체적합성 전달 모듈 (BDM) 및 하나 이상의 가변 융합유도 모이어티를 포함하는 하나 이상의 가공된 약물 봉입 모듈 (EDEM)로부터 유래한 구조적 생물활성 구성성분들을 포함하는 하이브리드 생체적합성 담체 (하이브리도좀)를 제공한다.
본 발명은 상기 정의된 하이브리도좀 및 하나 이상의 제약상 허용가능한 담체, 보조제 또는 부형제를 포함하는 제약상 조성물을 추가로 제공한다.
본 발명은 또한 하나 이상의 생체적합성 전달 모듈 (BDM) 및 하나 이상의 가변 융합유도 모이어티를 포함하는 하나 이상의 가공된 약물 봉입 모듈 (EDEM)로부터 유래한 구조적 생물활성 구성성분들을 포함하는 하이브리드 생체적합성 담체 (하이브리도좀)의 제조 방법을 추가로 제공하는데, 상기 방법은 다음을 포함한다:
(a) 하나 이상의 융합유도 모이어티를 보유하는 하나 이상의 EDEM 또는 이를 포함하는 조성물을 제공하는 단계;
(b) 하나 이상의 BDM 또는 이를 포함하는 조성물을 제공하는 단계;
(c) 상기 하나 이상의 EDEM을 상기 하나 이상의 BDM과 7.4 미만의 pH 및 0℃ 내지 60℃의 온도에서 접촉시켜, 상기 하나 이상의 EDEM을 상기 하나 이상의 BDM과 일체화시키고 하이브리도좀을 생성하는 단계; 그리고 선택적으로
(d) 상기 하이브리도좀을 비-융합 EDEM 및/또는 BDM들로부터 정제하는 단계.
본 발명은 또한 하나 또는 그 이상의 생물활성제들을 백혈구로 전달하는 방법을 추가로 제공하는데, 상기 방법은 상기 하나 또는 그 이상의 생물활성제들을 포함하는 하이브리도좀을 포함하는 조성물을 상기 백혈구를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 하이브리도좀은 하나 이상의 가변 융합유도 모이어티를 포함하는 하나 이상의 EDEM을 하나 이상의 백혈구-유래 BDM과 융합하여 생성된다.
본 발명은 또한 하나 또는 그 이상의 생물활성제들을 신경아교세포로 전달하는 방법을 추가로 제공하는데, 상기 방법은 상기 하나 또는 그 이상의 생물활성제들을 포함하는 하이브리도좀을 포함하는 조성물을 상기 신경아교세포를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 하이브리도좀은 하나 이상의 가변 융합유도 모이어티를 포함하는 하나 이상의 EDEM을 하나 이상의 신경아교세포-유래 BDM과 융합하여 생성된다.
본 발명은 또한 하나 또는 그 이상의 생물활성제들을 생체외 팽창동안 세포로 전달하는 방법을 추가로 제공하는데, 상기 방법은 상기 하나 또는 그 이상의 생물활성제들을 포함하는 하이브리도좀을 포함하는 조성물을 상기 세포를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 하이브리도좀은 하나 이상의 가변 융합유도 모이어티를 포함하는 하나 이상의 EDEM을 상기 세포로부터 유래된 하나 이상의 BDM과 융합하여 생성된다.
상세한 설명
제 1 양상에서 본 발명은 하나 이상의 생체적합성 전달 모듈 (BDM) 및 하나 이상의 가변 융합유도 모이어티를 포함하는 하나 이상의 가공된 약물 봉입 모듈 (EDEM)로부터 유래한 구조적 생물활성 구성성분들을 포함하는 하이브리드 생체적합성 담체 (하이브리도좀)를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "하이브리드 생체적합성 담체" 또는 "하이브리도좀"은 하나 이상의 생체적합성 전달 모듈 (BDM) (예컨대, 엑소좀, 미세소포, 세포고사체)로부터 유래한 구조적 생물활성 구성성분들 (예컨대, 지질, 탄수화물, 지방산, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드) 및 가변 융합유도 모이어티를 포함하는 하나 이상의 가공된 약물 봉입 모듈 (EDEM)을 포함하는 하이브리드 생체적합성 담체를 의미한다. 특정 구체예에서, 하이브리도좀의 내부 부피는 생체내 분비된 BDM으로부터 유래한 하나 이상의 생물활성제들 (예컨대, 내인성 폴리뉴클레오티드, 효소들 또는 폴리펩티드) 및 시험관내 제조된 EDEM에 봉입된 하나 이상의 생물활성제를 함유한다. 또다른 구체예에서, 하이브리도좀 만의 내부 부피는 BDM으로부터 유래한 천연 성분들을 포함하며 추가 처리될 수 있다. 본 발명의 하이브리도좀은 하나의 BDM을 하나의 EDEM과, 여러개의 BDM을 하나의 EDEM과, 여러개의 EDEM을 하나의 BDM과, 또는 여러개의 BDM을 여러개의 EDEM과 일체화시켜 생성된다. 일체화 사건은 BDM 및 EDEM의 크기, 이들 각각의 전하, 및 일체화 반응동안 적용되는 조건들, 가령, BDM/EDEM 비율, pH, 온도 및 반응 시간을 통해 제어될 수 있다. 별도의 단위체들로부터 신규한 조성물을 조합하기 위한 이러한 모듈화 전략은 새로운 수준의 공학적 유연성을 제공할 수 있다. 메신저(messenger) 및 치료적 성분들의 이러한 일체화는 생성되는 하이브리드 담체에 단일 시스템에 의해 달리 얻을 수 없는 독특한 특성을 부여할 수 있었다.
본 명세서에서 사용되는, "생체적합성 전달 모듈 (BDM)"은 지질 이중층을 포함하는 자연적으로 분비되는 소포를 의미하는데, 이는 생체내 생성되어 세포외 환경으로 방출된다. BDM은 상피 세포, 종양 세포 및 그 외 면역 세포 (예컨대, 비만 세포, T 및 B 림프구, 수지상 세포)를 포함한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 다양한 유형의 세포들에 의해 분비된다. 본 발명에서 사용되는 BDM은 개체, 바람직하게는 인간 개체로부터 취한 생리학적 체액 또는 조직 샘플으로부터 분리되거나, 배지로부터 분리된다. 한 특정 구체예에서, 본 발명에서 사용되는 BDM은 세포 배양으로부터 얻는데, 여기서 세포들은 천연이거나 사전에 불멸화되거나 및/또는 가공되어 있다. 세포 배양은 균질 (한가지 유형의 세포들) 또는 비균질 (여러가지 유형의 세포들)일 수 있으며, 분리된 세포들 및/또는 조직으로 구성될 수 있다. BDM은 원핵생물, 진핵생물, 세균, 균류, 효모, 무척추동물, 척추동물, 파충류, 어류, 곤충, 식물 및 동물을 포함한 유기체로부터 분리되거나 유래될 수 있다. 배양된 세포들로부터 취한 배지 ("조건화 배지", 세포 배지, 또는 세포 배양 배지) 는 생물학적 체액일 수 있다.
BDM은 당업자에게 공지된 방법들을 이용하여 수집되거나 분리될 수 있다. 예를 들어, BDM은 분별 초원심분리, 구배 초원심분리, 여과, 접선 유동 여과 (TFF), 저압 트랙-에칭(track-etched) 막 여과 및 이들의 조합으로 이루어진 군 (그러나 이에 제한되는 것은 아님)으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 기술들에 의해 세포 배양 또는 조직 상청액으로부터 수집될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명에서 사용되는 BDM은 배양 상청액을 원심분리하여 원치않는 세포 조직파편을 펠릿화한 후, 초원심분리하여 엑소좀을 펠릿화하거나, 밀도 구배 초원심분리 (예를 들어, 당 구배에 따라) 또는 이러한 방법들의 조합에 의해 준비된다.
본 발명에 유용한 BDM은 약 30 nm 내지 약 2000nm 크기 범위이며 생물학적 활성 분자들 (예컨대, 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드)을 함유할 수 있다. BDM의 예에는 "엑소좀" (약 30 nm 내지 약 200 nm 직경), "미세소포" (약 100 nm 내지 약 2000 nm 직경), 및 "세포고사체" (약 300 nm 내지 약 2000 nm 직경)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 용어 BDM은 "엑소좀", "미세소포" 또는 "세포고사체", "막 입자", "막 소포", "엑소좀-유사 소포", "엑토좀-유사 소포", "엑토좀" 또는 "외부소포"와 호환적으로 사용된다. BDM 지질 이중층은 공여체 세포의 막으로부터 유래된다. 상이한 세포 유형들로부터 유래한 BDM은 형질 막과 비교할 때 지질 조성에 있어 차이를 보일 수 있다. 엑소좀의 발생 동안, 막관통 및 외재성 막 단백질은 소포 막에 포매될 수 있으며, 동시에, 세포액 성분들 또한 상기 소포로 혼입될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "내인성"은 세포에 의해 자연적으로 생성되는 그리고 세포로부터 자연적으로 유래되는 화합물을 의미한다. 예를 들어, BDM이 유래되는 세포 내부에서 폴리펩티드가 생성되었을 경우 BDM은 내인성 폴리펩티드를 함유한다.
본 명세서에서 사용되는, 담체, 입자, 소포 또는 분자에 대해 사용될 때의 용어 "자연적으로 분비되는"은 자연적으로 발견되는 과정에 의해 세포, 유기체 또는 조직으로부터 환경에 방출되는 담체, 입자, 소포 또는 분자를 의미한다. 예를 들어, 실험실에서 인간에 의해 원료로부터 분리될 수 있으며 원료 범위에 속하는 것으로부터 물리적으로 전위되지 않은 엑소좀은 자연적으로 분비되는 것이다. 자연에서 입자들을 분비하는 절차들에 관한 또다른 비-제한적 예는 세포막과 세포내 소기관의 융합 또는 세포막의 기포형성이다.
본 명세서에서 사용되는, "가공된 약물 봉입 모듈 (EDEM)"은 시험관내 생성된 하나 또는 그 이상의 막을 포함하는 소포를 의미한다. 본 발명에 유용한 EDEM은 지질계 나노입자 (LNPs), 리포좀, 폴리머-안정화 LNP, 세라좀, 스핑고솜, 니오좀, 폴리머솜, 합성-나노입자 안정화 LNP, 코어-쉘 지질-폴리머 하이브리드 나노입자, 천연 막-유래 LNP, 신속 제거형 지질 나노입자 (reLNPs) 및 천연 막-코팅 LNP로부터 선택되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 사용되는 EDEM은 BDM과의 제어된 일체화를 가능하게 하는 하나 이상의 구조적 성질을 보유한다. 한 구체예에서, 상기 구조적 성질은 EDEM의 지질 이중층(들) 중 하나 또는 그 이상의 구성성분들에 의해 제공된다. 한 특정 구체예에서, 본 발명에서 사용되는 EDEM은 이온성-LNP (iLNP)이다.
본 발명에서 사용되는 EDEM은 다양한 형태를 가질 수 있다. 이들은 하나의 지질 이중층 (단층 소포), 좁은 수성 구획들에 의해 분리된 일련의 동심형 이중층 (다층 소포 또는 MLV) 또는 막 형성 폴리머들을 포함할 수 있다. 더욱이, BDM와 역으로, EDEM은 크기 및 밀도 분포가 실질적으로 균질하다. 본 명세서에서 사용되는 EDEM은 약 15 내지 약 500 nm의 직경 (평균 입자 직경)을 가진다. 일부 구체예에서, EDEM은 약 300 nm 또는 그 미만, 250 nm 또는 그 미만, 200 nm 또는 그 미만, 150 nm 또는 그 미만, 100 nm 또는 그 미만, 또는 50 nm 또는 그 미만의 직경을 가진다. 한 특정 구체예에서, 본 발명에서 사용되는 EDEM은 약 15 내지 약 150 nm의 직경을 가진다.
본 발명에서 유용한 EDEM은 특이적인 물리화학적 특성들을 보여주기 위하여 제조된다. 각각의 특정 EDEM의 물리화학적 특성들은 그 내부에 포획된 활성제(들)의 성질 및 농도, 폴리머 막 또는 지질 이중층(들)의 막 조성, EDEM이 분산되어 있는 배지의 성질, 이들의 크기 및 다분산도에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 한 특정 구체예에서, EDEM은 이온화가능한 양이온성 지질 및 헬퍼 지질을 포함하는 지질 이중층 막을 포함한다. 일부 특정 구체예들에서, 본 발명의 하이브리도좀을 생성하기 위하여 사용되는 EDEM은 DlinDMA:Chol:DSPC:PEG-Cer의 몰비 (40:40:17.5:2.5 몰비)에 기초하여 제조된다.
EDEM의 제조는 예를 들어 하기 문헌들에 개시된 바와 같이 당업계에 공지된 다양한 방식을 통해 실시될 수 있다. 이러한 방식들에는, 예를 들어, 음파파쇄, 압출, 고압/균질화, 미세유동화, 세척제 투석법, 소형 리포좀의 칼슘-유도 융합법 및 지질 막 수화법들이 포함된다. 예를 들어, LNP는 예전에 기술되었던 예비성형 소포법(preformed vesicle method) (Maurer 외., 2001)을 이용하여 제조될 수 있다. 전형적으로, 상기 방법은 소형 공극의 폴리카보네이트 막을 통해 LNP를 압출하여, LNP 크기를 결정된 크기 분포로 감소시키고, 이후 단계에서, 필요한 경우, 치료제들을 예비성형 소포들에 부하하는 단계로 구성된다. 대안적으로, EDEMS은 미세유체 시스템에서 자발적 자기-조립을 통해 제조될 수 있다. 상기 제조 기술들을 이용하여 명확한 크기 분포를 제조하기 위한 프로토콜들은 당업계게 공지이다 (Belliveau 외., 2012). 바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 EDEM은 BDM 및 하이브리도좀의 부분 모집단으로부터의 분리를 용이하게 하기 위해 크기 및 밀도 분포에 있어 실질적으로 균질하다. 상기 분리는 당업계에 공지된 기술들, 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피 및 밀도 구배 원심분리를 이용하여 이루어진다. 한 특정 구체예에서, EDEM의 밀도는 하이브리도좀의 밀도보다 낮아서, 수크로스 밀도 구배 원심분리를 통해 EDEM로부터 하이브리드 소포들을 분리하기 용이하다.
본 명세서에서 사용되는, "융합유도 모이어티"는 EDEM 또는 하이브리도좀의 융합유도 지질들 또는 임의의 다른 융합유도 성분들을 의미한다. 이러한 융합유도 모이어티는 막의 파괴, 또는 막과 지질 이중층 사이의 지질 혼합을 향상시키거나 가능하게 한다. 예를 들어, 제 1 막은 EDEM으로부터 온 것일 수 있으나 제 2 막은 BDM을 포함한다. 대안적으로, 제 1 막은 하이브리도좀 중 하나 일 수 있으나 제 2 막은 외부 세포 표면 막, 엔도솜 막, 리소솜 막 또는 핵막이다. 상기 융합유도 모이어티는 EDEM 또는 상기 융합유도 모이어티를 포함하는 하이브리도좀과 제 2 막의 상호작용을 증가시킴으로써, 막 지질들의 혼합 및 내부 부피와 봉입된 내용물들의 혼합을 촉진시킨다. 대안적으로, 융합유도 모이어티는 세포 구획 내부로의 유입 또는 세포 구획으로부터의 유출을 증가시킬 수 있다. 이러한 구획들은, 예를 들어, 엔도솜 또는 핵일 수 있다. 특정 구체예들에서 상기 융합유도 모이어티는 예를 들어, 표적화 인자, 가령, 막-파괴성 합성 폴리머, 또는 예를 들어, pH 반응성(responsive) 막 전위 폴리펩티드 (예컨대, 멜리틴) 일 수 있다. 일부 구체예에서, 융합유도 모이어티는 융합유도 분절 (예컨대, 지질의 머리 그룹, 지질의 꼬리 그룹, 폴리머의 블록 또는 부위, 펩티드의 분절)을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "가변"은, 본 발명의 방법의 반응 조건들 (예컨대 pH, 온도, 염)을 변화시킴으로써 및/또는 EDEM의 융합유도 성분들 (예컨대 이온성 지질, 융합유도 지질, pH-반응성 폴리머, 헬퍼 지질, 융합유도 표적화 모이어티)의 양을 변화시킴으로써, 일체화 반응 동안은 EDEM 및/또는 BDM에 높은 융합유도 물성들을 선택적으로 인정하면서 일체화 반응 이전 또는 이후에는 보다 낮은 상대적 융합유도성을 유지시키는 것이 가능하게 함을 의미한다. 바람직하게는, 각 경우에서, 상기 융합유도 모이어티는 가변 융합유도성을 원하는 양 (예컨대, 농도)으로 보유할 수 있다. 융합유도 모이어티의 융합유도 특성은 당업계에 공지된 적합한 분석법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 폴리머의 융합유도성은 시험관내 세포 분석법, 가령, 적혈구 용혈 분석에서 결정될 수 있다. 엔도솜 분해성 폴리머 활성은 시험관내 세포 분석에서 결정될 수 있다.
용어 "융합유도 지질"은 높은 pH (즉, 약 7.4의 pH)에서의 전하 또는 구조에 비해 낮은 pH (즉, 약 5.5의 pH)에서 구조 및/또는 전하의 변화를 거쳐, 더욱 융합유도성이 되는 지질을 생성하는 지질을 의미하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 융합유도 지질들은 음이온성 지질, 중성 지질 또는 pH 민감성 지질일 수 있는데, pH 민감성 지질은 pH가 대략 pH 7 로부터 대략 pH 4로 변화할 때, 지질이 전하 또는 구조의 변화를 거쳐 더욱 융합유도성이 되는 것으로 특징된다. 전하 또는 구조의 변화는 또한 역으로 대략 4로부터 대략 6으로 pH에서 일어날 수도 있다. 다른 구체예들에서, 온도가 상 전이 온도, 예를 들어 20℃ 이상으로 상승될 때, 융합유도 지질은 6각형 또는 원뿔형 구조로 추정되는 구조상의 변화를 거친다. 추가적인 이러한 유형의 융합유도 지질은 당업계에 공지이며 본 명세서에 기재된 제형들, 복합물들 및 방법들에서 사용될 수 있다. 이러한 "융합유도" 지질의 일부 예들은 6각형 구조를 취하도록 구조가 변화하는 반면, 이들 지질의 그 외 다른 예들은 전하의 변화를 거친다. 이들 융합유도 지질은 또한 해당 기술 분야에서 "원뿔형" 지질로 언급되는 것들을 포함할 수 있다. 용어 "융합유도 지질"은 또한 지질 뼈대가 작은 횡단면의 머리 그룹 및 보다 큰 아실 사슬 횡단면적을 포함하도록 하는 원뿔형의 분자 모양 성질을 나타내는 지질을 의미하기 위하여 사용될 수 있다. 임의의 특정 이론에 제한되지 않고, 특정 온도 (예컨대 20℃) 이상에서 이들 지질은 비-이중층 6각형 HII 상 전이를 유도하는 것으로 생각된다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "지질" 및 "지질성(lipoid)"은 링커 그룹에 의해 친지질성 꼬리-그룹에 결합되는 극성의 머리-그룹을 포함하는 유기 화합물들의 그룹을 의미한다. 지질은 일반적으로 물에서는 불용성이지만 많은 유기 용매들에서는 용해성인 것으로 특징된다. 지질은 보통 적어도 3가지 종류로 나누어진다: 지방 및 오일을 포함하는 "단순 지질"; 인지질 및 당지질을 포함하는 "복합 지질" ; 및 스테로이드와 같은 "유도 지질". 용어 "지질" 및 "지질성"은 호환적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, "헬퍼 지질"은 중성 지질 및 음이온성 지질을 포함하는 안정화 지질을 의미한다. 본 발명에서 사용되는 일부 EDEM은 하나 또는 그 이상의 헬퍼 지질, 가령, 콜레스테롤 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC)을 포함하거나 헬퍼 지질이 풍부할 수 있다. 중성 지질은 생리학적 pH에서 비전하성이거나 중성 양쪽성이온 형태로 존재하는 몇가지 지질 화학종들을 의미한다. 대표적인 지질에는 디스테아로일-포스파티딜콜린 (DSPC), 디올레오일-포스파티딜콜린 (DOPC), 디팔미토일-포스파티딜콜린 (DPPC), 디올레오일-포스파티딜글리세롤 (DOPG), 디팔미토일-포스파티딜글리세롤 (DPPG), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 팔미토일올레오일-포스파티딜콜린 (POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민 (POPE) 및 디올레오일-포스파티딜-에탄올아민, 디팔미토일-포스파티딜-에탄올아민 (DPPE), 디미리스토일포스포-에탄올아민 (DMPE), 디스테아로일-포스파티딜-에탄올아민 (DSPE), 16-O-모노메틸 PE, 16-O-디메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, 1-스테아리오일-2-올레오일-포스파티디에탄올 아민 (SOPE), 및 1,2-디엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (트랜스DOPE)이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 음이온성 지질은 생리학적 pH에서 음전하는 띠는 지질이다. 이들 지질은 음이온성 개질 그룹으로 개질된 중성 지질, 포스파티딜글리세롤, 디아실포스파티딜세린 및 카르디올리핀을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는, "이온화가능한 양이온성 지질"은 선택된 pH (예컨대 생리학적 pH 미만)에서 순 양전하를 보유하는 지질을 의미한다. 이러한 지질은, 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLinDMA), 2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란 (DLin-KC2-DMA), 헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일4-(디메틸아미노)부타노에이트 (DLin-MC3-DMA), 디옥타데실-디메틸암모늄 (DODMA), 디스테아릴디메틸암모늄 (DSDMA), N,N-디올레일-N,N-디메틸-암모늄 클로라이드 (DODAC); N-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸-암모늄 클로라이드 (DOTMA); 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판 (DODAP), N-(4-카르복시벤질)-N,N-디메틸-2,3-비스(올레오일옥시)프로판-1-아미늄 (DOBAQ), YSK05, 4-(((2,3-비스(올레오일옥시)프로필)-(메틸)아미노)메틸)벤조익 애시드 (DOBAT), N-(4-카르복시벤질)-N,N-디메틸-2,3-비스(올레오일옥시)프로판-1-아미늄 (DOBAQ), 3-((2,3-비스(올레오일옥시)프로필)(메틸)아미노)프로파노익 애시드 (DOPAT), N-(2-카르복시프로필)-N,N-디메틸-2,3-비스-(올레오일옥시)-프로판-1-아미늄 (DOMPAQ), N- 카르복시메틸)-N,N-디메틸-2,3-비스(올레오일옥시)프로판-1-아미늄 (DOAAQ), Alny-100, 3-(디메틸아미노)-프로필(12Z,15Z)-3-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일]-헤니코사-12,15-디에노에이트 (DMAP-BLP) 및 3-(N-(N',N′-디메틸아미노에탄)-카르바모일)콜레스테롤 (DC-Chol)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 구체예에서 이온화가능한 양이온성 지질은 아미노 지질일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "아미노 지질"은 양자화되어 양이온성 지질을 형성할 수 있는, 1 또는 2개의 지방산 또는 지방산 또는 지방 알킬 사슬 및 아미노 머리 그룹 (알킬아미노 또는 디알킬아미노 그룹을 포함)을 보유하는 지질들을 포함함을 의미한다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 아미노 또는 양이온성 지질은 하나 이상의 양자 공여성(protonatable) 또는 탈양자성 그룹을 가져서, 지질이 생리학적 pH (예컨대 pH 7.4) 또는 그 미만의 pH에서 양전하를 띠며, 바람직하게는 생리학적 pH 또는 그 이상의 제 2 pH에서 중성을 띤다. 물론, pH의 작용으로 인한 양자들의 부가 또는 제거는 평형 과정이며, 하전된 또는 중성 지질에 대한 언급은 우세한 화학종들의 성질을 의미하며 모든 지질이 하전된 또는 중성 형태로 존재할 필요는 없음을 의미함이 이해될 것이다. 하나 초과의 양자 공여성 또는 탈양자성 그룹을 가지는, 또는 양쪽성 이온인 지질이 본 발명에서의 사용에서 배제되지 않는다.
한 구체예에서, 양이온성 지질은 당업계에 공지된 방법들 및/또는 국제 공개 특허 출원 제 WO2012040184, WO2011153120, WO2011149733, WO2011090965, WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259, WO2012054365, WO2012044638, WO2010080724 WO201021865 및 WO2014089239; 뿐만 아니라 미국 공개 특허 출원 제 US20140309277에 기재된 방법들에 의해 합성될 수 있으며; 이들 각각은 본 출원에 온전히 참고문헌으로 포함된다.
용어 "이온성"은 그 분자 구조에 하나 이상의 이온성 부위를 보유하는 화합물을 의미하며, 반드시 "이온화된"을 의미하는 것은 아님을, 즉, 이온화가능한 양이온성 지질이 이온화되거나 비이온화된 형태로 존재할 수 있음을 의미함을 유위하여야 한다. 일부 특정 구체예들에서, 본 발명에서 사용되는 EDEM은 생리학적 pH에서 하이브리도좀의 알짜 양이온성 표면 전하를 정확히 맞추기 위하여 상기 개시된 이온화가능한 양이온성 지질 (예컨대, DLinDMA, DLin-KC2-DMA 및/또는 DLin-MC3-DMA)의 조합을 포함한다.
용어 "pH-반응성 폴리머"는 생리학적 pH (약 7.4의 pH)에서의 전하 또는 구조에 비해 낮은 pH에서 구조 또는 전하의 변화를 거치는 폴리머를 의미하며, 이러한 폴리머는 보다 융합유도성이 되는 폴리머를 생성한다. 본 발명의 일부 비-제한적 구체예들에서, 폴리머는 알킬 아크릴릭 애시드, 가령 부틸 아크릴릭 애시드 (BAA) 또는 프로필 아크릴릭 애시드 (PAA)의 호모폴리머일 수 있으며, 또는 에틸 아크릴릭 애시드 (EAA)의 코폴리머 일 수 있다. 메틸 비닐 에테르 또는 스티렌과의 말레산 무수물 코폴리머의 알킬 알콜 유도체들 또는 알킬 아민의 폴리머들 또한 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 폴리머들은 다른 모노머들과의 코폴리머로서 제조될 수 있다. 다른 모노머들의 부가는 폴리머의 효능을 향상시키거나, 유용한 작용기들을 가진 화학적 그룹들을 부가하여, 표적화 모이어티를 포함하는 그 외 다른 분자 엔터티 및/또는 그 외 다른 보조제 물질들, 가령 폴리(에틸렌 글리콜)과의 결합을 용이하게 할 수 있다. 이들 코폴리머는 표적화 모이어티에 교차-결합될 수 있는 그룹들을 함유하는 모노머들과의 코폴리머를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일반적으로, pH-반응성 폴리머는 특정 물성들을 보유하는 모노머 잔기로 이루어진다. 음이온성 모노머 잔기는 양자 공여성 음이온성 화학종을 비롯한 음이온으로 하전된 또는 하전가능한 화학종을 포함한다. 음이온성 모노머 잔기는 대략 7.2-7.4의 중성 pH에서 음이온성 일 수 있다. 양이온성 모노머 잔기는 탈양자성 양이온성 화학종들을 비롯한 양이온으로 하전된 또는 하전가능한 화학종들을 포함한다. 양이온성 모노머 잔기는 대략 7.2-7.4의 중성 pH에서 양이온성 일 수 있다. 소수성 모노머 잔기는 소수성 화학종들을 포함한다. 친수성 모노머 잔기는 친수성 화학종들을 포함한다.
일반적으로, 각각의 폴리머는 호모폴리머 (한가지 단일 유형의 모노머의 중합으로부터 유도됨-본질적으로 동일한 화학 조성을 가짐) 또는 코폴리머 (둘 또는 그 이상의 상이한 모노머들의 중합으로부터 유도됨-상이한 화학 조성을 가짐) 일 수 있다. 코폴리머인 폴리머들은 무작위 코폴리머 사슬 또는 블록 코폴리머 사슬(예컨대, 디블록 코폴리머, 트리블록 코폴리머, 보다 높은 등급의 블록 코폴리머 등)을 포함한다. 임의의 주어진 블록 코폴리머 사슬은 당업계에 공지된 방법들에 따라 관례적으로 구성되어 실시될 수 있다. 일반적으로, 각각의 폴리머는 선형 폴리머, 또는 비-선형 폴리머 일 수 있다. 비-선형 폴리머들은 예를 들어 가지형 폴리머, 브러쉬 폴리머, 별모양-폴리머, 덴드리머 폴리머를 포함한 다양한 구조를 가질 수 있으며, 가교 폴리머, 반가교 폴리머, 그라프트 폴리머, 및 이의 조합일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "일체화하다", "일체화하는", "일체화" 또는 "융합(fusion)"은 하나 또는 그 이상의 EDEM 및 BDM의 막의 구성성분들 및/또는 막 사이의 직접적인 상호작용을 의미한다. 용어 "직접적인 상호작용"은 단순 응집, 지질 교환, 구조적 파열, 반융합 및 융합을 의미할 수 있다. 용어 "반융합" 및 "융합"은 BDM 및 EDEM 막 성분들의 부분 또는 완전 혼합 그리고 융합된 입자(예컨대, 활성제, 내인성 단백질 또는 핵산)를 형성하는 각각의 BDM/EDEM에 본래 함유된 물질을 포함하는 공통의 내부 공간 형성을 의미한다. 용어 "융합 효율"은 융합하게 되는 EDEM 및 BDM으로부터 생성된 하이브리도좀의 상대량을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "막"은 지방족 분자들, 가령 지방산, 지질 분자 또는 폴리머를 포함하는 "외층(shell)"을 의미하며 내부 구획을 둘러싸고 있다. 예를 들어, 이 용어는 폴리머좀, 자연적으로 분비되는 입자, 또는 세균, 진균, 식물, 동물 또는 인간 세포들 (예컨대 상피 세포)을 포함한 임의의 세포 유형의 지질 나노입자 막을 정의하기 위하여 사용될 수 있다. 용어 막은 또한 세포내 지질 이중층, 가령, 예를 들어, 엔도솜 또는 리소솜 막 뿐만 아니라 핵막을 포함한다.
발명자는 놀랍게도 본 발명의 하이브리도좀이 당업계에 공지인 그 외 다른 제약상 담체보다 우수한 몇가지 이점들을 나타내며, 이러한 이점들은 EDEM을 BDM과 물리적으로 일체화시키고 이들 모듈들 각각에 의해 나타나는 이점들을 극대화시킴으로써 얻어짐을 발견하였다. 한편, EDEM은 광범위한 활성제들에 대하여 정확히 정의된 물리화학적 물성들, 가변 융합유도성, 높은 봉입 효율을 보유하고, 공액 화학에 요구되는 강한 환경들을 견디며, 임상적인 제조 요구량을 충족시키도록 고안될 수 있다. 한편, BDM은 안전한 독성 및 면역원성 프로파일을 가지며, 표적 (예컨대 세포, 조직 또는 기관)에 대해 선천적 특이성을 보이며 유기체 순환 성질들에 관해 최적화된다. 그러므로, 본 발명의 하이브리도좀은 특히 치료, 영상화 및 진단적 적용이 관심사이다. 널리 다양한 활성제들은 시험관내에서 EDEM 내부로 용이하게 봉입될 수 있으며, 개체로부터 유래한 특정 BDM과 상기 EDEM을 일체화시킴으로써, 활성제들을 포함하는 맞춤식(personalized) 생체적합성 하이브리도좀이 생성된다. 본 발명의 하이브리도좀은 또한 하나 또는 그 이상의 다음과 같은 이점들을 제공할 수 있다: (a) 망상내피계 (RES)의 대식세포들로부터의 격리 감소 ; (b) 면역계 반응의 감소; (c) 증가된 순환 수명; (d) 특이적이고 개선된 표적화에 따른 전달; 및 (e) 치료 및/또는 모니터 효과면에서의 증가.
유리하게는, 본 발명의 하이브리도좀의 크기는 매우 특이적이고 표적화된 적용에 맞추기 위해 조정될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일부 구체예에서, 표적 조직들로의 하이브리도좀의 분포를 용이하게 하기 위하여 하이브리도좀을 생성하기 위하여 사용되는 EDEM과 BDM의 특이적인 구조적 특성들이 선택될 수 있다. 예를 들어, 고형 종양 조직들을 표적으로 하기 위하여, 하나 또는 그 이상의 기본 모듈들 (EDEM 또는 BDM)은 생성되는 하이브리도좀의 크기가 고형 종양에서의 "누출성" 맥관구조에서 발견되는 천공 간격보다 작아지도록 선택될 수 있다. 이 방식에서, 이러한 조정된 하이브리도좀은 맥관구조의 천공들(fenestrations)을 통해 용이하게 혈관외유출 시킬 수 있으며 사이질 공간으로부터의 종양 세포를 직접 표적으로 할 수 있다. 유사하게는, 간세포들을 표적으로 하기 위하여, 하나 또는 그 이상의 기본 모듈들은 생성된 하이브리도좀이 간에서 내피층 내층 간 동모양혈관들(endothelial layer lining hepatic sinusoids)의 천공보다 작아지도록 선택되고/가공될 수 있다. 이 방식에서, 하이브리도좀은 내피 천공들을 용이하게 침투하여 표적화된 간세포들에 도달할 수 있을 것이다. 역으로, 본 발명의 하이브리도좀은 그 크기가 특정 세포들 또는 조직들에 대한 하이브리도좀의 분포를 제한하거나 방지하도록 하는 방식으로 고안될 수 있다. 일부 특정 구체예들에서, 하이브리도좀은 20 내지 800 nm, 바람직하게는 50 내지 400 nm, 그리고 더욱 바람직하게는 100 내지 200 nm에 포함되는 크기를 가진다.
일부 특정 구체예들에서, 하이브리도좀을 생성하기 위하여 사용되는 BDM 및/또는 EDEM은, 다른 유사하게 분류된 전달 시스템에 비해 이러한 하이브리도좀에 이점들을 제공하는, 수용체-매개 세포내이입, 클라트린-매개(clathrin-mediated) 및 소포-매개 세포내이입, 포식작용 및 대음세포작용, 융합유도성, 엔도솜 또는 리소솜 파괴 및/또는 방출 성질들 중 하나 또는 그 이상을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 EDEM의 세포독성 및/또는 생체적합성은 지질 이중층(들)에 포함되는 지질을 특이적으로 선택함으로써 감소되며, 이에 따라 생성된 하이브리도좀의 생체적합성은 더욱 개선된다. 그러므로, 본 발명에서 사용되는 EDEM은 독성 형질주입 지질들, 가령 Lipofectamine 및 HiPerFect가 없으며, 이러한 지질들은 하나 또는 그 이상의 이온화가능한 양이온성 지질, 가령 DLinDMA, DLin-KC2-DMA 및/또는 Dlin-MC3-DMA에 의해 유리하게 대체된다. 이온화가능한 양이온성 지질은 EDEM의 유일한 이온성 지질 (예컨대, iLNP)로서 사용될 수 있거나 헬퍼 지질 및/또는 PEG-개질된 지질과 조합될 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, EDEM을 본 발명의 하이브리도좀의 하나의 성분으로 사용하는 것은 다음과 같은 실질적인 이점들을 제공한다: (1) EDEM은 대규모 방법들에 의해 제조될 수 있으며 상당량의 봉입된 활성제(들)이 제조될 수 있고; (2) 활성제 봉입 효율이 높으며; (3) 제조된 EDEM의 크기는 생성된 하이브리도좀이 치료적 최적 크기로 제조될 수 있도록 제어될 수 있고; (4) EDEM이 시험관내 생성된다는 사실은, 일체화되지 않은 부분모집단의 분리를 용이하게 하기 위하여 일부 특이적인 구조적 특성이 유지되게 할 수 있으며; (5) EDEM은 공액 화학에 요구되는 강한 환경들을 견딜 수 있게 하며; 그리고 (6) 본 발명에 사용되는 EDEM들은 가변 융합유도성을 가진다. 여러개의 EDEM이 하나 또는 그 이상의 BDM과 일체화될 수 있기 때문에, (몇몇 이유들로, 가령 용매에서의 상이한 용해도 등으로 함께 봉입될 수 없는) 별개의 활성제들을 봉입시킨 EDEM을 별도로 생성한 후, 상기 별개의 EDEM 각각을 하나 또는 그 이상의 BDM에 일체화시켜, 원하는 모든 활성제들을 포함하는 하이브리도좀을 생성하는 것이 가능할 수 있다.
일부 특정 구체예들에서, 본 발명에서 사용되는 EDEM은 표적화 모이어티 및/또는 안정화 모이어티를 이용하여 개질된다.
본 발명에서 사용되는 EDEM은 BDM 소단위들에 비해 개선된 물리적 및 화학적 안정성을 보여준다. 따라서, BDM은 생리학적 환경에서 우수한 안정성을 보여주는 반면, EDEM은 사후 삽입 (post insertion) 및 공액 화학에 요구되는 다양한 환경들을 견딜 수 있다. 예를 들어, EDEM은 환원제들 (예컨대 디티오트레이톨 (DTT))과 접촉시 안정성을 보존할 수 있다. 이러한 개선된 안정성과 함께, 본 발명은 추가 부형제를 사용한 EDEM 표면들의 개질을 고려한다. 한 구체예에서, 용어 "개질"은 개질 EDEM을 제조된 EDEM과 비교하여 특징짓기 위해 사용될 수 있는데, 제조된 EDEM으로부터 개질 EDEM이 제조된 것이다. 따라서, 본 발명의 EDEM 조성물들은 조직 또는 세포들을 추가로 표적화하기 위해 융합유도 모이어티 또는 추가적인 양이온성, 비-양이온성 및 PEG-개질된 지질이 풍부해질 수 있기 때문에 "개질"은 또한 EDEM 제형들에 있어서의 변화를 의미할 수도 있다.
본 발명에서 사용되는 EDEM은 특정 조직, 세포 또는 기관들, 가령 심장, 폐, 신장 및/또는 뇌에 대한 하이브리도좀의 우선적 표적화를 제공하도록 제조될 수 있다. 예를 들어, EDEM, 가령 iLNP는 표적 세포들 및 조직들로의 개선된 전달을 구현하도록 제조될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, "표적화 모이어티"는 특정 표적 세포 또는 표적 조직들과 하이브리도좀의 상호작용을 장려하기 위하여 시험관내에서 EDEM에 (공유적으로 또는 비-공유적으로) 결합될 수 있는 부형제들이다. 본 명세서에서 사용되는, "결합된" 또는 "공액된"은 두 실체들 (여기서는 표적화 모이어티 및 담체 소포) 간의 결합의 치료적/진단적 이점이 구현되는 충분한 친화도로 두 실체들이 결합됨을 의미한다. 예를 들어, 표적화는 표적 세포 또는 조직으로의 전달을 장려하기 위하여 하이브리도좀 내부 또는 하이브리도좀 상에 하나 또는 그 이상의 표적화 리간드 (예컨대 모노클로날 항체)를 포함시킴으로써 매개될 수 있다. 표적화된 조직들에 의한 표적화 리간드의 인식은 표적 세포들 및 조직들에 의한 하이브리도좀의 내용물의 세포 흡수 및 조직 분배를 적극적으로 용이하게 한다. 적합한 리간드들은 이들의 물리적, 화학적 또는 생물학적 물성들 (예컨대, 표적 세포 표면 마커들 또는 특징들의 선택적 친화도 및/또는 인식)에 기초하여 선택된다.
표적화 리간드는 표적 세포의 독특한 특성들을 활용하여, 하이브리도좀이 표적과 비-표적 세포들을 식별할 수 있도록 선택된다. 이러한 표적화 모이어티는 특이적 결합 쌍, 항체, 모노클로날 항체 뿐만 아니라 가변 도메인 (Fv) 단편, 단일 사슬 Fv (scFv) 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, 단일 도메인 항체; 항체 단편, 인간화 항체, 항체 단편; 전술한 것들의 다가 형태들을 포함하는 이들의 유도체 또는 유사체 중 임의의 멤버를 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
하나 또는 그 이상의 표적 세포들 또는 조직들에 대한 조성물의 친화도를 개선시킬 수 있는 하나 또는 그 이상의 리간드 (예컨대, 펩티드, 압타머, 올리고뉴클레오티드, 비타민 또는 그 외 다른 분자들)을 포함하는 하이브리도좀들이 고려된다. 일부 구체예에서, 표적화 리간드는 하이브리도좀 내부에 포매되거나 봉입되는 지질 나노입자 (예컨대 글리코스아미노글리칸)의 표면에 걸쳐 있을 수 있다. 한 구체예에서, 하이브리도좀들은 다음을 포함하는 다가의 결합 시약들을 포함하는데 이에 제한되는 것은 아니며: 단일특이성 또는 이중특이성 항체, 가령 디설파이드 안정화 Fv 단편, scFv 연쇄 ((SCFV)2 단편), 디아바디, 트리아바디 또는 테트라바디, 이들은 전형적으로 공유 결합되거나 다른 방식으로 안정화된 (즉, 류신 지퍼 또는 나선 안정화된) scFv 단편; 및 그 외 다른 표적(homing) 모이어티는 예를 들어, 압타머, 수용체, 및 융합 단백질을 포함한다.
일부 구체예에서, 하이브리도좀은 다중-특이적 친화도 요법(regimes)을 위하여 이용될 수 있다. 이로써 하이브리도좀은 하이브리도좀 표면에 공유적으로 결합된 적어도 둘 이상의 별개의 표적화 모이어티를 포함한다. 제 1 표적화 모이어티는 세포 표면 상의 항원 또는 분자 (즉, 세포 표면 항원)에 특이적으로 결합하며, 제 2 표적화 모이어티는 세포내 표적에 결합한다. 일부 구체예에서, 제 1 표적화 모이어티 및 제 2 표적화 모이어티는 단일 폴리펩티드 사슬에 포함된다. 특정 구체예들에서, 표적화 모이어티 중 일부 또는 모두는 아미노산 (천연, 비-천연, 및 개질 아미노산 포함), 핵산 및 압타머 또는 사카라이드로 이루어진다. 특정 구체예들에서, 표적화 모이어티는 소형 분자이다. 일부 구체예에서 세포내 표적화 모이어티는 외인성이고 EDEM에 공액되는 반면 세포외 표적화 모이어티는 BDM 상에 존재하고 생체내 생성된다. 또다른 구체예에서, 생체내 생성된 세포내 표적화 모이어티는 BDM 상에 존재하는 반면, 세포외 표적화 모이어티는 EDEM에 공액된다.
이중특이성 구체예에서 "제 1 표적화 모이어티"는 항체, 항체-유사 분자, 펩티드, 또는 소형 분자, 가령 비타민, 예컨대, 엽산염, 당 가령 락토오스 및 갈락토오스, 또는 다른 소형 분자들일 수 있다. 세포 표면 항원은 내재화를 거치는 임의의 세포 표면 분자, 가령 세포 표면 상의 단백질, 당, 지질 머리 그룹 또는 그 외 다른 항원일 수 있다. 본 발명의 맥락에서 유용한 세포 표면 항원들의 예에는 테트라스파닌, EGF 수용체, HER2/Neu, VEGF 수용체, 인테그린, CD38, CD33, CD19, CD20, CD22 및 아시알로글리코단백질 수용체가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
이중특이성 구체예에서 "제 2 표적화 모이어티"는 세포내 표적을 인식한다. 이러한 표적화 모이어티는 세포내 막 표면 또는 항원, 가령 단백질에 특이적으로 결합한다. 특정 구체예들에서, 세포내 표적화 모이어티는 원하는 세포내 위치로의 물질의 국소화를 개선시킬 것이다. 일부 구체예에서, 제 2 표적화 모이어티는 단백질성이며, 특정 구체예들에서 항체 또는 항체-유사 분자이다. 그 외 다른 제 2 표적화 모이어티는 펩티드들, 가령, 예를 들어 합성 멜리틴 펩티드 유사체, 및 유기 거대분자들을 포함하며, 이들은 그 크기 (분자량 >500 g), 전하, 또는 그 외 다른 물리화학적 물성들에 의해, 독립적으로 세포들로 들어갈 수 없거나 들어가기 어렵다. 일부 구체예에서, 제 2 표적화 모이어티는 핵산 압타머이다. 제 2 표적화 모이어티는 세포액 단백질; 세포에 존재하는 형질 막, 또는 핵, 미토콘드리아 또는 그 외 다른 막들의 내부면에 결합된 단백질; 또는 핵 단백질 또는 그 외 다른 준세포 구획들에 있는 단백질에 결합할 수 있다. 세포내 신호전달의 중요한 기능을 차단하는 표적화 모이어티는 제 2 표적화 모이어티로서 사용하기에 좋은 후보들이 될 것임은 당업자에게 자명할 것이다. 제 2 표적화 모이어티는 단백질의 활성을 직접 억제하거나, 단백질의 기질과의 상호작용을 차단할 수 있거나, 제 2 표적화 모이어티는 단백질-단백질 상호작용을 차단할 수 있다.
또다른 구체예는 활성 하이브리도좀 세포내 운반을 개선시키기 위한 상보적 기능의 표적화 모이어티의 혼입을 포함한다. 개선된 세포내 운반에 관한 한 예는 천연 활성의 세포 운반 시스템을 "탈취(hijacking)", 결합 또는 관여 할 수 있는 표적화 모이어티를 이용함으로써 구현된다. 예를 들어, 이들 미세소관 모터 복합체 단백질 중 하나를 모터 단백질-결합 펩티드와 결합시키는 것은 미세소관 운반 네트워크를 따른 능동 운반을 가능하게 한다. 예시적인 모터 단백질은 디네인 및 키네신을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
특정 구체예들에서, 제 2 표적화 모이어티는 두 가지 역할, 즉, 막 관통능력 및 세포내 표적화 기능들을 보유한다. 예를 들어, 펩티드 멜리틴 또는 이의 유사체는 낮은 pH에서의 막 상호작용 능력과 세포액 내부에서의 핵-표적화 (nuclear-homing) 기능을 보유한다. 이러한 두 가지 역할은 제 2 표적화 모이어티의 분절로 인한 것일 수 있다 . 예를 들어, 핵 표적화 기능은 핵 국소화 서열 (예컨대 펩티드 서열 "KRKR")을 통해 매개되었으며, 양친매성 α-나선 분절들은 동일한 제 2 표적화 모이어티 내부에 함유되었다. 그러므로, 특정 구체예들에서 제 2 표적화 모이어티의 이중 역할은 하이브리도좀에 대한 두가지 상보적 기능들을 매개 할 수 있다 . 두 가지-목적의 제 2 표적화 모이어티로 개질된 예시적인 하이브리도좀 조성물들은 하기 실시예에 기재되어 있다.
더욱이 본 발명의 EDEM은 그 표면에서 양친매성 물성을 가진 분자들, 가령 세포-관통 펩티드를 나타내도록 개질될 수 있다. 이들 펩티드는 결함의 생성, 파열, 또는 공극 형성을 통해 막 이중층의 무결성을 저해하여, EDEM과 BDM 간의 상호작용을 가져오는 능력으로 특징된다. 이러한 펩티드들의 예들은 단백질, 가령 Tat 및 Rev로부터 유래된 것, 뿐만 아니라, 독소, 가령 크로타민 또는 멜리틴으로부터 유래된 펩티드일 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 바람직한 세포-관통 펩티드 종류는 생리학적 pH에서 '비활성'인, 그러나 낮은 pH 환경에서 활성인 소수성 도메인을 포함한다. 소수성 도메인의 pH-유도 풀림(unfolding) 및 노출시, 모이어티가 지질 이중층에 결합하여, EDEM과 BDM 또는 하이브리도좀과 엔도솜 구획 간의 상호작용을 일으킨다. 융합유도 펩티드의 예시적인 공액은 하기 실시예들에 기재되어 있다.
BDM과의 부위 특이적 일체화를 향상시키기 위하여 EDEM 내부로 또는 EDEM 상에 화학선택성이고 생물-직교성(bio-orthogonal)인 상보적 기능의 분자들을 혼입시키는 것 또한 본 발명에 의해 고려된다. 예를 들어, EDEM 지질 이중층 내부로 융합 펩티드들, 가령 SNARE 단백질 (용해성 N-에틸 말레이미드 민감성 인자 부착 단백질 수용체) 또는 이의 합성 모방체를 혼입시키는 것은 EDEM과 BDM 간의 수용체 특이적 상호작용을 가능하게 한다.
한 구체예에서, EDEM에 대한 표적화 모이어티의 공액을 용이하게 하기 위하여, PEG-개질된 지질의 몰비의 일 부분은 PEG의 원위 말단에서 기능적 실체들, 가령 말레이미드 (예컨대 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[말레이미드(폴리에틸렌 글리콜)-2000]) 또는 아민기 (예컨대 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌-글리콜)-2000])을 보유한 PEG-개질된 지질로 치환될 수 있다. 예시적인 공액법들이 하기 실시예들에 기재되어 있다.
본 명세서에 기재된 EDEM은 지질 이중층 내부로 고정되는 차폐 모이어티를 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "안정화 모이어티"는 내부에 포함된 EDEM 성분을 통해 하이브리도좀의 표면 물성들을 개질시킬 수 있는 분자를 의미한다. 안정화 모이어티는 하이브리도좀이 서로 부착하는 것 또는 혈액 세포 또는 혈관 벽에 부착하는 것을 억제할 수 있다. 특정 구체예들에서, 안정화 모이어티를 가지는 하이브리도좀은 개체에 투여될 때 감소된 면역원성을 가진다. 한 구체예에서, 안정화 모이어티는 또한 개체 내부에서 하이브리도좀의 혈액 순환 시간을 증가시킬 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 안정화 모이어티는 당업계에 일반적으로 공지된 것들을 포함할 수 있다.
안정화 모이어티의 예에는 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 화합물들 및 그 외 다른 화합물들 (이에 제한되는 것은 아님), 가령, 덴드리머, 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리비닐 알콜, 폴리카르복실레이트, 폴리사카라이드, 및/또는 하이드록시알킬 전분 (이에 제한되는 것은 아님)이 포함되는데, 이는 생체내 또는 시험관내 존재하는 화학종들, 가령 혈청 보체 단백질, 보조인자, 호르몬 또는 비타민에 대한 상기 복합체의 상호작용 또는 결합을 감소시킨다. 용어 "PEG-개질된 지질"은 C6-C20 길이의 알킬 사슬(들)을 가진 지질에 공유적으로 공액된 최대 20 kDa 길이의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 의미하나 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 구체예들에서, 적합한 폴리에틸렌 글리콜-지질은 PEG-개질 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE), PEG-개질 세라마이드 (예컨대 PEG-CerC20), PEG-개질 디알킬아민, PEG-개질 디아실글리세롤 및 PEG-개질 디알킬글리세롤을 포함한다. 한 구체예에서, 폴리에틸렌 글리콜-지질은 (메톡시 폴리에틸렌 글리콜)2000-디미리스톨글리세롤 (PEG-s-DMG)이다. PEG-개질된 지질의 또다른 비-제한적 예에는 PEG-디알킬옥시프로필 (DAA), R-3-[(ω-메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)2000)카르바모일)]-1,2-디미리스틸옥시프로필-3-아민 (PEG-c-DOMG) 및 N-아세틸갈락토스아민-((R)-2,3-비스(옥타데실옥시)프로필-l-(메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)2000)프로필카바메이트)) (GalNAc-PEG-DSG)가 포함된다.
본 발명은 PEG가 EDEM, BDM 및/또는 하이브리도좀 표면에 나타나면, 지질 이외의 화합물들, 가령, 예를 들어, 펩티드, 소수성 앵커들 또는 폴리머, 탄수화물, 금속 또는 그 외 다른 이온들은 지질 이중층 내부로 이들 화합물들을 고정시키기 위해 PEG와의 공액에 사용될 수 있음을 고려한다.
BDM으로 돌아가서, 본 발명은 BDM의 형성 동안 세포액 및 형질 막에 있는 생물활성 분자들이 혼입되어, BDM으로 하여금 활성제들의 효과적인 나노입자 담체로서 사용될 수 있게 하는 독특한 기능적 물성들을 가진 BDM을 생성하는 것을 고려한다 . 이와 관련하여, BDM은 내인성 카고 뿐만 아니라 활성제들의 생물학적 활성을 유지시키면서 활성제를 표적 세포들 및 조직들로 전달할 수 있다. 특히, BDM은 진화적으로 최적화된 혈청 반감기 및 표적 조직 및/또는 세포들과의 상호작용을 보여준다. 하나 또는 그 이상의 BDM의 유리한 전달 능력은 BDM을 하나 또는 그 이상의 EDEM과 일체화시킨 후 본 발명의 하이브리도좀으로 전달된다. 더욱이, BDM은 내인성 생물활성 성분들을 하이브리도좀으로 전달할 수 있다. 한 특정 구체예에서, 공여체 세포들에 의해 생체내 생성된 내인성 miRNA, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 , 본 발명의 하이브리도좀에 의해 둘러싸인 부피 내부로 방출하는 것을 촉진시키기 위해 하나 또는 그 이상의 BDM가 수집되어 사용된다. 또다른 구체예에서, BDM 막에 포매된 생물활성 분자 및/또는 폴리펩티드를 하이브리도좀의 막의 구성성분들로서 전달하는 것을 촉진시키기 위하여 하나 또는 그 이상의 BDM이 수집되어 사용된다.
일부 구체예에서, 본 발명에서 사용되는 BDM은 질병 또는 질환, 가령 암을 앓고 있는 공여체 개체로부터 유래된다. 임의의 특정 이론에 제한됨 없이, 개체로부터 수집된 BDM 중 적어도 일부는 상기 질병 또는 질환과 관련된 세포들을 특이적으로 표적화하는 능력을 가지므로, 상기 질병을 모니터링 또는 치료하기 위해 유리하게 사용될 수 있음이 예상된다. 더욱이, 본 발명에서 사용되는 BDM의 성분들은 특정 세포들과 상호작용하여 세포내이입을 용이하게 하고, 이로써 특정 세포, 세포 유형, 또는 조직에 봉입된 물질의 표적화된 전달을 가능하게 할 수 있다. 임의의 특정 이론에 제한됨 없이, 본 발명에서 사용되는 BDM의 표적 세포 특이성은 BDM이 유래되는 세포 유형에 따라 달라진다. 예를 들어, B-세포 또는 교모세포종 세포들로부터 유래된 BDM이 본 발명의 하이브리도좀을 생성하기 위하여 사용될 수 있다. 이러한 BDM은 생체내 생성된 하나 또는 그 이상의 내인성 B-세포 또는 교모세포종 표적화 모이어티를 하이브리도좀으로 전달하고, 이로써 상기 하이브리도좀을 B-세포 또는 교모세포종 특이성이 되도록 할 수 있다. 또한, 하이브리도좀을 생성하기 위해 사용된 BDM이 유래된 개체로 하이브리도좀을 재도입시키면, 하이브리도좀으로 전달되는 BDM 성분들이 하이브리도좀을 상기 개체의 면역계에 적합하게 하는 것으로 예상된다.
일부 구체예에서 BDM이 유래되는 세포는 종양 세포이다. 종양 세포는 원발성 종양 세포일 수 있거나, 종양 세포로부터, 예컨대 계대, 배양, 팽창, 불멸화 등에 의해 생성될 수 있다. 그러므로 종양 세포는 암 또는 예비-암 환자에서의 종양으로부터 얻거나, 종양 또는 암 세포주로부터 얻을 수 있다. 종양 세포는 양성 종양 또는 악성 종양으로부터 얻을 수 있다.
다른 구체예들에서, BDM이 유래되는 세포는 감염된 세포, 즉, 병원체를 함유하는 세포이다.
다른 구체예들에서, BDM이 유래되는 세포는 변이된 세포이다. 예를 들어, 일부 구체예에서 변이된 세포는 돌연변이 또는 미스폴딩된 단백질을 발현시킨다. 일부 구체예에서, 변이된 세포는 하나 또는 그 이상의 단백질을 과발현시킨다. 일부 구체예에서 돌연변이 세포는 퇴행성 질환, 가령, 원시성 질환에 관여한다. 일부 구체예에서, 세포는 중추 신경계 세포이다.
한 구체예에서, 본 발명의 제약상 조성물은 그 내부 구획에 임의의 치료제들 및/또는 진단 시약들을 함유하지 않는 하이브리도좀을 포함한다. 이러한 하이브리도좀은 예를 들어 "빈(empty)" EDEM을 BDM과 일체화시킴으로써 제조될 수 있다. 일부 특정 구체예들에서, "빈" EDEM은 그 막에 일부 구조적 구성성분을 포함하는데, 이는 당업계에 공지된 기술 (예컨대 전기천공법)에 의해 활성제들의 추가 부하(loading)를 용이하게 한다.
본 명세서에서 사용되는, "활성제" 또는 "생물활성제"는 살아있는 유기체, 예컨대, 포유동물, 가령 인간과 접촉시 생리학적 결과, 예컨대, 이로운 또는 유용한 결과를 만드는 임의의 화합물 또는 화합물들의 혼합물을 의미한다. 활성제들은 전달 조성물의 다른 성분들, 가령 담체, 희석제, 결합제, 착색제 등과 구별된다. 활성제는 살아있는 개체에서 생물학적 과정을 조절할 수 있는 임의의 분자, 뿐만 아니라 이의 결합 부분 또는 이의 단편일 수 있다. 특정 구체예들에서, 활성제는 질병의 진단, 치료, 또는 예방에 사용되는 물질 또는 약제의 성분으로서 사용되는 물질일 수 있다. 일부 구체예에서, 활성제는 살아있는 유기체, 가령 포유동물의 신체에서 또는 인간의 인체에서 표적화된 부위에 관한 진단 정보를 얻는 것을 용이하게 하는 화합물을 의미할 수 있다. 예를 들어, 조영제는 진단에 필요한 영상 정보를 제공하는 물질들이기 때문에 본 발명에서 활성제로 분류될 수 있다.
일부 다른 구체예들에서, 조성물의 하이브리도좀은 하나 또는 그 이상의 치료제들 및/또는 진단 시약들을 포함한다. 상기한 바와 같이, 이들 치료제들 및/또는 진단 시약들은 먼저 EDEM 내부에 봉입된 다음, 상기 EDEM을 BDM와 일체화시킴으로써 하이브리도좀의 내부 구획으로 전달된다.
본 명세서에서 사용되는, "치료제"는 동물, 가령 포유동물 또는 인간에서 표적화된 부위에 원하는 생물학적 효과를 생성할 수 있는 생리학적 또는 약물학적 활성 물질이다. 치료제는 임의의 무기 또는 유기 화합물일 수 있다. 치료제는 동물, 가령 포유동물 또는 인간에서의 질병, 질환 또는 세포 성장의 발달 또는 진행을 감소, 억제, 약화, 저하, 정지, 또는 안정화 시킬 수 있다. 예에는, 제한없이, 펩티드, 단백질, 핵산 (siRNA, miRNA 및 DNA 포함), 폴리머, 및 소형 분자들이 포함된다. 다양한 구체예들에서, 치료제들은 특성화되거나 특성화되지 않을 수 있다.
한 구체예에서, 치료제는 EDEM과 BDM을 일체화하기 이전 BDM 또는 EDEM에 존재할 수 있다. 예를 들어 BDM은 BDM이 유래되는 세포에 대해 내인성인 하나 또는 그 이상의 치료제들 (예컨대 miRNA)을 함유할 수 있으며 EDEM은 BDM과 일체화하기 이전에 하나 또는 그 이상의 치료제들 (예컨대 항신생물제)을 포함할 수 있다. EDEM에 활성제들을 봉입시키는 방법들은 당업계에 공지이다 (Bao, Mitragotri, & Tong, 2013). 대안적으로, 하이브리도좀은, EDEM과 BDM을 일체화시킨 후, 세포 표면에 공유 및 비-공유 결합에 의해, 하이브리도좀 막 내부로 사후-삽입에 의해 또는 활성제들이 봉입 부피로 유입될 수 있도록 하이브리도좀 막 내부로의 개구들을 통해 (예컨대 전기천공법) 치료제로 부하될 수 있다.
본 발명의 치료제들은 또한 다양한 형태로 존재할 수 있다. 이러한 형태들에는, 제한 없이, 비변형 분자들, 분자 복합물들, 및 약물학상 허용가능한 염 (예컨대, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 설페이트, 포스페이트, 니트라이트, 니트레이트, 보레이트, 아세테이트, 말레이트, 타르트레이트, 올레이트, 살리실레이트, 등)이 포함된다. 일부 구체예에서, 치료제들은 금속, 아민 또는 유기 양이온들 (예컨대, 4차 암모늄)의 염으로 개질될 수 있다. 약물의 유도체, 가령 염기, 에스테르 및 아미드 또한 치료제로서 사용될 수 있다. 수 불용성인 치료제는 이의 수용성 유도체, 가령, 염기 유도체의 형태로 사용될 수 있다. 이러한 예들에서, 유도체 치료제는 표적화된 부위로 전달시 본래의 치료적 활성 형태로 전환될 수 있다. 이러한 전환들은 효소적 절단, 신체 pH에 의한 가수분해, 또는 그 외 다른 유사한 절차들을 포함하는 다양한 대사 과정에 의해 일어날 수 있다.
본 발명에 의해 고려되는, 적합한 치료제들에는, 제한없이, 화학요법제 (즉, 항신생물제), 마취제, 베타-아드레날린성 차단제, 항-고혈압제, 항-우울제, 항-경련제, 항-구토제, 항-히스타민제, 항-부정맥제, 항-말라리아제, 항-증식제, 항-혈관신생제, 상처치유제, 조직치유제, 열 치료제, 및 이의 조합이 포함된다.
일부 구체예에서, 적합한 치료제들은 또한 면역억제제, 사이토킨, 세포독성제, 핵산분해 화합물, 방사성 동위원소, 수용체, 및 전구약물 활성화 효소들일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 치료제들은 자연적으로 분비되거나 합성 또는 재조합 방법들에 의해 제조되거나 이들의 임의의 조합에 의해 제조될 수 있다.
대규모 치료제들이 본 명세서에 기재된 EDEM과 함께 사용될 수 있다. 이러한 치료제들의 비-제한적 예에는 항신생물제, 항-감염제, 국소 마취제, 항-알러지제, 항-빈혈제, 혈관형성 억제제, 베타-아드레날린 차단제, 칼슘 채널 길항제, 항-고혈압제, 항-우울제, 항경련제, 항균제, 항-진균제, 항-바이러스제, 항-류마티스제, 구충제, 항-기생충제, 코르티코스테로이드, 호르몬, 호르몬 길항제, 면역조절물질, 신경전달물질 길항제, 항-당뇨병제, 항전간제, 지혈제, 항-긴장항진제(anti-hypertonics), 항녹내장제, 면역조절물질 사이토킨, 진정제, 케모카인, 비타민, 독소, 마약, 식물 유래 제제들 (예컨대 잎, 뿌리, 꽃, 종자, 줄기 또는 가지 추출물로부터) 및 이의 조합이 포함된다.
다양한 구체예들에서, 고전적인 다약물 내성에 의해 영향을 받는 약물들은 본 발명에서 치료제들로서 특히 유용성을 가질 수 있다. 이러한 약물들에는 빈카 알칼로이드 (예컨대, 빈블라스틴), 안트라사이클린 (예컨대, 독소루비신) 및 RNA 전사 억제제가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
추가적인 구체예들에서, 치료제는 암 화학요법제 일 수 있다. 적합한 암 화학요법제의 예에는, 제한 없이, 다음이 포함된다: 질소 머스타드, 니트로소우레아, 에틸렌이민, 알칸 설포네이트, 테트라진, 백금 화합물, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 항대사물질, 엽산염 유사체, 안트라사이클린, 탁산, 빈카 알칼로이드, 및 토포이소머라제 억제제 및 호르몬제.
본 발명에서 치료제들로서 사용될 수 있는 추가적인 암 화학요법 약물들에는 제한없이 다음이 포함된다: 알킬화제, 가령 시클로포스파미드; 알킬 설포네이트; 아지리딘; 에틸렌이민 및 메틸아멜아민(methylamelamine); 항-대사물질; 피리미딘 유사체; 항-부신제; 엽산 보충물; 레티노산; 및 제약상 허용가능한 염, 상기한 것들의 임의의 유도체 또는 산.
본 발명에 사용하기에 적합한 추가 치료제들에는, 제한없이, 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제가 포함된다. 이러한 항-호르몬제의 비-제한적 예들에는, 예를 들어 타목시펜 및 토레미펜을 포함한 항-에스트로겐; 항-안드로겐, 가령 류프롤리드 및 제약상 허용가능한 염, 상기한 것들의 임의의 유도체 또는 산이 포함된다.
본 발명의 추가적인 구체예들에서, 사이토킨 또한 치료제들로서 사용될 수 있다. 이러한 사이토킨의 비-제한적 예들은 림포카인, 모노카인, 및 통상의 폴리펩티드 호르몬이다. 추가적인 예들에는 성장 호르몬, 가령, 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 릴랙신; 프로릴랙신; 글리코단백질 호르몬, 가령 난포 자극 호르몬 (FSH), 갑상샘 자극 호르몬 (TSH), 및 황체형성 호르몬 (LH); 간 성장 인자; 섬유모세포 성장 인자; 프로락틴; 태반유선자극 호르몬; 종양 괴사 인자-α 및 -β; 뮐러-억제 물질; 마우스 생식샘자극호르몬-관련 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장 인자, 가령 NGF-β; 혈소판 성장 인자; 전환 성장 인자 (TGFs), 가령 TGF-α 및 TGF-β; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도 인자; 인터페론, 가령 인터페론-α, -β 및 -γ; 콜로니 자극 인자 (CSFs), 가령 대식세포-CSF (M-CSF), 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF), 및 과립구-CSF (GCSF); 인터류킨 (ILs); 종양 괴사 인자, 가령 TNF-α 또는 TNF-β; 및 LIF 및 키트 리간드 (KL)를 포함하는 그 외 다른 폴리펩티드 인자가 포함된다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 사이토킨은 천연 원료로부터 또는 재조합 원료로부터 (예컨대, 천연 서열 사이토킨의 T-세포 배양물 및 생물학적 활성 균등물로부터) 얻은 단백질을 포함한다.
추가적인 구체예들에서, 치료제는 또한 항체계 치료제일 수 있으며, 비-제한적 실시예들은 헤르셉틴, 에르비투스, 아바스틴, 리툭산, 시뮬렉트, 엔브렐, 아달리무맙, 및 레미케이드를 포함한다.
일부 구체예에서, 치료제는 나노입자 일 수 있다. 이러한 나노입자들의 비-제한적 예들에는 임의의 금속 및 반도체계 나노입자가 포함되는데, 이는 다음이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다: 금, 은, 철 산화물, 양자점 또는 탄소 나노튜브. 예를 들어, 일부 구체예에서, 나노입자는 열 제거술 또는 열 치료요법에 사용될 수 있는 나노입자 일 수 있다.
일부 구체예에서, EDEM은 음이온성 치료제들로 부하된다. 음이온성 치료제들은 알짜 음전하를 보유하거나, 하이브리도좀의 이온성 지질과 상호작용할 수 있는 음전하를 가진 임의의 치료제를 포함한다. 이러한 치료제들은 약물 및 화합물, 가령, 올리고뉴클레오티드, 핵산, 개질 핵산 (단백질-핵산 등을 포함), 음전하 그룹을 가진 단백질 및 펩티드, 종래의 약물들, 가령, 식물 알칼로이드 및 음전하 그룹을 가진 유사체 등 (이에 제한되지는 않음)을 포함하는 임의의 공지된 또는 잠재성인 치료제를 포함한다. 본래 음이온성이 아닌 치료제들은 본 발명에서의 사용을 용이하게 하기 위하여 음이온성 그룹들을 이용해 유도합성될 수 있다. 예를 들어, 파클리탁셀은 폴리글루타믹 애시드 그룹을 이용하여 유도합성 될 수 있다.
한 구체예에서, 하이브리도좀은 세포들 내부로 도입시키기 위한 음전하를 띠는 핵산을 포함한다. 본 발명에서 사용하고자 하는 핵산의 비-제한적 예는 siRNA, 마이크로 RNA (miRNA), 작은 또는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 가이드 RNA (gRNA), 주기적 간격으로 분포된 짧은 회문구조 반복서열 RNA (crRNA), 트랜스-활성화 주기적 간격으로 분포된 짧은 회문구조 반복서열 RNA (tracrRNA) 면역-자극 올리고뉴클레오티드, 플라스미드, 안티센스 핵산 및 리보자임이다. 본 발명은 하이브리도좀 내부에 함유된 핵산은 BDM이 유래되었던 세포에 대해 내인성이거나 및/또는 EDEM에 의해 봉입된 외인성 핵산일 수 있음을 고려한다.
일부 구체예에서, 하이브리도좀에 의해 봉입된 폴리뉴클레오티드는 내인성 핵산 또는 유전자의 발현을 조절 또는 그렇지 않으면 감소 또는 제거하기 위하여 작은 간섭 RNA (siRNA) 또는 안티센스 RNA를 인코딩한다. 특정 구체예들에서, 이러한 봉입된 폴리뉴클레오티드는 본래 천연이거나 재조합 일 수 있으며 센스 또는 안티센스 작용 기전 (예컨대, 표적 유전자 또는 핵산의 발현을 조절함으로써)을 이용하여 치료적 활성을 발휘할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "조절하는"은 표적 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현을 변화시키는 것을 의미한다. 조절하는 것은 증가시키는 것 또는 개선시키는 것을 의미할 수 있거나 감소시키는 것 또는 줄이는 것 또는 감소시키는 것을 의미할 수 있다.
일부 다른 구체예들에서, 본 발명의 하이브리도좀은 관심 폴리펩티드 또는 단백질, 가령, 호르몬, 효소, 수용체, 또는 조절 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 특정 구체예들에서, 하이브리도좀은, 형질주입에 더하여, 표적 세포들에 대한 추가 하이브리도좀의 표적화/형질주입을 용이하게 할 수 있는 기능적 폴리펩티드를 제조할 수 있는 생물활성제들을 포함한다. 특정 구체예들에서 본 명세서에 기재된 하이브리도좀은 표적 세포와 상호작용시 봉입된 물질들 (예컨대, 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드)의 전달 및 후속 방출을 용이하게 하는 다기능적 전략을 이용한다.
전형적으로, 특정 암 유형에 대한 백신으로서 사용하기 위한 제약상 조성물은 그 특정 암 유형의 종양/암 세포들로부터 유래된 BDM을 포함할 것이다. 예를 들어, 교모세포종 암 백신에 사용하기 위한 제약상 조성물은 전형적으로 교모세포종 종양/암 세포들로부터 정제된 BDM을 포함한다. 이렇게 하여, BDM은 치료될/보호될 종양/암 세포들 상에 존재하는 항원들에 대한 적응 면역 반응을 자극하는 종양-관련 항원들을 포함한다. 동일한 기원/의도의 대응이 다른 질병들에 적용된다.
한 구체예에서, 본 발명에 유용한 BDM은 외부 막으로부터 온 항원들을 보유한 소포들을 형성하기 위해 세균 외막 또는 기생충을 파괴하거나 세균 외막 또는 기생충으로부터의 기포형성에 의해 얻은 임의의 프로테오리포솜 소포일 수 있다 (국제 공개 특허 출원 제 WO2014122232 및 WO201108027을 참조하라, 이들 각각은 본 출원에 온전히 참고문헌으로 포함된다). 세균 및 기생충들로부터 유래된 BDM은 면역요법 전달 플랫폼을 위한 매력적인 후보가 되게 하는, 다음을 포함한 수많은 물성을 가진다: (i) 강한 면역원성, (ii) 자기-보조활성(self-adjuvanticity), (iii) 부착-수용체에 의한 막 융합 또는 세포 부착을 통해 포유동물 세포들과 상호작용하여 흡수되는 능력, 및 (iv) 재조합 조작에 의한 이종 항원 발현을 혼입시킬 가능성.
그러므로 본 발명의 하이브리도좀 및 하나 이상의 제약상 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 제약상 조성물은 다양한 질병 및 질환들의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, "진단 시약"는 개체 또는 시험 샘플에서 검출될 수 있는 성분을 의미하며 본 명세서에 추가로 기재되어 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 진단 시약들은 동물, 가령, 포유동물 또는 인간의 신체에서 표적화된 부위에 관한 영상 정보를 제공하는 물질들 일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 진단 시약은 당업계에 공지된 임의의 진단 시약을 포함할 수 있다.
진단 시약은 감마-방출, 방사성, 광학적, 형광 흡수, 에코발생, 자기 또는 단층촬영 신호들을 포함하는 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 검출가능한 신호를 제공 및/또는 증대시키는 제제로서 포함하는 다양한 방식에 의해 검출될 수 있다. 진단 시약을 영상화하는 기술들에는 컴퓨터 단층촬영 (CT), 자기 공명 영상 (MRI), 광학적 영상, 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영 (SPECT), 양전자 방출 단층촬영 (PET), x-선 영상, 감마선 영상 등이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
한 구체예에서, 방사성동위원소가 진단 시약으로 작용할 수 있으며 본 명세서에 기재된 하이브리도좀 내부로 혼입될 수 있고 감마선, 양전자, 베타 및 알파 입자들, 및 X-선을 방출하는 방사성핵종을 포함할 수 있다. 적합한 방사성핵종에는 225Ac, 72As, 211At, 11B, 128Ba, 212Bi, 75Br, 77Br, 14C, 109Cd, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 18F, 67Ga, 68Ga, 3H, 123I, 125I, 130I, 131I, 111In, 177Lu, 13N, 15O, 32P, 33P, 212Pb, 103Pd, 186Re, 188Re, 47Sc, 153Sm, 89Sr, 99mTc, 88Y 및 90Y가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 구체예에서, 페이로드(payload)는 검출가능한 제제, 가령, 다양한 유기 소형 분자들, 무기 화합물, 나노입자, 효소들 또는 효소 기질, 형광 물질, 발광 물질 (예컨대, 루미놀), 생물발광 물질 (예컨대, 루시페라제, 루시페린, 및 애쿼린), 화학발광 물질) 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 광학적으로-검출가능한 표지들에는 예를 들어, 제한 없이, 옥타데실 로다민 B, 7-니트로-2-1,3-벤족사디아졸-4-일, 4-아세트아미도-4′-이소티오시아나토스틸벤-2,2′ 디설퓨릭 애시드, 애크리딘 및 유도체, 5-(2′-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-설포닉 애시드 (EDANS), 4-아미노-N-(3-[비닐설포닐]페닐)나프탈이미드-3,6-디설포네이트 디리튬 염, N-(4-아닐리노-1-나프틸)말레이미드, 안트라닐아미드, BODIPY, 브릴리언트 옐로우(Brilliant Yellow), 쿠마린 및 유도체, 시아닌 염료, 시아노신, 4′,6-디아민이디노-2-페닐인돌 (DAPI), 브로모파이로갈롤 레드, 7-디에틸아미노-3-(4′-이소티오시아나토페닐)-4-메틸쿠마린, 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트, 4,4′-디이소티오시아나토디하이드로-스틸벤-2,2′-디설퓨릭 애시드, 4,4′-디이소티오시아나토스틸벤-2,2′-디설퓨릭 애시드, 단실클로라이드, 4-디메틸아미노페닐아조페닐-4′-이소티오시아네이트 (DABITC), 에오신 및 유도체, 에리트로신 및 유도체, 에티듐, 플루오레세인, 5-카르복시플루오레세인 (FAM), 5-(4,6-디클로로트리아진-2-일)아미노플루오레세인 (DTAF), 2′,7′-디메톡시-4′5′-디클로로-6-카르복시플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, X-로다민-5-(및 6)-이소티오시아네이트 (QFITC 또는 XRITC), 플루오레스카민, 텐-1-일]에테닐]-1,1-디메틸-3-(3-설포프로필)-,하이드록사이드, n,n-디에틸에탄아민과의 분자내 염 화합물(1:1) (IR144), 5-클로로-2-[2-[3-[(5-클로로-3-에틸-2(3H)-벤조티아졸-일리덴)에틸리덴]-2-(디페닐아미노)-1-시클로펜텐-1-일]에테닐]-3-에틸 벤조티아졸리움 퍼클로레이트 (IR140), 말라카이트 그린 이소티오시아네이트, 4-메틸움벨리페론, 오르토 크레졸프탈레인, 니트로티로신, 파라로사닐린, 페놀 레드, B-파이코에리트린, o-프탈디알데히드, 파이렌, 파이렌 부티레이트, 숙신이미딜 1-파이렌, 부티레이트 양자점, 반응성 레드 4 (Cibacron™ 브릴리언트 레드 3B-A), 로다민 및 도체, 6-카르복시-X-로다민 (ROX), 6-카르복시로다민 (R6G), 리스아민 로다민 B 설포닐 클로라이드 로다민 (Rhod), 로다민 B, 로다민 123, 로다민 X 이소티오시아네이트, 설포로다민 B, 설포로다민 101, 설포로다민 101의 설포닐 클로라이드 유도체(텍사스 레드), N,N,N′,N′테트라메틸-6-카르복시로다민 (TAMRA) 테트라메틸 로다민, 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트 (TRITC), 리보플라빈, 로솔릭 애시드, 테르븀 킬레이트 유도체, 시아닌-3 (Cy3), 시아닌-5 (Cy5), 시아닌-5.5 (Cy5.5), 시아닌-7 (Cy7), IRD 700, IRD 800, Alexa 647, La Jolta Blue, 프탈로 시아닌, 및 나프탈로 시아닌이 포함된다.
광학적 영상과 관계된 구체예들에 있어서, 진단 시약은 조영제, 예를 들어, 반도체 나노결정 또는 양자점 일 수 있다. 광간섭 단층영상에 있어서, 진단 시약은 금속, 가령 금 또는 은 나노케이지 입자들 일 수 있다. 일부 구체예에서, 진단 시약은 금속 나노입자, 가령 금 또는 은 나노입자일 수 있다.
일부 구체예에서, 진단 시약은 자기 공명 (MR) 영상화 제제를 포함할 수 있다. 예시적인 자기 공명 제제들은 상자성 제제들, 초상자성 제제들 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적인 상자성 제제들은 가도펜테틱 애시드, 가돌리늄, 가도테리돌, 또는 가독세틱 애시드를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 초상자성 제제들은 초상자성 철 산화물 및 페리스텐을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 구체예들에서, 진단 시약들은 x-선 조영제를 포함할 수 있다. x-선 조영제의 예들에는, 제한 없이, 이오파미돌, 이오메프롤, 이오헥솔, 이오펜톨 또는 메트리자미드가 포함된다.
상기 기재된 치료제들과 유사하게, 진단 시약들은 예를 들어, 하이브리도좀에 포매시키거나, 하이브리도좀에 봉입시키거나, 또는 하이브리도좀에 계류시키는 것을 포함한 다양한 방식으로 하이브리도좀과 연합될 수 있다. 일부 구체예에서, 진단 시약은 입자의 표면에 공유적으로 또는 비-공유적으로 부착될 수 있는 금속 이온 복합체/공액체 일 수 있다. 일부 구체예에서, 진단 시약은 하이브리도좀의 표면에 공유적으로 또는 비-공유적으로 부착될 수 있는 방사성뉴클레오티드 일 수 있다. 유사하게, 진단 시약들의 부하는 당업계에 공지된 다양한 방식을 통해 실시될 수 있다. 진단 시약들을 EDEM에 부하하는 한 예는 실시예 부분에서 발견된다.
따라서, 본 발명의 한 구체예는 활성제, 가령 진단 시약 및/또는 치료제를 함유할 수 있는 하나 이상의 EDEM을 포함하는 하이브리도좀에 관한 것이다. 상기 하이브리도좀은 암과 같은 질병을 포함한 질환 또는 질병을 치료, 모니터링, 예방, 병기결정(staging) 및/또는 진단하기 위한 조성물의 일부로서 사용될 수 있다. 이는, 예를 들어, 하이브리도좀에 치료제와 진단 시약을 조합시킴으로써 구현될 수 있다. 이는 또한 치료제를 부하시킨 제 1 부분모집단 및 진단 시약을 부하시킨 제 2 부분모집단을 포함하는 하이브리도좀을 투여함으로써 구현될 수 있다. 또다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 하이브리도좀을 이를 필요로하는 개체에 투여하는 것을 포함하는, 진단 시약 투여에 의해 진단가능한 질병 또는 질환의 진단 방법을 제공한다.
그러므로 본 발명의 하이브리도좀 및 하나 이상의 제약상 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 제약상 조성물은 진단적 적용에 사용될 수 있다.
또다른 양상에서, 본 발명은 BDM에 혼입된 활성제들이 하나 또는 그 이상의 질병-관련 항원들, 가령, 예를 들어 종양 항원에 대한 면역을 유도하는 하이브리도좀을 포함하는 제약상 조성물을 제공한다. 면역 반응을 유도할 수 있는 하이브리도좀을 포함하는 제약상 조성물은 예를 들어, 암 또는 감염에 맞서는 면역 요법과 관련하여 유용할 수 있음이 고려된다.
일부 구체예에서 BDM은 생체내 생성된 질병-관련 항원들, 가령 하나 또는 그 이상의 종양 관련 항원, 하나 또는 그 이상의 병원체-관련 항원 또는 하나 또는 그 이상의 퇴행성-질환-관련 항원을 포함한다. 용어 "질병-관련 항원"은 질병과 관련없는 세포들에 비해 비정상적 구조 및/또는 비정상적 발현 패턴을 가지는 질병 관련 세포들에서 생성되는 단백질에 관계된 것일 수 있다. 비정상적 단백질은 또한 종양바이러스, 예컨대 EBV 및 HPV로 감염된 세포들에 의해 생성된다. 예를 들어, 일부 구체예에서, BDM은 개체에서 원하는 면역 반응들을 자극할 수 있는 항원들을 제공하기에 적절하다. 이러한 이점은 BDM이 인공적으로-합성된 것이라기 보다는 세포들에 의해 생성되므로 "천연"인 항원들을 제공하는 것에 그 원인이 있을 수 있다. 즉, 세포들에 의해 생성되고 BDM에서 발견된 항원들은 개체 내 면역 세포에 의해 경험되는 항원들과 유사한 정도로 세포에 의해 가공되고 (예컨대, 당화 등) 폴딩된 전장 펩티드 일 수 있다. 단백질 이외에도, 세포 표면 당지질 및 글리코단백질과 같은 그 외 다른 물질들 또한 질병 관련 세포들에서 비정상적 구조를 가질 수 있고, 그리하여 면역계의 표적이 될 수 있다. 이와 같은 BDM 항원들은 예를 들어 암에 대항하는 백신 또는 치료에서 사용될 수 있다. 그러므로 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 항원들은 각각 암 세포 항원을 포함할 수 있다. 비-제한적 예로서, 암 세포 항원은 태반형 알칼리성 인산분해효소, p53, p63, p73, mdm-2, 프로카텝신-D, B23, C23, PLAP, CA125, MUC-1 , cerB/HER2, NY-ESO- 1.SCP1 , SSX-1 , SSX-2, SSX-4, HSP27, HSP60, HSP90, GRP78, TAG72, HoxA7, HoxB7, EpCAM, ras, 메조테린, 서비빈, EGFK, MUC-1, 및 c-myc 일 수 있다.
또다른 구체예에서, BDM은 항원 제공 세포들로부터 유래된다. 본 발명은 특히 질병에 걸린 항원 제공 세포들로부터 유래된 BDM을 고려한다. 특정 구체예에서, BDM은 만성 림프구 백혈병 (CLL) 및 맨틀 세포 림프종으로부터 얻은 종양 관련 항원들을 포함한다. 비-제한적 예에서, BDM은 티로신-단백질 키나아제 막관통 수용체 ROR1을 보유하는 맨틀 세포 림프종 세포들로부터 유래된다.
또다른 양상에서, 본 발명은, 개체들의 면역계의 유해한 활성화 및/또는 과다반응을 방지하기 위하여 자가면역성 질병, 감염, 알러지 및 이식의 맥락에서 원하는 바에 따라, BDM에 혼입된 활성제들이 조성물에 대한 면역 억제 능력을 유도하는 하이브리도좀을 포함하는 제약상 조성물을 제공한다. 이러한 양상은 하나 또는 그 이상의 면역억제제들을 제공하는 BDM을 단리시킴에 의해 구현될 수 있다. 한 구체예에서 상기 BDM은 동종이형/이종형 세포 이식 또는 유전자 요법의 결과로 발달하는 면역 반응을 억제한다. 실시예 부분에 나타나있는 바와 같이, 한 구체예는 혈소판 및 활성화된 다형핵 호중구로부터 분리된 면역억제성 BDM을 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 치료제들의 전달을 위한 하이브리도좀을 포함하는 제약상 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는, "제약상 조성물"은 단일 또는 다중 투약으로 투여되는 물리적으로 구별된 단위를 포함하는 조성물을 의미하는데, 각 단위는 예정된 양의 하나 이상의 제약상 활성 성분, 및 제약상 허용가능한 부형제로부터 선택된 하나 이상의 다른 성분을 함유한다. 예를 들어, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 활성제들을 살아있는 유기체 내의 조직 또는 세포로 표적화 전달하기 위한 하이브리도좀들을 포함하는 제약상 조성물을 제공한다. 추가 예에서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 활성제들을 시험관내 조직 또는 세포로 전달하기 위한 하이브리도좀을 포함하는 제약상 조성물을 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 하이브리도좀은 활성제, 가령 치료 및/또는 진단 시약을, 동물, 가령 포유동물 또는 인간의 표적화 세포 또는 조직으로 전달하기 위한 시스템으로서 사용될 수 있다. 특정 구체예들에서, 본 발명은 표적 세포 또는 조직 내부로 활성제를 도입하는 방법을 제공한다. 본 발명의 입자들은 널리 다양한 치료 및/또는 진단 시약들을 포함할 수 있다. 또다른 양상에서, 본 발명은 치료 및/또는 진단 시약을 개체에 투여하는 방법을 제공한다. 이 방법에서, 치료 및/또는 진단 시약을 포함하는 본 발명의 하이브리도좀이 이를 필요로하는 환자에게 투여된다. 특정 구체예들에서, 활성제, 가령, 치료 및/또는 진단 시약의 전달은, 요법의 수단을 구성할 수 있다.
용어 "요법" 또는 "치료"는 포유동물, 예컨대, 종종 환자로 언급되는 인간, 또는 동물과 같은 개체의 상태에 이로운 변화를 일으키고자 하는 과정을 의미한다. 이로운 변화는, 예를 들어, 다음 중 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다: 기능의 회복, 증상의 감소, 질병, 질환, 또는 병태의 진행의 제한 또는 지연 또는, 환자의 병태, 질병 또는 질환의 악화를 예방, 제한 또는 지연. 이러한 요법은 보통, 그 외 다른 것들 중에서도 하이브리도좀에 의한 활성제의 투여를 포함한다.
용어 "치료하는"은 업계에 공지이며, 질병, 질환 및/또는 병태를 가지고 있는 것으로 아직 진단되지는 않았으나 질병, 질환 및/또는 병태에 취약할 수 있는 살아있는 유기체, 가령 포유동물 또는 인간에서 질병, 질환 또는 병태가 발생하는 것을 예방; 질병, 질환 또는 병태를 억제, 예컨대, 질병, 질환 또는 병태의 진행을 방해; 및 질병, 질환, 또는 병태를 완화, 예컨대, 질병, 질환 및/또는 병태의 퇴행을 유발하는 것을 포함한다. 질병 또는 병태를 치료하는 것은 기저의 병태생리학이 영향을 받지 않는다 하더라도 특정 질병 또는 병태의 하나 이상의 증상을 개선하는 것, 가령, 진통제가 통증의 원인을 치료하지 않더라도 진통제를 투여하여 개체의 통증을 치료하는 것을 포함한다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 하이브리도좀은 치료되기를 원하는 질병의 유형에 따라 선택될 수 있는 치료제들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 유형들의 암 또는 종양, 가령 백혈병, 림프종, 골수종, 암종 및 육종 뿐만 아니라 고형 종양들 및 혼합 종양들이, 동일하거나 가능하게는 상이한 치료제들의 투여를 수반할 수 있다.
당업자는 또한 본 발명의 하이브리도좀이 다양한 목적에 사용될 수 있음을 알게될 것이다. 본 발명의 방법들은 선행 기술의 방법들 이상의 수많은 이점들을 가진다. 활성제들을 이용하여 환자를 치료하는 방법들은 오랜 시간 사용되어왔다. 그러나, 선행 기술의 방법들 대부분에서, 활성제는 보통 질병에 의해 영향받는 특정 부위로 표적화되지 않고 인간 또는 동물 신체의 전체에 전달되었다. 그러므로, 선행 기술의 방법들에서, 활성제는 유기체 전체에 불균일하게 분포된다. 선행 기술의 방법들의 한 가지 결점은 인간 또는 동물 신체의 발병되지 않은 부위들 또한 활성제에 의해 영향받을 수 있다는 점이다. 더욱이, 활성제의 소부분만이 질병에 걸린 부위에 작용할 수 있다.
본 발명에 의해 고려되는 바와 같이, 하이브리도좀은 적절한 양의 봉입 물질들 (예컨대, 치료제들 및/또는 진단 시약들)이 표적 세포들 또는 조직들로 전달되고, 그 후 일체화되지 않은 모듈들 또는 이들의 봉입 내용물과 관련된 잠재적인 전신 부작용 또는 독성들을 최소화할 가능성을 개선시킨다. 예를 들어, EDEM (예컨대, iLNP)이 하나 또는 그 이상의 이온성 지질을 포함하거나 다른 방식으로 이들이 풍부할 경우, 하나 또는 그 이상의 표적 세포들의 지질 이중층에서의 상 전이는 봉입 물질 (예컨대, 지질 나노입자에 봉입된 하나 또는 그 이상의 활성제들)의 표적 세포들로의 전달을 용이하게 할 수 있다. 유사하게, 특정 구체예들에서 본 명세서에 개시된 화합물은 생체내 감소된 독성으로 특징되는하이브리도좀들을 제조하기 위하여 사용될 수 있다. 특정 구체예들에서, 감소된 독성은 본 명세서에 개시된 조성물들과 관련하여 높은 형질주입 효율의 기능이며, 그리하여 이러한 조성물의 감소된 양이 개체에 투여되어 원하는 치료 반응 또는 치료 결과를 구현할 수 있다.
본 발명의 하이브리도좀은 봉입 물질 (예컨대, 하나 또는 그 이상의 활성제들)의 봉입 및 하나 또는 그 이상의 표적 세포들 및/또는 조직들로의 방출을 용이하게 하도록 고안될 수 있다. 예를 들어, 하이브리도좀이 하나 또는 그 이상의 융합유도 지질을 포함하거나 다른 방식으로 이들이 풍부할 경우, 하나 또는 그 이상의 표적 세포들의 지질 이중층에서의 상 전이 및 잠재적 파괴는 봉입 물질 (예컨대, 하이브리도좀에 봉입된 하나 또는 그 이상의 활성제들)의 전달을 용이하게 할 수 있다.
유사하게, 특정 구체예들에서 이온성 친수성 머리-그룹들을 가진 지질을 EDEM 내부로 혼입시키는 것은 하이브리도좀에 봉입되는 내용물들 중 엔도솜 또는 리소솜 방출을 촉진시키는데 도움이 될 수 있다. 이러한 향상된 방출은 양자-스폰지 매개된 파괴 기전에 의해 이루어질 수 있는데, 이러한 기전에서 EDEM 내부의 화합물의 능력은, 엔도솜의 산성화를 완충시킬 수 있고, 이는 차례로 엔도솜 또는 리소솜 지질 막의 삼투성 팽윤 및 파괴를 촉진시켜 내부에 봉입된 카고의 표적 세포로의 세포내 방출을 용이하게 할 수 있다.
추가적인 구체예들에서, 본 발명의 하이브리도좀은 또한 하기와 같은 추가적인 치료 이점들 중 하나 이상을 제공할 수 있다: (1) 전달 시스템의 순환시간 증가; (2) 환자로부터 유래된 BDM을 사용하고 선택적으로 안정화 모이어티를 추가함으로써 하이브리도좀의 RES 흡수를 경감; (3) 안정한 봉입으로 인해 하이브리도좀 내부로부터 카고의 조기 방출을 저해; (4) 내인성 BDM 성분들의 존재로 인해 개체의 신체에 도입시 면역계 반응을 감소; (5) BDM 상의 내인성 표적화 모이어티 또는 EDEM에 고정된 외인성 표적화 모이어티 로 인한, 맥관구조 내 생물학적 장벽들 (예컨대 내피 장벽, 혈액-뇌 장벽)을 통한 하이브리도좀의 트랜스사이토시스 증가 ; (6) 질병화 부위, 가령, 종양 부위에서 하이브리도좀의 축적 증가; (7) BDM으로부터 유래한 내인성 표적화 모이어티로 인한 표적 세포의 엔도솜 내부로의 내재화 증가 및 후속적으로 EDEM에 의해 제공되는 융합유도 물성들로 인한 엔도좀 방출 증가.
상기 논의된 바와 같이, 특정 구체예들에서, 본 발명의 하이브리도좀은 활성제가 우선적으로 질병화 부위로 전달되게 한다. 이러한 표적화 전달은 또한 개체에게 많은 양의 활성제가 투여되지 않게 할 수 있다. 이러한 표적화 전달은 활성제의 효능을 증강시킬 수 있다. 이는 순차적으로 많은 투여량의 다양한 활성제들의 투여와 관련된 독성 부작용들 또는 담체 그 자체 (예컨대 지질, 외인성 표적화 모이어티)와 관련된 효과들을 저해하는데 도움을 줄 수 있다. 특정 구체예들에서, 이는 관련 없는 신체 부위들에 영향을 주지 않는 표적화 방식으로 적은 투여량의 활성제를 사용하여 질병들을 치료 또는 검출가능하게 할 수 있다.
본 발명은 또한 생체내 및 시험관내 형질주입이 어려운 것으로 당업계에 공지된 세포 유형들(예컨대 줄기 세포 및 면역 세포)로 활성제들의 성공적 전달을 용이하게 할 수 있는 내인성 가용성 표적화 모이어티를 보유한 BDM을 포함하는 하이브리도좀을 고려한다. 예를 들어, 백혈구로부터 유래된 BDM을 포함하는 하이브리도좀은 증강된 세포 흡수를 보일 수 있는 반면, 단독의 EDEM은 감소된 세포 흡수를 보인다.
본 발명의 하이브리도좀은 수많은 질병 및 병태들 (예컨대, 염증, 가령, 암 관련 염증)을 치료, 모니터링, 예방 및/또는 진단하는데 사용될 수 있다. 특정 구체예들은 질병 또는 병태에 의해 영향받는 부위들로 동일하거나 가능하게는 상이한 치료제들을 전달하는 것을 수반할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 전달 시스템은 종양학적 적용에, 가령, 암성 병태 (예컨대, 악성 종양 세포)의 치료, 모니터링, 예방 및/또는 진단에 특히 유용할 수 있다. 이러한 구체예들에서, 본 발명의 하이브리도좀은 암 (예컨대, 종양)으로 영향받은 부위로 활성제 (예컨대, 치료 및/또는 진단 시약)를 전달하는데 사용될 수 있다. 치료, 모니터링, 예방 밍/또는 진단될 수 있는 암성 병태들의 비-제한적 예에는, 제한 없이, 백혈병, 림프종, 피부암 (흑색종, 기저 세포 암종, 및 편평 세포 암종을 포함), 두경부의 상피성 암종 , 폐암 (편평 또는 표피모양암종, 소세포 암종, 선암종, 및 대세포 암종을 포함), 유방암, 위장관암, 갑상샘의 악성 종양, 골 및 연조직의 육종, 난소암, 난관의 암종, 자궁암, 자궁경부암, 전립선 암종, 고환암, 방광암, 신장 세포 암종, 췌장암, 및 간세포암이 포함된다. 일부 구체예에서, 본 발명은 고형 종양으로 특징되는 암을 앓는 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 질병은 암 및 파킨슨 병으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
추가적인 구체예들에서, 본 발명의 하이브리도좀은 바이러스-감염된 세포들로 활성제를 전달하는데 사용될 수 있다. 이러한 구체예들에서, 본 발명의 하이브리도좀은 바이러스 감염을 치료, 모니터링, 예방 및/또는 진단하는데 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 하이브리도좀은 개체에서 염증이 생긴 부위를 표적화하는데 사용될 수 있다. 그러므로, 이러한 구체예들에서, 본 발명의 하이브리도좀은 염증과 관련된 병태 또는 질병을 치료, 예방, 모니터링 및/또는 진단하는데 사용될 수 있다. 대표적인 병태들에는, 제한없이 다음이 포함된다: 알러지; 천식; 알쯔하이머 병; 당뇨병; 호르몬 불균형; 자가면역성 질병, 가령 류마티스 관절염 및 건선; 골관절염; 골다공증; 관상 동맥 질병을 포함한 죽상경화증 ; 혈관염; 만성 염증성 병태들, 가령 비만증; 궤양, 가령 마르졸린 궤양; 석면 또는 담배 연기로 유발된 호흡기 염증; 포피 염증; 바이러스, 가령 인간 유두종 바이러스, B형 또는 C형 간염 또는 엡스타인바(Epstein-Barr) 바이러스에 의해 유발된 염증; 주혈흡충증; 골반 염증 질병; 난소 상피 염증; 바렛 화생; 헬리코박터 파일로리 위염; 만성 췌장염; 중국 간흡충 감염; 만성 담낭염 및 염증성 장 질환; 염증-관련 암, 가령 전립선암, 결장암, 유방암; 위장관암, 가령 위암, 간세포암종, 결장직장암, 췌장암, 위암, 비인두암, 식도암, 담관암종, 담낭암 및 항문생식기암; 외피 암, 가령 피부 암종; 호흡기암, 가령 기관지암 및 중피종; 비뇨생식관 암, 가령 포경, 음경 암종 및 방광암; 및 생식계 암, 가령 난소암. 본 발명의 하이브리도좀은 화학요법 및 방사선요법을 포함한 (이에 제한되는 것은 아님) 그 외 다른 공지의 질병 치료 방법과 결합하여 또는 동시에 사용될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명은 표적 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현을 조절하는 방법을 제공한다. 이들 방법들은 일반적으로 표적 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현을 조절할 수 있는 핵산과 관련된 본 발명의 하이브리도좀과 세포를 접촉시키는 것을 포함한다.
관련 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 하이브리도좀을 개체에 제공하는 것을 포함하는, 개체에서 폴리펩티드의 과발현으로 특징되는 질병 또는 질환의 치료 방법을 제공하는데, 여기서 치료제는 siRNA, 마이크로RNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 siRNA, 마이크로RNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 발현시킬 수 있는 플라스미드로부터 선택되며, siRNA, microRNA, 또는 안티센스 RNA는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 보체를 포함한다.
이들 방법들은 세포내 전달이 일어나기에 (예컨대 핵 내부) 충분한 시기 동안 본 발명의 하이브리도좀을 세포들과 접촉시킴으로써 실시될 수 있다. 전형적인 응용은 넉다운 또는 무증상(silence)인 특정 세포 표적들로의 siRNA의 세포내 전달을 제공하는 널리 공지된 절차들을 사용하는 것을 포함한다. 대안적으로 응용은 치료적으로 유용한 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 또는 mRNA 서열들을 전달하는 것을 포함한다. 이러한 방식에서, 결핍 또는 결손 유전자 생성물을 제공하여 유전적 질병을 치료하는 요법이 제공된다.
또한 본 명세서에 기재된 하이브리도좀에 의해 하나 또는 그 이상의 독특한 봉입 물질들을 표적 세포들에 함께 전달하는 것이 본 발명에 의해 고려된다. 따라서, 독특한 활성제들을 가진 두 가지 독특한 EDEM을 단일 하이브리도좀으로 융합함으로써, 각각의 이러한 활성제가 상이한 작용 기전으로 기능하는 특정 구체예는 단일 질환 또는 결핍증을 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 하이브리도좀은 기능부전의 내인성 폴리뉴클레오티드 및 이의 단백질 또는 효소 생성물을 불활성화 또는 "넉-다운" 시킬 목적의, 봉입된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 EDEM, 및 효소 치환을 제공할 목적의, 봉입된 효소를 포함하는 제 2 EDEM 모두와 융합될 수 있다. 특정 구체예들에서, 진단 시약들을 함유하는 EDEM,가령, 금 나노입자는, 질환을 치료하는 하이브리도좀에서 BDM과 융합되고, 진단 영상화 기술들을 통해 발병된 세포들 또는 기관들에 위치될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 특정 구체예들은, 예를 들어, 두 가지 독특한 BDM들을 동일한 EDEM 내부로 융합시킴으로써 두 가지 독특한 내인성의 생성 폴리뉴클레오티드 (예컨대, miRNA)를 함께-전달하는 것을 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 한 구체예는 표적 세포 내부의 또는 표적 세포에 의해 분비되는 효소들 및/또는 단백질의 결함과 관련된 질병 또는 질환들의 치료에 적합하다. 예를 들어, 질병의 증상은 본 발명의 조성물들을 제공함으로써 개선될 수 있다 (예컨대 낭성 섬유증). 본 발명이 유용한 질환들에는 질환들, 가령 폼페병, 고셔병, 베타-지중해성빈혈, 헌팅턴병, 파킨슨 병, 근 위축증 (가령, 예컨대 듀시엔형 및 벡커형), 혈우병, SMN1 -관련 척수근 위축증 (SMA),근위축성 측색 경화증 (ALS), 갈락토오스혈증, 낭성 섬유증 (CF), 갈락토세레브로시다아제 결핍증, 프리드라이히 운동실조증, 펠리제우스-메르츠바하병, 및 니만-피크병이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
추가적으로 본 발명은 항원을 제공할 수 있는 BDM 및 보조제 함유 EDEM의 공동-전달에 기초한 고도의 면역원성 백신의 발달을 위한 새로운 플랫폼을 제공한다. 항원 제공 BDM과 보조제들의 조합 전달은 상기 두 가지 성분들의 다음과 같은 주된 물성들을 활용함으로써 치료적 백신들이 선천적인 면역 반응을 끌어내도록 하는 유망한 전략을 제공한다: (1) EDEM에 의해 제공되는 강한 보조활성; 및 (2) BDM에 의해 제공되고 표적화 질병과 관련된 항원(들)에 대한 특이적 적응성 면역 반응. 예를 들어, BDM은 임의의 질병-관련 항원, 가령, 암 요법을 위한 하나 또는 그 이상의 종양 관련 항원, 감염의 치료를 위한 하나 또는 그 이상의 병원체성 항원, 또는 그 외 다른 질병, 특히, 면역-저하 증상들에 관한 및/또는 강한 면역 상승작용이 요구되는 (예컨대 노인들에서) 질병과 관련된 임의의 다른 항원 또는 항원들의 조합을 제공할 수 있다. 추가적으로 본 발명은 백신들, 가령 암, 간염, 플루, 말라리아 및 HIV에 대한 백신들에 중요한 강한 면역 반응을 유도하는 하이브리도좀 조성물들을 제공한다. 본 발명은 또한 환자의 면역계에 항원들의 조합을 제공하는 것이 이로울 수 있는 임의의 요법에 유용하다.
또다른 구체예에서, 면역 반응은 질병 관련 항원을 유도할 수 있는 하이브리도좀을 전달함으로써 유도될 수 있다. (미국 공개 특허 제 20120189700; 이는 본 출원에 온전히 참고문헌으로 포함된다). 한 구체예에서, EDEM은 병원체 또는 암에 대한 백신 (그러나 이에 제한되는 것은 아님)에서 사용하기 위해 제형화 될 수 있다.
한 구체예에서, EDEM은 백신으로서 사용하기 위해 제형화 될 수 있다. 한 구체예에서, EDEM은 하나 이상의 개질 핵산 분자 및/또는 하나 이상의 항원을 인코딩하는 mRNA를 봉입시킬 수 있다. 비-제한적 예로서, EDEM은 하나 이상의 외인성 항원 및 백신 투여 형태를 위한 부형제를 포함할 수 있다 (국제 공개 특허 출원 제 WO2011150264 및 미국 공개 특허 출원 제 US20110293723를 참조하라, 이들 각각은 본 출원에 온전히 참고문헌으로 포함된다). 백신 투여 형태는 본 명세서에 기재된 방법들, 당업자에 공지된 방법들 및/또는 국제 공개 특허 출원 제 WO2011150258 및 미국 공개 특허 출원 제 US20120027806에 기재된 방법들에 의해 선택될 수 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 온전히 참고문헌으로 포함된다).
한 구체예에서, EDEM은 하나 이상의 보조제를 포함할 수 있다. 또다른 구체예에서, EDEM은 하나 이상의 치료제 및 하나 이상의 보조제를 포함할 수 있다. 비-제한적 예로서, 보조제를 포함하는 EDEM은 국제 공개 특허 출원 제 WO2011150240 및 미국 공개 특허 출원 제 US20110293700에 기재된 방법들에 의해 제형화 될 수 있으며, 이들 각각은 본 출원에 온전히 참고문헌으로 포함된다.
한 구체예에서, EDEM은 바이러스로부터 온 펩티드, 단편 또는 부위를 인코딩하는 하나 이상의 외인성 질병 관련 항원을 봉입시킬 수 있다. 비-제한적 예로서, EDEM은 국제 공개 특허 출원 제 WO2012024621, WO201202629, WO2012024632 및 미국 공개 특허 출원 제 US20120064110, US20120058153 및 US20120058154에 기재된 항원들을 포함할 수 있으며 (그러나 이에 제한되는 것은 아님), 이들 각각은 본 출원에 온전히 참고문헌으로 포함된다.
본 발명의 하이브리도좀은 시험관내 또는 생체내에서 세포 또는 조직으로 치료제를 전달하는데 사용될 수 있다. 상기 방법들 및 제형들은 상기 치료에 허용가능한 임의의 질병 또는 질환의 치료에 적합한 임의의 치료제 전달을 위해 용이하게 개조될 수 있다. 본 발명의 방법들은 시험관내, 체외, 또는 생체내에서 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 하이브리도좀은 또한 당업자에게 공지된 방법들을 사용하여 생체내 세포들로 핵산을 전달하는데 사용될 수 있다. 또다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 하이브리도좀 및 제약상 허용가능한 희석제를 포함하는 제약상 조성물을 제공한다. 제약상 허용가능한 희석제의 예들은 정맥내 주사 (예컨대, 식염수 또는 포도당)를 위한 용액을 포함한다. 상기 조성물은 또한 크림, 연고, 겔, 현탁액, 또는 에멀젼의 형태를 취할 수 있다.
생체내 투여를 위해, 본 발명의 하이브리도좀을 포함하는 제약상 조성물은 바람직하게는 비경구적으로 (예컨대, 관절내, 정맥내, 복강내, 피하, 또는 근육내) 투여된다. 특정 구체예들에서, 제약상 조성물들은 일시 주사에 의해 정맥내 또는 복강내 투여된다. 그 외 다른 투여 경로들에는 국소 (피부, 눈, 점액 막), 경구, 폐, 비강내, 설하, 직장, 및 질을 포함한다. 더욱이 안과적 투여에 적합한 제약상 조성물이 제조될 수 있다. 이러한 제형들은 예를 들어, 점안약의 형태, 예를 들어, 수성 또는 유성 액체 부형제 중에서의 활성 성분의 0.1/1.0% (w/w) 용액 및/또는 현탁액을 비롯한, 점안약의 형태로 존재할 수 있다. 이러한 점안약은 완충 제제들, 염, 및/또는 본 명세서에 기재된 임의의 다른 추가 성분들 중 하나 또는 그 이상을 추가로 포함할 수 있다.
또다른 양상에서, 본 발명은 진단 시약들의 전달을 위한 상기에 따른 제약상 조성물을 제공한다.
치료를 위한 활성제들의 전달 이외에도, 본 발명의 하이브리도좀은 질병 또는 병태에 의해 영향받은 조직 및 세포들의 검출, 뿐만 아니라 요법 이후 진행 또는 재발을 검출하기 위한 수단을 제공할 수 있다. 전류 비-침습성 영상화는 종양 내부에서 증가된 대사성 및 아미노산 대사의 이점을 가지는 조영제의 사용을 필요로 하나, 배경 잡음 및 비특이적 흡수에 의해 제한된다. 그러므로, 본 발명은 영상 진단 및 이의 정밀한 위치추정을 가능하게 하기 위해 표적 부위, 가령, 종양 부위 및/또는 염증 부위에 진단 시약들을 직접 전달하기 위한 상기한 바에 따른 제약상 조성물을 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 하나 이상의 생체적합성 전달 모듈 (BDM) 및 하나 이상의 가변 융합유도 모이어티를 포함하는 하나 이상의 가공된 약물 봉입 모듈 (EDEM)로부터 유래한 구조적 생물활성 구성성분들을 포함하는 하이브리드 생체적합성 담체 (하이브리도좀)의 제조 방법을 추가로 제공하는데, 상기 방법은 다음을 포함한다:
(a) 하나 이상의 융합유도 모이어티를 보유하는 하나 이상의 EDEM 또는 이를 포함하는 조성물을 제공하는 단계;
(b) 하나 이상의 BDM 또는 이를 포함하는 조성물을 제공하는 단계;
(c) 상기 하나 이상의 EDEM을 상기 하나 이상의 BDM과 7.4 미만의 pH 및 0℃ 내지 60℃의 온도에서 접촉시켜, 상기 하나 이상의 EDEM을 상기 하나 이상의 BDM과 일체화시키고 하이브리도좀을 생성하는 단계; 그리고 선택적으로
(d) 상기 하이브리도좀을 비-융합 EDEM 및/또는 BDM들로부터 정제하는 단계.
본 발명의 방법은 해당 분야에 실질적으로 이용될 수 있게 하는 몇가지 중요한 특성들을 가진다. 본 발명은 본래의 EDEM 및 BDM 성분들의 특성들을 보여주는 하이브리드 성분을 제조하기 위하여 하나 또는 그 이상의 EDEM 및 하나 또는 그 이상의 BDM을 일체화시킴으로써 하이브리도좀을 생성하는 방법을 제공한다. EDEM을 BDM과 일체화시키는 것은 이들 두 성분들 중 임의의 성분에 존재하는 하나 이상의 융합유도 화학종들을 포함하는데, 이러한 융합유도 화학종들의 융합유도성은 반응 환경을 변화시킴으로써 조정가능하다. 특정 구체예들에서 EDEM (예컨대, iLNP)은 BDM과 일체화하는 개선된 능력 (예컨대, 정전기 상호작용)을 선택적으로 나타낸다. 특정 구체예들에서 BDM (예컨대, 엑소좀)은 BDM과 일체화하는 개선된 능력 (예컨대, 보다 높은 막 유동성)을 선택적으로 나타낸다. 따라서, 본 출원에서 반응 환경들을 정의함으로써 하이브리도좀을 생성하는 방법들이 제공된다. 이러한 방법들은 일반적으로 BDM을 본 출원에서 사용되는 EDEM (예컨대, iLNP)과 접촉시키는 단계를 포함하고, 이로써 이러한 접촉이 반융합 및/또는 융합을 통한 지질 혼합과 함께 단순 응집 및/또는 막 파괴를 유발하여, EDEM 및 BDM 모집단의 일부분이 하이브리도좀의 부분-모집단으로 융합되게 하는 결과를 가져온다. 이로써 상기 고려되는 방법들은 각각의 일체화 기전을 유도, 제어, 제한 및/또는 종결하는 수단으로 인해 실질적인 이점들을 가진다. 더욱이, 본 발명의 방법은 모듈 실체들로 하여금 치료에 관련된 구조를 만들도록 대체 또는 재배치되게 할 수 있다.
한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 지질이 융합유도 특성들을 보유하거나 융합유도 특성들을 띠는, 정의된 형태 및 물리적 특성들을 가진 사전-형성된 소포들을 포함하는 수성 EDEM 혼합물은 하나의 유입구에 의해 단일 챔버에 추가되고 수집된 BDM의 수성 혼합물은 제 2 유입구로 추가된다. 그 후 이 성분들은 공통의 챔버에서 접촉된다. 한 구체예에서, 상기 접촉은 확산을 통해 본래의 조성물들과 혼합함으로써 향상된다. 바람직한 구체예에서, 혼합은 기계적 수단들 (예컨대 진탕)에 의해 일어난다. 대안적으로, BDM과 EDEM을 일체화시키는 것은 제어된 유체 역학을 통해, 가령, 미세유체 혼합 장치에서 가능할 수 있다. 이러한 한 구체예에서, EDEM 및 BDM은 별도의 미세유체 챔버 유입구로 주입되며 제어된 혼합은 챔버 기하구조 및 유동 프로파일을 통해 일어난다.
본 발명은 하이브리도좀의 제조 방법에 관계하는데, 이 방법은 EDEM 및 BDM의 융합유도 물성들 전반에 걸친 제어를 제공한다. 본 발명의 하이브리도좀의 제조를 위해, EDEM 및/또는 BDM의 성분들이 증가된 융합유도 특성을 띠는 반응 환경을 포함시키는 것이 바람직한 구체예이다. 한 구체예에서, 산성 반응 환경은 EDEM의 알짜 양이온 표면 전하를 증가시키고 동시에 증가된 알짜 음이온성 표면 전하를 띠도록 할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 일체화는 약 4 내지 약 6의 pH를 가지는 산성 완충액에서 일어난다. 임의의 이론에 제한됨 없이, 또다른 구체예에서, 반응 온도는 EDEM에서 이중층으로부터 6각형 상으로 지질 상 전이를 유발시키면서 동시에 BDM에서의 막 강성(강성)을 감소시키도록 조절될 수 있다. 반응 온도는 BDM 구성성분들 (예컨대 단백질)의 잠재적 분해로 인해 약 60℃로 제한된다. 바람직한 구체예에서, 반응 온도는 37℃로 설정된다. 한 구체예에서, 반응 환경은 생리학적 이온 강도를 보여준다. 본 발명은 NaCl 또는 KCl의 혼합물을 사용하는 것을 고려하나 이에 제한되는 것은 아니다. 또다른 구체예에서, 반응 용액은 칼슘 이온들을 제공하게 할 수 있다.
그러므로 본 발명은 EDEM과 BDM의 일체화가 5분, 15 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 5 시간 또는 그 이상을 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 일정 시기에 걸쳐 반응성 환경에서 공-배양함으로써 가능해지는 하이브리도좀의 제조방법을 제공한다. 한 바람직한 구체예에서, 공-배양은 약 1 시간 동안 일어난다.
이 방법의 특정한 변형들에서, 혼합 환경은 상기 모듈들의 일체화를 제한하도록 변경된다. 일반적으로, EDEM 및 BDM 일체화는 수많은 매개변수들에 의해 제어되는데, 이러한 매개변수는 입자 농도, 알짜 표면 전하, 전하 밀도, pH, 이온 강도, 추가 농도 및 온도를 포함할 수 있다. 혼합 환경을 변경하는 방법들은 업계에 공지이다. 예를 들어, 높은 완충 용량을 가지는 용액의 추가 또는 모듈 혼합물의 투석이 반응 용액 물성들을 변경하기 위해 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 한 바람직한 구체예에서, 용질 물성을 변화시키기 위해 컬럼들의 탈염(desalting)이 이용될 수 있다.
본 발명은 또한 하이브리도좀을 제조하는 방법에 관련되는데, 여기서 이 방법은 이들 하이브리도좀을 과량의의 개개 모듈로부터 정제하는 단계를 선택적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 하이브리도좀의 제조를 위하여, 정제 단계를 포함시키는 것이 바람직한 구체예이다. 하이브리도좀의 정제가 필요한 경우, 정제는 수크로스 밀도 구배 또는 밀도 구배를 형성하기에 적합한 그 외 다른 배지를 통한 원심분리에 의해 이루어질 수 있다. 그러나 다른 정제 방법들, 가령, 크로마토그래피, 여과, 상 분배, 침전 또는 흡착 또한 이용될 수 있다고 생각된다. 정제 방법들은, 예를 들어, 수크로스 밀도 구배를 통한 원심분리에 의한 정제, 또는 크기 배제 컬럼을 통한 정제를 포함한다. 수크로스 구배는 약 0% 수크로스 내지 약 60% 수크로스, 바람직하게는 약 5% 수크로스 내지 약 30% 수크로스 범위일 수 있다. 수크로스 구배가 형성되어 있는 완충액은 상기 복합물들을 함유하는 분획의 저장에 적합한 임의의 수성 완충액, 그리고 바람직하게는,세포들 및 조직들로의 하이브리도좀 투여에 적합한 완충액이 될 수 있다. 대안적인 분리 기술들은 등전 집속 및/또는 면역친화 크로마토그래피를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 이온성 지질을 포함하는 EDEM은 알짜 양이온성 표면 전하를 보이며, 전기영동법을 통해 분리될 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서 , 하이브리도좀의 정제는 순차적 정제 기술들에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어, BDM 표면 분자들에 대한 친화도와 관계되는 제 1 면역친화 크로마토그래피 이후 PEG 분자의 친화도와 관계된 제 2 면역친화 크로마토그래피는 과량의 BDM 및 EDEM으로부터 순차적으로 하이브리도좀들을 분리할 수 있다. 또다른 분리 기술은 반응물 및 생성물 소포들을 분획하기 위하여 다각 광산란법과 결합된 비대칭 흐름 장 흐름 분획법을 포함할 수 있을 것이다.
본 발명의 방법에서 사용되는 EDEM은 봉입 및 하나 또는 그 이상의 표적 BDM으로의 봉입 물질 (예컨대, 활성제)의 방출 (예컨대, BDM의 지질 막을 투과 또는 지질 막과 융합함으로써)을 용이하게 하거나 향상시킨다. 특정 구체예들에서, 본 출원에 기재된 EDEM 및 BDM의 구조적 특성들은 높은 융합 효율을 나타낸다. 용어 "융합 효율"은 융합하게 되는 EDEM 및 BDM으로부터 생성된 하이브리도좀의 상대량을 의미한다. 특정 구체예들에서, 본 출원에 기재된 EDEM 및 BDM의 구조적 특성들은 높은 융합 효율을 나타내고, 이로써 적절한 양의 봉입 물질 (예컨대, 활성제) 및 내인성 생물재료가 하이브리도좀에 조합되고 후속적으로 화합물 또는 이의 봉입 내용물과 관련된 잠재적인 전신적 부작용 또는 독성을 최소화시킬 수 있는 가능성을 개선시킨다.
특정 구체예들에서, EDEM 제형들은 이러한 모듈이 구성성분인 하이브리도좀의 제조를 제공하기 위한 가변 특성들 (예컨대 막 적합성)을 가진다. 예를 들어, 본 출원에 개시된 EDEM 내부로의 이온성 지질, 헬퍼 지질, PEG-개질된 지질, pH-반응성 폴리머 및/또는 pH 활성화 세포 관통 펩티드의 혼입은, 하나 또는 그 이상의 표적 BDM의 지질 막과 이러한 모듈 (또는 이러한 모듈이 한 구성성분인 하이브리도좀)의 융합유도성을 제어하고, 이로써, 예를 들어, EDEM-BDM 일체화 전반에 걸친 제어를 향상시킬 수 있다. 특정 이론에 제한되지 않고, iLNP 지질들의 서로에 대한 상대적 몰비는 선택된 지질의 특성들, 표적 BDM의 성질, 봉입 물질들의 특성들 및 의도한 전달 표적 (예컨대 세포, 조직 또는 기관)의 특성들에 기초한다. 추가적인 고려사항들에는, 선택된 지질의 알킬 사슬의 포화도, 융합유도성, pKa, 전하, 크기 및 독성이 포함된다.
특정 구체예들에서, 본 출원에서 사용되는 EDEM 조성물들의 이온성 지질 내용물은 이러한 모듈들이 다른 분류 소단위들에 비해 이점들을 제공하는 하나 또는 그 이상의 물성들을 가지는 것으로 특징된다. 예를 들어, 특정 구체예들에서, 본 출원에서 사용되는 EDEM은 일체화 물성들 (예컨대, 표면 전하)의 제어 및 조정을 가능하게 한다. 특히, 본 출원에 개시된 화합물은 정의되고 가변성인 양이온성 성질 뿐만 아니라 전위적으로 반대로 하전된 BDM들과 일체화할 수 있는 능력으로 특징될 수 있다. 이러한 능력은, 예를 들어, 제어된 이온쌍 형성, 융합유도 능력 및/또는 생성된 조성물로의 봉입 물질 (예컨대, 활성제들)의 방출을 촉진시키는 것을 포함할 수 있다.
특정 구체예들에서, EDEM 제형들은 EDEM과 BDM 간에 막 적합성을 제공하기 위한 가변 특성을 가진다. 예를 들어, 헬퍼 지질의 본 출원에 개시된 EDEM으로의 조정된 혼입은, 이러한 모듈의 적합성 막 강성으로 하여금 하나 또는 그 이상의 표적 BDM의 지질 막과의 일체화를 용이하게 하는 것을 가능하게 할 수 있다. 구체적으로,지질 및 스테롤, 가령 콜레스테롤의 상대 몰비는 표적 BDM의 특성들에 유사하도록 맞추어질 수 있다. 표적 세포 또는 조직과의 상호작용을 확보하기 위한 추가적인 고려사항들에는, 예를 들어, 이러한 모듈이 한 구성성분인 하이브리도좀의 결과적인 강성이 포함된다.
본 발명의 한 구체예에서, BDM은 EDEM과 BDM 간에 막 적합성을 제공하기 위한 가변 특성을 가진다. 예를 들어 높은 함량의 BDM 막 성분들, 가령, 스핑고미엘린, 인지질에 혼입된 포화 지방산 및 콜레스테롤 (그러나 이에 제한되는 것은 아님)로 인해 그것이 유래되었던 공여체 세포보다 더 높은 강성이 생길 수 있다. 동시에, BDM 막 성분들이 BDM이 유래되는 세포들의 형질 막과 상이하여 보다 높은 강성을 가지는 결과를 가져올 수 있으므로, BDM은 제조 과정 동안 개선된 안정성을 보여줄 수 있다. 그러나 산성 pH 환경 (예컨대, 약 pH 5)에서, 본 발명의 BDM 막은 보다 낮은 강성 (및 보다 높은 융합유도성)을 보이는 것으로 생각되며, 이는 EDEM의 막과의 일체화를 가능하게 할 수 있다.
특정 구체예들에서, 사용된 EDEM (예컨대, 머리-그룹으로서) 내부로의 이온성 지질, 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 알킬 아미노기들 또는 모이어티를 가지는 이온성 지질의 혼입은 이들의 융합유도성을 이용함으로써 BDM 막의 파괴를 더욱 촉진시킬 수 있다. 이는 최적화된 pKa 및 그에 따른 지질의 pH 의존성 양이온성질 뿐만 아니라, 이중층 상으로부터 매우 융합유도성인 역 6각형 HII 상으로의 전이를 촉진시키는 최적화된 상 전이 온도에도 기반할 수 있다(Semple 외., 2010). 이러한 결과는 양이온 상태의 이온성 지질과 음이온성 지질 간의 이온 쌍 형성을 촉진시키고, 이로써 BDM 막 구조를 분열시키고 상기 내용물들을 하이브리도좀 내부로 이동시키는 것으로 생각된다.
본 출원에서 사용되는 EDEM은 봉입 및 하나 또는 그 이상의 표적 BDM로의 봉입 물질 (예컨대, 활성제들)의 방출 (예컨대, BDM의 지질 막들을 투과 또는 지질 막들과의 융합에 의해)을 용이하게 하거나 개선시키는 제약상 조성물을 제조하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 지질계 조성물 (예컨대, iLNP)이 하나 또는 그 이상의 이온성 지질을 포함하거나 다른 방식으로 이들이 풍부할 경우, 하나 또는 그 이상의 BDM들의 지질 이중층에서의 상 전이는 봉입 물질 (예컨대, 지질 나노입자에 봉입된 활성제들)의 하나 또는 그 이상의 하이브리도좀들로의 전달을 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 특정 구체예들에서, EDEM 내부의 이온성 지질의 총량에 대한 제어는 본 출원에 개시된 하이브리도좀들의 구조적 특성들을 제어하는 기능을 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 특정 구체예들에서, EDEM의 물리적 특성들은 이온성 지질 함량에 비례한다. 예를 들어, 작은 직경의 EDEM들은 더 큰 직경의 EDEM에 비해 보다 낮은 총 이온성 지질 함량을 가질 수 있다. 결과적으로, 본 출원에 개시된 하나 또는 그 이상의 EDEM은 중성 알짜-표면 전하 및 이로인해 제한된 크기가 달성될 때까지 동일한 BDM과 일체화시킬 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, EDEM은 하이브리도좀으로 통합시 BDM으로부터 비롯된 하나 또는 그 이상의 화합물과 상호작용할 수 있는 효소 및 생물활성 촉매 화합물을 봉입시키도록 제조될 수 있다. 예를 들어, EDEM은 BDM에 의해 하이브리도좀으로 이동되는 임의의 내인성 폴리뉴클레오티드를 분해시킬 수 있는 리보핵산분해효소를 함유하도록 제조될 수 있다.
도면의 간단한 설명
본 발명의 상기 및 그 외 다른 특성들 및 이점들은 첨부된 도면을 참고하여 하기 실시예들을 통해 보다 용이하게 명확해질 것이며, 여기서:
도 1은 Au-iLNPs, Au Stock 및 iLNPs의 UV-Vis 흡수 스펙트럼을 보여주는 그래프이고;
도 2는 Au-iLNPs의 투과 전자 현미경 (TEM) 그림이고 (스케일 바: 100nm);
도 3은 나노입자 추적 분석 (NTA)에 의해 얻은 GBM-엑소좀 및 빈 iLNPs 직경들의 히스토그램이고;
도 4는 비-이온화 조건 (pH 7.4)하에서 또는 융합 완충액 (pH 5.5)에서 GBM-엑소좀 및 iLNPs 혼합 후의 평균 입자 크기를 보여주는 그래프이고 (동적 광 산란 (DLS)을 통해 얻음);
도 5는 완충액의 pH 조건들을 변화시킴에 따른 GBM-엑소좀 및 iLNPs의 R18 융합 분석 결과들을 보여주는 그래프이고;
도 6은 0, 30, 40 또는 50%의 DLinDMA 함량을 함유하는 iLNPs 및 GBM-엑소좀의 R18 융합 분석 결과를 보여주는 그래프이고;
도 7은 이온성 지질 DODAP 또는 DLinDMA를 함유하는 iLNPs 및 GBM-엑소좀의 R18 융합 분석 결과를 보여주는 그래프이고;
도 8은 변화하는 PEG-지질 함량을 함유하는 iLNPs 및 GBM-엑소좀의 R18 융합 분석 결과를 보여주는 그래프이고;
도 9는 변화하는 온도에서의 iLNPs 및 GBM-엑소좀의 R18 융합 분석 결과를 보여주는 그래프이고;
도 10은 pH 5.5에서 GBM-엑소좀 및 iLNPs의 혼합물의 형광 교차-상관 분광술(FCCS)을 통해 얻은 그래프이고;
도 11은 동적 광 산란 (DLS)에 의해 모니터한 pH 5.5에서의 GBM-엑소좀 및 iLNPs의 혼합물의 시간에 따른 평균 입자 직경 변화를 보여주는 그래프이고;
도 12는 동적 광 산란 (DLS)에 의해 모니터한 pH 5.5에서의 MCL-엑소좀 및 iLNPs의 혼합물의 시간에 따른 평균 입자 직경 및 다분산 지수 변화를 보여주는 그래프이고;
도 13은 pH 5.5에서 3, 5, 7, 9 및 18분 혼합 후 iLNPs 및 엑소좀 혼합물의 입자 분포를 보여주는 5개의 히스토그램을 도시하며;
도 14는 iLNPs, 엑소좀 및 하이브리도좀의 NTA 크기 분포의 오버레이(overlay)를 보여주는 그래프이고;
도 15는 iLNPs, 엑소좀과 융합되지 않은 iLNPs, 및 하이브리도좀에서의 pDNA 당량을 형질주입하고 72시간 후 GFP 발현 세포들의 유세포 계측 분석을 보여주는 그래프이다. 시간은 형질주입 시간을 나타내고;
도 16은 pDNA-iLNPs의 수크로스 구배의 각 밀도 분율에서 나노입자들의 존재를 나타내는 초당 DLS 평균 광자를 보여주는 그래프이고;
도 17은 형질주입 72시간 후 모인 입자 밀도(pooled particle density)에 따른 GFP 발현 세포들의 유세포 계측 분석 결과를 보여주는 그래프이고;
도 18은 당량의 정제된 하이브리도좀의 형질주입 72시간 후 GFP 발현 세포들의 유세포 계측 분석 결과를 보여주는 그래프이다. 시간은 형질주입 시간을 나타내고;
도 19는 IgG 2차 항체로 표지된 정제 IgG 하이브리도좀을 24시간 배양한 유세포 계측 결과를 보여주는 그래프이고 (대조군: 밝은 회색, IgG 2차 항체: 회색);
도 20은 올리고뉴클레오티드를 함유하는 엑소좀 및 iLNPs의 R18 융합 분석 결과를 보여주는 그래프이고;
도 21은 엑소좀 및 고형 나노입자 봉입 iLNPs 또는 올리고뉴클레오티드/나노입자 공동-봉입 iLNPs의 R18 융합 분석 결과를 보여주는 그래프이고;
도 22는 엑소좀 및 단백질 봉입 iLNPs의 R18 융합 분석 결과를 보여주는 그래프이고;
도 23은 엑소좀 및 표면 개질 iLNPs의 R18 융합 분석 결과를 보여주는 그래프이고;
도 24는 미세유체 고속 혼합에 의해 또는 압출에 의해 제조된 MCL-엑소좀 단독 또는 iLNPs와 혼합된 MCL-엑소좀의 파이렌 융합 분석 결과를 보여주는 그래프이고;
도 25는 융합 완충액 또는 pH 7.4의 완충액에서의 빈 iLNPs 및 표지된 PMN-MVs 뿐만 아니라 상이한 화학종의 카고를 봉입한 iLNPs의 R18 융합 분석 결과를 보여주는 그래프이고;
도 26은 융합 완충액 또는 pH 7.0 완충액에서 빈 iLNPs 및 표지된 PLT-MVs의 R18 융합 분석 결과를 보여주는 그래프이고; 그리고
도 27은 NBD-표지된 iLNPs로 제조된 하이브리도좀으로 또는 NBD-표지된 iLNPs 단독으로 1시간 동안 형질주입된 Jeko1 세포들의 평균 형광 강도를 보여주는 히스토그램이다 (n=160개 세포들, 오차 바는 표준 오차를 지칭한다).
본 발명을 추가로 설명하는 하기 실시예들은 설명으로서 제공되며 어떠한 방식으로든 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예 1
가공 및 약물 봉입 모듈로서 iLNP의 제조
실시예 1-4를 위한 재료 및 방법
A) 화학약품
1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌-글리콜)-2000] (아민-PEG-DSPE), [1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(7-니트로-2-1,3-벤족사디아졸-4-일)] (NBD-PE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[말레이미드 (폴리에틸렌 글리콜)-2000] (mal-PEG-DSPE), 디스테아로일-포스파티딜콜린 (DSPC), 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판 (DODAP), N-팔미토일-스핑고신-1-숙시닐[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)2000] (PEG-Cer) 및 콜레스테롤을 Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL)로부터 구입하였다. 1,2-디리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판 (DLinDMA) 및 PEG-지질의 합성은 기존에 설명된 바 있다 (Heyes, Palmer, Bremner, & MacLachlan, 2005).
B) iLNP의 압출-계 제형
예비성형 소포들의 준비 원하는 소포 물성들에 따라, 이온화가능한 양이온성 지질 (DLinDMA 또는 DODAP), DSPC, 콜레스테롤 및 PEG-지질 (PEG-s-DMG 또는 PEG-Cer)을 적절한 몰비 (예컨대 40:17.5:40:2.5)로 에탄올에 용해시켰다. 소포를 형성하기 위해, 상기 지질 제형을 대략 10mM의 최종 농도 및 3:7의 에탄올-대-수용액 비율에 도달할 때까지 와류시키며 낮은 pH의 수성 완충액 (50 mM 아세테이트, pH 4)에 혼합시켰다. 그 후 생성된 다층형 소포들을 Mini-압출기 (Avanti)를 사용하여 실온에서 2개의 적층식 80nm 또는 100nm 공극 크기의 Nuclepore™ 폴리카보네이트 필터(Whatman)를 통해 압출시켰다.
예비성형된 소포 올리고뉴클레오티드 봉입: 올리고뉴클레오티드 봉입은 기존에 기술되었던 예비성형 소포법 (Maurer 외., 2001)을 이용하여 이루어졌다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드를 상기 압출된 소포들과 어울리는 수용액 (50 mM 아세테이트, pH 4, 30% 에탄올)에 용해시키고 후속하여 와류 혼합하에 단층 소포들에 적가하였다. 플라스미드, siRNA 및 shRNA 봉입을 각각 1:30 플라스미드-대-지질 wt/wt 비율 및 1:16 RNA-대-지질 wt/wt 비율로 실시하였다. 그 후 혼합물을 37℃에서 30분간 배양시킨 후, 4℃에서 PBS (pH 7.4)에 대한 대규모 투석을 통해 잔여 에탄올을 제거하고 완충액 교환하였다. 봉입되지 않은 shRNA 및 플라스미드를 음이온 교환 스핀 컬럼 (Pierce - Thermo Fisher Scientific Inc.)을 통해 제거하고, PBS (pH 7.4)에 대해 평형시켰다. 부하된 소포들을 산성-이소프로판올 (10% HCl)을 사용하여 1:5 부피비로 용해시킨 후 260nm 흡착 (Spectramax M5e, Molecular Devices)에 의해 올리고뉴클레오티드 봉입 효율을 결정하였다.
단백질 봉입 iLNP: 상기 프로토콜과 비교할 때, 소 혈청 알부민 (BSA, Sigma Aldrich) 및 인간 헤모글로빈 (Sigma Aldrich)을 봉입시킨 iLNP는 상기 단백질을 각각 1.5mg/ml 및 1mg/ml의 최종 농도에 도달할때까지 사전에 수성 완충액 (50mM 아세트산 나트륨, pH 5.5)에 용해시킨 후, 와류 혼합하에 지질 혼합물(40:17.5:40:2.5 몰비의 DlinDMA:DSPC:Chol:PEG-Cer)의 에탄올 용액 (20% 최종 EtOH 함량)을 적가하여 제조되었다. 이 용액을 37℃에서 1h 동안 배양하였다. BSA를 봉입시킨 지질 소포들을 상기 설명한 바와 같이 압출하였다. 유리 단백질, 잔여 에탄올의 제거 및 완충액 교환은 PBS (pH 7.4, 4℃)에 대한 대규모 투석 (300kDA MWCO, Spectrumlabs)을 통해 이루어졌다. 10%의 트리톤 X-100 (Sigma Aldrich)를 사용하여 iLNP를 용해시킨 후 BCA™ 단백질 분석 키트 (Pierce - Thermo Fisher Scientific Inc.,)를 통해 단백질 봉입 효율을 결정하였다. 단백질을 정량하는 동안 세척을 보류시킴으로써 유리 단백질의 대규모 제거를 모니터하였다 .
작은 분자 봉입 iLNP: 상기 프로토콜과 유사하게, 카르복시플루오레세인을 봉입시킨 iLNP는 상기 작은 분자를 1mM의 최종 농도에 도달할 때까지 사전에 수성 완충액 (25mM 아세트산 나트륨, pH 5.5)에 용해시킨 후, 와류 혼합하에 상기 지질 혼합물(40:17.5:40:2.5 몰비의 DODAP:DSPC:Chol:PEG-Cer) 에탄올 용액 (20%의 최종 EtOH 함량)을 적가하여 제조되었다. 이 용액을 37℃에서 1h 동안 배양한 후, 상기 설명한 바와 같이 압출하였다. 소형 분자들, 잔여 에탄올의 제거 및 완충액 교환은 PBS (pH 7.4, 4℃)에 대한 대규모 투석 (300kDA MWCO, Spectrumlabs)을 통해 이루어졌다.
Au-나노입자 봉입 iLNP: 이온성 완충액에서의 Au 나노입자의 불안정성으로 인해, 20nm Au 나노입자 (Nanocs Inc.)의 봉입은 Au 나노입자를 탈이온수 용액에서 1:20의 금-대-지질 중량비로 유지시킴으로써 이루어졌다. 상기 설명한 바와 같이, 에탄올 지질 혼합물을 첨가하고, 상기 용액을 압출시키고 투석을 통해 PBS로 완충액을 교환하였다. PBS에서, 유리 Au 나노입자들은 응집하여 침전된다. 봉입된 금 나노입자의 존재는 525nm의 플라즈몬 공명 파장 주변에서의 Au-iLNP의 UV-Vis 흡광도 뿐만 아니라 투과 전자 현미경 (TEM)에 의해 모니터하였다. 기존에 기술된 바와 같이 금 농도를 결정하기 위해(Haiss, Thanh, Aveyard, & Fernig, 2007) 450nm에서 빈 소포들과 비교한 UV-Vis 흡착 증가분을 사용하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, 금 나노입자 및 Au-iLNP 스톡 모두의 UV-Vis 흡착 스펙트럼은 대략 550nm에서 특징적인 표면 플라즈몬 공명 피크를 보여준다. 구체적으로, 빈 iLNP 및 DNA-iLNP에 비교한 450nm에서의 흡착 판독결과의 상대 증가분으로부터 Au-iLNP에 관한 30% 및 Au-DNA iLNP에 관한 26%의 봉입 효율을 결정하였다. 도 2에 도시된 전자 현미경사진은 봉입된 금 나노입자의 존재를 뒷받침하였다.
C) iLNP의 미세유체계 제형
급속 혼합 미세유체 시스템을 사용함에 의한 siRNA-부하된 지질 나노입자의 준비: 지질 나노입자는 제조업자의 지시에 따라 Nanoassemblr™ 미세유체 시스템 (Precision NanoSystems) 상에서 준비되었다. 의도한 제형에 따라, 예비성형 소포 접근에서와 유사하게, 적절한 비율의 (예컨대 40:40:18:2) DLinDMA, 콜레스테롤, DSPC 및 PEG-지질로 이루어진 에탄올 용액을 10mM의 최종 지질 농도로 준비하였다. 1:16 wt/wt 비의 siRNA 대 지질과의 수성 siRNA 용액을 pH 4.0의 25mM 아세테이트 완충액에서 준비하였다. 12 ml/분의 총 유속을 보유한 유입구 흐름을 생성하기 위해 총 생성 부피에 따라 1 내지 3 ml의 주사기가 사용되었다. 각 제형에 대하여 수성 siRNA 용액을 실온에서 3:1의 유동 비율 (Aq:Et)을 보유한 에탄올-지질 용액과 혼합하였다. 그 후 잔여 에탄올을 제거하고 뿐만 아니라 pH를 7.4로 올리기 위해 생성물을 PBS에 대하여 투석시켰으며, 유리 siRNA를 상기 예비성형 소포법에서 설명한 바와 같이 제거하였다.
실시예 2
생체적합성 전달 모듈로서 세포외 소포 (EV) 분리
엑소좀: Thery 외.에 의해 기존에 기술된 바와 같이 분별 원심분리에 의해 맨틀 세포 림프종 (MCL-엑소좀) 및 교모세포종 세포주 (GBM-엑소좀)의 상청액으로부터 엑소좀을 분리하였다 (Thery, Amigorena, Raposo, & Clayton, 2006). 그 후 BCA™ 단백질 분석 키트 (Pierce - Thermo Fisher Scientific Inc.)를 사용하여 단백질 함량을 측정한 엑소좀 및 엑소좀 부분표본들을 -80℃에 보관하였다. 추가 정제를 위하여, 상기 엑소좀 펠릿을 PBS에 용해시켜, 표준 프로토콜을 이용하여 수크로스 쿠션 상부에 층처리하였다(layered).
미세소포 : 인간 혈소판- 및 활성화된 다형핵 호중구-유래 미세소포 (PLT-MV 및 PMN-MV) 샘플들을 인간 표본으로부터 분리하였다. 재빨리, PLT-MV를 이전에 기술된 바와 같이 건강한 공여체의 혈액 수혈로부터 유래한 혈소판 농축물들을 분별 원심분리하여 분리하였다 (Sadallah, Eken, Martin, & Schifferli, 2011). 최근에 공개된 바와 같이 PMN-MV들을 정제하였으며 (Eken, Sadallah, Martin, Treves, & Schifferli, 2013); 건강한 혈액 공여체의 신선한 백혈구층으로부터 PMN을 분리하였다. 이들을 포르밀-메티오닐-류실-페닐알라닌으로 활성화시키고 흘러나온 미세소포들을 분별 원심분리를 통해 분리하였다.
실시예 3
Fab′ 단편, 항체 단편, 펩티드 및 글리코스아미노글리칸과 페길화 지질을 커플링함에 의한 iLNP의 표면 개질
iLNP의 가공 적합성은 iLNP 막에 고정된 페길화 지질에 환원된 항체, Fab' 단편, 융합 펩티드 및 글리코스아미노글리칸을 공액시킴에 의해 증명되었다. 실시예 1의 제형과 비교하여, 0.5 몰%의 페길화 지질이, PEG의 원위 말단에 말레이미드기 또는 아민기를 가진 PEG-개질된 지질을 치환하였다. 다음 두 가지 사이의 반응들에 기초한 표준 프로토콜에 따라 공액을 실시하였다; (1) 원위 PEG 말단의 말레이미드기 및 환원된 항체, Fab' 단편 또는 말단 티올화 펩티드의 유리 티올기. (2) 원위 PEG 말단의 아민기 및 글리코스아미노글리칸 (GAG)의 글리코스아미노글리칸 사슬 상의 활성화 카르복실기.
방법들 :
Fab′ 단편: 먼저, 항-CD38 F(ab)2 단편들을 공급업체의 지시사항에 언급된 최종 농도의 1/5을 이용하여 2-메르캅토에틸아민 (MEA) (Pierce - Thermo Fisher Scientific Inc.)과 함께 환원시켰다. 60μg F(ab)2 를 37℃에서 90분간 반응 완충액 (1mM EDTA, PBS)에서의 10mM MEA와 함께 배양하였다. Zeba™ 스핀 탈염 컬럼 (Pierce - Thermo Fisher Scientific Inc.)을 이용하여 반응 완충액으로 완충액 교환하여 MEA를 제거하였다. siRNA로 부하된 iLNP를 즉시 첨가하고 (2:1 비율의 mal:Fab') 4℃의 진탕 플레이트에서 하룻밤동안 배양하였다. 결합되지 않은 항체/단편들을 PBS (pH 7.4)를 이용하여 평형시킨 Sepharose CL-4B 컬럼 상에서 분리하였다. 280 nm에서의 흡광도 판독결과로부터 Fab′ 단편을 함유하는 분획들을 결정하고, 함께 모아서 10kDa의 원심분리 필터 (Amicon® Ultra-0.5, Merck Millipore)에서 농축시켰다. F(ab)2 의 Fab' 로의 환원 과정 후 Fab' 단편들에 대한 무결성을 입증하기 위하여 비-환원 조건하에서 10% 아크릴아미드를 이용한 겔 전기영동법 (SDS-PAGE)을 수행하였다.
IgG 항체: IgG 항체들을 디티오트레이톨 (DTT) (Sigma)을 이용하여 환원시켰다. 커플링 반응 전, 항체를 4℃의 PBS에서 1시간 동안 25 mM의 DTT를 이용하여 환원시켰다. 환원된 Ab를 PBS (pH 7.4)로 평형시킨 40kDa의 Zeba™ 스핀 탈염 컬럼 (Pierce - Thermo Fisher Scientific Inc.)을 이용하여 과량의 DTT로부터 분리하였다. 하룻밤에 걸쳐 4℃의 PBS (pH 7.4)에서 공액 (1:4 비율의 mal:항체)을 실시하였다. 결합되지 않은 항체를 Sepharose CL-2 컬럼 상에서 제거하였다. Fab′ 단편에 대하여 설명한 바와 같이 280 nm에서의 흡광도 판독결과로부터 항체 공액을 결정하였다.
펩티드: N-말단 시스테인을 보유한 26-아미노산 멜리틴 유사체 펩티드를 1:1 펩티드-대-말레이미드 몰비의 티올화 펩티드와 혼합하고 실온에서 하룻밤동안 배양함으로써 pDNA-iLNP에 공액시켰다.
글리코스아미노글리칸: 글리코스아미노글리칸 (5k MW)을 통상적인 EDC-설포 NHS 커플링 반응을 통해 원위 PEG 말단의 아민기에 공액시켰다. 먼저 상기 글리코스아미노글리칸을 DIW에서 1h 동안 EDC/NHS (1:1 비율의 EDC:COOH, 1:1 비율의 EDC/NHS)에 의해 활성화시킨 후 PBS (pH 8.2)에서의 iLNP (5:1 비율의 글리코스아미노글리칸:아민)를 첨가하였다. 이 반응을 2h 동안 지속시킨 다음, 결합되지 않은 글리코스아미노글리칸을 제거하기 위해 실온에서 PBS (pH 7.4)에 대해 10kDa 컷오프로 투석시켰다.
유체역학적 직경을 DLS 측정하여 성공적인 접합을 추가로 결정하였다. 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, DLS에 의한 유체역학적 직경 (Dh)을 비교시, IgGs, 융합 펩티드, Fab′ 단편 및 글리코스아미노글리칸의 커플링 이후 iLNP의 평균 직경이 증가하였다.
실시예 4
생체내 분비된 iLNP 및 EV의 특성화
실시예 1, 2 및 3에 설명된 바와 같이 iLNP를 제조하고 EV를 분리한 후, 표준 프로토콜을 사용하는 DLS (Zetasizer NS, Malvern) 및 NTA (LM20, Nanosight)를 이용하여 iLNP 및 EV의 크기 분포를 기록하였다. 표 1에 도시된 바와 같이, 카고의 봉입 또는 iLNP의 표면 개질과 함께 평균 크기가 증가하였다. 제어된 합성 조건들로 인해 작은 다분산 지수 (PDI)를 가지는 iLNP가 생성될 수 있으며, 이러한 다분산 지수는 또한 날카로운 모노-모달 NTA 크기 분포에 반영된다. 분비되는 소포에 따라, 엑소좀은 고유 다분산도를 가진다. 도 3에 도시된 바와 같이, 단일 입자 접근의 NTA 분석은 빈 iLNP 및 상이한 크기의 GBM-엑소좀의 부분 모집단에 대하여 모노-모달 크기 분포를 나타낸다.
표 1: iLNP 및 엑소좀의 크기 결정 및 카고 봉입 효율
샘플 DLSa NTA b 카고 봉입
Dh (nm) PDI D (nm) 표준 오차
빈 iLNP
2.5% PEG 66.8 0.167 84.4 ± 1.6 65.5 ± 1.9 -
10% PEG 70.4 0.058 - - -
DODAP 이온성 지질 121.2 0.098 - - -
올리고뉴클레오티드 iLNP
GFP pDNA 89.3 0.210 99.0 ± 4.1 85.0 ± 4.9 60.4%c
shRNA 71.6 0.074 80.2 ± 0.8 30.0 ± 2.0 86.9%c
siRNA 128.0 0.056 - - 66.3% c
siRNA (미세유체 장치) 83.0 0.270 - - 93.0% c
표면 개질 iLNPs
0.5% PEG-Mal (비어있음) 81.2 0.213 - - -
0.5% PEG-Mal (pDNA) 108.4 0.194 - - 63.8%c
0.5% PEG-Mal (siRNA) 111.0 0.049 - - 83.43% c
0.5% PEG-NH3 (siRNA) 129.1 0.088 - - 77.8% c
IgG-Mal 공액 (비어있음) 108.2 0.281 - - -
펩티드.-Mal 공액 (pDNA) 116.6 0.345 - - -
Fab'-Mal 공액. (siRNA) 126.4 0.052 - - -
GAG-NH3 공액. (siRNA) 189.3 0.248 - - -
단백질 iLNP
소 혈청 알부민 155.9 0.210 - - 0.599 mg/mle
헤모글로빈 202.5 0.274 - - 0.080 mg/mle
나노입자 iLNP
20nm 금 NP 104.2 0.083 - - 6.98x1011N/mlf
20nm 금 NP + pDNA 96.1 0.155 - - 6.06x1011N/mlf
소형 분자들
카르복시플루오레세인 83.6 0.106 - - -
엑소좀
GBM 엑소좀 127.7 0.250 128.3 ± 4.7 59.6 ± 4.8 -
B-세포 엑소좀 126.0 0.100 186g 69g -
a 결과들은 3번 실험의 평균을 나타낸다
b 결과들은 세 번의 1800 프레임의 평균 ± SE를 나타낸다		 c A260 UV-Vis (HCl-iPrOH 파괴 후)
d 공액되지 않은 분획들로부터 얻은 A280 UV-Vis
e BCA 단백질 분석 (세척 파괴 후)		 f A450 UV-Vis (금 단독)
g 결과들은 900 프레임을 나타낸다
실시예 5
BDM과 EDEM의 상호작용 개시를 제어
iLNP와 엑소좀 간의 상호작용이 환경의 pH를 변화시킴에 의해 유도될 수 있는지 여부를 조사하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, iLNP/엑소좀 용액의 평균 직경은 융합 (10mM MES, pH 5.5, 145mM NaCl, 5mM KCl) 완충액에서 증가하는 반면, pH 7.4에서는 큰 변화가 없음이 명백하다. DLS 측정치들의 총체적 성질은 상기 두 가지 소단위들 간의 상호작용의 존재를 분명하게 추정하기 어렵게 하기 때문에, 다음으로 엑소좀과 iLNP 모두의 지질 막들 사이의 상호작용에 초점을 두었다.
크기 변화 이외에도, 두 막들 사이의 지질 혼합은 융합이 일어남을 결정하는 또다른 방법을 제공한다. 융합 과정 동안, 두 막들로부터의 지질은 새로이 형성된 막 내부에 분산된다. 친지질성 자체-소광 로다민 염료 (R18)를 희석하여 생성되는 형광의 증가에 의해 지질 혼합을 모니터하였다. 엑소좀 (20μg의 단백질)을 MES 완충액 (10mM MES, pH 5.5, 145mM NaCl, 5mM KCl)에서의 옥타데실 로다민 B 클로라이드 (R18) (Biotium) (1mM)의 1μl 에탄올 용액으로 표지하였다. 이 용액을 실온에서 30분간 배양하였다. 혼입되지 않은 R18을 Zebaspinㄹ 탈염 컬럼 (40kDa 컷오프)를 사용하여 제거하고, MES 융합 완충액 (10mM MES, pH 5.5, 145mM NaCl, 5mM KCl)으로 평형시켰다. R18-표지된 엑소좀 (5μg의 총 단백질)을 교반되는 석영큐벳에서 적절한 완충액에 현탁시키고 샘플 형광을 560-nm 여기 및 590-nm 방출 파장에서 LS55 형광분광계 (Perkin Elmer)를 통해 측정하였다. 3 분의 평형 시간 후, 표지되지 않은 iLNP (30μg의 총 지질)를 엑소좀에 추가하고, 추가 30분간 형광을 모니터하였다. 막들을 파괴하기 위하여 트리톤 X-100을 추가함으로써 최대 R18 희석액을 얻었다. 엑소좀 단독으로부터의 평형 형광과 세척 파괴 후 %로 표현된 최대 형광 탈소광의 차이로 지질 혼합의 정도를 측정하였다. 엑소좀과 유사하게, 미세소포 샘플들 (0.25μg PLT-MV 및 1.2μg PMN-MV 총 단백질)을 R18의 에탄올 용액으로 표지한 후, 유리 염료를 제거하고, 상기 언급한 바와 같이 형광의 증가를 모니터하였다.
표지되지 않은 iLNP와 R18 표지된 엑소좀 간의 융합시, 엑소좀 막 내부로 혼입된 로다민은 표지되지 않은 리포솜 막 부분으로 분산되고, 이는 감소된 근거리(close-quarter) 자체-소광 그리고 후속적으로 막 융합 정도에 비례하는 형광 증가를 가져온다. 도 5에 도시된 바와 같이, 급속한 형광 증가가 pH 5.5에서 발생하였으며, pH 6.6에서 보다 느린 연속적 형광 증가가 발생하였고, 지질 혼합은 pH 7.6에서 저해되었다. pH의 변화가 아닌 iLNP의 양이온성 성질이 지질 혼합 배후의 추진력이었음을 입증하기 위하여, 도 6은 0% DLinDMA 리포좀 (DSPC/Chol/PEG)의 추가가 탈소광을 전혀 초래하지 않았음을 보여준다. 잠재적으로 지질 혼합 배후의 추진력이 될 수 있는, 이온성 지질 DLinDMA에 특이적인 융합유도 성질을 배제시키기 위하여, DLinDMA가 이온성 지질 DODAP로 치환된 iLNP를 제조하였다. 이러한 DODAP-iLNP를 R18 표지된 엑소좀에 추가시 지질 혼합을 관찰하였다 (도 7). 추가적으로, 2.5몰% 내지 10몰%로 iLNP의 PEG-지질 함량을 증가시키면서 (도 8) 그리고 온도를 변화시키면서 (도 9) 유사한 실험들을 실시하였다.
실시예 6
단일 입자들에서 탐지된 BMD 및 EDEM 상호작용
다음으로 조사는 일정 수준의 단일 입자들의 iLNP 및 엑소좀 간의 상호작용에 초점을 두었다. 엑소좀 단백질 및 리포솜 막들의 혼합물을 구성하는 입자들의 일시적 출현을 형광 교차-상관 분광술 (FCCS) 기구에서 정량화하였다. FCCS 측정을 위한 준비에 있어서, iLNP 막들을 친지질성 Bodipy™ (630/650)으로 표지하였으며 엑소좀 표면 단백질을 Bodipy™ NHS 에스테르 (493/502)로 공액시켜 표지하였다. 그 후 엑소좀 및 iLNP 모두를 필적할만한 입자수의 융합 완충액에 혼합시키고 두 채널 모두에서 관련 강도 변동의 발생을 기록하였다. 두 검출기 상의 동기화된 신호들은 응집되거나 융합된 엑소좀 및 iLNP를 나타내며, 개개의 입자들은 일시적인 독립 신호들을 생성한다. 도 10에서, 엑소좀-Bodipy™ (493) 및 iLNP-Bodipy™ (630)가 혼합되었을 때 상호 상관도 (θ)의 증가가 시간 전반에 걸쳐 도시된다. 녹색 및 적색 채널 간의 상관관계 없음은 두 입자들의 혼합 직후 관찰되었다. 8분의 시간 경과 전반에 걸쳐 개개 입자들의 상호 상관도는 0%로부터 대략 70%로 증가했는데, 이는 탐지된 입자들의 총 형광 방출의 거의 70%가 엑소좀 표면 단백질 및 리포솜 막을 나타냄을 암시한다.
두 가지 친수성 염료들 (488 및 633)의 대조 혼합물을 사용하여 검출 최소 상호상관도를 결정하였다. 양성 대조군으로서, 이중 표지된 상보적 DNA 가닥들 (488/633) IBA 표준(IBA GmbH)을 사용하여 구현가능한 최대 상호 상관도를 얻었다.
실시예 7
하이브리도좀을 형성하기 위한 융합유도성 EDEM 및 BDM 융합
지질 교환으로 인한 단순 응집, 구조적 파열 또는 허위 양성 융합 분석 가능성을 배제시키기 위하여, pH 5.5의 완충액에서 카고가 더 적은(cargo-less) iLNP/엑소좀 혼합물의 평균 크기 및 크기 분포를 DLS 및 NTA를 통해 상이한 시점에서 기록하였다. 10h의 기간 동안 z-평균 평균 크기를 모니터하기 위해 동일한 실험 조건들을 사용하였다. 도 11에 도시된 바와 같이, 처음 한 시간의 혼합 시간 이내에, 평균 입자 크기가 급속하게 증가하고 그 후 9시간에 걸쳐 사실상 영향받지 않은 상태로 유지되었다. 응집의 경우, 반대로 하전된 소포들은 정전기적으로 조직된 형태들로 연속적으로 응집하는 능력을 가지지만, 이 경우는 그렇지 않다. 응집을 제외시키는 또다른 지표는 직경의 증가 정도이다. 두 개의 융합 구들의 부피는
Figure 112016073517183-pct00001
방식으로 반경에 따라 증가하며, 이에 의해 85nm와 130nm 구의 융합은 141nm 입자를 생성하게 된다. 한편 응집에서, 반경은 응집체를 구성하는 모든 추가적인 구에 따라 선형으로 증가한다. 이것은 다수의 소단위체 직경 범위에서의 큰 직경 증가에 의해 분명해질 것이다. 이는 도 12에 도시된 바와 같이, 융합 완충액 (실온 보관됨)에서의 siRNA-iLNP 및 MCL-엑소좀 혼합물은 9일의 기간에 걸쳐 평균 직경에 있어 현저한 증가를 전혀 보이지 않았다는 점에서 더욱 뒷받침된다.
DLS에 의해 드러난 평균 크기 또는 가우시안 크기 분포의 변화가 부분모집단을 평균한 가상실제(artefact)가 아니라는 것을 배제시키기 위하여, 개개 입자들의 NTA-측정에 기초한, 엑소좀, iLNP 및 융합 생성물의 크기 분포를 평가하였다. 분석에 앞서, iLNP 및 엑소좀을 융합 완충액에 희석시켰다 (iLNP에 대해 20'000-배 그리고 ml 당 0.01mg의 엑소좀 단백질). 융합 반응을 위해, 엑소좀 및 iLNP를 1:1 비율로 배양하고, 이러한 반응 혼합물로부터 취한 샘플을 매 2분 마다 기록하였다. 매 측정시 1800 프레임의 영상이 기록되었다. 자동 블러(blur) 설정, 최소 트랙 길이 및 최소 예상 입자 크기를 구비한 NTA 분석 소프트웨어 묶음 버전 3.0을 이용하여 데이터를 분석하였다.
시간에 따른 융합 반응들에서의 크기 분포를 모니터링한 결과(도 13) 3분 혼합 후 50-90nm의 iLNP 모집단은 크게 감소되며 90-125nm의 부분모집단은 증가함을 보여주었다. 18분의 시간 경과 전반에 걸쳐, 크기 분포는 144.2nm 입자들의 피크를 보여주며, BMD의 존재하에서 EDEM의 융합유도성을 증가시킴으로써 구별되는 크기 분포를 나타내는 입자들을 생성시킴을 추정할 수 있다. 엑소좀, iLNP 및 새로이 형성된 입자들의 이러한 독특한 크기 프로파일은 도 14에 도시되어 있다. 새로이 형성된 소포들의 모집단은 "하이브리도좀"으로 부른다.
도 14에서의 명확한 크기 분포 또는 도 11 및 도 12에서 보이는 생성된 소포 직경의 지속적 안정성은 융합 후 감쇠된 알짜 표면 전하에 대한 지표가 된다. 결과적으로 일련의 융합은 저해되고 시스템은 자발적 피드백 루프를 보여준다.
실시예 8
하이브리도좀 매개된 유전자 전달은 GFP 발현을 초래한다
유전적 카고의 하이브리도좀 매개된 전달의 기능을 증명하기 위하여, GBM 세포주 엑소좀 및 GFP 플라스미드를 봉입시킨 iLNP로부터 하이브리도좀을 제조하였다. 시험 제형들로 형질주입된 GBM 세포들에서 리포터 GFP의 발현을 유세포 측정법과 공초점 현미경으로 분석하였다. 세포들 (전날 50'000개 세포들을 파종함)을 iLNP (웰 당 500ng GFP-pDNA)로 형질주입하였으며 하이브리도좀 (웰 당 5μg 총 단백질/500ng GFP-pDNA)을 부하하였다. 하이브리도좀들을 형질주입에 앞서 융합 완충액에서 30분간 pDNA-iLNP와 엑소좀을 혼합하여 제조하였다. 형질주입이 엑소좀-유도된 세포내이입으로 인한 iLNP의 우연한 내재화의 결과임을 배제시키기 위하여, 세포들을 또한 융합되지 않은 iLNP (웰 당 500ng GFP-pDNA) 및 엑소좀 (웰 당 5μg 총 단백질)과 공동-형질주입하였다. 0.5h, 1h, 2h 또는 24h의 형질주입 시간 후, 세포들을 PBS로 2회 세척하였으며, 신선한 배지를 추가하고 세포들을 72h 동안 배양하였다. GFP-발현 세포들의 양을 유세포 측정법으로 분석하였다 (도 15 참조). 하이브리도좀은 엑소좀과 공동-형질주입된 pDNA-iLNP 또는 융합되지 않은 pDNA-iLNP에 비해 보다 높은 형질주입율을 보여준다.
실시예 9
하이브리도좀의 정제
형질주입 실험에서 융합되지 않은 iLNP의 간섭을 배제시키기 위해, 융합되지 않은 iLNP를 연속 수크로스 밀도 구배 원심분리에 의해 하이브리도좀으로부터 분리하였다. pDNA-iLNP의 밀도를 결정하기 위하여, pDNA-iLNP를 0-55%의 연속 수크로스 (wt/vol) 구배에서 원심분리하고 (190'000g, 14h) 컬럼을 분획시켰다. 수크로스 분획들의 밀도를 굴절계로 결정하고, 입자들의 존재를 DLS에서 광자 계수하여 분석하였다. 데이터는 1.05 g/ml의 pDNA-iLNP 최대 밀도를 나타낸다(도 16 참조).
상응하는 수크로스 구배에서 pDNA-iLNP/엑소좀 융합 혼합물 (1:0.1, wt:wt의 단백질-대-플라스미드 비율)을 원심분리하여 구배 상부에 융합되지 않은 iLNP를 함유하는 뚜렷한 유백색 띠를 산출하였다. 1.06-1.08, 1.09-1.18, 및 1.19-1.25g/ml 밀도를 가진 입자들에 상응하는 수크로스 분획들을 모으고 PBS에 대해 투석하여 수크로스를 제거하였다.
GFP를 형질주입시키는 상기 분획들의 능력을 세포들 (72h, 50'000 세포/웰)과 함께 배양하여 모니터하고 유세포 측정법으로 GFP 발현 세포들의 수를 분석하였다. 도 17 및 도 16에 도시된 바와 같이, 모든 분획들은 GFP를 발현시켰다.
pDNA-하이브리도좀들 (1.05g/ml 미만의 입자들)을 모으고, 투석하여 수크로스를 제거하여, 이들을 독립된 형질주입 연구에서 재시험하였다. 세포들 (50'000 세포들)을 pDNA-하이브리도좀들 (상기 모은 분획의 BCA 분석에 기초하여 2.5μg 단백질/웰)로 0.5h, 1h, 2h 또는 24h 동안 형질주입하였다. 지시된 형질주입 시간 후, 세포들을 PBS로 2회 세척하고 신선한 배지를 추가하였다. 72h 동안 배양 후 GFP-발현 세포들의 양을 유세포 측정법으로 분석하였다 (도 18 참조).
실시예 10
하이브리도좀에 대한 외인성 표적화 모이어티
표면에 IgG 단편을 가진 하이브리도좀을 준비하기 위해 상기한 IgG 표면 개질된 iLNP를 사용하였다. 실시예 9에서의 풍부한 플라스미드가 부하된 하이브리도좀과 유사하게, IgG 고정된 iLNP를 융합 완충액에서 30분간 GBM 유래된 엑소좀과 혼합하고 (6:1 중량비의 지질 대 엑소좀 단백질) 융합되지 않은 iLNP를 수크로스 구배에서 분리하였다. 미립자 층은 1.12-1.14g/ml의 밀도에서 볼 수 있었다 (플라스미드 부하된 하이브리도좀에 있어 Rf=0.36과 비교하여 Rf=0.62). 1.08g/ml 미만의 분획들을 모으고 잔여 수크로스를 PBS에 대해 투석하여 제거하였다. IgG와 엑소좀 단백질 모두의 존재를 입증하기 위하여 비-환원 조건들하에서 10% 아크릴아미드를 이용한 겔 전기영동법 (SDS-PAGE)을 수행하였다.
GBM 세포주 (전날 웰 당 50'000개의 세포들을 파종함)에 수크로스 구배하여 정제한 IgG-하이브리도좀 (BCA 분석으로 결정된 웰 당 1.4μg 단백질 함량)을 형질주입하였다. 24h의 배양 후, 세포들을 세척하고 도 19에 도시된 바와 같이, 유세포 측정법으로 항-IgG 표지된 제 2 항체에 대하여 대략 80% 세포들이 양성임이 결정되었다.
실시예 11
다목적 하이브리도좀을 위한 다양한 EDEM
EDEM 카고 또는 표면 개질을 달리함으로써 별개의 구별되는 하이브리도좀들을 제조하는 능력을 두 가지 유형의 융합 분석에 의해 결정하였다.
실시예 5에서 기재된 바와 같이 R18 분석을 실시하였다. 요컨대, 실시예 1에서 기재한 상이한 iLNP 화학종들을 R18 표지된 GBM 세포주 유래 엑소좀과 융합 완충액에서 혼합하여 융합을 결정하였다. iLNP 봉입 올리고뉴클레오티드, 단백질 및 금 나노입자 (금 나노입자 단독 또는 pDNA와 공동-봉입된 금 나노입자)와의 융합이 도 20 내지 도 22에 도시되어 있다. 펩티드를 보유한 IgG 표면 개질된 iLNP와 엑소좀 사이의 융합은 도 23에 도시되어 있다.
siRNA 부하된 iLNP와 MCL-엑소좀의 융합을 결정하기 위하여 파이렌 분석법이 사용되었다. 미세유체 칩을 압출 또는 급속 혼합함으로써 이러한 siRNA-iLNP를 제조하였다 (실시예 1에서 설명됨).
이 분석법은 표지되지 않은 막과 표지된 막의 융합시 파이렌 엑시머의 희석으로 인한 모노머 형광의 증가 (대략 400nm)에 기초한다. 100μl의 PBS에서의 엑소좀 (35μg의 총 단백질)을 1-파이렌도데카노익 애시드 (Life Technologies)의 2.5mM 에탄올 용액 1μl로 37℃에서 30분간 표지하였다. 과량의 1-파이렌도데카노익 애시드를 2배수 펠릿화하고 100,000g에서 60분간 초원심분리를 통해 MES 완충액 (0.2M MES, 150mM NaCl, pH 5.5)으로 세척하여 제거하였다. 유리 파이렌을 제거한 후, 표지된 엑소좀 (10μg 총 단백질/웰)을 96-웰-플레이트에서 MES 완충액 (0.2M MES 150mM NaCl, pH 5.5)에 현탁시켰다. 표지되지 않은 iLNP (5μg의 총 지질)를 추가시 모노머 형광의 증가를 37℃에서 Synergy HT 마이크로플레이트 리더 (Biotek)를 이용하여 기록하였다. 도 24에 도시된 바와 같이, 압출 (ext) 및 미세유체 칩 (mf)에 의해 제조된 iLNP와 혼합될 때 모노머 신호의 증가가 발생한다.
실시예 12
다목적 하이브리도좀을 위한 생체적합성 전달 모듈로서 세포외 소포
다양한 유형의 세포들에 의해 분비되는 미세소포와 상이한 iLNP 간의 융합을 R18 융합 분석으로 결정하였다.
실시예 2에 도시된 바와 같이, 인간 미세소포를 혈소판 (PLT-MV) 및 다형핵 호중구 (PMN-MV)로부터 분리하였다.
실시예 5와 유사하게, 미세소포 샘플들 (0.25μg의 PLT- MV 및 1.2μg PMN-MV 총 단백질)을 R18의 에탄올 용액으로 표지한 후, 유리 염료를 제거하였다. 상이한 iLNP 화학종들을 추가시 형광의 증가를 모니터하였다.
도 25에 도시된 바와 같이, 융합 완충액에서 PMN-MV와 iLNP의 혼합은 R18의 탈소광을 가져왔다. pH 7.4에서 iLNP 추가시 pH 의존성 iLNP와 PMN-MV의 상호작용을 결정하였으며, 탈소광이 전혀 없었다. pDNA-iLNP와 BSA-iLNP의 혼합은 R18-탈소광을 가져왔다.
도 26에 도시된 바와 같이, PLT-MV와 빈 iLNP의 혼합은 pH 의존적이며 빈 iLNP 및 엑소좀의 혼합과 유사하다. PMN- 및 PLT-MV는 이들의 항-염증성 및 면역억제성 물성들로 인해 특히 BDM으로서 관심을 끈다. PMN-MV는 인간 단핵구로부터 유래된 수지상 세포에서 사이토킨 방출 (종양 괴사 인자-α, 전환 성장 인자 β1, 인터루킨-8, 인터루킨-10 및 인터루킨-12p70)을 억제하고 면역 활성화 수용체 (CD40, CD80, CD83, CD86, CCR7, HLA-DP, HA-DQ 및 HA-DR)를 감소시킬 수 있음을 보인 바 있다(Sadallah, Eken, & Schifferli, 2011).
실시예 13
형질주입하기 어려운 세포들에서 하이브리도좀의 세포 흡수
형질주입하기 어려운 림프구 세포주 (Jeko1)의 세포 흡수를 결정하기 위하여 형광 현미경이 사용되었다. MCL-exo 및 NBD 표지된 iLNP (40:40:17.5:2:0.5 배합의 DlinDMA:Chol:DSPC:PEG-S-DMG:NBD-PC의 iLNP 제형)로부터 하이브리도좀을 제조하였다. MCL-Exo (웰 당 2μg의 총 단백질)를 NBD 표지된 iLNP (웰 당 1μg의 총 지질)와 반응 완충액 (10mM MES, pH 6.0, 145mM NaCl, 5mM KCl)에서 혼합하고 37℃에서 30분간 진탕기에서 배양하였다.
하이브리도좀과 iLNP를 표적 세포들로 1h 동안 형질주입시킨 후, PBS로 2회 세척하여 표면-결합되고 유입되지 않은 소포들을 제거하였다. 그 후 세포들을 PBS에 재현탁시키고 동일한 장치 세팅하에서 형광 영상을 촬영하였다. 세포 당 iLNP 막 염료의 평균 형광 강도를 오픈 소스 소프트웨어 ImageJ에서 이미지 분석하여 결정하였다. 도 27에 도시된 바와 같이, Jeko1 세포들 (n=160)은 1h의 형질주입 후 iLNP만을 이용한 경우보다 하이브리도좀을 이용한 경우에 거의 7배 더 높은 iLNP 막 염료의 평균 강도를 보여주었다.
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Claims (211)

  1. 하이브리드 생체적합성 담체 (하이브리도좀)의 제조 방법에 있어서,
    a. 막을 포함하는 제 1 소포를 제공하되, 상기 제 1 소포는 시험관내 생성된 것이며, 상기 제 1 소포는 이온화가능한 융합유도 양이온성 지질을 포함하는 단계;
    b. 생체내 생성되어 세포외 환경으로 방출되는 지질 이중층을 포함하는 자연적으로 분비되는 제 2 소포를 제공하는 단계;
    c. 상기 제 1 소포를 7.4 미만의 pH 및 0°C 내지 60°C의 온도의 완충액에서 상기 제 2 소포와 접촉시킴으로써, 상기 제 1 소포를 상기 제 2 소포와 일체화시켜 하이브리도좀을 생성하는 단계를 포함하고,
    여기서 상기 이온화가능한 융합유도 양이온성 지질은 생리학적 pH 미만의 pH에서 양으로 하전되고 생리학적 pH 이상에서 중성이도록, 하나 이상의 양자 공여성(protonatable) 또는 탈양자성 그룹을 갖는, 제조 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 제 1 소포는 제 1 소포의 총 지질 중 최소한 30% 몰 농도의 이온화가능한 융합유도 양이온성 지질을 포함하는, 제조 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 접촉 단계는 다음 중 최소한 하나에서 실시되는, 제조 방법:
    a. 4 내지 6의 pH를 가지는 완충액에서; 그리고
    b. 37°C의 반응 온도에서.
  4. 청구항 1에 있어서, 생리학적 pH는 7.4인, 제조 방법.
  5. 청구항 1에 있어서:
    a. 상기 제 1 소포는 지질계 나노입자 (LNPs), 리포좀, 폴리머-안정화 LNPs, 세라좀, 스핑고솜, 니오좀, 폴리머솜, 합성-나노입자 안정화된 LNPs, 천연 막-유래 LNPs, 그리고 천연 막-코팅 LNPs로 이루어진 군에서 선택되며, 그리고
    b. 상기 제 2 소포는 엑소좀, 엑토좀, 미세소포 및 세포고사체로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 제조 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 이온화가능한 양이온성 지질은 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLinDMA), 2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란 (DLin-KC2-DMA), 헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일4-(디메틸아미노)부타노에이트 (DLin-MC3-DMA), 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판 (DODAP), N-(4-카르복시벤질)-N,N-디메틸-2,3-비스(올레오일옥시)프로판-1-아미늄 (DOBAQ), YSKO5, 4-(((2,3-비스(올레오일옥시)프로필)-(메틸)아미노)메틸)벤조익 애시드 (DOBAT), N-(4-카르복시벤질)-N,N-디메틸-2,3-비스(올레오일옥시)프로판-1-아미늄 (DOBAQ),3-((2,3-비스(올레오일옥시)프로필)(메틸)아미노)프로파노익 애시드 (DOPAT), N-(2-카르복시프로필)-N,N-디메틸-2,3-비스-(올레오일옥시)-프로판-1-아미늄 (DOMPAQ), N-(카르복시메틸)-N,N-디메틸-2,3-비스(올레오일옥시)프로판-1-아미늄 (DOAAQ), Alny-100, 3-(디메틸아미노)-프로필(12Z,15Z)-3-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일]-헤니코사-12,15-디에노에이트 (DMAP-BLP), 그리고 이온화가능한 아미노 지질의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 제조 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 제 1 소포는 표적화 모이어티를 추가로 포함하고, 이때 표적화 모이어티는 항체 또는 이의 단편, 항체-유사 분자, 펩티드, 단백질, 압타머, 올리고뉴클레오티드 및 폴리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 제조 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 제 1 소포는 PEG-인지질, PEG-개질 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE), PEG-개질 세라마이드, PEG-개질 디알킬아민, PEG-개질 디아실글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜 디팔미토일글리세롤 (PEG-DPG), PEG-개질 디알킬글리세롤 (메톡시 폴리에틸렌 글리콜)-디미리스톨글리세롤 (PEG-s-DMG), PEG- 디알킬옥시프로필 (DAA), R-3-[(ω-메톡시-폴리(에틸렌글리콜)2000)카르바모일)]-1,2-디미리스틸옥시프로필-3-아민 (PEG-c-DOMG) 및 N-아세틸갈락토스아민-((R)-2,3-비스(옥타데실옥시)프로필-l-(메톡시-폴리(에틸렌글리콜)2000)프로필카바메이트)) (GalNAc-PEG-DSG)로 이루어진 군으로부터 선택된 PEG-개질된 지질을 추가로 포함하는 제조 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 제 2 소포는 다음에서 유래하는, 제조 방법:
    a. 암 또는 전-암 (pre-cancer) 환자의 종양 세포, 또는 종양 또는 암 세포주;
    b. 교모세포종 세포 또는 맨틀 세포 림프종 세포;
    c. B-세포, 항원 제공 세포, 림프구, 혈소판, 호중구, 활성화된 다형핵 호중구 및 백혈구로 이루어진 군에서 선택된 세포;
    d. 세균성 병원체, 아메바성 병원체, 기생충성 병원체 또는 진균 병원체; 또는
    e. 병원체 감염된 세포.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 제 1 소포는 생물활성제를 봉입하는, 제조 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 생물활성제는 치료제인, 제조 방법.
  12. 청구항 10에 있어서, 생물활성제는 다음과 같은, 제조 방법:
    a. 약물 또는 이의 제약상 허용가능한 염 또는 이의 유도체;
    b. 항체-계 치료제; 또는
    c. 펩티드, 단백질, 또는 핵산.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 제 1 소포는 작은 간섭 RNA (siRNA), 안티센스 RNA, 마이크로 RNA (miRNA), 작은 또는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 가이드 RNA (gRNA), 주기적 간격으로 분포된 짧은 회문구조 반복서열 RNA (crRNA), 트랜스-활성화 주기적 간격으로 분포된 짧은 회문구조 반복서열 RNA (tracrRNA), 면역-자극 올리고뉴클레오티드, 플라스미드, 안티센스 핵산 및 리보자임으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산을 봉입하는 제조 방법.
  14. 청구항 1에 있어서:
    a. 상기 제 1 소포는 최소한 하나의 항원을 인코드하는 mRNA 및 최소한 하나의 개질 핵산 분자를 봉입하고; 또는
    b. 상기 제 2 소포는 종양-관련 항원 및 병원체-관련 항원으로 이루어진 군에서 선택된 질병-관련 항원을 포함하는, 제조 방법.
  15. 청구항 1에 있어서, 상기 제 1 소포는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 제제를 봉입하는, 제조 방법:
    a. 225Ac, 72As, 211At, 11B, 128Ba, 212Bi, 75Br, 77Br, 14C, 109Cd, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 18F, 67Ga, 68Ga, 3H, 123I, 125I, 130I, 131I, 111In, 177Lu, 13N, 15O, 32P, 33P, 212Pb, 86Re, 188Re, 47Sc, 153Sm, 89Sr, 99mTc, 88Y 및 90Y에서 선택된 방사성동위원소; 및
    b. 양자 점, 및 금, 은, 철 산화물 및 철 나노입자에서 선택된 금속 나노입자.
  16. 청구항 1에 있어서, 상기 제조 방법은 상기 접촉 단계의 환경의 pH를 증가시킴으로써 상기 일체화 방법을 종결하는 단계를 추가로 포함하는, 제조 방법.
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