JP6598786B2 - ハイブリドソーム、それを含む組成物、それらの製造方法、およびその使用 - Google Patents
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Description
(a)少なくとも一つの膜融合性部分を有する少なくとも一つのEDEMまたはそのEDEMを含む組成物を提供する工程;
(b)少なくとも一つのBDMまたはそのBDMを含む組成物を提供する工程;
(c)前記少なくとも一つのEDEMを前記少なくとも一つのBDMと、7.4より低いpHおよび0℃〜60℃の間の温度で接触させて、それにより前記少なくとも一つのEDEMを前記少なくとも一つのBDMと統合させて、前記ハイブリドソームを生産する工程;ならびに、任意に、
(d)非融合EDEMおよび/またはBDMから前記ハイブリドソームを精製する工程を含む、方法を提供する。
(a)少なくとも一つの膜融合性部分を有する少なくとも一つのEDEMまたはそのEDEMを含む組成物を提供する工程;
(b)少なくとも一つのBDMまたはそのBDMを含む組成物を提供する工程;
(c)前記少なくとも一つのEDEMを前記少なくとも一つのBDMと、7.4より低いpHおよび0℃〜60℃の間の温度で接触させて、それにより前記少なくとも一つのEDEMを前記少なくとも一つのBDMと統合させて、前記ハイブリドソームを生産する工程;ならびに、任意に、
(d)非融合EDEMおよび/またはBDMから前記ハイブリドソームを精製する工程を含む、方法を提供する。
加工および薬物カプセル化モジュールとしてのiLNPの製造
実施例1〜4のための材料と方法
A)化学物質
1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−[アミノ(ポリエチレン−グリコール)−2000](アミン−PEG−DSPE)、[1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−(7−ニトロ−2−1,3−ベンゾオキサジアゾール−4−イル)](NBD−PE)、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−[マレイミド(ポリエチレングリコール)−2000](mal−PEG−DSPE)、ジステアロイル−ホスファチジルコリン(DSPC)、1,2−ジオレオイル−3−ジメチルアンモニウム−プロパン(DODAP)、N−パルミトイル−スフィンゴシン−1−サクシニル[メトキシ(ポリエチレングリコール)2000](PEG−Cer)、およびコレステロールは、Avanti Polar Lipids(Alabaster、AL)から購入した。1,2−ジリノレイルオキシ−3−ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)とPEG−脂質の合成は過去に記載されている(Heyes、Palmer、Bremner&MacLachlan、2005年)。
プレフォームド小胞の調製:小胞の望ましい特性に依存して、イオン化可能なカチオン性脂質(DLinDMAまたはDODAP)、DSPC、コレステロール、およびPEG−脂質(PEG−s−DMGまたはPEG−Cer)を、エタノール中に適切なモル比(例、40:17.5:40:2.5)で可溶化した。小胞を形成させるために、終濃度が約10mMおよびエタノール対水の比が3:7に到達するまで、ボルテックス下で低pHの水性バッファー(50mMアセテート、pH4)中に、脂質製剤を混合した。生成された多層小胞を、その後、室温でMini−Extruder(ミニ押出機)(Avanti製)を使用して、二つの積層した80nmまたは100nm孔サイズNuclepore(商標)ポリカーボネートフィルターを通して押出成形した。
高速混合ミクロ流体システムを採用することによるsiRNA充填脂質ナノ粒子の調製:製造事業者の取扱説明書に従って、Nanoassemblr(商標)ミクロ流体システム(Precision NanoSystems社)で、脂質ナノ粒子を調製した。所望の製剤に依存して、プレフォームド小胞法のエタノール溶液に類似する溶液(DLinDMA、コレステロール、DSPC、およびPEG−脂質が適切なモル比(例、40:40:18:2)からなるもの)を、総脂質が10mMの濃度で調製した。さらにまた、siRNA対脂質の比(wt/wt)が1:16である水性siRNA溶液を、25mMアセテートバッファー(pH4.0)中に調製した。総製造量に依存するが、1および3mlシリンジを用いて、総流速が12ml/分の投入口流を作り出した。各製剤に関して、水性siRNA溶液を、室温で流速比が3:1(Aq:Et)となるようにエタノール−脂質溶液と混ぜた。生成物を、その後、PBSに対して透析して、残存エタノールを除去すると共にpHを7.4へと上昇させた。そして、上記プレフォームド小胞法を用いて説明したように遊離siRNAを除去した。
生体適合性送達モジュールとしての細胞外小胞(EV)の単離
エキソソーム:エキソソームを、分画遠心法(Theryら(Thery、Amigorena、Raposo&Clayton、2006年)により過去に記載されるもの)によって、マントル細胞リンパ腫細胞株(MCL−exo)とグリオブラストーマ細胞株(GBM−exo)の上清から単離した。エキソソームは、その後、BCA(商標)タンパク質アッセイキット(Pierce−Thermo Fisher Scientific社)を使用してタンパク質含量の測定を行った。そして、エキソソームのアリコートを−80℃で保存した。さらに精製するために、エキソソームのペレットを、PBS中に溶解し、標準的手順を使用して、ショ糖クッションの上に層とした。
PEG化脂質をFab’断片、抗体断片、ペプチド、およびグリコサミノグリカンと連結することによるiLNPの表面修飾
還元型抗体、Fab’断片、融合ペプチド、およびグリコサミノグリカンを、iLNP膜中にアンカーされているPEG化脂質へと結合することによって、iLNPの加工適合性を実証した。実施例1の製剤と比較すると、0.5モル%のPEG化脂質を、PEGの遠位端にマレイミド基またはアミン基を有するPEG修飾脂質で代替した。(1)遠位PEG末端のマレイミド基と還元型抗体、Fab’断片、または末端にチオール基を有するペプチドのフリーなチオール基との間、(2)遠位PEG末端のアミン基とグリコサミノグリカン(GAG)のグリコサミノグリカン鎖上の活性化カルボキシル基との間の反応に基づく標準的手順に従って、結合を実施した。
Fab’断片:第一に、供給元の説明書に記述されている終濃度の1/5を使用して、2−メルカプトエタノール(MEA)(Pierce−Thermo Fisher Scientific社)を用いて、抗CD38 F(ab)2断片を還元した。60μgのF(ab)2を、37℃で90分間、反応液(1mMのEDTA、PBS)中、10mMのMEAとインキュベーションした。Zeba(商標)スピン脱塩カラム(Pierce−Thermo Fisher Scientific社)を使って、反応バッファーへバッファー交換して、MEAを除去した。siRNAを充填したiLNPを(mal:Fab’の比が2:1で)すぐに加えて、そして、一晩4℃でプレートを振とうしてインキュベーションした。非結合抗体/断片を、PBS(pH7.4)で平衡化したSepharose CL−4Bカラム上で分離した。Fab’断片を含む画分を、280nmでの吸光度測定値から決定し、一緒にプールして、そして、10kDa遠心分離フィルター(Amicon(登録商標)ウルトラ−0.5、Merck Millipore社)中で濃縮した。非還元条件下で、ゲル電気泳動(SDS−PAGE)(10%アクリルアミドを使用するもの)を実施して、F(ab)2からFab’へと還元する過程の後のFab’断片の完全性を確認した。
iLNPとインビボで分泌されるEVの特徴解析
実施例1、2、および3で記載したようにiLNPの製造とEVの単離の後、標準的手順を使用し、DLS(Zetasizer NS、Malvern)およびNTA(LM20、Nanosight)を使用してiLNPとEVのサイズ分布を記録した。表1に示すように、平均サイズは、積み荷のカプセル化またはiLNPの表面修飾に伴って増加した。合成条件の制御に起因して、iLNPは多分散指数(PDI)が低く(それは鋭く単一の最頻値を有するNTAサイズ分布にも反映されている)作製可能である。分泌小胞としてのエキソソームは固有の多分散度を有する。図3に示すように、NTA解析の単粒子法は、空のiLNPに関しては単一の最頻値を有するサイズ分布を示し、そして、GBM−exoは互いに異なるサイズの亜集団があるのを明らかにする。
BDMとEDEMの相互作用の開始の制御
iLNPとエキソソームとの間の相互作用がpH環境の変化によって誘導可能であるかどうかを検証した。図4に示すように、iLNP/エキソソーム溶液の平均直径は、融合バッファー(10mMのMES(pH5.5)、145mMのNaCl、5mMのKCl)中で増加するが、pH7.4では有意な変化は明確でない。DLS測定は全体的効果の性状なので、二つのサブユニット間の相互作用の存在を明確に推定することは難しい。従って、次に焦点を、エキソソームとiLNPの両者の脂質膜間の相互作用に向けた。
単粒子上で精査されるBMDとEDEMの相互作用
検証の次の焦点は、単粒子レベルでのエキソソームとiLNPとの間の相互作用である。エキソソームタンパク質とリポソーム膜との混合物を含む粒子の時間的出現を、蛍光相互相関分光法(FCCS)装置中で定量した。FCCS測定の準備のため、iLNP膜を親油性Bodipy(商標)(630/650)で標識する一方、エキソソーム表面タンパク質をBodipy(商標)NHSエステル(493/502)と結合することによって標識した。エキソソームとiLNPの両者を、その後、相当な粒子数で融合バッファー中で混合した。そして、両方のチャネルでの相関する強度変動の出現を記録した。両方の検出器上の同調シグナルは、凝集または融合エキソソームとiLNPを示す一方、個々の粒子は時間的に独立したシグナルを生成する。図10では、エキソソーム−Bodipy(493)とiLNP−Bodipy(630)を混ぜた際の相互相関度(θ)の増加を経時的に示す。緑と赤のチャネル間の相関は、二種類の粒子を混合直後には観察されなかった。8分間の時間推移に渡って、個々の粒子の相互相関度は、0%から約70%へと増加した。これは、調査した粒子の総蛍光バーストの70%近くがエキソソーム表面タンパク質およびリポソーム膜を示すことを意味する。
膜融合性EDEMとBDMが融合してハイブリドソームを形成する
単純凝集、構造破壊、または脂質交換に起因する偽陽性融合アッセイである可能性を排除するために、pH5.5での積み荷の無いiLNP/エキソソーム混合物の平均サイズおよびサイズ分布を、DLSとNTAを介して複数の異なる時点で記録した。同一の実験条件を使用して、z−平均の平均サイズを10時間モニターした。図11に示すように、混合の最初の1時間内では、平均粒子サイズが急激に増加し、次の9時間に渡ってはほとんど変化しないままであった。凝集の場合、互いに逆に帯電した小胞は静電的な構造物へと連続的に凝集する能力を有するが、この場合はそれには当たらない。凝集でないことをさらに示すことは、直径増加の程度である。二つの融合球体の体積は半径に伴ってある割合で増加し、その様式は、85nmと130nmの球体の融合により141nmの粒子が生じ得るということである。他方、凝集では、凝集物に連結する球体がさらにあるごとに直線的に半径が増加する。このことは、サブユニットの直径の倍数の範囲での大きな直径増加としてはっきり表れるであろう。このことはさらに図12で示されるように支持される。融合バッファー(室温で保存されたもの)中のsiRNA−iLNPとMCL−exosとの混合物は、9日間に渡って平均直径の有意な増加を示さなかった。
ハイブリドソーム媒介遺伝子導入はGFP発現を導く
遺伝子の積み荷をハイブリドソームを介して送達することの機能性を実証するために、GBM細胞株エキソソームとGFPプラスミドをカプセル化したiLNPとからハイブリドソームを製造した。試験製剤をトランスフェクトしたGBM細胞中でのレポーターGFPの発現を、フローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡解析によって解析した。細胞(前日に50,000細胞を播種したもの)に、iLNP(ウエル当たり500ngのGFP−pDNA)と積み荷を有するハイブリドソーム(ウエル当たり5μgの総タンパク質/500ngのGFP−pDNA)をトランスフェクトした。ハイブリドソームは、トランスフェクション前にエキソソームをpDNA−iLNPと融合バッファー中で30分間混合して製造した。トランスフェクションがエキソソーム誘導性エンドサイトーシスのために偶然にiLNPの内在化が起こった結果であることを排除するために、細胞に、また、非融合iLNP(ウエル当たり500ngのGFP−pDNA)とエキソソーム(ウエル当たり5μgのタンパク質)とをコトランスフェクトした。0.5、1、2、または24時間のトランスフェクション時間後、細胞をPBSで二回洗浄し、新鮮な培地を加え、そして、細胞を72時間培養した。GFP発現細胞の量をフローサイトメトリーで解析した(図15参照)。ハイブリドソームは、pDNA−iLNPまたはエキソソームとコトランスフェクトした非融合型pDNA−iLNPと比較すると、より高いトランスフェクション率を示す。
ハイブリドソームの精製
トランスフェクション実験において非融合iLNPの干渉を除外するために、連続性ショ糖密度勾配遠心分離によって、非融合iLNPをハイブリドソームから分離した。pDNA−iLNPの密度を測定するために、pDNA−iLNPを0〜55%ショ糖(重量/体積)連続性勾配上で遠心分離し(190,000g、14時間)、そして、カラム分画を行った。ショ糖画分の密度を、屈折率測定器で測定し、そして、粒子の存在をDLSでの光子数により解析した。データは、pDNA−iLNPの最大密度が1.05g/mlであることを示す(図16参照)。
ハイブリドソーム上の外因性標的化部分
IgGで表面を修飾した上記iLNPを使用して、表面にIgG断片を有するハイブリドソームを調製した。実施例9におけるプラスミドを充填したハイブリドソームの濃縮と同様に、IgGが繋がれているiLNPをGBM由来エキソソームと融合バッファー中で30分間(脂質対エキソソームタンパク質の重量比が6:1で)混合し、そして、非融合iLNPをショ糖勾配にて分離した。粒子層は、密度が1.12〜1.14g/mlの所に視認された(プラスミドを搭載したハイブリドソームがRf=0.36だったのに対して、Rf=0.62であった)。1.08g/mlより下にある画分をプールし、そして、PBSに対して透析することによって残存ショ糖を除去した。10%アクリルアミドを使用するゲル電気泳動(SDS−PAGE)を非還元条件下で実行してIgGとエキソソームタンパク質の両者の存在を確認した。
汎用性ハイブリドソーム用の多様なEDEM
EDEMの積み荷または表面修飾を変えることによって異なるハイブリドソームを製造する能力を、2つのタイプの融合アッセイによって決定した。
汎用性ハイブリドソーム用の生体適合性送達モジュールとしての細胞外小胞
各種型の細胞により分泌される微小胞と様々なiLNPとの間の融合をR18融合アッセイによって測定した。
トランスフェクトするのが難しい細胞におけるハイブリドソームの細胞取り込み
蛍光顕微鏡観察を行って、トランスフェクトするのが難しいリンパ球細胞株(Jeko1)によるハイブリドソームの細胞取り込みを測定した。ハイブリドソームをMCL−exoとNBD標識iLNP(iLNP製剤はDlinDMA:Chol:DSPC:PEG−S−DMG:NBD−PCが40:40:17.5:2:0.5で製剤化したもの)から調製した。MCL−Exo(ウエル当たり2μgの総タンパク質)をNBD標識iLNP(ウエル当たり1μgの総タンパク質)と反応バッファー(10mMのMES(pH6.0)、145mMのNaCl、5mMのKCl)中で混合し、そして、37℃で30分間、振とう機上でインキュベーションした。
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Claims (14)
- ハイブリッド生体適合性担体(ハイブリドソーム)を製造する方法であって、前記方法が、
(a)膜を含む第一の小胞を提供する工程であって、前記小胞はインビトロで生産され、前記小胞は、膜融合性のイオン化可能なカチオン性脂質を、第一の小胞の脂質合計に対し少なくとも30%のモル濃度で含む、工程と、
(b)インビボで生産されて、細胞外環境中に放出される、脂質二重膜を含む自然に分泌される第二の小胞を提供する工程と、
(c)前記第一の小胞を前記第二の小胞と、7.4より低いpHおよび0℃〜60℃の間の温度にてバッファー中で接触させて、それにより前記第一の小胞を前記第二の小胞と統合させて、前記ハイブリドソームを生産する工程と
を含み、膜融合性の前記イオン化可能なカチオン性脂質が生理学的pH7.4以下のpHで正に荷電し、かつ生理学的pH7.4を超えると中性である、方法。 - 工程(c)が、
(a)pH4〜6のバッファー中で、および/または
(b)約37℃の反応温度で
実施される、請求項1に記載の方法。 - 前記第二の小胞がエキソソーム、エクトソーム、微小胞、およびアポトーシス小体からなる群より選択される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記第一の小胞が、脂質系ナノ粒子(LNP)、リポソーム、ポリマー安定化LNP、セラソーム、スフィンゴソーム、ポリマーソーム、合成ナノ粒子安定化LNP、天然膜由来LNP、および天然膜でコーティングされたLNPからなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記イオン化可能なカチオン性脂質が、1,2−ジリノレイルオキシ−N,N−ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)、2,2−ジリノレイル−4−(2−ジメチルアミノエチル)−[1,3]−ジオキソラン(DLin−KC2−DMA)、ヘプタトリアコンタ−6,9,28,31−テトラエン−19−イル4−(ジメチルアミノ)ブタノエート(DLin−MC3−DMA);1,2−ジオレオイル−3−ジメチルアンモニウム−プロパン(DODAP)、N−(4−カルボキシベンジル)−N,N−ジメチル−2,3−ビス(オレオイルオキシ)プロパン−1−アミニウム(DOBAQ)、YSK05、4−(((2,3−ビス(オレオイルオキシ)プロピル)−(メチル)アミノ)メチル)安息香酸(DOBAT)、N−(4−カルボキシベンジル)−N,N−ジメチル−2,3−ビス(オレオイルオキシ)プロパン−1−アミニウム(DOBAQ)、3−((2,3−ビス(オレオイルオキシ)プロピル)(メチル)アミノ)プロパン酸(DOPAT)、N−(2−カルボキシプロピル)−N,N−ジメチル−2,3−ビス−(オレオイルオキシ)−プロパン−1−アミニウム(DOMPAQ)、N−カルボキシメチル)−N,N−ジメチル−2,3−ビス(オレオイルオキシ)プロパン−1−アミニウム(DOAAQ)、アルニー(Alny)−100、3−(ジメチルアミノ)−プロピル(12Z,15Z)−3−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イル]−ヘニコサ−12,15−ジエノエート(DMAP−BLP)、および、イオン化可能なアミノ脂質の誘導体からなる群より選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第一の小胞が、標的化部分を含み、前記標的化部分が、抗体またはその断片、抗体様分子、ペプチド、タンパク質、アプタマー、オリゴヌクレオチド、およびポリサッカライドからなる群より選択される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第一の小胞が、特に、PEG−リン脂質、PEG−修飾ホスファチジルエタノールアミン(PEG−PE)、PEG−修飾セラミド、PEG−修飾ジアルキルアミン、PEG−修飾ジアシルグリセロール、ポリエチレングリコールジパルミトイルグリセロール(PEG−DPG)、PEG−修飾ジアルキルグリセロール(メトキシポリエチレングリコール)−ジミリストイルグリセロール(PEG−s−DMG)、PEG−ジアルキルオキシプロピル(DAA)、R−3−[(ω−メトキシ−ポリ(エチレングリコール)2000)カルバモイル)]−1,2−ジミリストイルオキシプロピル−3−アミン(PEG−c−DOMG)、およびN−アセチルガラクトサミン−((R)−2,3−ビス(オクタデシルオキシ)プロピル−1−(メトキシ−ポリ(エチレングリコール)2000)プロピルカルバメート))(GalNAc−PEG−DSG)からなる群より選択される、PEG修飾脂質を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第二の小胞が、
(a)がんもしくは前がん患者の腫瘍細胞に由来するか、または、腫瘍もしくはがん細胞株に由来するか、
(b)グリオブラストーマ細胞またはマントル細胞リンパ腫細胞に由来するか、
(c)B細胞、抗原提示細胞、リンパ球、血小板、好中球、活性化多形核好中球および白血球からなる群から選択される細胞に由来するか、
(d)細菌病原体、アメーバ病原体、寄生虫病原体または真菌病原体に由来するか、あるいは
(e)病原体感染細胞に由来する、
請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第一の小胞が、
(a)薬物または医薬的に許容可能なその塩もしくは誘導体、
(b)抗体に基づいた治療薬、
(c)ペプチド、タンパク質、および核酸
から選択される一又は複数の治療薬を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第一の小胞が、低分子干渉RNA(siRNA)、アンチセンスRNA、マイクロRNA(miRNA)、スモールまたはショートヘアピンRNA(shRNA)、ガイドRNA(gRNA)、CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)RNA(crRNA)、トランス活性化CRISPRRNA(tracrRNA)、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、プラスミド、アンチセンス核酸、およびリボザイムからなる群より選択される核酸を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- (a)前記第一の小胞が、少なくとも一つの抗原をコードする修飾核酸分子および/もしくはmRNAを含み、ならびに/または
(b)前記第二の小胞が、腫瘍関連抗原および病原体関連抗原から選択される疾患関連抗原を含む、
請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第一の小胞が、
(a)225Ac、72As、211At、11B、128Ba、212Bi、75Br、77Br、14C、109Cd、62Cu、64Cu、67Cu、18F、67Ga、68Ga、3H、123I、125I、130I、131I、111In、177Lu、13N、15O、32P、33P、212Pb、103Pd、186Re、188Re、47Sc、153Sm、89Sr、99mTc、88Y、および90Yからなる群より選択される放射性同位元素、
(b)酸化鉄ナノ粒子、量子ドット、ならびに金、銀、および鉄ナノ粒子から選択される金属ナノ粒子
から選択される一又は複数の因子を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。 - 請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法によって得られたハイブリッド生体適合性担体(ハイブリドソーム)。
- 治療薬または診断薬を細胞内に送達させるための、請求項13に記載のハイブリドソーム。
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