KR20230172538A - Fc-유래된 폴리펩티드 - Google Patents

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KR20230172538A
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조엘 드 비어
모니크 마우러
니콜라스 메이어
라바니야 쿠날링암
마르셀로 클레리치
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안자리움 바이오사이언시스 아게
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Abstract

본 개시내용은 막관통 도메인 및 FcRn 결합 부위 (예컨대, 변형된 Fc 도메인)를 포함하는 폴리펩티드, 및 이러한 폴리펩티드를 포함하는 나노소포 (예컨대, 세포외 소포 (EV) 및 하이브리도좀)에 관한 것이다. 상기 폴리펩티드는 이러한 폴리펩티드를 포함하는 나노소포의 단리 및 정제를 용이하게 할 수 있다. 폴리펩티드 및 나노소포는 치료적 및/또는 진단적 적용에 사용될 수 있다. 또한, 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 및 발현 벡터뿐만 아니라 상기 폴리펩티드를 발현하는 세포가 제공된다. 이러한 폴리펩티드를 포함하는 나노소포를 생산하는 방법 및 이들 나노소포를 정제하는 방법이 추가로 제공된다. 이러한 폴리펩티드 또는 나노소포를 포함하는 조성물뿐만 아니라 이들의 용도가 또한 기재되어 있다.

Description

FC-유래된 폴리펩티드
우선권
본 출원은 2021 년 4 월 14 일에 출원된 미국 일련 제63/174,855호에 대한 우선권을 주장하며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용된다.
전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조
본 출원은 2022 년 4 월 8 일에 생성되고 176,537 바이트의 크기를 갖는 "14497-004-228_Sequence_Listing.txt"라는 이름의 텍스트 파일로서 본 출원과 함께 제출된 서열 목록을 참조로 포함한다.
1. 분야
본 개시내용은 막관통 도메인 및 FcRn 결합 부위 (예컨대, 변형된 Fc 도메인)를 포함하는 폴리펩티드 및 이러한 폴리펩티드를 포함하는 나노소포 (예컨대, 세포외 소포 (EV) 및 하이브리도좀)에 관한 것이다. 상기 폴리펩티드는 이러한 폴리펩티드를 포함하는 나노소포의 단리 및 정제를 용이하게 할 수 있다. 폴리펩티드 및 나노소포는 치료적 및/또는 진단적 적용에 사용될 수 있다. 또한, 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 및 발현 벡터뿐만 아니라 상기 폴리펩티드를 발현하는 세포가 제공된다. 이러한 폴리펩티드를 포함하는 나노소포를 생산하는 방법 및 이들 나노소포를 정제하는 방법이 추가로 제공된다. 이러한 폴리펩티드 또는 나노소포를 포함하는 조성물뿐만 아니라 이들의 용도가 또한 기재된다.
2. 개시내용의 배경기술
유망한 새로운 약물 후보의 식별에 있어 중대한 큰 발전에도 불구하고, 이러한 발견을 임상에 옮기는 것은 종종 효과적인 약물 투여량을 질환의 부위에 전달하는 것에 있어서의 어려움으로 인해 방해를 받는다. 최근 발견된 세포-간 통신 경로는 보다 정확한 약물 전달을 위한 누락된 퍼즐 조각을 제공할 수 있다. 우리의 신체 내의 거의 모든 세포는 세포외 소포 (EV)라고 불리는 작은 "풍선"의 방출을 통해 이웃 세포뿐만 아니라 떨어져 있는 세포와도 연결을 확립할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이러한 EV, 특히 엑소좀이 시그널링 분자의 기능적 셔틀이라는 발견은 이들이 현대 의약품의 약물 전달 시스템에 대한 이상적인 나노규모 후보로서 제시될 수 있다는 제안으로 이어졌다. 그러나, 이러한 개념은 EV를 제조 및 단리하는 것뿐만 아니라 순환 반감기를 증가시키는 것과 관련된 것을 포함하여 몇 가지 어려움과 관련이 있다. 따라서, EV-기반 기술의 치료적 용도 및 기타 적용을 더 잘 가능하게 하기 위해 EV의 생성, 단리 및 정제와 관련된 적합한 방법 및 조성물이 필요하다.
따라서, 산업적 제약에 적합하고 치료적 품질의 소포 제제의 생산을 가능하게 하는, 막 소포 제조의 개선된 방법에 대한 필요성이 있다. 이를 위해, 국제 특허 출원 공개공보 WO2019/081474호는 크로마토그래피 매트릭스에 결합된 항체의 Fc 도메인을 사용함으로써 Fc-결합 폴리펩티드를 포함하도록 유전적으로 조작된 EV를 포착하고, 8 미만, 또는 바람직하게는 6 미만의 pH로 낮춤으로써 포착된 EV의 용리를 촉발시키기 위한 크로마토그래피 기술을 개시한다. 그러나, 특히 EV 치료적 분야가 EV-기반 요법의 임상 번역 및 영향으로 발전함에 따라 상기 방법에 비해 유의한 개선이 필요하다.
본원의 참고문헌의 인용은 이것이 본 개시내용에 대한 선행 기술임을 인정하는 것으로서 해석되어서는 안 된다.
3. 개시내용의 요약
일 양태에서, 본원은 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 다음을 포함한다: a. 막관통 도메인; 및 b. i. FcRn의 Fc 결합 부위에 특이적으로 결합할 수 있고; ii. 동종이합체를 형성하는 능력이 결여된, 면역글로불린의 변형된 Fc 도메인.
특정 실시양태에서, 6.5의 pH에서 FcRn에 결합된 변형된 Fc 도메인의 평형 해리 상수는 최대 10-4 M의 값을 갖는다. 특정 실시양태에서, pH 7.4에서 FcRn에 결합된 변형된 Fc 도메인의 평형 해리 상수는 10-4 M 이상의 값을 갖는다.
특정 실시양태에서, 변형된 Fc 도메인은 인간 FcRn (서열번호 7) 및/또는 마우스 FcRn (서열번호 8)의 위치 135-158 사이의 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 변형된 Fc 도메인은 아미노산 서열 LNGEEFMX1FX2X3X4X5GX6WX7GX8W (서열번호 6)에 특이적으로 결합할 수 있으며, 여기서 X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7 및 X8 각각은 임의의 아미노산이다.
특정 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 C1q, FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII에 실질적으로 결합하지 않는다.
특정 실시양태에서, 변형된 Fc 도메인의 보체 의존적 세포독성 (CDC) 활성, 변형된 Fc 도메인의 항체 의존적 세포 매개된 세포독성 (ADCC) 활성, 변형된 Fc 도메인의 항체 의존적 세포 매개된 식세포작용 (ADCP) 활성, 및/또는 변형된 Fc 도메인의 항체 의존적 세포내 중화 (ADIN) 활성은 미변형된 Fc 도메인과 비교하여 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이상 감소된다.
특정 실시양태에서, 변형된 Fc 도메인의 보체 의존적 세포독성 (CDC) 활성, 변형된 Fc 도메인의 항체 의존적 세포 매개된 세포독성 (ADCC) 활성, 변형된 Fc 도메인의 항체 의존적 세포 매개된 식세포작용 (ADCP) 활성 및/또는 변형된 Fc 도메인의 항체 의존적 세포내 중화 (ADIN) 활성은 미변형된 Fc 도메인과 비교하여 1.5, 2, 3, 4 또는 5-배 이상 감소된다.
특정 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단으로, 다음을 포함한다: a. 미변형된 CH2 도메인에 비해 이펙터 기능이 감소되도록 변형되는 변형된 CH2 도메인; b. 미변형된 CH3 도메인에 비해 동종이합체화가 결여되도록 변형되는 변형된 CH3 도메인; c. 링커 서열; 및 d. 막관통 도메인.
특정 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 C-말단에서 N-말단으로, 다음을 포함한다: a. 미변형된 CH3 도메인에 비해 동종이합체화가 결여되도록 변형되는 변형된 CH3 도메인; b. 미변형된 CH2 도메인에 비해 이펙터 기능이 감소되도록 변형되는 변형된 CH2 도메인; c. 링커 서열; 및 d. 막관통 도메인.
다양한 실시양태에서, 막관통 도메인은 다중통과 막관통 도메인이다.
구체적인 실시양태에서, 폴리펩티드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적화 도메인을 추가로 포함한다: scFv, (scFv)2, Fab, Fab', F(ab')2, F(abl)2, Fv, dAb, Fd 단편, 디아바디, F(ab)2, F(ab'), F(ab')3, Fd, Fv, 디설파이드 연결된 Fv, dAb, sdAb, 나노바디, CDR, di-scFv, bi-scFv, tascFv (탠덤 scFv), 아비바디 (예컨대, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디), T-세포 관여자 (BiTE), V-NAR 도메인, Fcab, IgGACH2, DVD-Ig, 프로바디, 인트라바디, DARPin, 센티린(Centyrin), 아피바디, 아필린, 아피틴, 안티칼린, 아비머, 파이노머, Kunitz 도메인 펩티드, 모노바디, 아드넥틴, 트리바디 및 나노피틴.
다른 양태에서, 본원은 본원에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제공한다.
다른 양태에서, 본원은 본원에 기재된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
다른 양태에서, 본원은 본원에 기재된 핵산 또는 본원에 기재된 발현 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
다른 양태에서, 본원은 본원에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 세포외 소포를 제공한다.
다른 양태에서, 본원은 본원에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 하이브리도좀을 제공한다.
다른 양태에서, 본원은 세포외 소포 (EV)를 정제하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 다음을 포함한다: a. 제1 결합 파트너와 회합되어 있는 EV를 제공하는 단계이되, 여기서 제1 결합 파트너는 pH 의존적 방식으로 FcRn의 Fc 결합 부위에 결합할 수 있는, 단계; 및 b. 제1 결합 파트너와 회합된 EV를 제2 결합 파트너와 제1 pH에서 접촉시키는 단계이되, 여기서 제2 결합 파트너는 FcRn의 Fc 결합 부위를 포함하고 고체 매트릭스와 회합되어 있는, 단계; 및 c. 제2 pH에서 고체 매트릭스로부터 제1 결합 파트너와 회합된 EV를 용리하는 단계. 특정 실시양태에서, 방법은 제1 pH에서의 세척 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 pH는 6.5 미만이다. 특정 실시양태에서, 제2 pH는 7.4 초과이다.
다른 양태에서, 본원은 세포외 소포 (EV)를 정제하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 다음을 포함한다: a. 제1 결합 파트너와 회합되어 있는 EV를 제공하는 단계이되, 여기서 제1 결합 파트너는 pH 의존적 방식으로 FcRn의 Fc 결합 부위에 결합할 수 있고 본원에 기재된 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진, 단계; 및 b. 제1 결합 파트너와 회합된 EV를 제2 결합 파트너와 제1 pH에서 접촉시키는 단계이되, 여기서 제2 결합 파트너는 FcRn의 Fc 결합 부위를 포함하고 고체 매트릭스와 회합되어 있는, 단계; 및 c. 제2 pH에서 고체 매트릭스로부터 제1 결합 파트너와 회합된 EV를 용리하는 단계. 특정 실시양태에서, 방법은 제1 pH에서의 세척 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 pH는 6.5 미만이다. 특정 실시양태에서, 제2 pH는 7.4 초과이다.
본 개시내용은 당업계 내의 기존 요구를 충족시키는 것을 목표로 하며, 예를 들어, 생리학적 조건에 더 가까운 조건 (예컨대, pH 값)에서 수행될 수 있는 세포외 소포의 단리/분리를 위한 수단을 제공하고, 치료적 전달을 위한 EV의 치료적 잠재력을 상당히 향상시키기 위해 순환에서의 EV의 더 긴 반감기를 가능하게 하는 것을 목표로 한다.
본원은 막관통 도메인 (본원에서는 종종 FcRn 바인더로서 지칭됨)을 포함하는 FcRn 결합 폴리펩티드를 제공한다.
일 양태에서, 본원은 관심 있는 나노소포 (예컨대, EV)의 정제를 위한 시스템을 제공하며, 여기서 시스템은 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 바인더 및 포유동물 FcRn을 포함하고, 여기서 FcRn 바인더 및 FcRn은 제1 조건의 세트 하에서 높은 친화도로 서로 결합하고, 제2 조건의 세트 하에서 낮은 친화도로 서로 결합한다.
3.1 예시적인 실시양태
1. 다음을 포함하는, 폴리펩티드:
a. 막관통 도메인; 및
b. 다음과 같은 면역글로불린의 변형된 Fc 도메인:
i. FcRn의 Fc 결합 부위에 특이적으로 결합할 수 있고;
ii. 동종이합체를 형성하는 능력이 결여됨.
2. 단락 1에 있어서, 6.5의 pH에서 FcRn에 결합된 변형된 Fc 도메인의 평형 해리 상수가 최대 10-4 M의 값을 갖는, 폴리펩티드.
3. 단락 1 또는 2에 있어서, 7.4의 pH에서 FcRn에 결합된 변형된 Fc 도메인의 평형 해리 상수가 10-4 M 이상의 값을 갖는, 폴리펩티드.
4. 단락 1-3 중 어느 하나에 있어서, 변형된 Fc 도메인이 인간 FcRn (서열번호 7) 및/또는 마우스 FcRn (서열번호 8)의 위치 135-158 사이의 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있는, 폴리펩티드.
5. 단락 1-4 중 어느 하나에 있어서, 변형된 Fc 도메인이 아미노산 서열 LNGEEFMX1FX2X3X4X5GX6WX7GX8W (서열번호 6)에 특이적으로 결합할 수 있고, 여기서 X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7 및 X8 각각이 임의의 아미노산인, 폴리펩티드.
6. 단락 1-5 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩티드가 C1q, FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII에 실질적으로 결합하지 않는, 폴리펩티드.
7. 단락 1-6 중 어느 하나에 있어서,
a. 변형된 Fc 도메인의 보체 의존적 세포독성 (CDC) 활성;
b. 변형된 Fc 도메인의 항체 의존적 세포 매개된 세포독성 (ADCC) 활성;
c. 변형된 Fc 도메인의 항체 의존적 세포 매개된 식세포작용 (ADCP) 활성; 및/또는
d. 변형된 Fc 도메인의 항체 의존적 세포내 중화 (ADIN) 활성이
미변형된 Fc 도메인과 비교하여 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이상 감소되는, 폴리펩티드.
8. 단락 1-7 중 어느 하나에 있어서,
a. 변형된 Fc 도메인의 보체 의존적 세포독성 (CDC) 활성;
b. 변형된 Fc 도메인의 항체 의존적 세포 매개된 세포독성 (ADCC) 활성;
c. 변형된 Fc 도메인의 항체 의존적 세포 매개된 식세포작용 (ADCP) 활성; 및/또는
d. 변형된 Fc 도메인의 항체 의존적 세포내 중화 (ADIN) 활성이
미변형된 Fc 도메인과 비교하여 1.5, 2, 3, 4 또는 5-배 이상 감소되는, 폴리펩티드.
9. 단락 1-8 중 어느 하나에 있어서, FcRn 결합 폴리펩티드가 N-말단에서 C-말단으로, 다음을 포함하는, 폴리펩티드:
a. 미변형된 CH2 도메인에 비해 이펙터 기능이 감소되도록 변형되는 변형된 CH2 도메인;
b. 미변형된 CH3 도메인에 비해 동종이합체화가 결여되도록 변형되는 변형된 CH3 도메인;
c. 링커 서열; 및
d. 막관통 도메인.
10. 단락 1-9 중 어느 하나에 있어서, FcRn 결합 폴리펩티드가 C-말단에서 N-말단으로, 다음을 포함하는, 폴리펩티드:
a. 미변형된 CH3 도메인에 비해 동종이합체화가 결여되도록 변형되는 변형된 CH3 도메인;
b. 미변형된 CH2 도메인에 비해 이펙터 기능이 감소되도록 변형되는 변형된 CH2 도메인;
c. 링커 서열; 및
d. 막관통 도메인.
11. 단락 1-10 중 어느 하나에 있어서, 막관통 도메인이 다중통과 막관통 도메인인, 폴리펩티드.
12. 단락 1-11 중 어느 하나에 있어서, 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적화 도메인을 추가로 포함하는, 폴리펩티드: scFv, (scFv)2, Fab, Fab', F(ab')2, F(abl)2, Fv, dAb, Fd 단편, 디아바디, F(ab)2, F(ab'), F(ab')3, Fd, Fv, 디설파이드 연결된 Fv, dAb, sdAb, 나노바디, CDR, di-scFv, bi-scFv, tascFv (탠덤 scFv), 아비바디 (예컨대, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디), T-세포 관여자 (BiTE), V-NAR 도메인, Fcab, IgGACH2, DVD-Ig, 프로바디, 인트라바디, DARPin, 센티린, 아피바디, 아필린, 아피틴, 안티칼린, 아비머, 파이노머, Kunitz 도메인 펩티드, 모노바디, 아드넥틴, 트리바디 및 나노피틴.
13. 단락 1-12 중 어느 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산.
14. 단락 13의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
15. 단락 13의 핵산 또는 단락 14의 발현 벡터를 포함하는 세포.
16. 단락 1 내지 12 중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 세포외 소포.
17. 단락 1 내지 12 중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 하이브리도좀.
18. 세포외 소포 (EV)를 정제하는 방법으로서, 상기 방법은 다음을 포함하는 것인, 방법:
a. 제1 결합 파트너와 회합되어 있는 EV를 제공하는 단계이되, 여기서 제1 결합 파트너는 pH 의존적 방식으로 FcRn의 Fc 결합 부위에 결합할 수 있는, 단계; 및
b. 제1 결합 파트너와 회합된 EV를 제2 결합 파트너와 제1 pH에서 접촉시키는 단계이되, 여기서 제2 결합 파트너는 FcRn의 Fc 결합 부위를 포함하고 고체 매트릭스와 회합되어 있는, 단계; 및
c. 제2 pH에서 고체 매트릭스로부터 제1 결합 파트너와 회합된 EV를 용리하는 단계.
19. 단락 18에 있어서, 방법이 제1 pH에서의 세척 단계를 포함하는 것인, 방법.
20. 단락 18 또는 19에 있어서, 제1 pH가 6.5 미만인, 방법.
21. 단락 18 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 제2 pH가 7.4 초과인, 방법.
22. EV를 정제하는 방법으로서, 상기 방법은 다음을 포함하는 것인, 방법:
a. 제1 결합 파트너와 회합되어 있는 EV를 제공하는 단계이되, 여기서 제1 결합 파트너는 pH 의존적 방식으로 FcRn의 Fc 결합 부위에 결합할 수 있고 단락 1-12 중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진, 단계; 및
b. 제1 결합 파트너와 회합된 EV를 제2 결합 파트너와 제1 pH에서 접촉시키는 단계이되, 여기서 제2 결합 파트너는 FcRn의 Fc 결합 부위를 포함하고 고체 매트릭스와 회합되어 있는, 단계; 및
c. 제2 pH에서 고체 매트릭스로부터 제1 결합 파트너와 회합된 EV를 용리하는 단계.
23. 단락 22에 있어서, 방법이 제1 pH에서의 세척 단계를 포함하는 것인, 방법.
24. 단락 22 또는 23에 있어서, 제1 pH가 6.5 미만인, 방법.
25. 단락22 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 제2 pH가 7.4 초과인, 방법.
4. 도면의 간략한 설명:
도 1은 유형 1 막관통 도메인을 함유하는 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포의 개략도이다.
도 2는 T1 스캐폴드, T2 스캐폴드 및 PT 스캐폴드를 포함하는 상이한 막관통 스캐폴드의 막관통 나선 (TMH)과 관련된 변형된 Fc (CH2 및 단량체성 CH3)의 위치의 예를 묘사한다. PT 스캐폴드의 경우, FcRn 결합 부위는 N-말단 (PTa), C-말단 (PTb) 또는 세포외 루프 (PTc)에 위치될 수 있다.
도 3. Eph 수용체의 세포외 도메인으로부터 유래된 스캐폴드 단백질에 융합된 단량체성 Fc를 포함하는, FcRn 결합 폴리펩티드의 예시적인 구조.
도 4. 컨디셔닝된 배지로부터 정제된 조작된 EV를 보여주는 웨스턴 블롯.
도 5a-5d. 실시예 2에 기재된 바와 같은 형광 항-인간 Fc 도메인 항체로 염색된 상이한 세포주의 유세포 분석 히스토그램.
도 6. 20 분 동안 상이한 pH에서 항온처리된 EV의 나노입자 추적 분석 (NTA) 측정치.
도 7. scFcRn의 정제를 보여주는 항-FcRn 웨스턴 블롯
도 8. scFcRn 컬럼에 로딩되는, 농축된 컨디셔닝된 배지 내 작제물로부터 발현된 EphA4 융합 단백질의 검출을 보여주는 항-EphA4 웨스턴 블롯. 제1 레인은 로드이고, 제2 레인은 통과액(flow through)의 샘플이고, 제3 레인은 용리된 분획의 샘플이다.
도 9a 및 도 9b. 상이한 pH에서 scFcRn 컬럼에 로딩되는, 농축된 컨디셔닝된 배지 내 작제물로부터 발현된 EphA4 융합 단백질의 검출을 보여주는 항-EphA4 웨스턴 블롯. 도 9a에서, 컨디셔닝된 배지는 산성화되지 않았지만, 도 9b에서, 컨디셔닝된 배지는 실시예 7에 기재된 바와 같이 산성화되었다. 제1 레인은 용리 샘플이고, 제2 레인은 통과액의 샘플이고, 제3 레인은 컨디셔닝된 배지의 샘플이다.
도 10a 및 도 10b는 변형된 Fc 도메인을 발현하는 EV (도 10a), 천연 EV (도 10a), 인간 IgG1 (도 10b) 및 마우스 IgG1 (도 10b)을 이용한 인간 FcRn 결합 면역검정으로부터의 결합 곡선을 묘사한다.
도 11. 변형된 Fc 도메인을 전시하는 스캐폴드 단백질을 포함하는 EV 대 LNP 제형의 IV 투여 후 3, 6, 21 및 24 일차에 마우스 혈장 1 ul당 DNA 벡터 카피 수.
5. 상세한 설명:
막관통 도메인 및 FcRn 결합 부위 (예컨대, 면역글로불린의 변형된 Fc 도메인)를 포함하는 폴리펩티드가 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, FcRn 결합 부위 (예컨대, 면역글로불린의 변형된 Fc 도메인)는 FcRn의 Fc 결합 부위에 특이적으로 결합할 수 있으며 동종이합체를 형성하는 능력이 결여되어 있다. 폴리펩티드의 다양한 양태 및 실시양태는 섹션 5.2에 기재되어 있다.
또한, 본원에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 본원에 기재된 핵산을 포함하는 발현 벡터, 및 본원에 기재된 핵산 또는 발현 벡터를 포함하는 세포가 제공되며, 이들 모두는 섹션 5.3에 추가로 기재되어 있다.
본원에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 나노소포 (예컨대, EV 및 하이브리도좀)가 추가로 제공된다. 나노소포 (예컨대, EV 및 하이브리도좀)는 섹션 5.4에 추가로 기재되어 있다.
나노소포 (예컨대, EV 또는 하이브리도좀)를 생산하는 방법이 제공되며, 섹션 5.4에 추가로 기재되어 있다. 나노소포 (예컨대, EV 또는 하이브리도좀)를 정제하는 방법이 또한 제공되며, 섹션 5.5에 추가로 기재되어 있다.
본원에 기재된 폴리펩티드, 나노소포 (예컨대, EV 또는 하이브리도좀), 핵산, 발현 벡터, 또는 세포를 포함하는 조성물 및 키트가 제공되며, 섹션 5.6에 추가로 기재되어 있다.
본원에 기재된 폴리펩티드, 나노소포 (예컨대, EV 또는 하이브리도좀), 조성물 또는 키트의 치료적 및 진단적 용도가 제공되며, 섹션 5.7에 추가로 기재되어 있다.
본 개시내용의 목적은 나노소포 (예컨대, EV)의 단리 및 정제와 연관된 문제를 극복하는 것이다. 게다가, 본 개시내용은 예를 들어, 높은 수율 및 높은 특이성으로 나노소포 (예컨대, EV)를 정제하기 위해 일반적으로 적용가능한 친화도 정제 전략을 개발하기 위한 당업계 내의 다른 기존 요구를 충족시키는 것을 목표로 한다. 특히, 엑소좀을 정제하기 위한 이전에 알려진 방법은 EV 치료제의 상업적 생산에 필요한 대규모 생산 및 규모 확대(scale up)에 이상적으로 적합하지 않다. 본 개시내용은 이전에 알려진 방법으로 달성가능한 것보다 높은 친화도를 갖는 조작된 EV의 훨씬 더 큰 규모의 정제를 가능하게 한다.
본 발명자들은 조작된 나노소포 (예컨대, EV) 및 세포에 존재할 수 있거나 친화도 크로마토그래피를 위한 결합제로서 존재할 수 있는 FcRn 수용체 사이의 특이적 상호작용을 가능하게 하는 방법 및 조성물을 개발하였다. 특히, 일부 나노소포 (예컨대, EV)는 낮은 pH에서 낮은 콜로이드 안정성을 가지며, pH-불안정한 구성요소를 함유하고, fc-결합 기반 친화도 크로마토그래피에 통상적으로 사용되는 낮은 pH 용리에 가담하지 않는다는 것이 입증되었지만, 효율적인 친화도 크로마토그래피에는 결합 특이성이 약 5-8의 pH 범위에서 조정될 수 있는 fc-결합제를 필요로 한다.
높은 친화도 및 특이성으로 FcRn에 결합하는 FcRn 바인더를 포함하는 나노소포 (예컨대, EV)가 본원에 개시된다. 유리하게는, 본원에 기재된 FcRn 바인더 중 몇몇은 하나 이상의 개선된 또는 원하는 약동학적 특성, 예컨대,순환 반감기를 갖는다. 이론에 얽매이기를 바라지 않으면서, 나노소포 (예컨대, EV)는 인간에서 다양한 순환 반감기를 가질 수 있고, 순환 반감기는 예컨대, 혈청 및 세포 구성요소와의 상호작용, FcRn과의 상호작용, 수용체 매개된 엔도사이토시스, 약물 용량 및 항-약물 항체의 생성에 영향을 미칠 수 있는 것으로 여겨진다. 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 발현 벡터, 숙주 세포, 조성물 (예컨대, 약학 조성물), 키트, 용기 및 FcRn 결합 나노소포 (예컨대, EV)를 제조하기 위한 방법이 또한 제공된다. 본원에 개시된 폴리펩티드 (예컨대, 항체 분자 또는 융합 단백질) 및 약학 조성물은 장애 및 병태, 예컨대, 표적 분자 (예컨대, 단백질) 또는 세포와 연관된 장애 및 병태, 예컨대, 본원에 기재된 장애 또는 병태를 치료하고/하거나, 예방하고/하거나, 진단하기 위해 (단독으로 또는 다른 약제 또는 치료적 양식과 조합하여) 사용될 수 있다.
이론에 얽매이기를 바라지 않으면서, 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 FcRn 결합 또는 반감기 연장을 위한 Fc의 조작은 Fc에 의해 매개되는 다양한 이펙터 기능의 맥락에서 수행되는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 구조적 정보는 중성 및 산성 pH에서 Fc와 FcRn의 상호작용을 조사하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 구조적 정보를 사용하여, 산성 pH에서 FcRn 결합을 개선시키기 위한 상이한 구조가 식별될 수 있다. Fc 돌연변이가 조합되고, FcRn 및 기타 Fc 수용체에 대한 결합에 대해 평가될 수 있다. 예를 들어, 반감기의 향상을 부여하고 이펙터 기능, 예컨대, ADCC 및 CDC를 유지하고 일부 경우에는 감소된 이펙터 기능을 갖는 Fc 변이체가 식별될 수 있다. 상이한 질환의 예방 및 치료를 위한 치료제로서 나노소포 (예컨대, EV)를 사용하려는 관심이 증가함에 따라, 예컨대, 만성 질환을 치료 또는 예방하기 위해 긴 반감기를 갖는 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포를 개발할 필요성이 더 커졌다.
게다가, 본원에 식별된 모든 FcRn 결합 폴리펩티드 및 단백질은 폴리펩티드를 융합하기 위한 종래의 전략을 사용하여 융합 단백질로 자유롭게 조합될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 본원에 기재된 모든 FcRn 결합 폴리펩티드는 하나 이상의 EV 폴리펩티드와 임의의 조합으로 자유롭게 조합될 수 있다. 또한, FcRn 결합 폴리펩티드는 서로 조합되어, 하나 초과의 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 생성할 수 있다. 더욱이, 임의의 및 모든 특징 (예를 들어, 본원에 기재된 Markush 그룹의 임의의 및 모든 구성원)은 임의의 및 모든 다른 특징 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 다른 Markush 그룹의 임의의 및 모든 구성원)과 자유롭게 조합될 수 있으며, 예컨대, FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 임의의 EV는 임의의 FcRn 도메인 함유 폴리펩티드를 사용하여 정제 및/또는 단리될 수 있다. 게다가, 본원의 교시가 나노소포 (예컨대, EV)(및/또는 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 EV)를 단수로 지칭하고/하거나, 별개의 자연 나노입자-유사 소포로서 나노소포 (예컨대, EV)를 지칭할 때, 이러한 모든 교시가 복수의 나노소포 (예컨대, EV) 및 나노소포 (예컨대, EV)의 집단에 동등하게 관련되고 적용가능하다는 것이 이해되어야 한다.
5.1 정의
본원에 사용된 바와 같이, 단수형 "(단수형)"은 내용이 달리 명백하게 나타내지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "폴리펩티드"에 대한 언급은 2 개 이상의 이러한 분자 등을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약" 및 "대략"은 수치 값 또는 범위에 명시된 양을 변형시키는 데 사용될 때, 수치 값뿐만 아니라 당업자에게 알려진 값으로부터의 합리적인 편차, 예를 들어, ±20%, ±10% 또는 ±5%가 인용된 값의 의도된 의미 내에 있음을 나타낸다.
용어 "유전적으로 변형된" 및 "유전적으로 조작된" EV는 EV가 통상적으로 이러한 세포에 의해 생산된, 나노소포 (예컨대, EV)에 혼입되는 재조합 또는 외인성 단백질 산물을 포함하는 유전적으로 변형된/조작된 세포로부터 유래됨을 나타낸다. 용어 "변형된 EV"는 소포가 유전적 또는 화학적 접근법을 사용하여, 예를 들어, EV-생산 세포의 유전자 조작을 통해 또는 예컨대, 예를 들어, 엑소좀 표면에 모이어티를 부착시키기 위한 화학적 컨쥬게이션을 통해 변형되었음을 나타낸다.
"결합 도메인"은 하나 이상의 특이적 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 (예컨대, 항체)으로부터 유래된 폴리펩티드의 단편과 같은 펩티드 영역이다. 복수의 결합 파트너가 존재하는 경우, 이들 파트너는 결합 도메인에 검출가능하게 결합하기에 충분한 결합 결정자를 공유한다. 바람직하게는, 결합 도메인은 아미노산의 연속적인 서열이다.
용어 "FcRn"은 신생아 Fc-수용체를 나타낸다. FcRn은 리소좀 분해 경로로부터 IgG를 회수하는 기능을 하여, 감소된 청소율 및 긴 반감기를 초래한다. FcRn은 다음의 2 개의 폴리펩티드로 이루어진 이종이합체 단백질이다: 50 kDa 클래스 I 주요 조직적합성 복합체-유사 단백질 (a-FcRn) 및 15 kDa β2-마이크로글로불린 (β2). FcRn은 IgG의 Fc 도메인의 CH2-CH3 부분에 높은 친화도로 결합한다. FcRn은 항체의 Fc 영역과 상호작용하여, 정상적인 리소좀 분해로부터의 구제를 통해 재활용을 촉진한다. 이 과정은 산성 pH (예컨대, 6.5 미만의 pH)에서 엔도솜에서 발생하지만 혈류의 생리학적 pH 조건 (예컨대, 비-산성 pH) 하에서는 발생하지 않는 pH-의존적 과정이다. 산성 pH는 약 7.0 미만의 pH, 예컨대, 약 pH 6.5, 약 pH 6.0, 약 pH 5.5, 약 pH 5.0이다. 상승된 비-산성 pH는 약 7 이상의 pH, 예컨대, 약 pH 7.4, 약 pH 7.6, 약 pH 7.8, 약 pH 8.0, 약 pH 8.5 또는 약 pH 9.0이다. 이어서, FcRn은 FcRn 결합 폴리펩티드의 세포 표면으로의 재순환, 및 세포 외부의 중성 pH 환경에 대한 FcRn-FcRn 결합 폴리펩티드 복합체의 노출 시 혈류로의 후속 방출을 용이하게 한다.
본원에 사용된 바와 같이, "FcRn 결합 부위"는 FcRn에 결합하는 Fc 폴리펩티드의 영역을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "Fc 결합 부위"는 면역글로불린의 Fc 도메인에 결합하는 FcRn 폴리펩티드의 영역을 지칭한다.
용어 "특이적으로 결합한다"는 다른 에피토프 또는 비-표적 화합물 (예컨대, 구조적으로 상이한 항원)에 결합하는 것보다 샘플 내 해당 에피토프 또는 표적에 대해 더 큰 친화도, 더 큰 결합력 및/또는 더 긴 지속시간으로 에피토프 또는 표적에 결합하는 분자 (예컨대, Fab, scFv 또는 변형된 Fc 폴리펩티드 (또는 이의 표적-결합 부분))를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 에피토프 또는 표적에 특이적으로 결합하는 Fab, scFv 또는 변형된 Fc 폴리펩티드 (또는 이의 표적-결합 부분)는 다른 에피토프 또는 비-표적 화합물보다 5-배 이상 더 큰 친화도, 예컨대, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 25-배, 50-배, 100-배, 1000-배, 10,000-배 이상 또는 그 초과의 친화도로 에피토프 또는 표적에 결합하는 Fab, scFv 또는 변형된 Fc 폴리펩티드 (또는 이의 표적-결합 부분)이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 특정 에피토프 또는 표적에 "특이적인 결합", "특이적으로 결합하는", 또는 "특이적이다"는 예를 들어, 예컨대, 10-4 M 이하, 예컨대, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M 또는 10-12 M의, 그것이 결합하는 에피토프 또는 표적에 대한 평형 해리 상수 KD를 갖는 분자에 의해 나타낼 수 있다. 하나의 종으로부터의 표적에 특이적으로 결합하는 Fab 또는 scFv가 또한 해당 표적의 오솔로그에 특이적으로 결합할 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "CH3 도메인" 및 "CH2 도메인"은 면역글로불린 불변 영역 도메인 폴리펩티드를 지칭한다. 본 출원의 목적을 위해, CH2 및 CH3 도메인 폴리펩티드는 IMGT (ImMunoGeneTics) 넘버링 체계에 의해 넘버링될 수 있으며, 여기서 IMGT 과학 차트 넘버링 (IMGT 웹사이트)에 따라 CH2 도메인 넘버링은 1-110이고 CH3 도메인 넘버링은 1-107이다. CH2 및 CH3 도메인은 면역글로불린의 Fc 영역의 일부이다. 대안적으로, CH2 및 CH3 도메인 폴리펩티드는 EU 넘버링 체계에 의해 넘버링될 수 있으며, 여기서 EU 넘버링 체계에 따라 CH2 도메인 넘버링은 잔기 231-340에 걸쳐 있고 CH3 도메인 넘버링은 잔기 341-447에 걸쳐 있다. Fc 영역은 EU 넘버링 체계에 따라 넘버링된 바와 같이 약 위치 231로부터 약 위치 447까지의 아미노산의 세그먼트를 지칭한다. "EU 넘버링 체계"는 이들 각각이 그 전체가 본원에 참조로 원용되는 Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health and Human Services, 5th edition, 1991에 기재된 바와 같은 항체의 불변 영역에 대한 EU 넘버링 규약을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "스캐폴드 단백질"은 FcRn 결합 폴리펩티드를 나노소포에 고정하기 위해 사용될 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 양태에서, 스캐폴드 단백질은 나노소포 (예컨대, EV)에 자연적으로 존재하지 않는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드 단백질은 합성 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드 단백질은 변형된 단백질을 포함하며, 여기서 상응하는 미변형된 단백질은 나노소포, 예컨대, 엑소좀에 자연적으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드 단백질은 EV에 자연적으로 존재하는 단백질, 또는 이의 단편, 예컨대, EV 단백질의 단편을 포함하며, 여기서 단백질은 자연 발생 수준보다 더 높은 수준으로 발현된다.
일부 실시양태에서, 스캐폴드 단백질은 (i) 자연 발생 EV 단백질 또는 이의 단편 및 (ii) 이종 폴리펩티드 (예컨대, FcRn 결합 폴리펩티드, 항원 결합 도메인 또는 이의 임의의 조합)를 포함하는, 융합 단백질을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 본 개시내용의 용어 "스캐폴드 단백질" 또는 문법적 변형은 다음과 같을 수 있으며:
(i) 하나 이상의 FcRn 결합 부위를 포함하고 나노소포, 예컨대, 엑소좀의 막에 걸쳐 있는 막관통 도메인을 추가로 포함하는 폴리펩티드 (자연적으로 발현되거나, 화학적으로 또는 효소적으로 합성되거나, 재조합적으로 생산됨);
(ii) (i)의 임의의 기능적 단편;
(iii) (i) 또는 (ii)의 임의의 기능적 변이체;
(iv) (i)-(iii) 중 임의의 것의 임의의 유도체;
(v) 나노소포 (예컨대, 엑소좀)의 막에 걸쳐 있을 수 있는 (i)의 단백질, 또는 이러한 폴리펩티드를 포함하는 분자로부터 유래된 도메인 또는 이의 조합에 상응하는 임의의 펩티드;
(vi) 본원에 기재된 FcRn 결합 폴리펩티드;
(vii) 하나 이상의 비-자연 아미노산을 포함하는 (i) 내지 (vi) 중 임의의 것의 분자; 또는
(viii) (i)-(vii)의 임의의 조합;
이는 FcRn 결합 부위를 표면 나노소포, 예컨대, 엑소좀에 표적화 (부착)하기 위한 스캐폴드로서 사용하기에 적합하다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "표면 장식된"은 관심 있는 분자 (예컨대, 단백질)가 부착된 스캐폴드 단백질을 포함하는 나노소포를 지칭한다. 스캐폴드 단백질은 화학적, 물리적, 생물학적 방법에 의해, 또는 화학적, 물리적 또는 생물학적 방법에 의해 변형될 세포로부터 생산됨으로써 변화될 수 있다. 구체적으로, 스캐폴드 단백질은, 유전적 조작에 의해 이전에 변형된 세포가 이러한 변형된 스캐폴드 단백질을 생산하도록 유전적 조작을 통해 변화될 수 있다.
"융합된" 폴리펩티드 서열은 2 개의 대상 폴리펩티드 서열 사이의 펩티드 결합을 통해 연접된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "도메인"은 독립적으로 안정한 3차 구조로 폴딩(fold)될 수 있는 폴리펩티드의 유닛 (예컨대, 세그먼트)을 지칭한다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 별개의 기능적인 특성을 담당하며, 많은 경우에 단백질 및/또는 도메인의 나머지 부분의 기능의 손실 없이 다른 단백질에 첨가, 제거 또는 전달될 수 있다. 여러 개의 별개의 도메인이 상이한 조합으로 함께 접합되어, 다중-도메인 폴리펩티드를 형성할 수 있다. 전통적으로, 도메인에 걸쳐 있는 폴리펩티드의 길이는 단백질의 실험적으로 결정된 3-차원 구조로부터의 원자 좌표를 사용하여 밝혀졌다. 보다 최근에는, 실험적으로 결정된 3-차원 (3D) 구조가 결여된 단백질에 대해 서열 상동성에 기반한 계산 방법에 의해 도메인이 할당되었다. 많은 수의 단백질이 해결된(resolved) 구조를 가지고 있지 않기 때문에, 서열-기반 접근법은 훨씬 더 많은 관심을 얻고 있다. 서열-기반 접근법은 예측 방법이 Wang, Yan et al. Computational and structural biotechnology journal vol. 19 1145-1153. 2 Feb. 2021에서 검토된 바와 같은 3D 구조 또는 상동 서열을 사용하는지 여부에 따라, 주형-기반, 상동-모델링-기반 및 기계-학습-기반 기술을 포함한다. 몇몇 계산상 예측된 도메인은 공개적으로 이용가능한 데이터베이스 (예컨대, Pfam database as described in Pfam: The protein families database in 2021: J. Mistry, S. et al, Nucleic Acids Research (2020) 또는 the NCBI Conserved Domain Database (CDD) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)에 목록화되어 있다.
용어 "도메인-간 링커"는 2 개의 이웃 도메인을 함께 묶는 폴리펩티드의 세그먼트를 지칭한다. 도메인-간 링커는 Bhaskara RM, et al., J Biomol Struct Dyn. 2013 Dec; 31(12):1467-80에 기재된 바와 같이 도메인 동작을 용이하게 하고 도메인-간 기하학을 조절하는 가요성을 제공한다. 도메인-간 링커는 이들의 길이, 입체형태, 분자간 상호작용 및 로컬(local) 구조에 의해 인접한 도메인의 상호작용을 조정하며, 그에 의해 전체 도메인-간 기하학에 영향을 미친다. 예측된 구조적 도메인에 기반한 위에 언급된 데이터베이스 (Pfam 데이터베이스 또는 NCBI 보존된 도메인 데이터베이스)는 도메인의 일반화를 제공하고, (예컨대, 도메인 내에 있거나 도메인-간 링커인 잔기를 구별하기 위해) 도메인 경계의 근사치만을 제공할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 도메인 서열 (예컨대, 표 2-20의 서열)은 상응하는 도메인뿐만 아니라 도메인-간 링커를 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 목록화된 도메인 서열의 N- 또는 C 말단에서의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 아미노산 잔기는 도메인-간 링커일 수 있다. 당업자는 도메인 및 도메인-간 링커에 상응하는 폴리펩티드 쇄의 세그먼트, 및 도메인으로부터 도메인-간 링커로의 (즉, 도메인 경계에서) 전환이 발생하는 곳을 결정할 수 있다.
용어 "융합 폴리펩티드"는 FcRn 결합 폴리펩티드, 또는 적어도 제2 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 폴리펩티드로부터 유래된 아미노산 서열, 또는 적어도 제2 폴리펩티드로부터 유래된 아미노산 서열을 지칭한다. 융합 단백질의 개별화된 요소는 예를 들어, 직접 부착, 중간(intermediate) 또는 스페이서 펩티드의 사용, 링커 영역의 사용, 힌지 영역의 사용, 또는 링커 및 힌지 영역 둘 모두의 사용을 포함하는 다양한 방식 중 임의의 것으로 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커 영역은 힌지 영역의 서열 내에 속할 수 있거나, 대안적으로 힌지 영역은 링커 영역의 서열 내에 속할 수 있다. 바람직하게는, 링커 영역은 펩티드 서열이다. 예를 들어, 링커 펩티드는 대체로 0 내지 40 개의 아미노산, 예컨대, 0 내지 35 개의 아미노산, 0 내지 30 개의 아미노산, 0 내지 25 개의 아미노산, 또는 0 내지 20 개의 아미노산을 포함한다. 바람직하게는, 힌지 영역은 펩티드 서열이다. 예를 들어, 힌지 펩티드는 대체로 0 내지 75 개의 아미노산, 예컨대, 0 내지 70 개의 아미노산, 0 내지 65 개의 아미노산 또는 0 내지 62 개의 아미노산을 포함한다.
CH3 또는 CH2 도메인과 관련하여 용어 "야생형", "천연" 및 "자연 발생"은 자연에서 발생하는 서열을 갖는 도메인을 지칭하기 위해 본원에 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 돌연변이체 폴리펩티드 또는 돌연변이체 폴리뉴클레오티드와 관련하여 용어 "돌연변이체"는 "변이체"와 상호교환적으로 사용된다. 특정 실시양태에서, IgG의 주어진 야생형 CH3 또는 CH2 도메인 (예컨대, Fc 도메인) 참조 서열 또는 야생형 스캐폴드 단백질 참조 서열과 관련하여 변이체는 자연 발생 대립유전자 변이체를 포함할 수 있다. "비-자연" 발생 변이체는 자연의 세포에 존재하지 않고, 예컨대, 유전 조작 기술 또는 돌연변이유발 기술을 사용하여 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 적절한 변형을 도입하는 모 Fc 도메인 폴리뉴클레오티드의 유전적 변형에 의해, 또는 단백질/펩티드 합성에 의해 생산된 변이체 또는 돌연변이체 도메인을 지칭한다. "변이체"는 야생형과 관련하여 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 임의의 서열을 포함한다. 돌연변이는 하나 이상의 아미노산의 치환, 삽입 및 결실 (예컨대, 절삭)뿐만 아니라 다른 단백질의 프레임이동 또는 재배열을 포함할 수 있다. 유사하게, 폴리뉴클레오티드와 관련하여 용어 "변이체"는 명시된 모 폴리뉴클레오티드와 뉴클레오티드 서열이 상이한 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 모 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 동일성은 문맥으로부터 분명해질 것이다. 변이체는 모 서열과 % 서열 동일성을 갖는 것뿐만 아니라 하나 이상의 특이적 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다.
용어 "아미노산 치환"은 하나 이상의 기존 아미노산 잔기의 다른 상이한 아미노산 잔기로의 대체 (아미노산 잔기를 대체하는 것)를 의미한다. 대체 아미노산 잔기는 "자연 발생 아미노산 잔기"일 수 있고, 알라닌 (3 문자 코드: ala, 1 문자 코드: A), 아르기닌 (arg, R), 아스파라긴 (asn, N), 아스파르트산 (asp, D), 시스테인 (cys, C), 글루타민 (gin, Q), 글루탐산 (glu, E), 글리신 (gly, G), 히스티딘 (his, H), 이소류신 (ile, I ), 류신 (leu, L), 리신 (lys, K), 메티오닌 (met, M), 페닐알라닌 (phe, F), 프롤린 (pro, P), 세린 (ser, S), 트레오닌 (thr, T), 트립토판 (trp, W), 티로신 (tyr, Y) 및 발린 (val, V)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
용어 "아미노산 삽입"은 아미노산 서열의 미리결정된 위치에서의 하나 이상의 아미노산 잔기의 혼입을 의미한다. 일 실시양태에서, 삽입은 하나 또는 2 개의 아미노산 잔기의 삽입일 것이다. 삽입된 아미노산 잔기(들)는 임의의 자연 발생 또는 비-자연 발생 아미노산 잔기일 수 있다. 용어 "아미노산 결실"은 아미노산 서열의 미리결정된 위치에서의 하나 이상의 아미노산 잔기의 제거를 의미한다.
용어 "비-자연 발생 아미노산 잔기"는 위에 나열된 바와 같은 자연 발생 아미노산 잔기 이외의 아미노산 잔기를 의미하며, 이는 폴리펩티드 쇄의 인접한 아미노산 잔기에 공유 결합될 수 있다. 비-자연 발생 아미노산 잔기의 예는 노르류신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린이 있다. 추가 예는 Ellman, et al., Meth. Enzym. 202 (1991) 301-336에 나열되어 있다. 비-자연 발생 아미노산 잔기의 합성을 위한 예시적인 방법은 예컨대, Noren, et al., Science 244 (1989) 182 및 위의 Ellman et al.,에 보고되어 있다.
참조 폴리펩티드 서열과 관련하여 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입한 후, 그리고 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않으면서, 참조 폴리펩티드 서열에서의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에서의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 당업계의 기술 내에 있는 다양한 방식, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교될 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열 정렬을 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다.
용어 "세포외 소포", "EV" 또는 "엑소좀"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 임의의 형태의 세포, 예를 들어, 마이크로소포 (예컨대, 세포의 원형질막으로부터 배출된 임의의 소포), 엑소좀 (예컨대, 엔도솜, 리소좀 및/또는 엔도-리소좀 경로로부터 유래된 임의의 소포), 아폽토시스체(apoptotic body), ARMM (단백질 1-매개된 마이크로소포를 함유하는 어레스틴(arrestin) 도메인), 푸소좀, 마이크로입자 및 세포 유래된 소포 구조로부터 수득가능한 임의의 유형의 소포와 관련된 것으로 이해되어야 한다. 일반적으로 세포외 소포는 20 nm 내지 1000 nm의 유체역학적 직경의 범위이며, 내부 공간 내, 세포외 소포의 외부 표면에 전시된 및/또는 막에 걸쳐 있는 다양한 거대분자 카고를 포함할 수 있다. 상기 카고는 핵산, 단백질, 탄수화물, 지질, 소분자 및/또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예로서 그리고 제한 없이, 세포외 소포는 아폽토시스체, 세포의 단편, 직접 또는 간접적인 조작 (예컨대, 연속 압출, 초음파처리 또는 알칼리 용액으로의 처리)에 의해 세포로부터 유래된 소포, 소포형 소기관, 및 (예컨대, 직접적인 원형질 막 발아 또는 후기 엔도솜과 원형질막의 융합에 의해) 살아있는 세포에 의해 생산된 소포를 포함한다. 세포외 소포는 살아있는 또는 사멸된 유기체, 외식된 조직 또는 기관, 및/또는 배양된 세포로부터 유래될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 EV는 엑소좀, 마이크로소포 (MV), 또는 엔도솜, 엔도리솜(endolysomal) 및/또는 리소좀 경로로부터 또는 모 세포의 원형질막으로부터 분비되는 임의의 다른 유형의 소포이다. 게다가, 본원의 교시가 EV를 단수로 지칭하고/하거나, 별개의 자연 나노입자-유사 소포로서 EV를 지칭할 때, 이러한 모든 교시가 복수의 EV 및 EV의 집단에 동등하게 관련되고 적용가능하다는 것을 이해해야 한다.
나노소포 (예컨대, EV)의 의학적 및 과학적 용도 및 적용을 설명할 때, 본 개시내용은 보통 복수의 나노소포 (예컨대, EV), 즉, 수천, 수백만, 수십억 또는 심지어 수조 개의 나노소포 (예컨대, EV)를 포함할 수 있는 나노소포 (예컨대, EV)의 집단에 관한 것이라는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 아래 실험 섹션으로부터 볼 수 있는 바와 같이, 나노소포 (예컨대, EV)는 부피의 단위당 (예를 들어, ml당) 105, 108, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1018, 1025, 1030 개의 나노소포 (종종 "입자"라고 함), 또는 더 큰, 더 작은 또는 그 사이의 어디에서의 임의의 다른 수와 같은 농도로 존재할 수 있다. 복수로 존재할 때 개별 나노소포 (예컨대, EV)는 EV 집단을 구성한다. 따라서, 당업자에게 명백할 것인 바와 같이, 당연히, 본 개시내용은 개별 나노소포 (예컨대, EV) 및 나노소포 (예컨대, EV)를 포함하는 집단 둘 모두에 관한 것이다.
용어 "나노소포"는 공급원 세포로부터 유래된 지질 나노소포 (즉, 세포외 소포), 또는 합성 지질 나노입자, 및 천연/합성 하이브리드 (예컨대, 하이브리도좀)를 지칭한다. 나노소포는 전형적으로 지질 또는 지방산뿐만 아니라 폴리펩티드를 포함하고, 페이로드, 표적화 모이어티 또는 다른 분자를 추가로 포함할 수 있다. 게다가, 본원의 교시가 나노소포를 단수로 지칭할 때, 이러한 모든 교시가 복수의 나노소포 및 나노소포의 집단에 동등하게 관련되고 적용가능하다는 것이 이해되어야 한다. 나노소포의 의학적 및 과학적 용도 및 적용을 설명할 때, 본 개시내용은 보통 복수의 나노소포, 즉, 수천, 수백만, 수십억 또는 심지어 수조 개의 나노소포를 포함할 수 있는 나노소포의 집단에 관한 것이라는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 아래 실험 섹션으로부터 볼 수 있는 바와 같이, 나노소포는 부피의 단위당 (예를 들어, ml당) 105, 108, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1018, 1025, 1030 개의 입자, 또는 더 큰, 더 작은 또는 그 사이의 어디에서의 임의의 다른 수와 같은 농도로 존재할 수 있다. 복수로 존재할 때 개별 나노소포는 나노소포 집단을 구성한다. 따라서, 자연적으로, 본 개시내용은 개별 나노소포 및 나노소포를 포함하는 집단 둘 모두에 관한 것이다.
게다가, 본 개시내용의 나노소포 (예컨대, EV)는 또한 나노소포 표면에 결합될 수 있는 FcRn 결합 폴리펩티드에 더하여 추가적인 페이로드를 포함할 수 있다.
용어 "공급원 세포" 또는 "EV 공급원 세포" 또는 "모 세포" 또는 "세포 공급원" 또는 "EV-생산 세포" 또는 임의의 다른 유사한 용어는 적합한 조건 하에서, 예를 들어, 부유식 배양(suspension culture) 또는 부착 배양 또는 임의의 다른 유형의 배양 시스템에서 나노소포 (예컨대, EV)를 생산할 수 있는 임의의 유형의 포유동물 세포와 관련된 것으로 이해될 수 있다. 본 개시내용에 따른 공급원 세포는 또한 생체내에서 나노소포 (예컨대, EV)를 생산하는 세포를 포함할 수 있다. 본 개시내용에 따른 공급원 세포는 부유식 또는 부착 배양물에서 성장할 수 있거나 부유식 성장에 적응될 수 있는 광범위한 세포 및 세포주로부터 선택될 수 있다. 일반적으로, 나노소포 (예컨대, EV)는 일차 세포 공급원이든 불멸화 세포주이든 상관없이 본질적으로 임의의 세포 공급원으로부터 유래될 수 있다. EV 공급원 세포는 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 및 임의의 방법에 의해 유래된 기타 줄기 세포를 포함하여 임의의 배아, 태아 및 성체 체세포 줄기 세포 유형일 수 있다. 공급원 세포는 치료될 환자에 대해 사실상 동종이계, 자가유래 또는 심지어 이종발생일 수 있으며, 즉, 세포는 환자 자신으로부터 유래되거나, 관련이 없거나 매칭되거나 매칭되지 않는 공여자로부터 유래될 수 있다. 특정 맥락에서, 동종이계 세포는 특정 적응증을 앓고 있는 환자의 자가유래 세포로부터 수득가능하지 않을 수 있는 면역-조정 효과를 제공할 수 있으므로, 의학적 관점에서 바람직할 수 있다. 예를 들어, 염증성 또는 퇴행성 질환을 치료하는 맥락에서, 동종이계 MSC 또는 AE는 이들의 나노소포 (예컨대, EV), 그리고 특히 이들의 나노소포 (예컨대, EV)의 고유한 면역-조정으로 인해 EV-생산 세포 공급원으로서 매우 유익할 수 있다. 특히 관심 있는 세포주는 인간 제대 내피 세포 (HUVEC), 인간 배아 신장 (HEK) 세포, 예컨대, HEK293 세포, HEK293T 세포, 무혈청 HEK293 세포, 부유 HEK293 세포, 내피 세포주, 예컨대, 미세혈관 또는 림프 내피 세포, 적혈구, 적혈구 전구세포, 연골세포, 상이한 기원의 MSC, 양막 세포, 양막 상피 (AE) 세포, 양수천자를 통해 또는 태반으로부터 수득된 임의의 세포, 기도 또는 폐포 상피 세포, 섬유아세포, 내피 세포, 상피 세포 등을 포함한다.
용어 "완충 물질"은 용액 내에 있을 때 산성 또는 염기성 물질의 첨가 또는 방출로 인한 용액의 pH 값의 변화를 평탄화할 수 있는 물질을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단리하다", "단리된" 및 "단리하는" 또는 "정제하다", "정제된" 및 "정제하는" 뿐만 아니라 "추출된" 및 "추출하는"은 상호교환적으로 사용되며, 하나 이상의 정제 과정, 예컨대, 원하는 FcRn 결합 EV 제제의 선택 또는 풍부화를 거친 원하는 FcRn 결합 나노소포 (예컨대, EV)의 제제의 상태 (예컨대, 복수의 알려진 또는 미지의 양 및/또는 농도)를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본원에 사용된 바와 같은 단리하는 것 또는 정제하는 것은 생산자 세포를 함유하는 샘플로부터 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포를 제거, 부분적으로 (예컨대, 분획) 제거하는 공정이다. 일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드 조성물을 포함하는 단리된 나노소포는 검출가능한 바람직하지 않은 활성을 갖지 않거나, 대안적으로, 바람직하지 않은 활성의 수준 또는 양은 허용가능한 수준 또는 양이거나 그 미만이다. 다른 실시양태에서, 단리된 엑소좀 조성물은 허용가능한 양 및/또는 농도의 또는 그 초과의, FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 원하는 나노소포의 양 및/또는 농도를 갖는다. 다른 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드 조성물을 포함하는 단리된 나노소포는 조성물이 수득되는 출발 재료 (예컨대, 생산자 세포 제제)와 비교하여 풍부하다. 이 풍부화는 출발 재료와 비교하여 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 99.99%, 99.999%, 99.9999%), 또는 99.9999% 초과)일 수 있다. 일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드 제제를 포함하는 단리된 나노소포에는 잔류 생물학적 산물이 실질적으로 없다. 일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드 제제를 포함하는 단리된 나노소포에는 임의의 오염된 생물학적 물질이 100% 없거나, 99% 없거나, 98% 없거나, 97% 없거나, 96% 없거나, 95% 없거나, 94% 없거나, 93% 없거나, 92% 없거나, 91% 없거나, 90% 없다. 잔류 생물학적 산물은 무생물적 재료 (화학물질 포함) 또는 원치 않는 핵산, 단백질, 지질 또는 대사산물을 포함할 수 있다. 잔류 생물학적 산물이 실질적으로 없다는 것은 또한 FcRn 결합 폴리펩티드 조성물을 포함하는 나노소포가 검출가능한 생산자 세포를 함유하지 않고 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포만이 검출가능하다는 것을 의미할 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 쇄를 상호교환적으로 지칭하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해 쇄에 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대, 메틸화된 뉴클레오티드 및 이들의 유사체를 포함할 수 있다. 본원에 고려되는 폴리뉴클레오티드의 예는 단일-가닥 및 이중-가닥 DNA, 단일-가닥 및 이중-가닥 RNA, 및 단일-가닥 및 이중-가닥 DNA 및 RNA의 혼합물을 갖는 하이브리드 분자를 포함한다.
보통 융합 단백질의 경우와 같이, 융합 단백질에 보통 포함되는 2 개의 구성요소 (즉, FcRn 결합 폴리펩티드, 및 막관통 도메인을 포함하는 스캐폴드 단백질)는 융합 단백질에서 연속 방식으로 직접 연결될 수 있거나, 이들은 다양한 링커를 사용하여 서로 연결되고/되거나 부착될 수 있다. 펩티드 링커 중 임의의 것은 5 개 이상의 잔기, 10 개 이상의 잔기, 15 개 이상의 잔기, 20 개 이상의 잔기, 25 개 이상의 잔기, 30 개 이상의 잔기 또는 그 초과의 길이를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 링커는 2-4 개 사이의 잔기, 2-4 개 사이의 잔기, 2-6 개 사이의 잔기, 2-8 개 사이의 잔기, 2-10 개 사이의 잔기, 2-12 개 사이의 잔기, 2-14 개 사이의 잔기, 2-16 개 사이의 잔기, 2-18 개 사이의 잔기, 2-20 개 사이의 잔기, 2-22 개 사이의 잔기, 2-24 개 사이의 잔기, 2-26 개 사이의 잔기, 2-28 개 사이의 잔기, 또는 2-30 개 사이의 잔기의 길이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 링커는 가요성 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 링커는 글리신-세린 링커, 즉, 글리신 및 세린 잔기의 스트레치로 주로 또는 완전히 이루어진 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 링커는 (G4S)n 링커 (GGGGS)n (서열번호 1)을 포함하며, 여기서 "n"은 모티프의 반복의 횟수를 나타내고, 1 내지 10의 정수이다. 일부 실시양태에서, 제1 링커는 G4S (GGGGS; 서열번호 2) 링커, (G4S)2 (GGGGS GGGGS; 서열번호 3) 링커, (G4S)3 (GGGGS GGGGS GGGGS; 서열번호 4) 링커, 또는 (G4S)2-G4 (서열번호 5) 링커를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "단일-쇄 Fv" 또는 "scFv"는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체 단편을 의미하며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 원하는 구조를 형성할 수 있게 하는 VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv를 생산하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. scFv를 생산하는 방법에 대한 검토에 대해 Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 1 13, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)를 참고한다.
양태 또는 실시양태가 본원에서 언어 "포함하는"과 함께 기재되는 어디에서나, 달리 "이로 이루어지는" 및/또는 "본질적으로 이로 이루어지는"의 측면에서 기재되는 유사한 양태가 또한 제공된다는 것이 이해된다.
5.2 본 개시내용의 폴리펩티드
특히, 본원은 (i) 하나 이상의 FcRn 결합 부위 및 (ii) 막관통 (TM) 도메인을 포함하는 특정 FcRn 결합 폴리펩티드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 막관통 도메인은 다중통과 막관통 도메인이다.
일 양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물과 함께 사용하기 위한 FcRn 결합 폴리펩티드는, 생리학적 pH 미만의 pH에서 높은 친화도로 FcRn에 결합할 수 있고 하나 이상의 막관통 도메인 또는 이의 단편에 의해 막에 고정되는 FcRn 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것으로 이해되어야 한다.
특정 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 막관통 도메인 (예컨대, 스캐폴드 단백질) 및 신생아 Fc 수용체의 Fc 결합 부위에 특이적으로 결합할 수 있고 이종이합체를 형성하는 능력이 결여되어 있는 FcRn 결합 부위 (예컨대, 면역글로불린의 변형된 Fc 도메인)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 6.5의 pH에서 FcRn에 결합된 FcRn 결합 부위 (예컨대, 면역글로불린의 변형된 Fc 도메인)의 평형 해리 상수는 최대 10-4 M의 값을 갖는다. 특정 실시양태에서, 7.4의 pH에서 FcRn에 결합된 FcRn 결합 부위 (예컨대, 면역글로불린의 변형된 Fc 도메인)의 평형 해리 상수는 10-4 M 이상의 값을 갖는다. 특정 실시양태에서, FcRn 결합 부위 (예컨대, 면역글로불린의 변형된 Fc 도메인)는 하기 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있으며,
여기서 X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7 및 X8 각각은 임의의 아미노산이다. 특정 실시양태에서, FcRn 결합 부위 (예컨대, 면역글로불린의 변형된 Fc 도메인)는 인간 FcRn (서열번호 7) 및/또는 마우스 FcRn (서열번호 8)의 위치 135-158 사이의 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 FcRn 결합 폴리펩티드는 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 (예컨대, Fc 도메인)의 C-말단 영역으로부터 유래된 FcRn 결합 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 폴리펩티드는 2 개의 연결된 Ig-유사 폴딩 구조적 도메인 (예컨대, CH2 및 CH3 도메인)을 포함할 수 있고, 산성 pH에서 FcRn은 CH2 및 CH3 구조적 도메인 (FcRn 결합 부위) 둘 모두의 아미노 잔기에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, FcRn 폴리펩티드는 Ig-유사 폴딩 구조적 도메인 (예컨대, Fc 도메인의 CH2)을 포함할 수 있고, 산성 pH에서 FcRn은 CH2 구조적 도메인의 아미노 잔기 (예컨대, FcRn 결합 부위)에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, FcRn 폴리펩티드는 Ig-유사 폴딩 구조적 도메인 (예컨대, Fc 폴리펩티드의 CH3 도메인)을 포함할 수 있고, 산성 pH에서 FcRn은 CH3 구조적 도메인의 아미노 잔기 (FcRn 결합 부위)에 결합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 FcRn 결합 폴리펩티드는 다양한 포유동물 종 (예컨대, 인간으로부터)뿐만 아니라 다양한 면역글로불린 서브타입, 예를 들어, IgG (비-제한적인 예로서 IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG2a, IgG2d 및/또는 IgG2c의 경우)로부터 유래된 하나 이상의 FcRn 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, FcRn 결합 부위는 인간 Fc 구조적 도메인, 예를 들어, 인간 IgG Fc 폴리펩티드 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG Fc 구조적 도메인이거나, 이를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, FcRn 결합 부위는 인간 IgG1 Fc 폴리펩티드 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 인간 Fc 구조적 도메인이거나, 이를 포함한다 (야생형 인간 IgG1 Fc의 아미노산 서열에 대해서는 서열번호 9 참고). 다른 실시양태에서, FcRn 결합 부위는 인간 IgG2 Fc 폴리펩티드로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 인간 Fc 구조적 도메인이거나, 이를 포함한다 (야생형 인간 IgG2 Fc의 아미노산 서열에 대해서는 서열번호 10 참고). 다른 실시양태에서, FcRn 결합 부위는 인간 IgG3 Fc 폴리펩티드로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 인간 Fc 구조적 도메인이거나, 이를 포함한다 (야생형 인간 IgG3 Fc의 아미노산 서열에 대해서는 서열번호 11 참고). 다른 실시양태에서, FcRn 결합 부위는 인간 IgG4 Fc 폴리펩티드로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 인간 Fc 구조적 도메인이거나, 이를 포함한다 (야생형 인간 IgG4 Fc의 아미노산 서열에 대해서는 서열번호 12 참고).
일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드의 CH2 도메인은 임의의 적합한 항체로부터 용이하게 수득될 수 있다. 임의로 CH2 도메인은 인간 기원이다. CH2 도메인은 링커 아미노산 서열의 힌지에 (예컨대, 이의 N-말단에서) 연결될 수 있거나, 연결되지 않을 수 있다. 일 실시양태에서, CH2 도메인은 IgG1, 2, 4 또는 4 서브타입의 자연 발생 인간 CH2 도메인이다. 일 실시양태에서, CH2 도메인은 (예컨대, 10, 20, 30, 40 또는 50 개 이상의 아미노산 길이의) CH2 도메인의 단편이다. 일 실시양태에서, CH2 도메인은 본원에 기재된 폴리펩티드에 존재할 때, FcRn, 특히 인간 FcRn에 대한 결합을 유지할 것이다.
일 양태에서, 본원에 기재된 FcRn 결합 폴리펩티드는 Fc 도메인을 포함할 수 있고, 상기 Fc 도메인은 항체 (예컨대, IgG)의 야생형 Fc 도메인의 Fc 구조와 겹쳐질 수 있는 3 차원 구조를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 Fc 도메인을 포함하고, 상기 Fc 도메인은 베타-가닥의 동등한 Cα 위치 사이의 부분이 최대 1, 2, 4, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 15 Å의 제곱 평균 제곱근 편차 (RMSD)로 항체 (예컨대, IgG)의 야생형 Fc 도메인과 겹쳐질 수 있는 3 차원 구조를 나타낸다. 예를 들어, Fc 도메인의 구조는 Tam SH, et al Antibodies (Basel). 2017;6(3):12에 기재된 바와 같이 IgG1, IgG2 및 IgG4 서브타입의 Fc 도메인과 겹쳐질 수 있다. 겹쳐진 구조의 RMSD를 계산함으로써 2 개의 생물학적 구조를 비교하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다 (Xu, Y., Xu, D. and Liang, J., 2007. Computational methods for protein structure prediction and modeling. Springer.에 기재된 바와 같음).
다른 양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물과 함께 사용하기 위한 폴리펩티드는 야생형 면역글로불린 중쇄 Fc 폴리펩티드 서열과 비교하여 하나 이상의 돌연변이, 예컨대, 치환, 결실 또는 삽입을 갖지만, 천연 Fc 도메인의 전체 Ig 폴딩 또는 구조를 유지하는 FcRn 결합 폴리펩티드에 관한 것으로 이해되어야 한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 FcRn 결합 폴리펩티드는 FcRn의 Fc 결합 부위에 결합하는 역량을 갖는 면역글로불린의 변형된 Fc 도메인을 포함한다. 변형된 Fc 도메인은 임의의 IgG 항체의 Fc 부분의 임의의 서열과 50% 이상의 상동일 수 있다. 일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 임의의 IgG 항체의 Fc 부분의 임의의 서열과 60% 이상의 상동일 수 있다. 특정 실시양태에서, 변형된 Fc 도메인은 임의의 IgG 항체의 Fc 부분의 임의의 서열과 70% 이상의 상동일 수 있다. 특정 실시양태에서, 변형된 Fc 도메인은 임의의 IgG 항체의 Fc 부분의 임의의 서열과 80% 이상의 상동일 수 있다. 특정 실시양태에서, 변형된 Fc 도메인은 임의의 IgG 항체의 Fc 부분의 임의의 서열과 90% 이상의 상동일 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 Fc 도메인은 서열번호 13-34 중 임의의 것과 50% 이상의 상동일 수 있다. 특정 실시양태에서, FcRn 결합 모이어티는 서열번호 13-34 중 임의의 것과 60% 이상의 상동일 수 있다. 특정 실시양태에서, 변형된 Fc 도메인은 서열번호 13-34 중 임의의 것과 70% 이상의 상동일 수 있다. 특정 실시양태에서, 변형된 Fc 도메인은 서열번호 13-34 중 임의의 것과 80% 이상의 상동일 수 있다. 특정 실시양태에서, 변형된 Fc 도메인은 서열번호 13-34 중 임의의 것과 90% 이상의 상동일 수 있다. 특정 실시양태에서, 변형된 Fc 도메인은 서열번호 13-34 중 임의의 것과 95% 이상 또는 98% 이상의 상동일 수 있다.
일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 천연 FcRn 결합 부위 (예컨대, Fc 도메인)를 포함한다. 일부 실시양태에서, FcRn 결합은 FcRn 결합을 변경하는 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 Fc 도메인은 FcRn 결합을 추가로 향상시키기 위해 돌연변이되거나 변형된다. 이들 실시양태에서, 돌연변이된 또는 변형된 Fc 폴리펩티드는 다음의 돌연변이를 포함할 수 있다: EU 넘버링 시스템을 사용한, M252Y, S254T, T256E, L309N, T250Q, M428L, N434S, N434A, T307A, E380A. 일부 실시양태에서, 돌연변이된 또는 변형된 Fc 폴리펩티드는 M252Y, S256T, T256E, M428L, M428V, N434S 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 향상된 FcRn 결합을 위한 CH2 및 CH3 도메인의 변형은 본원에 참조로 원용되는 US16/845,894호에 제시되어 있다.
다양한 실시양태에서, 본 개시내용의 FcRn 결합 폴리펩티드는 산성 pH에서 FcRn의 Fc 결합 부위에 대한 증가된 결합 친화도를 갖고, 약 중성 pH에서 FcRn의 Fc 결합 부위에 대한 감소된 결합 친화도를 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 본 개시내용의 FcRn 결합 폴리펩티드는 중성 pH (예컨대, 7.4의 pH)와 반대로 산성 pH (예컨대, 6.5의 pH)에서 FcRn과 복합체를 형성하는 증가된 경향을 갖는다.
일부 실시양태에서, 산성 pH에서 FcRn에 결합된 FcRn 결합 폴리펩티드의 평형 해리 상수는 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 또는 10-9 M 이상이다. 일부 실시양태에서, 6.5의 pH에서 FcRn에 결합된 FcRn 결합 폴리펩티드의 평형 해리 상수는 6.5의 pH에서 FcRn에 결합된 변형된 Fc 도메인의 평형 해리 상수와 동일하다. 일부 실시양태에서, 6.5의 pH에서 FcRn에 결합된 FcRn 결합 폴리펩티드의 평형 해리 상수는 FcRn에 결합된 변형된 Fc 도메인 단편의 평형 해리 상수와 비교하여 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 60% 이상 증가된다.
일부 실시양태에서, 중성 pH에서 FcRn에 결합된 FcRn 결합 폴리펩티드의 평형 해리 상수는 10-5, 10-4, 10-3, 10-2 또는 10-1 M 초과이다. 일부 실시양태에서 중성 pH에서 FcRn에 결합된 FcRn 결합 폴리펩티드의 평형 해리 상수는 중성 pH에서 FcRn에 결합된 변형된 Fc 도메인의 평형 해리 상수와 동일하다. 일부 실시양태에서, 6.5의 pH에서 FcRn에 결합된 FcRn 결합 폴리펩티드의 평형 해리 상수는 FcRn에 결합된 변형된 Fc 도메인 단편의 평형 해리 상수와 비교하여 20%, 30%, 40%, 50% 또는 60% 이상 증가된다.
일부 실시양태에서, 산성 pH에서 FcRn에 결합된 FcRn 결합 폴리펩티드의 변형된 Fc 도메인의 3-차원 구조는 생리학적 pH에서보다 더 큰 표면적 (예컨대, 1000 Å 초과)에 걸쳐 있는 결합 계면을 갖는다. 특정 실시양태에서, 변형된 Fc 도메인 쇄 및 FcRn의 폴리펩티드 쇄 사이의 계면에서의 매립된 표면적은 Fc 및 Fc의 CH2-CH3 도메인간 영역에 결합하는 다른 단백질 (예컨대, 단백질 A, 단백질 G 또는 류마티스 인자) 사이의 계면에서 매립된 면적보다 더 클 수 있다. 사이의 매립된 표면적을 계산하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다 (Xu, Y., Xu, D. and Liang, J., 2007. Computational methods for protein structure prediction and modeling. Springer.에 기재된 바와 같음).
본원에 기재된 바와 같은 모든 양태의 일 실시양태에서, 산성 pH에서 FcRn 결합 폴리펩티드는 인간 FcRn, 시노몰구스 FcRn, 마우스 FcRn, 랫트 FcRn, 양 FcRn, 개 FcRn 및 토끼 FcRn으로부터 선택된 FcRn에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 인간 FcRn보다 마우스 FcRn에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는다.
본원에 개시된 FcRn 결합 폴리펩티드뿐만 아니라 FcRn 결합 폴리펩티드의 Fc 도메인에 대해, 결합 친화도 및 결합 동역학을 분석하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 이러한 방법은 고체-상 결합 검정 (예컨대, ELISA 검정), 면역침강법, 표면 플라스몬 공명 (예컨대, Biacore™), 역학적 배제 검정 (예컨대, KinExA®), 유세포 분석법, 형광-활성화된 세포 분류 (FACS), 생물층 간섭계 (예컨대, Octet® (ForteBio,)) 및 웨스턴 블롯 분석을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 결합 친화도를 결정하기 위해 ELISA가 사용된다. ELISA 검정을 수행하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 일부 실시양태에서, 결합 친화도 및 또는 결합 동역학을 결정하기 위해 표면 플라스몬 공명 (SPR)이 사용된다. 일부 실시양태에서, 결합 친화도 및/또는 결합 동역학을 결정하기 위해 동역학 배제 검정이 사용된다. 일부 실시양태에서, 결합 친화도 및/또는 결합 동역학을 결정하기 위해 생물층 간섭계 검정이 사용된다.
5.2.1 CH2 및 CH3 도메인 동종이합체 변형
다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 FcRn 결합 폴리펩티드는 다른 Fc 도메인과 이합체를 형성하지 않도록 조작된다 (예컨대, 다른 변형된 Fc 도메인과 동종이합체 또는 내인성 Fc 도메인과 이종이합체를 형성하지 않음). 일 실시양태에서, Fc 도메인은 예컨대, 자연적으로 하전된 CH3-CH3 계면 내의 접촉 잔기의 정전기 조작 또는 소수성 패치 변형에 의해 이종이합체화를 붕괴시키는 변형을 함유한다 (예컨대, 단량체성 CH3로서 지칭되는 다른 CH3 도메인과의 상호작용을 통해 이합체화하지 않음). 본원의 특정 실시양태에서, 구체적으로 Fc 도메인의 CH3 도메인은 CH3 이합체화 계면을 붕괴시키기 위한 하나 이상의 아미노산 변형 (예컨대, 아미노산 치환)을 포함한다. 이러한 실시양태에서, CH3 도메인 변형은 CH2-CH3 도메인이 단량체성 형태일 때 소수성 잔기의 노출에 의해 유발된 단백질 스캐폴드 응집을 방지할 것이다. 동시에, 본 개시내용에 유용한 CH3 도메인 변형은 신생아 Fc 수용체 (FcRn), 예컨대, 인간 FcRn에 결합하는 Fc-유래된 폴리펩티드의 능력을 추가적으로 방해하지 않을 것이다.
일 양태에서, 본원에 기재된 FcRn 결합 폴리펩티드는 단량체성 CH3 도메인을 포함할 수 있고, 상기 CH3 도메인은 항체 (예컨대, IgG)의 야생형 CH3 도메인의 CH3 구조와 겹쳐질 수 있는 3 차원 구조를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 단량체성 CH3 도메인을 포함하고, 상기 단량체성 CH3 도메인은 베타-가닥의 등가 Cα 위치 사이의 부분이 최대 1, 2, 4, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 15 Å의 평균 제곱근 편차 (RMSD)로 항체 (예컨대, IgG)의 야생형 CH3 도메인과 겹쳐질 수 있는 3 차원 구조를 나타낸다. 예를 들어, 단량체성 CH3 도메인의 구조는 Tam SH, et al Antibodies (Basel). 2017;6(3):12에 기재된 바와 같이 IgG1, IgG2 및 IgG4 서브타입의 CH3 도메인과 겹쳐질 수 있다.
동종이합체 형성을 방지하기 위해 사용될 수 있는 단량체성 변형된 Fc 도메인은 다양한 공개물에 기재되어 있다. 예컨대, US 2006/0074225호, WO2006/031994호, WO2011/063348호 및 Ying et al. (2012) J. Biol. Chem. 287(23):19399-19407을 참고하며, 이들 각각의 개시내용은 본원에 참조로 원용된다. 동종이합체 형성을 방해하기 위해, CH3-CH3 계면을 구성하는 하나 이상의 잔기가 하전된 아미노산으로 대체되어, 상호작용이 정전기적으로 바람직하지 않게 만든다. 예를 들어, WO2011/063348호는 계면의 양으로 하전된 아미노산, 예컨대, 리신, 아르기닌 또는 히스티딘이 상이한 아미노산 (예컨대, 음으로 하전된 아미노산, 예컨대, 아스파르트산 또는 글루탐산)으로 대체되고/되거나, 계면의 음으로 하전된 아미노산이 상이한 (예컨대, 양으로 하전된) 아미노산으로 대체됨을 제공한다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 CH3 도메인은 (EU 넘버링에 따른) 위치 R355, D356, E357, K370, K392, D399, K409 및 K439 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 개에서 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 계면 내의 2 개 이상의 하전된 잔기는 반대 전하로 바뀐다. 예시적인 CH3 도메인은 K392D 및 K409D 돌연변이, 및 D399K 및 D356K 돌연변이를 포함하는 도메인을 함유한다.
단량체성 Fc 도메인을 유지하기 위한 추가 전략은 CH3-CH3 계면을 구성하는 하나 이상의 큰 소수성 잔기를 작은 극성 아미노산으로 대체하는 것을 포함한다. 예로서, 인간 IgG를 사용하면, CH3-CH3 계면의 큰 소수성 잔기는 Fc 도메인의 Y349, L351, L368, L398, V397, F405 및 Y407을 포함한다. 작은 극성 아미노산 잔기는 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 세린 및 트레오닌을 포함한다. 따라서, 일 실시양태에서, 본원에 기재된 CH3 도메인은 위치 R355, D356, E357, K370, K392, D399, K409 및 K439 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 개에서 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 포함한다. WO2011/063348호에 기재된 연구에서, CH3 도메인 계면에서 밀접하게 위치되는 양으로 하전된 Lys 잔기 중 2 개가 Asp로 돌연변이되었다. 그런 다음, 이러한 2 개의 Lys에서 Asp로의 돌연변이의 배경 하에 구조적으로 보존된 큰 소수성 잔기에 대해 트레오닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행하였다. 트레오닌으로의 다양한 치환과 함께 K392D 및 K409D 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인을 단량체성 형성에 대해 분석하였다. 예시적인 단량체성 Fc 도메인은 K392D, K409D 및 Y349T 치환을 갖는 것들, 및 K392D, K409D 및 F405T 치환을 갖는 것들을 포함한다.
Ying et al. (2012) J. Biol. Chem. 287(23):19399-19407에서, 잔기 L351, T366, L368, P395, F405, T407 및 K409에서 CH3 도메인 내에서 아미노산 치환이 이루어졌다. 상이한 돌연변이의 조합은 단백질 응집을 유발하지 않으면서, CH3 이합체화 계면의 붕괴를 초래하였다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 CH3 도메인은 위치 L351, T366, L368, P395, F405, T407 및/또는 K409 중 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 개에서 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 포함한다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 CH3 도메인은 아미노산 변형 L351Y, T366Y, L368A, P395R, F405R, T407M 및 K409A를 포함한다. 일 실시양태에서, CH3 도메인은 아미노산 변형 L351S, T366R, L368H, P395K, F405E, T407K 및 K409A를 포함한다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 CH3 도메인은 아미노산 변형 L351K, T366S, P395V, F405R, T407A 및 K409Y를 포함한다.
다양한 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 Fc 도메인은 야생형 Fc 분자와 비교하여 감소된 이합체화를 나타낸다. 따라서, 본 개시내용의 실시양태는 본원에 기재된 바와 같은 FcRn 결합 폴리펩티드의 집단을 포함하는 조성물을 포함하며, 여기서 상기 FcRn 결합 폴리펩티드에 의해 나타나는 Fc 도메인-Fc 도메인 동종이합체화의 양은 집단의 10% 미만, 20% 미만, 30% 미만, 40% 미만, 50% 미만, 60% 미만, 70% 미만, 80% 미만, 90% 미만, 95% 미만, 97% 미만 또는 99% 미만이다. 이합체화는 당업계에 알려진 여러 기술에 의해 측정될 수 있다. 변형된 Fc 도메인의 동종이합체화를 측정하는 바람직한 방법은 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), 분석적 초원심분리 (AUC), 동적 광산란 (DLS) 및 천연(Native) PAGE를 포함한다.
5.2.2 추가적인 Fc 도메인 변형
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 FcRn 결합 폴리펩티드는 하나 이상의 추가 변형을 함유한다. 변형된 Fc 도메인에 도입될 수 있는 다른 돌연변이의 비-제한적인 예는 예를 들어, 혈청 안정성 및/또는 반감기를 증가시키는 돌연변이, 이펙터 기능을 조정하는 돌연변이, 글리코실화에 영향을 미치는 돌연변이 및 또는 인간에서 면역원성을 감소시키는 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 FcRn 결합 폴리펩티드는 이펙터 기능을 감소시키는 변형, 즉, 이펙터 기능을 매개하는 이펙터 세포 상에서 또는 그 내에서 발현되는 (FcRn 이외의) Fc 수용체에 대한 결합 시 특정 생물학적 기능을 유도하는 능력이 감소된 변형을 포함한다. Fc-수용체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성 (CDC), Fc 수용체 결합, 항체-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC), 항체-의존적 세포-매개된 식세포작용 (ADCP), 세포 표면 수용체 (예컨대, B 세포 수용체)의 하향-조절 및 B-세포 활성화를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 FcRn 결합 폴리펩티드에 존재하는 변형된 Fc 도메인은 이펙터 기능을 조정하는 추가적인 변형을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 Fc 도메인의 보체 의존적 세포독성 (CDC) 활성; 변형된 Fc 도메인의 항체 의존적 세포 매개된 세포독성 (ADCC) 활성; 변형된 Fc 도메인의 항체 의존적 세포 매개된 식세포작용 (ADCP) 활성; 및/또는 변형된 Fc 도메인의 항체 의존적 세포내 중화 (ADIN) 활성은 미변형된 Fc 도메인과 비교하여 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 이상 감소된다.
일부 실시양태에서, 변형된 Fc 도메인의 보체 의존적 세포독성 (CDC) 활성; 변형된 Fc 도메인의 항체 의존적 세포 매개된 세포독성 (ADCC) 활성; 변형된 Fc 도메인의 항체 의존적 세포 매개된 식세포작용 (ADCP) 활성; 및/또는 변형된 Fc 도메인의 항체 의존적 세포내 중화 (ADIN) 활성은 미변형된 Fc 도메인과 비교하여 1.5, 2, 3, 4 또는 5-배 이상 감소된다.
일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단으로, 다음을 포함한다: (a) 미변형된 CH2 도메인에 비해 이펙터 기능이 감소되도록 변형되는 변형된 CH2 도메인; (b) 미변형된 CH3 도메인에 비해 동종이합체화가 결여되도록 변형되는 변형된 CH3 도메인; (c) 링커 서열; 및 (d) 막관통 도메인.
일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 C-말단에서 N-말단으로, 다음을 포함한다: (a) 미변형된 CH3 도메인에 비해 동종이합체화가 결여되도록 변형되는 변형된 CH3 도메인; (b) 미변형된 CH2 도메인에 비해 이펙터 기능이 감소되도록 변형되는 변형된 CH2 도메인; (c) 링커 서열; 및 (d) 막관통 도메인.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 FcRn 결합 폴리펩티드는 이펙터 기능을 감소시키거나 제거하는 변형을 포함할 수 있다. 예시적인 변형은 이펙터 기능을 감소시키는 CH2 도메인 변형을 포함하며, 이는 예컨대, EU 넘버링 체계에 따른 위치 234 및 235에서 modCH2로서 지칭되는 CH2 도메인에서의 치환을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 변형된 Fc 도메인은 위치 234 및 235에서 알라닌 잔기를 포함할 수 있다. 따라서, FcRn 결합 폴리펩티드는 L234A 및 L235A 치환을 가질 수 있다.
일 실시양태에서, 본원에 기재된 FcRn 결합 폴리펩티드에 존재할 때, CH2 도메인은 Fcγ 수용체, 특히 FcγRIIIA (CD16)에 대한 결합의 감소 또는 결여를 부여한다. CD16에 결합할 수 없는 CH2 도메인을 포함하는 FcRn 결합 폴리펩티드는 관심 있는 이펙터 세포 항원 (예컨대, NKp46, CD3 등)을 발현하지 않는 세포 (예컨대, NK 세포, T 세포)에 의해 ADCC를 활성화하거나 매개할 수 없을 것이다.
일 실시양태에서, 본원에 기재된 FcRn 결합 폴리펩티드에 존재할 때 CH2 도메인은 항체 의존적 세포독성 (ADCC), 보체 의존적 세포독성 (CDC), 항체 의존적 세포성 식세포작용 (ADCP), FcR-매개된 세포성 활성화 (예컨대, FcR 가교를 통한 사이토카인 방출) 및/또는 FcR-매개된 혈소판 활성화/고갈이 감소될 것이거나, 실질적으로 결여될 것이다.
일 실시양태에서, 본원에 기재된 FcRn 결합 폴리펩티드에 존재할 때 CH2 도메인은 활성화 Fcγ 수용체, 예컨대, FcγRIIIA (CD16), FcγRIIA (CD32A) 또는 CD64, 또는 억제성 Fc 수용체, 예컨대, FcγRIIB (CD32B)에 대한 결합의 실질적인 손실을 갖는다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 FcRn 결합 폴리펩티드에 존재할 때 CH2 도메인은 보체의 제1 구성요소 (C1q)와의 결합의 실질적인 손실을 갖는다.
예를 들어, 위치 233-236에서의 IgG2 잔기 및 위치 327, 330 및 331에서의 IgG4 잔기의 인간 IgG1의 CH2 도메인으로의 치환은 Fcγ 수용체에 대한 결합을 크게 감소시키고, 따라서 ADCC 및 CDC를 크게 감소시키는 것으로 나타났다. 게다가, Idusogie et al. (2000) J Immunol. 164(8):4178-84에서는 K322를 포함한 상이한 위치에서의 알라닌 치환이 보체 활성화를 유의하게 감소시킨다는 것을 입증하였다.
이펙터 기능을 조정하는 추가적인 CH2 도메인 변형 또는 돌연변이는 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 위치 329는, 프롤린이 글리신 또는 아르기닌, 또는 Fc의 프롤린 329 및 FcγRIII의 트립토판 잔기 Trp 87 및 Trp 110 사이에 형성된 Fc/Fcy 수용체 계면을 파괴하기에 충분히 큰 아미노산 잔기로 치환되는 돌연변이를 가질 수 있음.
CH2 도메인에서의 추가적인 예시적인 치환은 EU 넘버링 체계에 따른, S228P, E233P, L235E, N297A, N297D 및 P331S를 포함한다. 다중 치환, 예컨대, EU 넘버링 체계에 따른, 인간 IgG1 Fc 영역의 L234A 및 L235A; 인간 IgG1 Fc 영역의 L234A, L235A 및 P329G; 인간 IgG4 Fc 영역의 S228P 및 L235E; 인간 IgG1 Fc 영역의 L234A 및 G237A; 인간 IgG1 Fc 영역의 L234A, L235A 및 G237A; 인간 IgG2 Fc 영역의 V234A 및 G237A; 인간 IgG4 Fc 영역의 L235A, G237A 및 E318A; 및 인간 IgG4 Fc 영역의 S228P 및 L236E. 일부 실시양태에서, 하나의 FcRn 결합 폴리펩티드는 ADCC를 조정하는 하나 이상의 아미노산 치환, 예컨대, EU 넘버링 체계에 따른 위치 298, 333 및/또는 334에서의 치환을 가질 수 있다.
일 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 예컨대, 전장 야생형 인간 IgG1 Fc 도메인과 비교하여 인간 Fcγ 수용체 (예컨대, CD16, CD32A, CD32B 및/또는 CD64)에 대한 감소된 결합을 갖는다. 일 실시양태에서, 폴리펩티드는 예컨대, 인간 IgG1 아이소타입의 야생형 Fc 도메인을 갖는 FcRn 결합 폴리펩티드와 비교하여, 면역 이펙터 세포에 의해 매개된 바와 같은, 항체 의존적 세포독성 (ADCC), 보체 의존적 세포독성 (CDC), 항체 의존적 세포성 식세포작용 (ADCP), Fc 수용체 매개된 세포성 활성화 (예컨대, FcR 교차를 통한 사이토카인 방출), 및/또는 Fc 수용체 매개된 혈소판 활성화/고갈의 감소 (예컨대, 부분적 또는 완전한 손실)를 갖는다.
일 실시양태에서, FcRn 수용체에 대한 결합을 유지하지만 Fcγ 수용체에 대한 결합의 감소를 갖는 CH2 도메인은 예컨대, EU 넘버링 체계에 따른 잔기 N297에서 N-연결된 글리코실화가 결여되어 있거나 변형되어 있다. 예를 들어, FcRn 결합 폴리펩티드는 N297에서 글리코실화를 산출하지 않는, N-아세틸글루코사민에 푸코실을 첨가하기 위한 높은 효소 활성을 자연적으로 갖는 세포주에서 발현될 수 있다. 다른 실시양태에서, CH2 도메인은 잔기 297-299에서 표준 Asn-X-Ser/Thr N-연결된 글리코실화 모티프의 결여를 초래하는 하나 이상의 치환을 가질 수 있으며, 이는 또한 Fcγ 수용체에 대한 결합의 감소를 초래할 수 있다. 따라서, CH2 도메인은 N297 및/또는 이웃 잔기 (예컨대, 298, 299)에서 치환을 가질 수 있다.
일 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 저하된 FcγR 결합 역량을 나타내지만 보존된 FcRn 결합을 갖는 IgG2 Fc 돌연변이체로부터 유래된 CH2 도메인을 함유한다. 특정 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 EU 넘버링 시스템에 따른 돌연변이 V234A, G237A, P238S를 포함한다. 다른 양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 EU 넘버링 시스템에 따른 돌연변이 V234A, G237A, H268Q 또는 H268A, V309L, A330S, P331S를 포함한다. 특정 양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 EU 넘버링 시스템에 따른 돌연변이 V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S, P331S, 및 임의로 P233S를 포함하는 IgG2 Fc로부터 유래된 CH2 도메인을 함유한다.
일 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는, 임의로 추가로 다른 도메인 (예컨대, CH3 도메인)의 하나 이상의 아미노산 변형과 조합하여, Fc 도메인의 CH2 도메인에 하나 이상의 아미노산 변형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 개 이상의 아미노산 변형을 보유함)을 포함한다. Fc 도메인 변형의 임의의 조합이 이루어질 수 있다. 일 실시양태에서, 인간 Fcγ 수용체에 대한 감소된 결합을 갖는 본 개시내용의 FcRn 결합 폴리펩티드는 아미노산 잔기 237-340 (EU 넘버링) 내의 야생형 CH2 도메인에 비해 하나 이상의 아미노산 변형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 개 이상의 아미노산 변형을 보유함)을 포함하며, 그에 따라 이러한 CH2 도메인을 포함하는 FcRn 융합 폴리펩티드는 야생형 CH2 도메인을 포함하는 등가 폴리펩티드에 비해 관심 있는 인간 Fcγ 수용체에 대해 감소된 친화도를 갖는다.
일 양태에서, 본원에 기재된 FcRn 결합 폴리펩티드는 CH2 도메인 (예컨대, 변형된 CH2 도메인)을 포함할 수 있고, 상기 CH2 도메인 (예컨대, 변형된 CH2 도메인)은 항체 (예컨대, IgG)의 야생형 CH2 도메인의 CH2 구조와 겹쳐질 수 있는 3 차원 구조를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 변형된 CH2 도메인을 포함하고, 상기 변형된 CH2 도메인은 베타-가닥의 등가 Cα 위치 사이의 부분이 최대 1, 2, 4, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 15 Å의 평균 제곱근 편차 (RMSD)로 항체 (예컨대, IgG)의 야생형 CH2 도메인과 겹쳐질 수 있는 3 차원 구조를 나타낸다. 예를 들어, 변형된 CH2 도메인의 구조는 Tam SH, et al Antibodies (Basel). 2017;6(3):12에 기재된 바와 같은 IgG1, IgG2 및 IgG4 서브타입의 CH2 도메인과 겹쳐질 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CH3 도메인을 포함하는 FcRn 결합 폴리펩티드는 3부분(tripartite) 모티프-함유 단백질 21 (TRIM21)의 활성화를 감소시키는 변형을 포함할 수 있다. TRIM21의 활성화를 감소시키는 예시적인 CH3 도메인 돌연변이는 예컨대, EU 넘버링 체계에 따른 위치 433에서 CH3 도메인에서의 치환을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, CH3 도메인은 EU 넘버링 체계에 따른 위치 433에서 알라닌 잔기를 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 관심 있는 분자를 부착하기 위한 나노소포 (예컨대, EV 및 하이브리도좀)의 신호 중성 단백질 스캐폴드에 고정된 FcRn 결합 폴리펩티드가 본원에 제공된다.
추가 양태에서, 본 개시내용에 유용한 Fc 폴리펩티드의 FcRn 결합 부위는 CH2 및 CH3 도메인 (예컨대, fc 폴리펩티드)의 C- 또는 N-말단을 포함하지 않으면서 CH2 및 CH3 도메인 사이의 도메인-간 계면 (예컨대, 힌지 영역)에 가까운 내부 아미노-산을 포함할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, FcRn 결합 부위를 포함하는 구조적 도메인의 말단 둘 모두는 FcRn 결합 기능과 관련이 없으며, 따라서 폴리펩티드의 FcRn 결합 기능을 유의하게 변경시키지 않으면서 변형될 수 있다 (예컨대, 이종 단백질에 연결됨). 구조적 보완 (예컨대, FcRn 결합)을 위해 접근가능한 (N- 또는 C-말단으로부터 원위의) 내부 FcRn 결합 부위를 갖는 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 섹션에 기재된 바와 같은 상이한 유형의 막관통 도메인 (유형 1, II 및 PT)을 포함하는 스캐폴드 단백질의 N- 또는 C- 말단에 테더링될 때 설계 이점을 제공할 수 있다. 게다가, 세포 유형-특이적 표적화, 수용체 디코이 또는 정제와 같은 추가적인 기능성을 위해 스캐폴드 단백질 및 임의로 이종 단백질에 융합되는 접근가능한 N- 및 C-말단을 갖는 내부 FcRn 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, FcRn 결합 부위는 막으로부터 돌출하는 단백질 스캐폴드에 융합되어, FcRn이 FcRn 결합 부위에 접근할 수 있게 한다. 특정 실시양태에서, 이는 안정성을 유지하면서 동시에 구부리고/리거나 재구성하는 데 가요성인 막으로부터의 FcRn 결합 부위의 긴 돌출부를 초래한다 (예컨대, 에프린 수용체 스캐폴드 단백질에 융합된 경우). 안정한 막 고정은 관심 있는 분자가 나노소포 (예컨대, EV 또는 하이브리도좀) 또는 세포의 외부 표면으로 지시될 수 있다는 점에서 생성된 융합 단백질의 입체배치를 간소화할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 FcRn 결합 폴리펩티드는 C1q, FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII에 실질적으로 결합하지 않는다.
표 1 야생형 IgG1 Fc 도메인 및 변형된 Fc 도메인의 예
5.2.3 FcRn 결합 폴리펩티드의 아키텍처
일 양태에서 FcRn 결합 폴리펩티드는 막관통 도메인을 포함하는 스캐폴드 단백질 (예컨대, 스캐폴드 단백질)에 연결된 FcRn 결합 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, FcRn 결합 부위는 FcRn의 Fc 결합 부위에 결합하는 역량을 갖는 면역글로불린의 변형된 Fc 도메인을 포함한다.
(a) 막관통 도메인 (예컨대, 막관통 도메인을 함유하는 스캐폴드 단백질)
다양한 실시양태에서, 본 개시내용의 FcRn 결합 폴리펩티드는, 세포막에 임베딩되고 1 회 이상 이를 횡단하는 하나 이상의 막관통 영역을 포함하는 막관통 단백질 또는 막-결합된 단백질의 막관통 도메인을 포함한다. 이러한 막관통 영역 또는 이의 기능적 단편은 FcRn 결합 폴리펩티드의 막 앵커로서 사용될 수 있다. 본 개시내용의 FcRn 결합 폴리펩티드에 유용한 막관통 도메인은 비제한적으로 원형질 막, 소포체 막, 골지체 막, 리소좀 막, 핵 막 및 미토콘드리아 막를 포함하는 세포의 다양한 막 중 임의의 것과 회합되는 막관통 단백질로부터 기원할 수 있다. 이러한 상이한 유형의 막 중 임의의 것과 회합된 막관통 단백질의 예는 EV 샘플의 프로테오믹스 데이터 세트 (예컨대, www.exocarta.org)에서 일상적으로 찾아볼 수 있으며, 일부 경우에, CD63과 같은 막관통 단백질의 엔도사이토시스 신호가 돌연변이되어 엔도솜 막으로부터 원형질 막으로의 국소화를 전환할 때, 생성된 분비된 EV는 동일한 단백질의 엔도솜-표적화된 형태보다 더 많은 양의 전환된 막관통 단백질을 함유한다 (Fordjour et al, bioRxiv; 2019 참고).
막관통 단백질에는 4 개의 일반적인 부류 또는 유형이 있다 (유형 I-IV, Nelson and Cox, Principles of Biochemistry (2008) 참고). 유형 I 막관통 단백질은 소포체 (ER) 내강에 대해 표적화된 N-말단 영역, 및 세포질에 대해 지시된 C-말단 영역을 가지고 있다. 유형 II 막관통 단백질은 세포질 도메인에 대해 표적화된 N-말단 영역, 및 ER 내강에 대해 지시된 C-말단 영역을 가지고 있다. PT 유형 막관통 단백질은 세포막에 걸쳐 있는 번역된 단백질의 하나 초과의 세그먼트를 갖는 "다중-통과" 또는 폴리토픽(polytopic) 막관통 단백질이다.
다양한 실시양태에서, 본 개시내용의 FcRn 결합 폴리펩티드 내 막관통 도메인은 막관통 단백질이 보통 회합되어 있는 세포의 막을 정상적으로 횡단하는 막관통 단백질의 막관통 영역의 전부 또는 일부를 포함한다. 본 개시내용의 FcRn 결합 폴리펩티드의 막관통 도메인은 막관통 단백질의 막에-걸쳐 있는 영역뿐만 아니라 막관통 단백질의 막에-걸쳐 있는 또는 막-임베딩된 영역에 대한 상류 (N-말단) 및/또는 하류 (C-말단)의 측접 영역에 위치하는 막관통 단백질의 추가적인 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 막관통 단백질의 전체 막관통 영역이 사용될 것이다. 추가적인 실시양태에서, 막관통 영역 전체 및 막관통 단백질의 막-임베딩된 부분의 임의의 상류 또는 하류 영역의 전부 또는 일부가 본 개시내용에 따른 FcRn 결합 폴리펩티드의 막관통 도메인으로서 사용될 수 있다. 본 개시내용의 FcRn 결합 폴리펩티드의 막관통 앵커의 일부일 수 있는 막관통 단백질의 막-임베딩된 부분으로부터 상류 (N-말단) 및/또는 하류 (C-말단)에 위치하는 추가적인 아미노산은 비제한적으로 1 내지 10 개의 아미노산, 1 내지 20 개의 아미노산, 1 내지 30 개의 아미노산, 1 내지 40 개의 아미노산, 1 내지 50 개의 아미노산, 1 내지 60 개의 아미노산, 1 내지 70 개의 아미노산, 1 내지 80 개의 아미노산, 1 내지 90 개의 아미노산, 1 내지 100 개의 아미노산, 1 내지 200 개의 아미노산, 1 내지 300 개의 아미노산, 1 내지 400 개의 아미노산, 1 내지 500 개의 아미노산, 1 내지 600 개의 아미노산, 1 내지 700 개의 아미노산, 1 내지 800 개의 아미노산, 및 1 내지 900 개의 아미노산을 포함하는 크기의 범위를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 단편 막관통 도메인에는 천연 단백질의 N-말단으로부터 5, 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 또는 800 개 이상의 아미노산이 결여되어 있다. 일부 실시양태에서, 단편 막관통 도메인에는 천연 단백질의 C-말단으로부터 5, 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 또는 800 개 이상의 아미노산이 결여되어 있다. 일부 실시양태에서, 서열은 천연 단백질의 N-말단 및 C-말단 둘 모두로부터 5, 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 또는 800 개 이상의 아미노산이 결여된 막관통 도메인의 단편을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 서열은 천연 단백질의 하나 이상의 기능적 또는 구조적 도메인이 결여된 막관통 도메인 단백질의 단편을 코딩한다.
본원에 기재된 막관통 도메인을 포함하는 FcRn 결합 폴리펩티드는 또한 막관통 단백질의 막관통 영역에 부착된 전체 세포질 영역, 또는 예를 들어, 세포질 꼬리의 바람직하지 않은 시그널링 기능을 제거하기 위한, 하나 이상의 아미노산에 의한 세포질 영역의 절삭을 포함할 수 있다. 예를 들어, 막관통 단백질의 세포질 영역의 C-말단 부분 내 키나제 도메인의 존재는 시그널링 도메인으로서 역할을 할 수 있다. 따라서, 키나제 막관통 단백질의 막-임베딩된 (막관통) 영역 및 인접한 세포질 C-말단 영역의 전부 또는 일부가 본 개시내용의 융합 단백질의 막관통 도메인으로서 사용된다면, 임의의 알려진 기능적 키나제 신호는, 막관통 영역 및 임의의 인접한 세포질을 포함하는 융합 단백질이 숙주 세포를 활성화하지 않도록 제거되거나 붕괴될 수 있다.
아래 표 2-4는 Uniprot 데이터베이스 항목과 함께 단일-통과 (표 2) 및 다중-통과 (표 3 및 표 4) 막관통 도메인을 포함하는 스캐폴드 단백질의 여러 비-제한적인 예의 목록을 제공한다. 본 개시내용의 FcRn-결합 폴리펩티드에 사용될 수 있는 막관통 도메인은 FcRn 결합 폴리펩티드를 나노소포에 고정시키기에 충분한 막관통 영역 서열의 일부를 사용할 수 있다. 막관통 영역의 상류 또는 하류의 측접 영역의 세그먼트를 포함하는 막관통 단백질의 다른 부분은 이들의 포함이 나노소포의 표면 상의 FcRn 결합 폴리펩티드의 전시를 향상시키거나 적어도 유의하게 저하시키지 않는 한, FcRn 결합 폴리펩티드에 포함될 수 있다. FcRn 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드를, 막관통 도메인을 포함하는 스캐폴드 단백질의 표면 접근가능한 단부에 융합시키는 것은 구부러지고/지거나 재구성하기에 가요성이지만 동시에 안정한 구조를 산출할 수 있다. 더욱이, 일부 실시양태에서, 스캐폴드 단백질의 엑토도메인은, 스캐폴드 단백질의 엑토도메인이 막으로부터 돌출되기 때문에 도달을 위한 긴 돌출부를 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 서열번호 35 (GLWTTITIFITLFLLSVCYSATVTFF)의 막관통 도메인 (예컨대, 막 결합된 IgG의 막관통 도메인)을 포함하지 않는다.
표 2 스캐폴드 단백질로서 사용될 수 있는 단일-통과 (바이토픽(bitopic)) 막관통 단백질의 예
표 3 접근가능한 N- 또는 C-말단을 갖는 스캐폴드 단백질로 사용될 수 있는 다중 통과 (폴리토픽) 막관통 단백질의 예
표 4 스캐폴드 단백질로 사용되는 막관통 도메인을 함유할 수 있는 다중-통과 (폴리토픽) 막관통 단백질의 예
본 개시내용과 함께 사용될 수 있는 막관통 도메인을 포함하는 다른 스캐폴드 단백질의 추가의 비-제한적인 예는 다음을 포함한다: 아미노펩티다제 N (CD13); 네프릴리신, AKA 막 메탈로엔도펩티다제 (MME); 엑토뉴클레오티드 피로포스파타제/포스포디에스테라제 패밀리 구성원 1 (ENPP1); 뉴로필린-1 (NRP1); PDGFR, GPI 앵커 단백질, 락타드헤린, LAMP2 및 LAMP2B)
일부 실시양태에서, 막관통 도메인은 야생형 에프린 수용체의 막관통 도메인 (예컨대, 서열번호 35-48로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 에프린 수용체 TM 도메인)과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 막관통 도메인은 야생형 에프린 수용체의 막관통 도메인 (예컨대, 서열번호 35-48로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 에프린 수용체 TM 도메인)이다.
일부 실시양태에서, 막관통 도메인은 야생형 FPRP의 막관통 도메인 (예컨대, 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 FPRP TM 도메인)과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 막관통 도메인은 야생형 FPRP의 막관통 도메인 (예컨대, 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 FPRP TM 도메인)이다.
표 5. TM 도메인의 비-제한적인 예.
일부 실시양태에서, 막관통 도메인은 1 개의 아미노산 돌연변이, 2 개의 아미노산 돌연변이, 3 개의 아미노산 돌연변이, 4 개의 아미노산 돌연변이, 5 개의 아미노산 돌연변이, 6 개의 아미노산 돌연변이, 7 개의 아미노산 돌연변이, 또는 7 개 초과의 아미노산 돌연변이를 제외한 야생형 에프린 수용체의 막관통 도메인의 아미노산 서열 (예컨대, 서열번호 35-48로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 에프린 수용체 막관통 도메인)을 포함한다. 돌연변이(들)는 치환(들), 삽입(들), 결실(들), 또는 이의 임의의 조합일 수 있다.
일부 실시양태에서, 막관통 도메인은 1 개의 아미노산 돌연변이, 2 개의 아미노산 돌연변이, 3 개의 아미노산 돌연변이, 4 개의 아미노산 돌연변이, 5 개의 아미노산 돌연변이, 6 개의 아미노산 돌연변이, 7 개의 아미노산 돌연변이, 또는 7 개 초과의 아미노산 돌연변이를 제외한 야생형 FPRP의 막관통 도메인의 아미노산 서열 (예컨대, 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 FPRP 막관통 도메인)을 포함한다. 돌연변이(들)는 치환(들), 삽입(들), 결실(들), 또는 이의 임의의 조합일 수 있다.
일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 막관통 도메인에서 2 개 이상의 폴리펩티드 사이의 상호작용을 증가시키는 막관통 도메인 동종-도메인 이합체화 모티프를 포함한다. 특정 실시양태에서, 막관통 도메인 동종-도메인 이합체 모티프는 막관통 류신 지퍼 모티프이다. 특정 실시양태에서, 막관통 도메인 동종-이합체 모티프는 막관통 글리신 지퍼 모티프이다. 막관통 도메인 이합체화를 변형하고 검정하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예컨대, Bocharov et al. J Biol Chem. 2008 Oct 24;283(43):29385-95를 참고한다.
일부 실시양태에서, 막관통 도메인은 야생형 에프린 수용체의 막관통 도메인의 아미노산 서열 (예컨대, 서열번호 35-48로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 에프린 수용체 막관통 도메인)을 포함하며, 이의 길이는 서열번호 35-48의 N 말단 및/또는 C 말단에서 1 개의 아미노산, 2 개의 아미노산, 3 개의 아미노산, 4 개의 아미노산, 5 개의 아미노산, 6 개의 아미노산, 7 개의 아미노산, 8 개의 아미노산, 9 개의 아미노산, 10 개의 아미노산, 11 개의 아미노산, 12 개의 아미노산, 13 개의 아미노산, 14 개의 아미노산, 15 개의 아미노산, 16 개의 아미노산, 17 개의 아미노산, 18 개의 아미노산, 19 개의 아미노산, 또는 20 개 이상의 아미노산이다.
일부 실시양태에서, 막관통 도메인은 야생형 FPRP의 막관통 도메인의 아미노산 서열 (예컨대, 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 FPRP 막관통 도메인)을 포함하며, 이의 길이는 서열번호 50의 N 말단 및/또는 C 말단에서 1 개의 아미노산, 2 개의 아미노산, 3 개의 아미노산, 4 개의 아미노산, 5 개의 아미노산, 6 개의 아미노산, 7 개의 아미노산, 8 개의 아미노산, 9 개의 아미노산, 10 개의 아미노산, 11 개의 아미노산, 12 개의 아미노산, 13 개의 아미노산, 14 개의 아미노산, 15 개의 아미노산, 16 개의 아미노산, 17 개의 아미노산, 18 개의 아미노산, 19 개의 아미노산, 또는 20 개 이상의 아미노산이다.
(b) 막관통 스캐폴드 단백질의 선택
본 개시내용의 FcRn 결합 폴리펩티드에서 막관통 도메인으로서 사용하기 위한 스캐폴드 단백질을 선택하는 데 있어 여러 인자가 고려될 수 있다. 이러한 인자 중에는 막관통 도메인의 공급원으로서 사용하기 위해 고려될 단백질의 특정 막관통 단백질 유형 (유형 I, II 또는 폴리토픽)이 무엇인지에 대한 인식, 막관통 단백질의 자연적인 세포하의 위치에 대한 인식, 및 본 개시내용에 따른 융합 단백질 내 FcRn 결합 폴리펩티드 및 막관통 도메인이 나노소포의 표면 상에 FcRn 결합 폴리펩티드를 전시하기 위한 본원에 기재된 전체 과정에서 서로의 기능에 영향을 미칠 수 있다는 인식이다.
위에 언급된 바와 같이, 4 개의 유형의 스캐폴드 단백질은 세포질 및 소포체 또는 나노소포 (예컨대, EV) 내강에 대한 N- 및 C-말단의 상대적인 배향, 및 단백질의 막관통 영역이 나노소포 (예컨대, EV) 막을 단 1 회만 횡단하는지 ("단일 통과" 막관통 영역) 또는 단백질 전체가 막을 1 회 초과로 통과하도록 2 개 이상의 막에 걸쳐 있는 영역 (다중-통과 막관통 영역)을 포함하는지 여부에 의해 서로 구별될 수 있다.
막관통 영역이 특정 유형의 막관통 단백질로부터 유래된다는 것을 아는 것은 본 개시내용의 FcRn 결합 폴리펩티드 내 FcRn-결합 부위에 대해 막관통 도메인에 대한 선호되는 배향 및 위치를 제시한다. 이는 막관통 영역의 양 측면 상의 세포질 및 나노소포 (예컨대, EV) 내강과 관련하여 N- 및 C-말단에 대해 고정된 배향 및 위치를 갖는 유형 I 및 유형 II 막관통 단백질과 관련하여 특히 중요하다. 예를 들어, 유형 I 막관통 단백질로부터의 막관통 영역이 본 개시내용의 FcRn 결합 폴리펩티드의 스캐폴드 단백질 (T1 스캐폴드로서 지칭됨)로서 사용되는 경우, FcRn 결합 부위는 막관통 도메인에 대해 N-말단이다 (도 2에 묘사된 바와 같음). 따라서, 유형 I-유래된 막관통 도메인을 갖는 본 개시내용의 FcRn 결합 폴리펩티드의 가장 일반적인 입체배치는 다음과 같이 예시된 N-말단에서 C-말단으로의 선형 구조를 포함할 것이며:
(1) (FcRn 결합 부위)-L-(T1 스캐폴드),
여기서 화학식 내 L은 2 개의 도메인을 연결하는 직접적인 펩티드 결합 또는 하나 이상의 아미노산 잔기의 링커 서열을 나타낸다. 유형 I 막관통 도메인을 함유하는 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포의 개략도에 대해 도 1을 참고한다.
또한, 유형 I-유래된 막관통 도메인을 포함하는 FcRn 결합 폴리펩티드는 바람직하게는 ER 막을 관통하여 ER 내강으로 융합 단백질의 N-말단을 지시하기 위한 유형 I 막관통 단백질의 특징인 N-말단 신호 서열 (예컨대, 신호 펩티드)을 포함한다.
구체적인 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 EphA1로부터 유래된 엑토도메인 및 막관통 도메인을 포함하는 T1 스캐폴드 단백질에 연결된다. 일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 야생형 EphA1의 전체 엑토도메인 및 막관통 도메인 영역 또는 이의 단편과 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 포함하고, 야생형 EphA1의 전체 엑토도메인 및 막관통 도메인 영역의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 적어도 99% 이상 서열 동일성을 가지며, 여기서 상기 폴리펩티드는 모 Eph 수용체와 비교하여 에프린에 대한 감소된 결합 또는 결합 없음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호 50과 동일하거나 유사한 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고, 서열번호 50과 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가지며, 여기서 상기 폴리펩티드는 모 Eph 수용체와 비교하여 에프린에 대한 감소된 결합 또는 결합 없음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, EphA1로부터 유래된 폴리펩티드의 일부는 하나 이상의 이종 단백질에 융합된다.
구체적인 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 EphA2로부터 유래된 엑토도메인 및 막관통 도메인을 포함하는 T1 스캐폴드 단백질에 연결된다. 일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 야생형 EphA2의 전체 엑토도메인 및 막관통 도메인 영역 또는 이의 단편과 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 포함하고, 야생형 EphA2의 전체 엑토도메인 및 막관통 도메인 영역의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가지며, 여기서 상기 폴리펩티드는 모 Eph 수용체와 비교하여 에프린에 대한 감소된 결합 또는 결합 없음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호 51과 동일하거나 유사한 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고, 서열번호 51과 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가지며, 여기서 상기 폴리펩티드는 모 Eph 수용체와 비교하여 에프린에 대한 감소된 결합 또는 결합 없음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, EphA2로부터 유래된 폴리펩티드의 일부는 하나 이상의 이종 단백질에 융합된다.
구체적인 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 EphA3으로부터 유래된 엑토도메인 및 막관통 도메인을 포함하는 T1 스캐폴드 단백질에 연결된다. 일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 야생형 EphA3의 전체 엑토도메인 및 막관통 도메인 영역 또는 이의 단편과 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 포함하고, 야생형 EphA3의 전체 엑토도메인 및 막관통 도메인 영역의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가지며, 여기서 상기 폴리펩티드는 모 Eph 수용체와 비교하여 에프린에 대한 감소된 결합 또는 결합 없음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호 52와 동일하거나 유사한 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고, 서열번호 52와 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가지며, 여기서 상기 폴리펩티드는 모 Eph 수용체와 비교하여 에프린에 대한 감소된 결합 또는 결합 없음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, EphA3으로부터 유래된 폴리펩티드의 일부는 하나 이상의 이종 단백질에 융합된다.
구체적인 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 EphA4로부터 유래된 엑토도메인 및 막관통 도메인을 포함하는 T1 스캐폴드 단백질에 연결된다. 일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 야생형 EphA4의 전체 엑토도메인 및 막관통 도메인 영역 또는 이의 단편과 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 포함하고, 야생형 EphA4의 전체 엑토도메인 및 막관통 도메인 영역의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가지며, 여기서 상기 폴리펩티드는 모 Eph 수용체와 비교하여 에프린에 대한 감소된 결합 또는 결합 없음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호 53과 동일하거나 유사한 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고, 서열번호 53과 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가지며, 여기서 상기 폴리펩티드는 모 Eph 수용체와 비교하여 에프린에 대한 감소된 결합 또는 결합 없음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, EphA4로부터 유래된 폴리펩티드의 일부는 하나 이상의 이종 단백질에 융합된다.
구체적인 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 EphA5로부터 유래된 엑토도메인 및 막관통 도메인을 포함하는 T1 스캐폴드 단백질에 연결된다. 일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 야생형 EphA5의 전체 엑토도메인 및 막관통 도메인 영역 또는 이의 단편과 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 포함하고, 야생형 EphA5의 전체 엑토도메인 및 막관통 도메인 영역의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가지며, 여기서 상기 폴리펩티드는 모 Eph 수용체와 비교하여 에프린에 대한 감소된 결합 또는 결합 없음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호 54와 동일하거나 유사한 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고, 서열번호 54와 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가지며, 여기서 상기 폴리펩티드는 모 Eph 수용체와 비교하여 에프린에 대한 감소된 결합 또는 결합 없음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, EphA5로부터 유래된 폴리펩티드의 일부는 하나 이상의 이종 단백질에 융합된다.
구체적인 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 EphA6으로부터 유래된 엑토도메인 및 막관통 도메인을 포함하는 T1 스캐폴드 단백질에 연결된다. 일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 야생형 EphA6의 전체 엑토도메인 및 막관통 도메인 영역 또는 이의 단편과 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 포함하고, 야생형 EphA6의 전체 엑토도메인 및 막관통 도메인 영역의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가지며, 여기서 상기 폴리펩티드는 모 Eph 수용체와 비교하여 에프린에 대한 감소된 결합 또는 결합 없음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호 55와 동일하거나 유사한 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고, 서열번호 55와 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가지며, 여기서 상기 폴리펩티드는 모 Eph 수용체와 비교하여 에프린에 대한 감소된 결합 또는 결합 없음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, EphA6으로부터 유래된 폴리펩티드의 일부는 하나 이상의 이종 단백질에 융합된다.
구체적인 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 EphA7로부터 유래된 엑토도메인 및 막관통 도메인을 포함하는 T1 스캐폴드 단백질에 연결된다. 일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 야생형 EphA7의 전체 엑토도메인 및 막관통 도메인 영역 또는 이의 단편과 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 포함하고, 야생형 EphA7의 전체 엑토도메인 및 막관통 도메인 영역의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가지며, 여기서 상기 폴리펩티드는 모 Eph 수용체와 비교하여 에프린에 대한 감소된 결합 또는 결합 없음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호 56과 동일하거나 유사한 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고, 서열번호 56과 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가지며, 여기서 상기 폴리펩티드는 모 Eph 수용체와 비교하여 에프린에 대한 감소된 결합 또는 결합 없음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, EphA7로부터 유래된 폴리펩티드의 일부는 하나 이상의 이종 단백질에 융합된다.
구체적인 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 EphA8로부터 유래된 엑토도메인 및 막관통 도메인을 포함하는 T1 스캐폴드 단백질에 연결된다. 일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 야생형 EphA8의 전체 엑토도메인 및 막관통 도메인 영역 또는 이의 단편과 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 포함하고, 야생형 EphA8의 전체 엑토도메인 및 막관통 도메인 영역의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가지며, 여기서 상기 폴리펩티드는 모 Eph 수용체와 비교하여 에프린에 대한 감소된 결합 또는 결합 없음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호 57과 동일하거나 유사한 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고, 서열번호 57과 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가지며, 여기서 상기 폴리펩티드는 모 Eph 수용체와 비교하여 에프린에 대한 감소된 결합 또는 결합 없음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, EphA8로부터 유래된 폴리펩티드의 일부는 하나 이상의 이종 단백질에 융합된다.
구체적인 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 EphA10으로부터 유래된 엑토도메인 및 막관통 도메인을 포함하는 T1 스캐폴드 단백질에 연결된다. 일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 야생형 EphA10의 전체 엑토도메인 및 막관통 도메인 영역 또는 이의 단편과 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 포함하고, 야생형 EphA10의 전체 엑토도메인 및 막관통 도메인 영역의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가지며, 여기서 상기 폴리펩티드는 모 Eph 수용체와 비교하여 에프린에 대한 감소된 결합 또는 결합 없음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호 58과 동일하거나 유사한 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고, 서열번호 58과 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가지며, 여기서 상기 폴리펩티드는 모 Eph 수용체와 비교하여 에프린에 대한 감소된 결합 또는 결합 없음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, EphA10으로부터 유래된 폴리펩티드의 일부는 하나 이상의 이종 단백질에 융합된다.
구체적인 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 EphB1로부터 유래된 엑토도메인 및 막관통 도메인을 포함하는 T1 스캐폴드 단백질에 연결된다. 일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 야생형 EphB1의 전체 엑토도메인 및 막관통 도메인 영역 또는 이의 단편과 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 포함하고, 야생형 EphB1의 전체 엑토도메인 및 막관통 도메인 영역의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가지며, 여기서 상기 폴리펩티드는 모 Eph 수용체와 비교하여 에프린에 대한 감소된 결합 또는 결합 없음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호 59와 동일하거나 유사한 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고, 서열번호 59와 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가지며, 여기서 상기 폴리펩티드는 모 Eph 수용체와 비교하여 에프린에 대한 감소된 결합 또는 결합 없음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, EphB1로부터 유래된 폴리펩티드의 일부는 하나 이상의 이종 단백질에 융합된다.
구체적인 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 EphB2로부터 유래된 엑토도메인 및 막관통 도메인을 포함하는 T1 스캐폴드 단백질에 연결된다. 일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 야생형 EphB2의 전체 엑토도메인 및 막관통 도메인 영역 또는 이의 단편과 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 포함하고, 야생형 EphB2의 전체 엑토도메인 및 막관통 도메인 영역의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가지며, 여기서 상기 폴리펩티드는 모 Eph 수용체와 비교하여 에프린에 대한 감소된 결합 또는 결합 없음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호 60과 동일하거나 유사한 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고, 서열번호 60과 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가지며, 여기서 상기 폴리펩티드는 모 Eph 수용체와 비교하여 에프린에 대한 감소된 결합 또는 결합 없음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, EphB2로부터 유래된 폴리펩티드의 일부는 하나 이상의 이종 단백질에 융합된다.
구체적인 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 EphB3으로부터 유래된 엑토도메인 및 막관통 도메인을 포함하는 T1 스캐폴드 단백질에 연결된다. 일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 야생형 EphB3의 전체 엑토도메인 및 막관통 도메인 영역 또는 이의 단편과 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 포함하고, 야생형 EphB3의 전체 엑토도메인 및 막관통 도메인 영역의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가지며, 여기서 상기 폴리펩티드는 모 Eph 수용체와 비교하여 에프린에 대한 감소된 결합 또는 결합 없음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호 61과 동일하거나 유사한 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고, 서열번호 61과 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가지며, 여기서 상기 폴리펩티드는 모 Eph 수용체와 비교하여 에프린에 대한 감소된 결합 또는 결합 없음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, EphB3으로부터 유래된 폴리펩티드의 일부는 하나 이상의 이종 단백질에 융합된다.
구체적인 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 EphB4로부터 유래된 엑토도메인 및 막관통 도메인을 포함하는 T1 스캐폴드 단백질에 연결된다. 일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 야생형 EphB4의 전체 엑토도메인 및 막관통 도메인 영역 또는 이의 단편과 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 포함하고, 야생형 EphB4의 전체 엑토도메인 및 막관통 도메인 영역의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가지며, 여기서 상기 폴리펩티드는 모 Eph 수용체와 비교하여 에프린에 대한 감소된 결합 또는 결합 없음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호 62와 동일하거나 유사한 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고, 서열번호 62와 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가지며, 여기서 상기 폴리펩티드는 모 Eph 수용체와 비교하여 에프린에 대한 감소된 결합 또는 결합 없음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, EphB4로부터 유래된 폴리펩티드의 일부는 하나 이상의 이종 단백질에 융합된다.
구체적인 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 EphB6으로부터 유래된 엑토도메인 및 막관통 도메인을 포함하는 T1 스캐폴드 단백질에 연결된다. 일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 야생형 EphB6의 전체 엑토도메인 및 막관통 도메인 영역 또는 이의 단편과 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 포함하고, 야생형 EphB6의 전체 엑토도메인 및 막관통 도메인 영역의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가지며, 여기서 상기 폴리펩티드는 모 Eph 수용체와 비교하여 에프린에 대한 감소된 결합 또는 결합 없음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호 63과 동일하거나 유사한 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고, 서열번호 63과 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가지며, 여기서 상기 폴리펩티드는 모 Eph 수용체와 비교하여 에프린에 대한 감소된 결합 또는 결합 없음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, EphB6으로부터 유래된 폴리펩티드의 일부는 하나 이상의 이종 단백질에 융합된다.
표 6. 엑토도메인 및 막관통 도메인을 포함하는 예시적인 Eph 수용체 유래된 스캐폴드 단백질.
유형 II 막관통 단백질의 막관통 영역이 스캐폴드 단백질 (T2 스캐폴드로 지칭됨)로서 사용되는 경우, FcRn-결합 부위는 바람직하게는 유형 II-유래된 막관통 도메인이 FcRn-결합 부위에 대해 N-말단인 도메인의 배열을 포함한다. 예를 들어, FcRn 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단 방향으로, 유형 II-유래된 막관통 도메인을 포함하는 스캐폴드 단백질 또는 이의 단편이 (변형된 Fc 도메인의) CH2 도메인에 연결되고, 차례로 (변형된 Fc 도메인의) 단량체 CH3 도메인에 연결되는 도메인의 배열을 포함할 수 있다 (도 2에 묘사된 바와 같음).
따라서, 유형 II-유래된 막관통 도메인을 포함하는 본 개시내용의 FcRn 결합 폴리펩티드의 가장 일반적인 입체배치는 다음과 같이 예시된 N-말단에서 C-말단으로의 선형 구조를 함유할 것이며:
(2) (T2 스캐폴드)-L-(FcRn 결합 부위),
여기서 화학식 내 L은 2 개의 도메인을 연결하는 직접적인 펩티드 결합 또는 하나 이상의 아미노산 잔기의 링커 서열을 나타낸다.
비-제한적인 예로서, FcRn 결합 폴리펩티드는 변형된 Fc 폴리펩티드를, 서열번호 64에 따른 AT1B3 또는 이의 기능적 단편과 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 동일성을 공유하는 AT1B3 (Uniprot P54709)의 폴리토픽 유형 II 유래된 막관통 단백질 스캐폴드 (T2 스캐폴드)의 C-말단에 융합시킴으로써 작제된다.
특정 실시양태에서, 다중-스팬(span) (폴리토픽) 막관통 단백질로부터의 막관통 영역이 스캐폴드 단백질 (PT 스캐폴드로서 지칭됨)로서 사용되는 경우, FcRn 결합 부위에 대한 막관통 도메인의 위치는 막관통 영역의 막에-걸쳐 있는 영역이 얼마나 많이 선택되었는지, 그리고 세포막의 세포질 및 ER 측면에 대해 N-말단에서 C-말단으로 선택된 막에-걸쳐 있는 영역(들)의 배향이 무엇인지에 따라 달라질 것이다 (도 2에 묘사된 바와 같음). 비-세포질 말단을 갖는 예시적인 PT 스캐폴드는 표 3에 나열되어 있다. PT 스캐폴드 또는 이의 단편의 말단이 비-세포질이라는 것은 당업자에게 명백할 것이다.
따라서, 폴리토픽 막관통 도메인을 포함하는 스캐폴드 단백질 (PT 스캐폴드)로부터 유래된 막관통 도메인을 활용하는 본 개시내용의 FcRn 결합 폴리펩티드에 대한 가능한 선형 입체배치는 다음과 같이 예시될 수 있고, 복수의 막관통 도메인의 사용을 포함할 수 있으며:
(3) (FcRn 결합 부위)-L-(PT 스캐폴드), 및/또는
(4) (PT 스캐폴드)-L-(FcRn 결합 부위),
여기서 각각의 화학식 내 L은 2 개의 도메인을 연결하는 직접적인 펩티드 결합 또는 하나 이상의 아미노산 잔기의 링커를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 폴리토픽 막관통 도메인을 포함하는 PT 스캐폴드 단백질은 유형 I-유래된 막관통 도메인을 포함하는 스캐폴드 단백질을 사용하기 위한 배열과 유사하게 FcRn 결합 부위에 대해 C-말단 도메인에 위치하지만, 다른 실시양태에서, 폴리토픽 막관통 도메인을 포함하는 PT 스캐폴드 단백질은 FcRn 결합 부위에 대해 N-말단 도메인에 위치한다. 유형 I 막관통 도메인을 포함하는 스캐폴드 단백질과 달리, PT 막관통을 포함하는 스캐폴드 단백질은 PT 스캐폴드의 N-말단을 ER 막 내로 그리고 ER 내강으로 관통하여 지시하는 데 N-말단 신호 서열을 필요로 하지 않을 수 있다. 그러나, PT-유래된 막관통 도메인을 포함하는 FcRn-결합 폴리펩티드 단백질의 경우, 나노소포 표면 상의 FcRn 결합 폴리펩티드의 원하는 위치를 달성하기 위해 N-말단 신호 서열이 여전히 필요할 수 있다.
비-제한적인 예로서, FcRn 결합 폴리펩티드는 변형된 Fc 폴리펩티드를, 서열번호 65에 따른 Zip2 또는 이의 기능적 단편과 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 동일성을 공유하는 (야생형 서열에 비해 위치 H63A에서 금속 수송을 감소시키는 변형을 포함하는) Zip2의 단백질 스캐폴드로부터 유래된 폴리토픽 막관통 도메인의 C-말단에 융합시킴으로써 작제된다.
추가적인 비-제한적인 예로서, FcRn 결합 폴리펩티드는 변형된 Fc 폴리펩티드를, 서열번호 66에 따른 Zip2 또는 이의 기능적 단편과 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 동일성을 공유하는 (야생형 서열에 비해 위치 H63A에서 금속 수송을 감소시키는 변형을 포함하는) Zip2의 PT 스캐폴드의 N-말단에 융합시킴으로써 작제된다.
추가의 비-제한적인 예로서, FcRn 결합 폴리펩티드는 변형된 Fc 폴리펩티드를, 서열번호 67에 따른 Zip2 또는 이의 기능적 단편과 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 동일성을 공유하는 나노소포의 표면에 위치하는 두 말단 모두로서 (야생형 서열에 비해 위치 H63A에서 금속 수송을 감소시키는 변형을 포함하는) Zip2의 PT 스캐폴드의 N-말단 및 C-말단 둘 모두에 융합시킴으로써 작제된다.
특정 실시양태에서, 세포질을 향해 배향된 N- 및 C-말단 둘 모두를 포함하는 멀티-스팬 (폴리토픽) 스캐폴드 단백질로부터의 막관통 영역인 경우, FcRn 결합 부위는 막관통 도메인의 2 개의 인접한 막에-걸쳐 있는 단편 사이의 세포외 루프에 배치될 수 있다. 세포질 말단을 갖는 예시적인 PT 스캐폴드는 표 4에 나열되어 있다. PT 스캐폴드 막관통 도메인으로부터의 루프가 세포질이 아닌 세포외에 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.
따라서, 폴리토픽 막관통 도메인을 포함하는 스캐폴드 단백질 (PT 스캐폴드)로부터 유래된 막관통 도메인을 활용한 본 개시내용의 FcRn 결합 폴리펩티드에 대한 가능한 선형 입체배치 (도 2에 묘사된 바와 같음)는 다음과 같이 예시될 수 있고, 복수의 막관통 도메인의 사용을 포함할 수 있으며:
(6): (TMH1)-(CL1)-(TMH2)-(L1)-(FcRn 결합 부위)-(L2)-(TMH3)-(CL2)
여기서 화학식 내 각각의 L은 2 개의 도메인을 연결하는 직접적인 펩티드 결합 또는 하나 이상의 아미노산 잔기의 링커를 나타내고, TMH는 "막관통 나선"을 나타내며, CL은 "세포질 루프"를 나타낸다.
(c) 스캐폴드 단백질로서 유용한 폴리펩티드를 결정하기 위한 표준 검정
아래 실시예에 설명된 본 개시내용의 특정한 특징에 더하여, 막관통 영역을 포함하는 단백질이, 특정 스캐폴드 단백질이 본 개시내용에 따른 FcRn 결합 폴리펩티드로서 유용한지 여부를 결정하기 위한 검정에 사용될 수 있다는 것이 명백하다. 이러한 스캐폴드 단백질 검정에서, 재조합 핵산 분자는, 후보 막관통 도메인과 인 프레임(in frame)으로 융합된 FcRn 결합 부위를 포함하는 융합 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 표준 방법 (예를 들어, 핵산 합성, 재조합 DNA 기술 및/또는 중합효소 변화 반응 (PCR) 방법)에 의해 생산된다. 후보 스캐폴드 단백질은 본원에 기재된 막관통 도메인의 특징에 따라 보통 세포막 또는 세포내막에 거주하거나 이를 횡단하는 막 단백질의 일부를 포함한다. 따라서, 비-제한적인 예로서, 스캐폴드 단백질로서 임의의 후보 폴리펩티드를 테스트하거나 평가하기 위해, 후보 막관통 도메인을 코딩하는 핵산은 FcRn 결합 부위를 포함하는 FcRn 결합 폴리펩티드의 공통 부분을 코딩하는 핵산에 인 프레임으로 연결된다. 그런 다음, 후보 FcRn 결합 폴리펩티드 융합 단백질을 코딩하는 생성된 재조합 핵산은 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 하기 실시예에 사용된 HEK 293 세포와 같은 포유동물 세포주의 세포는 발현 벡터로 형질주입될 수 있다. 이어서, 형질주입된 세포는 단리되고, 발현 벡터 상에 코딩된 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양물에서 성장될 수 있다. 배양 배지 또는 그로부터 단리된 나노소포의 샘플은 나노소포 (예컨대, EV) 고정된 FcRn 결합 폴리펩티드의 양 (예를 들어, 효소 연결된 면역흡착 검정 (ELISA)을 사용함), 유세포 분석법 (예컨대, 형광 항-Fc 도메인 항체를 사용함) 또는 산성 pH에서 FcRn에 대한 기능적 결합 (예컨대, Lumit™ FcRn 경쟁 검정을 사용함)에 대해 검정될 수 있다. 형질주입되지 않은 대조군 세포의 배지 내 FcRn 결합 폴리펩티드의 수준과 비교하여 형질주입된 세포의 배지 내 FcRn 결합 폴리펩티드의 수준의 향상은 스캐폴드 단백질, 및 따라서 후보 FcRn 결합 폴리펩티드가 본 개시내용에 따른 스캐폴드로서 유용하다는 것을 나타낸다. 바람직하게는, 융합 단백질을 발현하는 세포의 배양물의 배지로 분비된 나노소포에 존재하는 FcRn 결합 폴리펩티드의 수준은 대조군 세포의 배지 내 수준보다 1.5-배 이상 더 높다. 나노소포 (예컨대, 엑소좀)로부터 분비된 FcRn 결합 폴리펩티드의 수준을 강화시키는 것은 또한 치료적으로 그리고 상업적으로 중요한 특성이며, 1.5-배 이상 만큼의 증가는 생산 비용의 유의한 감소 및 치료적으로 그리고 상업적으로 중요한 나노소포의 이용가능성의 유의한 증가를 제공할 수 있다.
일부 실시양태에서, FcRn 결합 부위 및 스캐폴드 단백질을 포함하는 FcRn 결합 폴리펩티드는 또한 추가적인 폴리펩티드 도메인 또는 서열을 함유할 수 있다. 이러한 추가적인 폴리펩티드 도메인은 다양한 기능을 발휘할 수 있으며, 예를 들어, 이러한 도메인은 (i) FcRn 결합 폴리펩티드의 표면 농도를 증가시키는 데 기여하고/하거나, (ii) 스캐폴드 단백질의 클러스터링을 야기하여, 그에 의해 FcRn 결합 폴리펩티드의 결합력을 증가시키고/시키거나, (iii) 스캐폴드 단백질 및 FcRn 결합 부위 사이의 상호작용을 최적화하기 위한 링커로서 기능하고/하거나, (iv) 나노소포 막의 고정뿐만 아니라 다양한 다른 기능을 개선시킨다.
5.2.4 기능적 모이어티
추가 양태에서, 본원에 제공된 FcRn 결합 폴리펩티드는 FcRn에 조건부로 결합할 수 있는 것 외에도 하나 이상의 기능적 모이어티 (예컨대, 융합 모이어티, 바람직하게는 특이적 기관, 조직 또는 세포 유형에 대한 폴리펩티드를 포함하는 나노소포 (예컨대, EV 또는 하이브리도좀)를 표적화할 수 있는 표적화 도메인)를 또한 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 기능적 모이어티는 단백질 (예컨대, 펩티드 또는 폴리펩티드)이다. 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 기능적 모이어티는 폴리펩티드의 나머지 부분에 인-프레임으로 융합된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 기능적 모이어티는 링커를 통해 폴리펩티드의 나머지 부분에 공유적으로 융합된다.
이러한 하나 이상의 기능적 모이어티는 폴리펩티드의 나머지 부분에 대해 N- 또는 C-말단일 수 있거나 (예컨대, 이에 N-말단 및/또는 C-말단으로 융합될 수 있거나), 폴리펩티드의 나머지 부분의 상이한 도메인 사이에 배치될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 기능적 모이어티는 나노소포의 외부 공간을 향해 제시된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 기능적 모이어티는 스캐폴드 단백질의 막관통 도메인에 대해 N-말단이다 (예컨대, 이에 N-말단으로 융합된다). 일부 실시양태에서, 하나 이상의 기능적 모이어티는 변형된 Fc 도메인에 대해 N-말단이다 (예컨대, 이에 N-말단으로 융합된다). 일부 실시양태에서, 하나 이상의 기능적 모이어티는 변형된 Fc 도메인에 대해 C-말단이다 (예컨대, 이에 N-말단으로 융합된다). 일부 실시양태에서, 하나 이상의 기능적 모이어티는 스캐폴드 단백질의 막관통 도메인에 대해 C-말단이다 (예컨대, 이에 C-말단으로 융합된다). 일부 실시양태에서, 하나 이상의 기능적 모이어티는 스캐폴드 단백질의 막관통 도메인에 대해 N-말단이다 (예컨대, 이에 N-말단으로 융합된다). 특정 실시양태에서, 하나 이상의 기능적 모이어티는 나노소포의 내강을 향해 제시된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 기능적 모이어티는 스캐폴드 단백질의 막관통 도메인에 대해 C-말단이다 (예컨대, 이에 C-말단으로 융합된다). 일부 실시양태에서, 하나 이상의 기능적 모이어티는 변형된 Fc 도메인에 대해 C-말단이다 (예컨대, 이에 C-말단으로 융합된다).
예시적인 기능적 모이어티는 표적화 도메인 및 정제 도메인, 예컨대, 친화도 태그를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 기능적 모이어티는 큰 폴리펩티드 또는 펩티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 FcRn 결합 부위 및 임의로 표적화 모이어티를 포함하며, 이들 각각은 독립적으로 변형될 수 있다.
일부 실시양태에서 표적화 도메인은 바람직하게는 나노소포의 표면에 위치한다. 표적화 도메인은 나노소포를 특이적 기관, 조직 또는 세포를 향해 지시하는 데 도움을 주며, 바람직하게는 기관, 조직 또는 세포에 대해 특이적이다. 하나 이상의 표적화 도메인은 FcRn 결합 폴리펩티드의 나머지 부분에 융합될 수 있다. 하나 초과의 표적화 도메인의 존재는 표적화된 기관, 조직 또는 세포에 대한 특이성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 도메인은 하나 이상의 항원 결합 분자이거나, 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 도메인은 암 세포, 전이성 세포, 수지상 세포, 줄기 세포 또는 면역학적 세포 상에 발현되는 항원을 특이적으로 표적화한다. 종양 세포 상에 발현된 예시적인 항원은 BAGE, BCMA, CEA, CD19, CD20, CD33, CD123, CEA, FAP, HER2, LMP1, LMP2, MAGE, Mart1/MelanA, NY-ESO, PSA, PSMA, RAGE 및 서바이빈을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 표적화 도메인은 나노소포의 내강에 위치한다. 표적화 도메인은 함입 및 소포 형성 전에 세포질 구성요소 (예컨대, 단백질, 단백질-복합체, 바이러스)를 스캐폴드에 부착시키는 데 도움이 된다. 하나 초과의 표적화 도메인의 존재는 생물발생 동안 나노소포의 내강으로의 세포질 구성요소의 로딩 효율을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 도메인은 하나 이상의 항원 결합 분자이거나, 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 도메인은 아데노-연관된 바이러스 상에 발현된 항원을 특이적으로 표적화한다.
특정 실시양태에서, 표적화 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: scFv, (scFv)2, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dAb, Fd 단편, 디아바디, F(ab')3, 디설파이드 연결된 Fv, sdAb (VHH 또는 나노바디), CDR, di-scFv, bi-scFv, tascFv (탠덤 scFv), 트리아바디, 테트라바디, V-NAR 도메인, Fcab, IgGACH2, DVD-Ig, 프로바디, DARPin, 센티린, 아피바디, 아필린, 아피틴, 안티칼린, 아비머, 파이노머, Kunitz 도메인 펩티드, 모노바디 (또는 아드넥틴), 트리바디 및 나노피틴. 특정 실시양태에서, 표적화 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: scFv, (scFv)2, Fab, Fab', F(ab')2, F(abl)2, Fv, dAb, Fd 단편, 디아바디, F(ab)2, F(ab'), F(ab')3, Fd, Fv, 디설파이드 연결된 Fv, dAb, sdAb, 나노바디, CDR, di-scFv, bi-scFv, tascFv (탠덤 scFv), 아비바디 (예컨대, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디), T-세포 관여자 (BiTE), V-NAR 도베인, Fcab, IgGACH2, DVD-Ig, 프로바디, 인트라바디, DARPin, 센티린, 아피바디, 아필린, 아피틴, 안티칼린, 아비머, 파이노머, Kunitz 도메인 펩티드, 모노바디, 아드넥틴, 트리바디 및 나노피틴.
특정 실시양태에서, 표적화 도메인은 마커에 특이적으로 결합한다. 구체적인 실시양태에서, 마커는 종양-관련 항원이다. 구체적인 실시양태에서, 종양-관련 항원은 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2), CD20, CD33, B-세포 성숙 항원 (BCMA), 전립선-특이적 막 (PSMA), DLL3, 강글리오시드 GD2 (GD2), CD 123, 아녹타민-1 (Anol), 메조텔린, 탄산 탈수효소 IX (CAIX), 종양-관련 칼슘 신호 변환기 2 (TROP2), 암배아 항원 (CEA), 클라우딘-18.2, 수용체 티로신 키나제-유사 희귀 수용체 1 (ROR1), 영양막 당단백질 (5T4), 당단백질 비전이성 흑색종 단백질 B (GPNMB), 폴레이트 수용체-알파 (FR-알파), 임신-연관된 혈장 단백질 A (PAPP-A), CD37, 상피 세포 부착 분자 (EpCAM), CD2, CD19, CD30, CD38, CD40, CD52, CD70, CD79b, fms-유사 티로신 키나제 3 (FLT3), 글리피칸 3 (GPC3), B7 상동체 6 (B7H6), C-C 케모카인 수용체 유형 4 (CCR4), C-X-C 모티프 케모카인 수용체 4 (CXCR4), 수용체 티로신 키나제-유사 희귀 수용체 2 (ROR2), CD133, HLA 클래스 I 조직적합성 항원, 알파 쇄 E (HLA-E), 표피 성장 인자 수용체 (EGFR/ERBB-1), 인슐린 유사 성장 인자 1-수용체 (IGF1R), 및 인간 표피 성장 인자 수용체 3으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 FcRn 결합 폴리펩티드의 부분에 표적화 도메인을 융합시키는 단계 및 나노소포에서 발현된 폴리펩티드를 얻는 단계를 포함하는, 특이적 기관, 조직 또는 세포에 나노소포를 표적화하는 방법이 제공된다.
표적화 도메인으로서 작용하는 항원 결합 분자는 단일특이적, 이중특이적 또는 다중특이적일 수 있으며, 즉, 이들은 동일한 표적 또는 상이한 표적의 하나 이상의 에피토프를 표적화할 수 있다. 나노소포 상에 전시되는 특이성이 많을수록 이의 표적화도 더욱 특이적이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 분자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
i) 전장 항체 분자 (예컨대, IgG, IgM, IgA, IgM 또는 IgE);
ii) 항체 단편, 예컨대, CDR, Dab, Fab, Fab', F(ab)'2, Fd 단편, Fv 단편, 디설파이드 연결된 Fv, scFab, 나노바디, 최소 인식 유닛, VHH 또는 V-NAR 도메인;
iii) 비-항체 스캐폴드, 예컨대, 아피바디, 아피틴 분자, 아피틴, 아드넥틴, 안티칼린, 아비머, 센티린, 리포칼린 뮤테인, DARPin, 파이노머, Knottin, Kunitz-유형 도메인, 나노피틴, 테트라넥틴 또는 트랜스-바디;
iv) 하나 이상의 항체 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드, 예컨대, bi-scFv, aBITE, 디아바디, di-scFv, 프로바디, tascFv (탠덤 scFv), 트리아바디, 트리바디, 테트라바디, IgGACH2, DVD-Ig, MATCH, 미니바디, scFv, scFv-Fc, 이중특이적 F(ab')2, F(ab')3, 1가 IgG;
v) 가용성 T-세포 수용체 (sTCR);
vi) 펩티드, 예컨대, 자연 펩티드, 재조합 펩티드, 합성 펩티드; 및
vii) 바이러스 단백질, 예컨대, (예컨대, 코로나바이러스의) 바이러스 스파이크 단백질 또는 인플루엔자의 헤마글루티닌 (HA)의 수용체 결합 도메인, 니파 바이러스 단백질 F, 홍역 바이러스 F 단백질, 투파이아 파라믹소바이러스 F 단백질, 파라믹소바이러스 F 단백질, 헨드라 바이러스 F 단백질, 헤니파바이러스 F 단백질, 모르빌리바이러스 F 단백질, 레스피로바이러스 F 단백질, 센다이 바이러스 F 단백질, 루불라바이러스 F 단백질, 또는 아불라바이러스 F 단백질, 또는 각자, 이들의 단편.
추가 양태에서, 막관통 영역이 특정 유형의 막관통 단백질로부터 유래된다는 것을 아는 것은 본 개시내용의 FcRn-결합 폴리펩티드 내의 표적화 모이어티에 대해 막관통 도메인에 대한 바람직한 배향 및 위치를 제시한다.
따라서, 유형 I-유래된 막관통 도메인을 갖는 본 개시내용의 FcRn 결합 폴리펩티드의 가장 일반적인 입체배치는 다음과 같이 예시된 N-말단에서 C-말단으로의 선형 구조를 포함할 것이며:
(표적화 도메인)-L-(FcRn 결합 부위)-L-(T1 스캐폴드),
여기서 화학식 내 각각의 L은 2 개의 도메인을 연결하는 직접적인 펩티드 결합 또는 하나 이상의 아미노산 잔기의 링커를 나타낸다.
대조적으로, 유형 II 막관통 단백질의 막관통 영역이 막관통 도메인으로서 사용되는 실시양태에서, 본 개시내용의 FcRn 결합 폴리펩티드에 융합된 표적화 모이어티의 입체배치를 초래하는 도메인의 배열은 다음과 같이 예시된 N-말단에서 C-말단으로의 선형 구조는 포함할 것이며:
(T2 스캐폴드)-L-(FcRn 결합 부위)-L-(표적화 모이어티),
여기서 화학식 내 각각의 L은 2 개의 도메인을 연결하는 직접적인 펩티드 결합 또는 하나 이상의 아미노산 잔기의 링커를 나타낸다.
일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 이중특이적 변형된 Fc 도메인 (예컨대, 트랜스페린 수용체 결합을 촉진하기 위해 추가로 변형된 Fc 도메인)인 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 변형된 Fc 도메인은 비-변형된 CH3 도메인과 비교하여 트랜스페린 수용체에 대해 더 높은 결합 친화도를 나타내도록 변형된 단량체성 CH3 도메인을 포함하고, FcRn의 Fc 결합 부위에 결합하는 능력을 유지한다. 일부 실시양태에서, 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 변형된 Fc 도메인은 EU 넘버링에 따른, 380, 384, 386, 387, 388, 389, 390, 413, 415, 416 및 421을 포함하는 아미노산 위치의 세트에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11 개의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 변형된 Fc 도메인은 서열번호 34와 80%, 90% 또는 95% 이상 유사하다.
5.3 핵산, 발현 벡터, 세포, 및 폴리펩티드를 제조하는 방법
또한 본원에 기재된 (예컨대, 섹션 5.2에 기재된) 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 본원에 기재된 핵산을 포함하는 벡터 (예컨대, 발현 벡터), 및 본원에 기재된 핵산 또는 발현 벡터를 포함하는 세포 (예컨대, 숙주 세포)가 본원에 제공된다.
본 개시내용의 FcRn 결합 폴리펩티드는 원핵 및 진핵 발현 시스템을 포함하는 임의의 수의 발현 시스템을 사용하여 생산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현 시스템은 HEK293T 시스템과 같은 포유동물 세포 발현 시스템이다. 이러한 많은 시스템은 상업적 공급업체로부터 널리 이용가능하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 (특히, FcRn 결합 폴리펩티드)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 단일 벡터를 사용하여, 예컨대, 바이-시스트론 발현 유닛에서 또는 상이한 프로모터의 제어 하에서 발현될 수 있다. 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 (특히, FcRn 결합 폴리펩티드)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 별도의 벡터를 사용하여 발현될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 다양한 상이한 형태로 및/또는 상이한 벡터에 존재할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 본질적으로 선형, 원형일 수 있고/있거나, 임의의 이차 및/또는 삼차 및/또는 더 높은 차수의 구조를 가질 수 있다. 게다가, 본 개시내용은 또한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 예컨대, 벡터, 예컨대, 플라스미드, 임의의 원형 또는 선형 DNA 폴리뉴클레오티드, 미니-서클, 바이러스 (예컨대, 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스), mRNA 및/또는 변형된 mRNA에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 중 임의의 것 (특히, FcRn 결합 폴리펩티드)을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산; 이러한 핵산을 포함하는 벡터; 및 핵산을 복제하고/하거나 폴리펩티드 (특히, FcRn 결합 폴리펩티드)를 발현시키는 데 사용되는, 핵산이 도입된 숙주 세포를 제공한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 (예컨대, 단리된 폴리뉴클레오티드)는 본원에 개시된 바와 같은 (예컨대, 위에 기재된 바와 같은) 폴리펩티드 (특히, FcRn 결합 폴리펩티드)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드는 이종 핵산, 예컨대, 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
본 개시내용의 폴리펩티드 (특히, FcRn 결합 폴리펩티드)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편을 함유하는 적합한 벡터는 클로닝 벡터 및 발현 벡터를 포함한다. 선택된 클로닝 벡터는 사용하려는 세포에 따라 달라질 수 있지만, 유용한 클로닝 벡터는 일반적으로 자가-복제 능력을 갖고/갖거나, 특정 제한 엔도뉴클레아제에 대한 단일 표적을 보유할 수 있고/있거나, 벡터를 함유하는 클론을 선택하는 데 사용될 수 있는 마커에 대한 유전자를 보유할 수 있다. 예는 플라스미드 및 박테리아 바이러스, 예컨대, pUC18, pUC19, Bluescript (예컨대, pBS SK+) 및 이의 유도체, mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, 파지 DNA 및 셔틀 벡터, 예컨대, pSA3 및 pAT28을 포함한다. 이들 및 기타 많은 클로닝 벡터는 상업적 공급업체, 예컨대, BioRad, Strategene 및 Invitrogen으로부터 이용가능하다.
발현 벡터는 일반적으로 본 개시내용의 핵산을 함유하는 복제가능한 폴리뉴클레오티드 작제물이다. 발현 벡터는 에피좀으로서 또는 염색체 DNA의 통합 부분으로서 세포에서 복제될 수 있다. 적합한 발현 벡터는 플라스미드, 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스 및 임의의 기타 벡터를 포함한 바이러스 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 전형적으로, 폴리펩티드의 코딩 서열은 적합한 숙주에서 DNA의 발현에 영향을 미칠 수 있는 적합한 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 이러한 제어 서열은 전사에 영향을 미치는 프로모터, 전사를 제어하는 임의적 오퍼레이터 서열, mRNA 상의 적합한 리보솜 결합 부위를 코딩하는 서열, 인핸서 및/또는 전사 및 번역의 종결을 제어하는 서열을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 클로닝하거나 발현시키기에 적합한 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 원핵세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 진핵 세포, 예컨대, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 세포, 예컨대, 인간 배아 신장 (HEK) 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 세포, 예컨대, 인간 배아 신장 (HEK) 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 양수세포로부터 유래된 비-종양 세포주이다
형질주입은 비-바이러스 방법에 의해 세포에 핵산을 도입하는 과정이다. 형질도입은 외래 DNA가 바이러스 벡터를 통해 다른 세포에 도입되는 과정이다. 일반적인 형질주입 방법은 칼슘 포스페이트, 양이온성 중합체 (예컨대, PEI), 자기 비드, 전기천공법 및 상업적 지질-기반 시약, 예컨대, 리포펙타민 및 Fugene을 포함한다. 형질도입은 주로 재조합 바이러스 벡터 입자의 표적 세포로의 도입을 설명하는 데 사용되는 반면, '감염'은 야생형 바이러스를 이용한 인간 또는 동물의 자연 감염을 지칭한다.
핵산 전달의 위에 언급된 표준 방법 외에도, 본원에 제공된 핵산은 세포의 게놈 내의 특이적 부위에 표적화될 수 있다. 이러한 방법은 CRISPR-Cas9, TALEN, 숙주 세포 내 관심 있는 게놈 서열에 대해 설계된 메가뉴클레아제, 및 게놈의 정확한 편집을 위한 기타 기술, Cre-lox 부위-특이적 재조합; 징크-핑거 매개된 통합; 및 상동 재조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 핵산은 본 개시내용의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 트랜스포존을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 핵산은 트랜스포사제 효소를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 함유할 수 있다. 다른 실시양태에서, 제1 플라스미드가 본 개시내용의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 트랜스포존을 함유하고, 제2 플라스미드가 트랜스포사제 효소를 코딩하는 핵산 서열을 함유하는, 2 개의 핵산을 갖는 시스템이 제공된다. 제1 핵산 및 제2 핵산 둘 모두는 숙주 세포 내로 공동-전달될 수 있다. 본원에 기재된 폴리펩티드 (특히, FcRn 결합 폴리펩티드)를 발현하는 세포는 또한 유전자 삽입 (트랜스포존 사용) 및 유전자 편집 (뉴클레아제 사용)의 조합을 사용함으로써 생성될 수 있다. 예시적인 트랜스포존은 piggyBac 및 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty) 트랜스포존 시스템 (SBTS)을 포함하나, 이에 제한되지 않는 반면; 예시적인 뉴클레아제는 제한 없이, CRISPR/Cas 시스템, 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 및 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN)를 포함한다.
유전적으로-변형된 세포는 일시적 또는 안정한 형질전환에 의해 외인성 서열을 함유할 수 있다. 외인성 서열은 플라스미드로서 형질전환될 수 있다. 외인성 서열은 세포의 게놈 서열 내로, 표적화된 부위에서 또는 무작위 부위에 안정적으로 통합될 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 폴리펩티드 (특히, FcRn 결합 폴리펩티드)를 포함하는 나노소포 (예컨대, EV 및 하이브리도좀)의 생산을 위한 안정한 세포주가 생성된다. 바람직하게는, 세포는 본 개시내용의 폴리펩티드 (특히, FcRn 결합 폴리펩티드)를 코딩하는 작제물로 안정하게 형질주입되고, 그에 따라 안정한 세포주가 생성된다. 이는 유리하게도 균일한 품질 및 수율의 나노소포 (예컨대, EV 및 하이브리도좀)의 일관된 생산을 초래한다.
본원에 기재된 폴리펩티드의 단편 (특히, FcRn 결합 부위를 포함하는 단편)을 코딩하는 외인성 서열은 내인성 서열의 상류 (5'-단부) 또는 하류 (3'-단부) 내에 위치한 생산자 세포의 게놈 서열에 삽입될 수 있다. 외인성 서열의 생산자 세포로의 도입을 위해 당업계에 알려진 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 다양한 유전자 편집 방법 (예컨대, 상동 재조합, 트랜스포존-매개된 시스템, loxP-Cre 시스템, CRISPR/Cas9 또는 TALEN을 사용하는 방법)을 사용하여 변형된 세포는 본 개시내용의 범주 내에 있다.
외인성 핵산 서열은 본원에 개시된 폴리펩티드 (특히, FcRn 결합 폴리펩티드) 또는 이의 단편 또는 변이체를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드 (특히, FcRn 결합 폴리펩티드)를 코딩하는 서열의 여분의 카피는, 본원에 기재된 나노소포 (예컨대, 더 높은 밀도의 FcRn 결합 폴리펩티드를 갖거나 나노소포의 표면 상에 다중 상이한 FcRn 결합 폴리펩티드를 발현하는 나노소포)를 생산하기 위해 도입될 수 있다. 폴리펩티드 (특히, FcRn 결합 폴리펩티드), 이의 변이체 또는 단편을 코딩하는 외인성 서열은, 내강-조작된 및/또는 표면-장식된 나노소포 (EV 또는 하이브리도좀) 및 임의로 폴리펩티드 (특히, FcRn 결합 폴리펩티드)의 변형 또는 단편을 함유하는 나노소포를 생산하기 위해 도입될 수 있다.
일부 양태에서, 세포는 본원에 기재된 외인성 융합 모이어티 (예컨대, 표적화 모이어티 또는 정제 도메인)를 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드 (특히, 상이한 스캐폴드 단백질을 포함하는 하나 이상의 FcRn 결합 폴리펩티드)를 코딩하는 하나 이상의 벡터로 변형, 예컨대, 형질주입될 수 있다.
다른 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 (특히, FcRn 결합 폴리펩티드)를 제조하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 폴리펩티드 (특히, FcRn 결합 폴리펩티드)의 발현에 적합한 조건 하에서 본원에 기재된 바와 같은 숙주 세포 (예컨대, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 또는 발현 벡터를 포함하는 세포)를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 (특히, FcRn 결합 폴리펩티드)는 후속적으로 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 회수된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 (특히, FcRn 결합 폴리펩티드)는 예컨대, 친화도 크로마토그래피에 의해 정제된다.
5.4 나노소포 (예컨대, 세포외 소포 및 하이브리도좀), 및 나노소포를 생산하는 방법
또한, 본원에 기재된 (예컨대, 섹션 5.2에 기재된) 폴리펩티드를 포함하는 나노소포 (예컨대, 세포외 소포 및 하이브리도좀)가 본원에 제공된다. 본 개시내용의 다른 양태는 표면-조작된 나노소포의 생성 및 사용에 관한 것이다. 본원에 기재된 폴리펩티드 (특히, FcRn 결합 폴리펩티드)를 포함하는 나노소포는 중요한 진전을 제공하며, 신규 나노소포 조성물 및 이를 제조하는 방법으로 이어진다. 이전에, 외인성 단백질의 과발현은 표면-조작된 나노소포를 생산하기 위해 나노소포에 대한 외인성 단백질의 확률론적 또는 무작위 배치에 좌우되었다. 이로 인해 나노소포 상의 관심 있는 단백질의 낮은-수준의 예측불가능한 밀도를 초래하였다.
따라서, 일 양태에서, 적어도 FcRn 결합 부위를 포함하는 나노소포가 제공되며, 여기서 상기 FcRn 결합 부위는
(i) 산성 pH에서 FcRn에 결합하고
(ii) 동종이합체를 형성하는 능력이 결여되어 있고;
(ii) 막관통 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 나노소포는 천연 (즉, 엔도솜, 엔도리솜 및/또는 리소좀 경로로부터의 분비를 통해 공급원 세포로부터 생산되거나, 공급원 세포의 원형질막으로부터 생산된) 나노소포 또는 합성 나노소포일 수 있다. 예시적인 나노소포는 제한 없이 세포외 소포 ("EV"), 마이크로소포 (MV), 엑소좀, 아폽토시스체, ARMM, 푸소좀, 마이크로입자 및 세포 유래된 소포 구조, 막 입자, 막 소포, 엑소좀-유사 소포, 엑토좀-유사 소포, 엑토좀, 또는 엑소소포 또는 하이브리도좀을 포함한다.
일 양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 하이브리도좀, 즉, FcRn 결합 폴리펩티드 및 WO2015110957호에 기재된 바와 같은 조율가능한 융합생성 모이어티를 포함하는 지질 나노입자를 포함하는 EV로부터 기원하는 구조적 및 생활성 요소를 포함하는 하이브리드 생체적합성 담체 상에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 단리된 하이브리도좀은 치료적 분자를 추가로 포함한다.
본 개시내용은 위에 기재된 바와 같은 하나 이상의 폴리펩티드 (특히, 하나 이상의 FcRn 결합 폴리펩티드)를 포함하는 나노소포 (예컨대, EV 및 하이브리도좀)를 생산 및/또는 정제하는 방법을 추가로 제공한다. 방법은 전형적으로 (i) 위에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 (특히, FcRn 결합 폴리펩티드)를 코딩하는 핵산을 EV-생산 세포 내로 도입하는 단계; 및 (ii) EV-생산 세포가 폴리펩티드 (특히, FcRn 결합 폴리펩티드)를 포함하는 EV를 생산하도록 허용하는 단계, 예컨대, 적합한 조건 하에서 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 막관통 도메인의 존재의 결과로서, 폴리펩티드 (특히, FcRn 결합 폴리펩티드)는 세포의 막, 및 EV의 표면 안에 또는 상에 전시된 FcRn 결합 부위로 효율적으로 수송된다. 후속적으로, 단계 (iii)에서, EV는 배양 배지로부터 정제될 수 있다. 이러한 방법은 임의로 (iv) 정제된 EV를 화학적으로 변형시켜, 예를 들어, 합성 나노소포, 예컨대, 하이브리도좀을 생산하는 단계를 포함할 수 있다.
일 양태에서, 하나 이상의 FcRn 결합 부위로 표면 장식될 나노소포를 생산하는 방법이 제공되며, 이는 다음 단계를 포함한다:
(i) 하나 이상의 FcRn 결합 부위를 포함하는, 위에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 (특히, FcRn 결합 폴리펩티드)를 코딩하는 핵산 또는 발현 벡터를 제공하는 단계
(ii) 상기 핵산 또는 발현 벡터를 EV-생산 세포 (예컨대, 중간엽 줄기 세포)에 도입하는 단계;
(iii) EV (예컨대, 엑소좀)가 생산되도록 적합한 조건 하에서 상기 세포를 배양하는 단계; 및
(iv) 세포 배양물로부터 폴리펩티드 (특히, FcRn 결합 폴리펩티드)를 포함하는, 그렇게 생산된 EV (예컨대, 엑소좀)를 정제하는 단계.
방법은 (v) 예를 들어, 합성 나노소포, 예컨대, 하이브리소좀을 생산하기 위해 EV를 화학적으로 변형시키는 단계를 임의로 포함할 수 있다. 하이브리도좀은 예컨대, 시험관내에서 생산된, 막, 융합생성, 이온화가능한, 양이온성 지질 (예컨대, 제2 소포의 총 지질의 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 바람직하게는 30% 이상의 몰 농도) 및 임의로 치료제를 포함하는 제2 소포와 EV를 접촉시켜, 그에 의해 상기 EV를 상기 제2 소포와 결속시키고, 하이브리도좀을 생산함으로써 생성된다.
일 양태에서, EV를 생산하는 방법은 다음을 포함한다: a. 본원에 기재된 핵산 또는 본원에 기재된 발현 벡터로 세포를 형질주입시키는 단계; b. EV의 생산에 적합한 조건 하에서 세포를 배양하는 단계; 및 c. 세포에 의해 분비된 EV를 수집하는 단계.
일 양태에서, 하이브리도좀을 생성하는 방법은 제1 EV를 제2 EV와 접촉시켜, 그에 의해 제1 EV를 제2 EV와 결속시키고, 하이브리도좀을 생산하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 제1 EV는 시험관내에서 생산되고, 제1 EV는 (i) 막, 및 (ii) 융합생성, 이온화가능한, 양이온성 지질 (예컨대, 제1 EV의 총 지질의 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 바람직하게는 30% 이상의 몰 농도)을 포함하며, 여기서 상기 제2 EV는 본원에 기재된 EV를 생산하는 방법에 의해 생산되었다.
본 개시내용의 폴리펩티드 (특히, FcRn 결합 폴리펩티드)를 포함하는 나노소포 (예컨대, EV 및 하이브리도좀)는 예를 들어, 부유식 배양물, 부착 배양물 또는 임의의 기타 유형의 배양 시스템에서 적합한 조건 하에서 나노소포 (예컨대, EV)를 생산할 수 있는 임의의 유형의 포유동물 세포로부터 생산될 수 있다. 본 개시내용에 따른 공급원 세포는 또한 생체내에서 나노소포 (예컨대, EV)를 생산할 수 있는 세포를 포함할 수 있다. 공급원 세포는 부유식 또는 부착 배양물에서 성장할 수 있거나 부유식 성장에 적응될 수 있는 광범위한 세포 및 세포주로부터 선택될 수 있다. 일반적으로, 나노소포 (예컨대, EV 및 하이브리도좀)는 본질적으로 임의의 세포 공급원, 즉 일차 세포 공급원 또는 불멸화된 세포주로부터 유래될 수 있다. 공급원 세포는 치료될 환자에 대해 본질적으로 동종이계, 자가유래 또는 심지어 이종발생일 수 있으며, 즉, 세포는 환자 자신으로부터 유래되거나, 관련이 없거나 매칭되거나 매칭되지 않는 공여자로부터 유래될 수 있다. 특정 맥락에서, 동종이계 세포는 특정 적응증을 앓고 있는 환자의 자가유래 세포로부터 수득가능하지 않을 수 있는 면역-조정 효과를 제공할 수 있으므로, 의학적 관점에서 바람직할 수 있다. 예를 들어, 염증성 또는 퇴행성 질환을 치료하는 맥락에서, 동종이계 MSC 또는 양막 상피 (AE)는 이들의 EV의 고유한 면역-조정으로 인해 나노소포 (예컨대, EV 또는 하이브리도좀)-생산 세포 공급원으로서 매우 유익할 수 있다. 특히 관심 있는 세포주는 제한 없이 음이온성 유체 유래된 세포, 유도 만능 세포, 인간 제대 내피 세포 (HUVEC), 인간 배아 신장 (HEK) 세포, 예컨대, HEK293 세포, HEK293T 세포, 무혈청 HEK293 세포, 부유 HEK293 세포, 내피 세포주, 예컨대, 미세혈관 또는 림프 내피 세포, 적혈구, 적혈구 전구세포, 연골세포, 상이한 기원의 MSC, 양막 세포, AE 세포, 양수천자를 통해 또는 태반으로부터 수득된 임의의 세포, 기도 또는 폐포 상피 세포, 섬유아세포, 내피 세포 및 상피 세포 등을 포함한다.
위에 기재된 바와 같이, 공급원 세포는 (예컨대, 하나 이상의 융합 단백질을 코딩하는) 하나 이상의 외인성 서열을 포함하도록 유전적으로 변형되어, 본원에 기재된 나노소포를 생산할 수 있다. 바람직하게는, 본원에 기재된 폴리펩티드 (특히, FcRn 결합 폴리펩티드)를 코딩하는 외인성 서열은 생산자 세포의 게놈 서열 내로, 표적화된 부위에서 또는 무작위 부위에 안정적으로 통합된다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 폴리펩티드 (특히, FcRn 결합 폴리펩티드)를 포함하는 나노소포 (예컨대, EV)의 생산을 위한 안정한 세포주가 생성된다. 이는 유리하게는 균일한 품질 및 수율의 나노소포 (예컨대, EV)의 일관된 생산을 초래한다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 폴리펩티드 (특히, FcRn 결합 폴리펩티드)를 포함하는 나노소포는 위에 기재된 바와 같은 하나 이상의 이종 단백질 (예컨대, 표적화 도메인)을 추가적으로 포함할 수 있는 본원에 개시된 바와 같은 FcRn 결합 부위 (특히, FcRn 결합 폴리펩티드)에 융합된 전장의 스캐폴드 단백질을 코딩하는 서열로 형질전환된 세포로부터 생산될 수 있다. 본원에 기재된 폴리펩티드 (특히, FcRn 결합 폴리펩티드) 중 임의의 것은 플라스미드, 게놈에 삽입된 외인성 서열, 또는 다른 외인성 핵산, 예컨대, 합성 메신저 RNA (mRNA)로부터 발현될 수 있다.
일 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 세포로부터 생산되는 2 개 이상의 상호작용 FcRn 결합 폴리펩티드 (예컨대, 스캐폴드 단백질)를 포함하는 EV를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 EV 상의 폴리펩티드 (예컨대, 스캐폴드 단백질)의 표면 밀도 또는 농도는 이합체화 또는 올리고머화 (CH3-CH3 이합체화 제외)에 의해 증가된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 공급원 세포는 추가적인 외인성 서열을 포함하도록 추가로 변형된다. 예를 들어, 내인성 유전자 발현을 조정하거나 페이로드로서 특정 폴리펩티드를 포함하는 나노소포를 생산하기 위해 추가적인 외인성 서열이 도입될 수 있다. 일부 양태에서, 공급원 세포는 2 개의 외인성 서열을 포함하도록 변형되는데, 하나는 본원에 기재된 폴리펩티드 (특히, FcRn 결합 폴리펩티드) 또는 이의 변이체 또는 단편을 코딩하고, 다른 하나는 페이로드를 코딩한다. 일부 양태에서, 공급원 세포는 2 개의 외인성 서열을 포함하도록 변형되는데, 하나는 본원에 기재된 폴리펩티드 (특히, FcRn 결합 폴리펩티드) 또는 이의 변이체 또는 단편을 코딩하고, 다른 하나는 임의적 표적화 모이어티를 포함하는 본원에 기재된 폴리펩티드 (특히, FcRn 결합 폴리펩티드)를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 공급원 세포는 나노소포에 추가적인 기능성을 부여하는 추가적인 외인성 서열 (예컨대, 페이로드, 표적화 모이어티, 또는 정제 도메인)을 포함하도록 추가로 변형될 수 있다. 일부 양태에서, 공급원 세포는 2 개의 외인성 서열을 포함하도록 변형되는데, 하나는 본원에 개시된 폴리펩티드 (특히, FcRn 결합 폴리펩티드) 또는 이의 변이체 또는 단편을 코딩하고, 다른 하나는 나노소포에 추가적인 기능성을 부여하는 단백질을 코딩한다. 일부 양태에서, 공급원 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개 이상의 추가적인 외인성 서열을 포함하도록 추가로 변형된다.
따라서, 본 개시내용은 추가로 하나 이상의 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 EV의 생성 및 용도에 관한 것이며, 여기서 상기 FcRn 결합 폴리펩티드는 막관통 도메인, 및 (i) FcRn의 Fc 결합 부위에 특이적으로 결합할 수 있고; (i) 동종이합체를 형성하는 능력이 결여되어 있는 면역글로불린의 변형된 Fc 도메인을 포함한다. 일 양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드가 나노소포 (예컨대, EV) 상에서 발현되는 경우, 변형된 Fc 도메인이 공유적으로 연결되는 (예컨대, 융합되는) 막관통 도메인 또는 이의 단편은 변형된 Fc 도메인의 EV 막에 대한 고정을 제공하고, 그 결과 FcRn 결합 폴리펩티드의 변형된 Fc 도메인이 세포외 환경으로 돌출되고, 이는 후속적으로 FcRn의 Fc 결합 부위에 대한 특이적 및 조건부 결합을 가능하게 한다.
일 양태에서, 본 개시내용의 하나 이상의 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포 (예컨대, EV)는 산성 pH에서 FcRn의 Fc 결합 부위에 대한 증가된 결합 친화도 및 약 중성 pH에서 FcRn의 Fc 결합 부위에 대한 감소된 결합 친화도를 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 본 개시내용의 하나 이상의 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 EV는 중성 pH가 아닌 산성 pH에서 FcRn과 복합체를 형성하는 증가된 경향을 갖는다.
일부 실시양태에서, 산성에서 FcRn에 결합된 본 개시내용의 하나 이상의 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포 (예컨대, EV)의 평형 해리 상수는 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 또는 10-9 M 이상이다. 일부 실시양태에서, 산성 pH (예컨대, 6.5 미만의 pH)에서 FcRn에 결합된 본 개시내용의 하나 이상의 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 EV의 평형 해리 상수는 6.5의 pH에서 FcRn에 결합된 변형된 Fc 도메인의 평형 해리 상수와 동일하다. 일부 실시양태에서, 6.5의 pH에서 FcRn에 결합된 본 개시내용의 하나 이상의 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 EV의 평형 해리 상수는 FcRn에 결합된 변형된 Fc 도메인 단편의 평형 해리 상수와 비교하여 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 60% 이상 증가된다.
일부 실시양태에서, 중성 pH에서 FcRn에 결합된 본 개시내용의 하나 이상의 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 EV의 평형 해리 상수는 10-5, 10-4, 10-3, 10-2 또는 10-1 M 초과이다. 일부 실시양태에서, 중성 pH에서 FcRn에 결합된 본 개시내용의 하나 이상의 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 EV의 평형 해리 상수는 중성 pH에서 FcRn에 결합된 변형된 Fc 도메인의 평형 해리 상수와 동일하다. 일부 실시양태에서, 6.5의 pH에서 FcRn에 결합된 본 개시내용의 하나 이상의 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 EV의 평형 해리 상수는 FcRn에 결합된 변형된 Fc 도메인 단편의 평형 해리 상수와 비교하여 20%, 30%, 40%, 50% 또는 60% 이상 증가된다.
본원에 기재된 바와 같은 모든 양태의 일 실시양태에서, 산성 pH에서 본 개시내용의 하나 이상의 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 EV는 인간 FcRn, 시노몰구스 FcRn, 마우스 FcRn, 랫트 FcRn, 양 FcRn, 개 FcRn 및 토끼 FcRn으로부터 선택된 FcRn에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 인간 FcRn보다 마우스 FcRn에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는다.
본원에 개시된 개시내용의 하나 이상의 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 EV에 대해, 결합 친화도 및 결합 동역학을 분석하는 방법이 당업계에 알려져 있다. 이러한 방법은 고체-상 결합 검정 (예컨대, ELISA 검정), 면역침강법, 표면 플라스몬 공명 (예컨대, Biacore™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ)), 역학적 배제 검정 (예컨대, KinExA®), 유세포 분석법, 형광-활성화된 세포 분류 (FACS), 생물층 간섭계 (예컨대, Octet® (ForteBio, Inc., Menlo Park, CA)) 및 웨스턴 블롯 분석을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 결합 친화도를 결정하기 위해 ELISA가 사용된다. 일부 실시양태에서, 결합 친화도 및 또는 결합 동역학을 결정하기 위해 표면 플라스몬 공명 (SPR)이 사용된다. 일부 실시양태에서, 결합 친화도 및/또는 결합 동역학을 결정하기 위해 동역학 배제 검정이 사용된다. 일부 실시양태에서, 결합 친화도 및/또는 결합 동역학을 결정하기 위해 생물층 간섭계 검정이 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 하나 이상의 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 EV는 이펙터 기능을 감소시키거나 제거하는 FcRn 결합 폴리펩티드의 변형을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 하나 이상의 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 EV는 이펙터 기능을 감소시키는 변형, 즉, 이펙터 기능을 매개하는 이펙터 세포 상에 또는 그 안에서 발현되는 Fc 수용체 (FcRn 이외)에 결합 시 특정 생물학적 기능을 유도하는 능력이 감소된 변형을 포함한다. Fc-수용체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성 (CDC), Fc 수용체 결합, 항체-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC), 항체-의존적 세포-매개된 식세포작용 (ADCP), 세포 표면 수용체 (예컨대, B 세포 수용체)의 하향-조절 및 B-세포 활성화를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 FcRn 결합 폴리펩티드에 존재하는 변형된 Fc 도메인은 이펙터 기능을 조정하는 추가적인 변형을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 EV는 단백질 세포에 세포독성을 유발하고 단백질 불안정성을 야기할 수 있는 생산자 세포에서의 단백질 미스폴딩, 및/또는 EV의 응집을 피하기 위해 동종이합체를 형성하는 능력이 결여된 변형된 Fc 도메인을 갖는다.
다른 양태에서, 본 개시내용의 하나 이상의 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 EV는 FcRn에 결합하는 것 외에도 특이적 세포 상의 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 EV는 추가적인 표적화 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, EV는 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 단편 (예컨대, Fab, Fv 또는 scFv)과 같은 표적화 도메인에 융합될 수 있는 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 EV는 FcRn 결합 부위 및 임의로 표적화 모이어티를 함유하며, 이들 각각은 독립적으로 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형은 하나 이상의 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 EV가 산성 pH에서 FcRn에 특이적으로 결합하도록 허용한다. 표적화 모이어티는 하나 이상의 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 EV를 특이적 기관, 조직 또는 세포 상의 항원에 표적화하기 위해 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 하나 이상의 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 EV는 당업계에 알려진 EV와 비교하여 우수한 특질을 입증한다. 예를 들어, 상이한 막관통 도메인 또는 이의 단편을 포함하는 FcRn 결합 폴리펩티드는 자연 발생 EV 또는 종래의 EV 단백질을 사용하여 생산된 EV보다 EV 표면에서 더 풍부하다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 EV는 더 많은 수 (예컨대, 2, 3, 4 또는 5 개 이상)의 FcRn 결합 부위를 발현할 수 있으며, 그에 따라 다중 EV가 필요하지 않다. 더욱이, 본 개시내용의 조작된 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 EV의 표면은 자연 발생 EV 또는 종래의 막관통 도메인 (예컨대, Lamp2b, PTGFRN, CD63 또는 CD81)을 사용하여 생산된 EV와 비교하여 더 크거나, 더 특이적이거나, 더 제어된 생물학적 활성 (예컨대, 특이적 세포에 대한 표적화 또는 반감기)을 가질 수 있다.
추가적인 양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 FcRn 결합 폴리펩티드 및 WO2015110957호에 기재된 바와 같은 조율가능한 융합생성 모이어티를 포함하는 지질 나노입자를 포함하는 EV로부터 기원하는 구조적 및 생활성 요소를 포함하는 하이브리드 생체적합성 담체인 하이브리도좀 상에 존재할 수 있다. FcRn 결합 폴리펩티드의 존재의 결과로서, 생성된 하이브리도좀은 본원에 기재된 친화도 크로마토그래피 방법에 의해 융합되지 않은 지질 나노입자로부터 단리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 단리된 하이브리도좀은 치료제를 추가로 포함한다.
5.4.1 치료적 분자
일부 양태에서, 본원에 개시된 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포 (예컨대, EV 또는 하이브리도좀)는 하나 이상 (예컨대, 2, 3, 4 또는 5 개 이상)의 치료적 분자를 표적 세포에 전달하도록 조작되거나 변형되었다.
치료적 분자는 임의의 무기 또는 유기 화합물일 수 있다. 치료적 분자는 포유류 또는 인간과 같은 동물의 질환, 장애 또는 세포 성장의 발달 또는 진행을 감소, 억압, 약독화, 저하, 저지 또는 안정화시킬 수 있다. FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포 (예컨대, EV 또는 하이브리도좀) 내로 도입될 수 있는 치료적 분자의 예는 치료제, 예컨대, 핵산 (예컨대, 폴리펩티드, 예컨대, 효소를 코딩하는 DNA 또는 mRNA 분자, 폴리펩티드, 예컨대, 항원을 코딩하는 mRNA 분자, 또는 조절 기능을 갖는 RNA 분자, 예컨대, miRNA, dsDNA 및 lncRNA), 아미노산 (예컨대, 검출가능한 모이어티 또는 독소를 포함하거나 번역을 방해하는 아미노산), 폴리펩티드 (예컨대, 효소, 유전자 편집용 효소, 핵산 결합 단백질, 항체, 인트라바디, 단일 쇄 가변 단편 (scFv), 아피바디, 이중-특이적 및 다중특이적 항체 또는 바인더, 아피바디, darpin, 수용체, 리간드 또는 이들의 단편), 지질, 탄수화물 및 소분자 (예컨대, 소분자 약물 및 독소)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 치료적 분자는 질환의 진단, 치료 또는 예방에 사용되거나 의약의 구성성분으로서 사용되는 물질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 페이로드는 포유류 또는 인간과 같은 살아있는 유기체의 신체 내 표적화된 부위에 대한 진단적 정보의 수득을 용이하게 하는 화합물을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 영상화제는 진단에 필요한 영상 정보를 제공하는 물질이므로, 본 개시내용에서 활성제로서 분류될 수 있다.
본 개시내용에 사용되도록 의도된 치료적 핵산의 추가의 비-제한적인 예는 siRNA, 소형 또는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 가이드 RNA (gRNA), 단일 가이드 RNA (sgRNA), 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부 RNA (crRNA), 트랜스-활성화 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부 RNA (tracrRNA) 면역-자극 올리고뉴클레오티드, 플라스미드, 안티센스 핵산 및 리보자임이다. 특정 실시양태에서, 치료적 핵산은 선형 DNA, 원형 DNA 또는 인공 염색체를 포함한 DNA일 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료적 DNA는 에피좀으로(episomally) 유지된다. 일부 실시양태에서, 치료적 DNA는 게놈에 통합된다. 치료적 RNA는 화학적으로 변형된 RNA일 수 있으며, 예컨대, 하나 이상의 백본 변형, 당 변형, 비정규 염기 또는 캡을 포함할 수 있다. 백본 변형은 예컨대, 포스포로티오에이트, N3' 포스포르아미다이트, 보라노포스페이트, 포스포노아세테이트, 티오-PACE, 모르폴리노 포스포르아미다이트 또는 PNA를 포함한다. 당 변형은 예컨대, 2'-O-Me, LNA, UNA 및 2'-O-MOE를 포함한다. 비정규 염기는 예컨대, 5-브로모-U 및 5-아이오도-U, 2,6-디아미노퓨린, C-5 프로피닐 피리미딘, 디플루오로톨루엔, 디플루오로벤젠, 디클로로벤젠, 2-티오우리딘, 슈도우리딘 및 디하이드로우리딘을 포함한다. 캡은 예컨대, ARCA를 포함한다. 추가적인 변형은 예컨대, Deleavey et al., "Designing Chemically Modified Oligonucleotides for Targeted Gene Silencing" Chemistry & Biology Volume 19, Issue 8, 24 August 2012, Pages 937-954에 논의되어 있다.
다른 적합한 치료적 분자의 비-제한적인 예는 항신생물제, 항-염증제, 호르몬 또는 호르몬 길항제, 이온 채널 개질제 및 신경활성제를 포함한 약리학적 활성 약물 및 유전적 활성 분자를 포함한다. 치료제의 적합한 페이로드의 예는, 모두가 참조로 본원에 원용되는 "The Pharmacological Basis of Therapeutics," Goodman and Gilman, McGraw-Hill, New York, N.Y., (1996), Ninth edition, under the sections: Drugs Acting at Synaptic and Neuroeffector Junctional Sites; Drugs Acting on the Central Nervous System; Autacoids: Drug Therapy of Inflammation; Water, Salts and Ions; Drugs Affecting Renal Function and Electrolyte Metabolism; Cardiovascular Drugs; Drugs Affecting Gastrointestinal Function; Drugs Affecting Uterine Motility; Chemotherapy of Parasitic Infections; Chemotherapy of Microbial Diseases; Chemotherapy of Neoplastic Diseases; Drugs Used for Immunosuppression; Drugs Acting on Blood-Forming organs; Hormones and Hormone Antagonists; Vitamins, Dermatology; 및 Toxicology에 기재된 것들을 포함한다. 적합한 페이로드는 독소, 생물학적 및 화학전 약제(chemical warfare agent)를 추가로 포함하며, 예를 들어, Somani, S. M. (ed.), Chemical Warfare Agents, Academic Press, New York (1992))를 참고한다.
일 양태에서, 스캐폴드 단백질 및 변형된 Fc 도메인을 포함하는 나노소포는 증가된 혈청 반감기, 더 짧은 혈액 청소율 및 개선된 친화도 정제를 포함하여 나노소포에 여러 바람직한 특성을 부여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 나노소포는 순환에서의 반감기를 증가시키거나 감소시키기 위해 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 순환에서의 본원에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 나노소포 내 치료적 카고의 반감기는 나노소포의 반감기를 변경함으로써 변형될 수 있다. 일부 경우에, 반감기는 증가되고, 증가는 예를 들어, 혈청-함유 용액에서 측정될 반감기 및 나노소포에 함유되지 않은 치료제와 비교할 때, 본원에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 나노소포에 유지되는 치료제 페이로드에 대해 약 1.5-배 내지 20-배일 수 있다.
특정 실시양태에서, 순환계 내 나노소포 및/또는 치료적 분자 페이로드의 존재 또는 부재는 나노소포 상의 특정 폴리펩티드 또는 이의 단편, 예를 들어, 변형된 Fc 도메인 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편의 존재 또는 부재에 의해 결정된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 나노소포는 연장된 기간 동안 대상체의 순환계 또는 조직에 존재할 수 있어, 상기 폴리펩티드가 없는 나노소포에 의해 달성될 수 있는 것보다 더 효율적인 치료적 효과의 전달을 가능하게 한다. 반감기 연장은 변형된 Fc 도메인을 포함하는 스캐폴드 단백질을 포함하지 않는 현재의 EV-기반 요법과 비교할 때 특히 유리하다.
변형된 Fc 도메인을 포함하는 스캐폴드 단백질의 유효량은 나노소포당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 60, 80 또는 100 개 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 대안적으로, 유효량은 나노소포가 폴리펩티드 없이 나타낼 반감기에 비해 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 400%, 800%, 1,000% 또는 10,000% 만큼 나노소포 반감기를 연장할 수 있는 양이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 나노소포 (예컨대, EV 또는 하이브리도좀)는 다음의 방법으로 입증될 수 있는 특성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 상기 나노소포의 함량이 연구 및 특성화를 위해 추출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 나노소포는 단리되고, 비제한적으로 크기, 모양, 형태, 또는 분자 조성, 예컨대, 핵산, 단백질, 대사산물 및 지질뿐만 아니라 반감기 및 약력학을 포함하는 측정법에 의해 특성화된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 정제된 분획에 포함된 나노소포 및/또는 나노소포의 집단의 크기를 측정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 나노소포 크기는 측정가능한 가장 긴 치수로서 측정된다. 일반적으로, 나노소포의 가장 긴 일반적인 치수는 직경으로서 또한 지칭된다.
나노소포 크기는 당업계에 알려진 다양한 방법, 예를 들어, 나노입자 추적 분석, 다중-각도 광산란, 단일 각도 광산란, 크기 배제 크로마토그래피, 분석적 초원심분리, 장 유동 분별, 레이저 회절, 조율가능한 저항성 펄스 감지 또는 동적 광산란을 사용하여 측정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 나노소포 표면 상의 FcRn 결합 폴리펩티드의 밀도를 측정하는 단계를 포함한다. 표면 밀도는 단위 면적당 질량, 면적당 단백질의 수, 나노소포당 분자의 수 또는 분자 신호의 세기, 단백질의 몰량 등으로서 계산되거나 제시될 수 있다. 표면 밀도는 당업계에 알려진 방법에 의해, 예를 들어, 생물-층 간섭계 (BLI), FACS, 웨스턴 블롯팅, 형광 (예컨대, GFP-융합 단백질) 검출, 나노-유세포 분석법, ELISA, 알파LISA 및/또는 단백질 겔 상의 밴드의 측정에 의한 밀도측정을 사용함으로써 실험적으로 측정될 수 있다.
5.5 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포의 정제
의료 목적을 위한 나노소포의 사용은 나노소포에 배양 상층액 내, 비제한적으로 거대분자, 예컨대, 핵산, 오염 단백질, 지질, 탄수화물, 대사산물, 소분자, 금속 또는 이들의 조합을 포함하는 불순물이 없거나 대부분 없을 것을 요구한다. 본 개시내용은 오염성 거대분자로부터 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포를 정제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 정제된 나노소포는 오염성 거대분자가 실질적으로 없다.
일부 경우에, FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포의 단리, 정제 및 제거는 FcRn 및 고체 지지체 (예컨대, 수지)가 컬럼 내에 패킹되어 있는 컬럼을 사용하는 컬럼 크로마토그래피에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포를 함유하는 샘플을 로딩하고, 컬럼을 통해 실행하여, 결합을 허용하고, 임의로, 세척 완충액을 컬럼을 관통하여 실행하고, 용리 완충액을 후속적으로 컬럼에 적용하고, 본 개시내용의 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포를 함유하는 용리액을 수집한다. 이러한 단계는 주변 압력에서 또는 추가적인 압력의 적용으로 수행될 수 있다. 일부 경우에, FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포의 단리, 정제 및 용리는 배치 처리를 사용하여 수행된다. 예를 들어, 용기 내 고체 지지체에 부착된 FcRn에 샘플을 첨가한 후, 혼합하고, 고체 지지체를 분리하고, 후속적으로 액체상을 제거하고, 세척하고, 원심분리하고, 용리 완충액을 첨가하고, 재-원심분리하고, 용리액을 제거하였다. 일부 경우에, 하이브리드 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 용기 내 고체 지지체에 부착된 FcRn에 샘플을 첨가하고, FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포에 결합된 고체 지지체를 후속적으로 컬럼에 패킹하고, 컬럼에서 세척 및 용리를 수행한다.
일반적으로 말하면, 본 개시내용의 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포의 친화도 정제 방법은 순수하고 고도로 풍부한 나노소포 집단을 생성할 것이다. 그러나, 친화도 정제 단계의 상류 및/또는 하류 둘 모두에 추가적인 단리, 정제 및/또는 폴리싱 단계를 포함할 수 있다. 적합한 보완적 정제 단계는 크기 배제 액체 크로마토그래피, 비드-용리 액체 크로마토그래피, 이온 교환 정제 (예컨대, 음이온 교환), 하전된 막 분리, 및 당업계에서 사용되는 다양한 기타 정제 및/또는 폴리싱 전략을 포함한다.
일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드 샘플을 포함하는 나노소포를, FcRn 결합제를 이용하여 단리 또는 정제하고, 후속적으로 상이한 결합제 (예컨대, 단백질 친화도 바인더, 이온 교환 또는 혼합 모드 수지)로 처리한다. 일부 실시양태에서, 하나 초과의 컬럼이 연속적으로 사용되며, 여기서 다중 컬럼 각각은 상이한 표적 단백질에 특이적인 상이한 결합제를 함유한다. 일부 실시양태에서, 단일 컬럼은 각각이 상이한 표적 단백질에 특이적인 다중 결합제를 함유한다.
또한 본원은 상기 폴리펩티드를 포함하지 않는 나노소포 (예컨대, 비-표면 장식된 EV 또는 지질 나노입자)로부터 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포를 분리하는 방법을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포의 하위집단은 산성 pH에서 FcRn과 복합체를 형성함으로써 다른 하위집단과 구별된다.
일 실시양태에서, 리간드로서 FcRn을 포함하는 크로마토그래피 재료는 본원에 기재된 바와 같은 방법 및 용도에서 3 회 이상 사이클의 안정성을 갖는다. 사이클은 각자의 방법의 제1 pH 값으로부터 제2 pH 값까지의 pH 구배이다. 따라서, 일 실시양태에서, 사이클은 약 pH 5.5의 pH 값으로부터 약 pH 8.8의 pH 값까지의 pH 구배이다.
일단 하나 이상의 용리된 분획이 수집되면, 용리된 분획의 조성을 분석할 수 있다. 예를 들어, FcRn 결합 폴리펩티드, 숙주 세포 단백질, 오염 단백질, DNA, 탄수화물 또는 지질을 포함하는 나노소포의 농도는 각각의 용리된 분획에서 측정될 수 있다. 각각의 용리된 분획 내 나노소포의 다른 특성이 또한 측정될 수 있다. 특성은 평균 크기, 평균 전하 밀도 및 생체-분포, 세포 흡수, 반감기, 약력학, 효능, 투약, 면역 반응, 로딩 효율, 안정성 또는 다른 화합물에 대한 반응성과 관련된 기타 생리학적 특성을 포함한다.
일부 양태에서, FcRn에 대한 증가된 친화도를 갖는 (즉, FcRn 컬럼에서의 체류 시간이 증가했지만, 천연 나노소포와 비교하여 본원에 기재된 바와 같이 여전히 pH 7.4 미만의 pH 값에서 용리되는) FcRn 결합 폴리펩티드 변이체를 포함하는 나노소포는 FcRn에 대한 감소된 친화도를 갖는 것들과 비교하여 더 긴 혈청 반감기를 갖는 것으로 예측될 수 있다. FcRn에 대해 증가된 친화도를 갖는 FcRn 결합 폴리펩티드 변이체를 포함하는 나노소포는 투여된 EV의 긴 반감기가 바람직한, 포유류, 특히 인간을 치료하는 방법, 예컨대, 만성 질환 또는 장애의 치료에 적용되고 있다.
본 발명의 일부 실시양태는 나노소포 막 상의 풍부한 FcRn 결합 폴리펩티드 (예컨대, FcRn 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드에 연결된 본 개시내용의 스캐폴드 단백질) 및 고정화된 결합제 (예컨대, FcRn) 사이의 특이적 결합 상호작용을 사용하는 나노소포의 단리, 정제 및 하위-분별 (즉, 친화도 정제)에 관한 것이다. 이들 방법은 일반적으로 (1) 본 개시내용의 나노소포를 포함하는 샘플을 고정화된 약제에 적용하거나 로딩하는 단계, (2) 임의로 나노소포 상에 전시된 FcRn 결합 폴리펩티드 및 결합제 사이의 결합 상호작용을 유지시키는 적절한 완충액을 사용하여 미결합된 샘플 구성요소를 세척하는 단계, 및 (3) 결합 상호작용이 더 이상 발생하지 않도록 완충액 조건을 변경함으로써 고정화된 결합제로부터 나노소포를 용리 (해리 및 회수)하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 하나 이상의 폴리펩티드 (특히, 하나 이상의 FcRn 결합 폴리펩티드)를 포함하는 나노소포를 정제하기 위한 친화도 정제 방법은 당업계에 알려진 나노소포의 다른 친화도 정제와 비교하여 우수한 회수 수율을 갖는다. 예를 들어, 본원에 기재된 하나 이상의 폴리펩티드 (특히, 하나 이상의 FcRn 결합 폴리펩티드)를 포함하는 나노소포는 고정화된 결합 파트너 (예컨대, 단백질 A)로부터 나노소포를 용리 (예컨대, 해리)하기 위해 5 미만의 pH, 때로는 3 미만의 pH를 요구하는 종래의 친화도 정제 방법과 비교하여 온화한 pH (예컨대, pH 7 - pH 9)에서 고정화된 결합 파트너로부터 용리될 수 있다.
게다가, 의료 목적을 위한 나노소포 (예컨대, EV 또는 하이브리도좀)의 사용은 나노소포 (예컨대, EV 또는 하이브리도좀)가 응집된 형태가 아니며 콜로이드 안정성을 나타낼 것을 요구하지만, 매우 산성인 pH는 콜로이드 불안정성을 유발할 수 있다. 본 개시내용의 중요한 양태는 생리학적 pH 값과 같은 보다 생리학적 조건에서 하나 이상의 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포 (예컨대, EV 또는 하이브리도좀)를 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 개시내용의 일부 양태는 제1 결합 파트너 (예컨대, 나노소포 막 상에 존재하는 FcRn 결합 폴리펩티드) 및 제2 결합 파트너 (예컨대, 고정화된 FcRn) 사이의 특이적 결합 상호작용을 사용하여 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포 (예컨대, EV 또는 하이브리도좀)의 단리 및 정제에 관한 것이다. 이들 방법은 일반적으로 (1) 제1 결합 파트너 (예컨대, 나노소포 막 상에 존재하는 FcRn 결합 폴리펩티드)를 포함하는 나노소포를 포함하는 샘플을 제2 결합 파트너 (예컨대, 고정화된 FcRn)를 함유하는 매트릭스에 적용하거나 로딩하는 단계, (2) 임의로 제1 결합 파트너 (예컨대, 나노소포 막에 존재하는 FcRn 결합 폴리펩티드) 및 제2 결합 파트너 (예컨대, 고정화된 FcRn) 사이의 결합 상호작용을 유지시키는 적절한 완충액을 사용하여 미결합된 샘플 구성요소를 세척하는 단계, 및 (3) 결합 파트너 사이의 결합 상호작용이 더 이상 발생하지 않도록 완충액 조건을 변경함으로써 고정화된 결합 FcRn 약제로부터 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포를 용리 (해리 및 회수)하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 결합 파트너는 적절한 매트릭스 또는 크로마토그래피 재료 상에 임의로 고정화되는 FcRn이다. 일부 실시양태에서, 이러한 단리 및 정제 과정에 사용되는 제2 결합 파트너는 유전적 변형 또는 형질주입에 의해 생산자 세포에서 시험관내 생산된 FcRn 단백질, 또는 화학적, 물리적 또는 기타 생물학적 방법에 의해 변형된 단리된 FcRn 단백질이다. 일부 경우에, FcRn 단백질은 비-돌연변이체 FcRn 단백질 또는 돌연변이체 FcRn 단백질, 예컨대, FcRn 단백질의 변이체 또는 단편이다. 일부 경우에, FcRn은 융합 단백질이다. 구체적인 실시양태에서, FcRn은 Feng et al. (2011), Protein Expr. Purif. 79:66-71의 방법에 따라 생성된 바와 같은 가용성 단일-쇄 FcRn이다. 일 실시양태에서, 가용성 FcRn은 베타-2-마이크로글로불린 (B2M)과 비-공유 이종이합체를 형성한다.
구체적인 실시양태에서, 본원은 EV를 정재하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 다음을 포함한다: a. 제1 결합 파트너와 회합되어 있는 EV를 제공하는 단계이되, 여기서 제1 결합 파트너는 pH 의존적 방식으로 FcRn의 Fc 결합 부위에 결합할 수 있는, 단계; b. 제1 결합 파트너와 회합된 EV를 제2 결합 파트너와 제1 pH에서 접촉시키는 단계이되, 여기서 제2 결합 파트너는 FcRn의 Fc 결합 부위를 포함하고 고체 매트릭스와 회합되어 있는, 단계; 및 c. 제2 pH에서 고체 매트릭스로부터 제1 결합 파트너와 회합된 EV를 용리하는 단계. 특정 실시양태에서, 방법은 제1 pH에서의 세척 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 pH는 6.5 미만이다. 특정 실시양태에서, 제2 pH는 7.4 초과이다.
구체적인 실시양태에서, 본원은 EV를 정제하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 다음을 포함한다: a. 제1 결합 파트너와 회합되어 있는 EV를 제공하는 단계이되, 여기서 제1 결합 파트너는 pH 의존적 방식으로 FcRn의 Fc 결합 부위에 결합할 수 있고 본원에 기재된 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진, 단계; b. 제1 결합 파트너와 회합된 EV를 제2 결합 파트너와 제1 pH에서 접촉시키는 단계이되, 여기서 제2 결합 파트너는 FcRn의 Fc 결합 부위를 포함하고 고체 매트릭스와 회합되어 있는, 단계; 및 c. 제2 pH에서 고체 매트릭스로부터 제1 결합 파트너와 회합된 EV를 용리하는 단계. 특정 실시양태에서, 방법은 제1 pH에서의 세척 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 pH는 6.5 미만이다. 특정 실시양태에서, 제2 pH는 7.4 초과이다.
구체적인 실시양태에서, 본원은 하이브리도좀을 정제하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 다음을 포함한다: a. 제1 결합 파트너와 회합되어 있는 하이브리도좀을 제공하는 단계이되, 여기서 제1 결합 파트너는 pH 의존적 방식으로 FcRn의 Fc 결합 부위에 결합할 수 있는, 단계; b. 제1 결합 파트너와 회합된 하이브리도좀을 제2 결합 파트너와 제1 pH에서 접촉시키는 단계이되, 여기서 제2 결합 파트너는 FcRn의 Fc 결합 부위를 포함하고 고체 매트릭스와 회합되어 있는, 단계; 및 c. 제2 pH에서 고체 매트릭스로부터 제1 결합 파트너와 회합된 하이브리도좀을 용리하는 단계. 특정 실시양태에서, 방법은 제1 pH에서의 세척 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 pH는 6.5 미만이다. 특정 실시양태에서, 제2 pH는 7.4 초과이다.
구체적인 실시양태에서, 본원은 하이브리도좀을 정제하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 다음을 포함한다: a. 제1 결합 파트너와 회합되어 있는 하이브리도좀을 제공하는 단계이되, 여기서 제1 결합 파트너는 pH 의존적 방식으로 FcRn의 Fc 결합 부위에 결합할 수 있고 본원에 기재된 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진, 단계; b. 제1 결합 파트너와 회합된 하이브리도좀을 제2 결합 파트너와 제1 pH에서 접촉시키는 단계이되, 여기서 제2 결합 파트너는 FcRn의 Fc 결합 부위를 포함하고 고체 매트릭스와 회합되어 있는, 단계; 및 c. 제2 pH에서 고체 매트릭스로부터 제1 결합 파트너와 회합된 하이브리도좀을 용리하는 단계. 특정 실시양태에서, 방법은 제1 pH에서의 세척 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 pH는 6.5 미만이다. 특정 실시양태에서, 제2 pH는 7.4 초과이다. 본원에 기재된 바와 같은 모든 양태의 일 실시양태에서, FcRn은 인간 FcRn, 시노몰구스 FcRn, 마우스 FcRn, 랫트 FcRn, 양 FcRn, 개 FcRn 및 토끼 FcRn으로부터 선택된다.
본원에 기재된 바와 같은 모든 양태의 일 실시양태에서, 베타-2-마이크로글로불린은 인간 베타-2-마이크로글로불린, 시노몰구스 베타-2-마이크로글로불린, 마우스 베타-2-마이크로글로불린, 랫트 베타-2-마이크로글로불린, 양 베타-2-마이크로글로불린, 개 베타-2-마이크로글로불린 및 토끼 베타-2-마이크로글로불린으로부터 선택된다.
일 실시양태에서, 이종 이합체는 동일한 종으로부터의 베타-2-마이크로글로불린 및 가용성 FcRn으로 구성된다. 일 실시양태에서, 이종 이합체는 상이한 종으로부터의 베타-2-마이크로글로불린 및 가용성 FcRn으로 구성된다.
따라서, 본원에 기재된 바와 같은 리간드로서 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린의 복합체를 포함하는 크로마토그래피 재료는 단량체성 FC를 전시하는 세포외 소포의 단리/분리에 사용될 수 있으며, 따라서 종래의 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 대한 대안을 제공한다. 또한, 본원에 기재된 바와 같은 크로마토그래피 재료를 사용함으로써, 종래의 단백질 A 친화도 크로마토그래피와 비교하여 pH 값과 같은 보다 생리학적 조건에서 분리가 수행될 수 있다.
가용성 및 기능적 FcRn을 제조하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 한 가지 방법은 포유동물 세포에서 가용성 인간 FcRn (sFcRn)을 단일-쇄 가용성 융합 단백질로서 발현시키는 단계를 포함한다 (인간 단일-쇄 FcRn 및 마우스 단일-쇄 FcRn의 아미노산 서열에 대해 각자, 서열번호 70 및 71 참고). 고도의 친수성 베타-2-마이크로글로불린은 15 개의 아미노산 링커를 통해 소수성 중쇄와 접합된다. 단일-쇄 융합 단백질 형식은 중쇄의 발현 수준을 개선시키지만, 정제 과정도 단순화시킨다 (Feng et al. (2011), Protein Expr. Purif. 79:66-71). 양의 선형 pH 구배를 갖는 가용성 Fc-융합 단백질에 대한 친화도 크로마토그래피에서 친화도 크로마토그래피 리간드로서 FcRn 및 베타-2-마이크로글로불린 (b2m)의 고정화된 비-공유 복합체의 사용이 WO2013/120929호에 기재되어 있다. Fc-함유 가용성 융합 단백질의 정제를 위한 재조합 FcRn 및 이의 변이체는 WO 2010/048313호에 기재되어 있다.
일 실시양태에서, 제2 결합제는 포유동물 세포에서 β2-마이크로글로불린 (인간 베타-2-마이크로글로불린에 대해 서열번호 69)과 공동-발현된 C-말단 His-Avi 태그 또는 C-태그를 갖는 FcRn (예컨대, 인간 FcRn에 대해 서열번호 68)의 가용성 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-공유 또는 단일 쇄 FcRn-복합체는 비오티닐화되고, 스트렙타비딘 유도체화된 세파로스 상에 로딩된다. 일부 실시양태에서, c-태그를 포함하는 비-공유 FcRn-복합체는 C-TagX1 비드 상에 로딩된다.
예시적인 친화도 크로마토그래피 컬럼은 매트릭스 및 매트릭스 결합된 크로마토그래피 기능기를 포함하며, 매트릭스 결합된 크로마토그래피 기능기는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린의 복합체를 포함하는 것을 특징으로 한다. 추가의 예시적인 친화도 크로마토그래피 컬럼은 매트릭스 및 매트릭스 결합된 크로마토그래피 기능기를 포함하며, 매트릭스 결합된 크로마토그래피 기능기는 가용성 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 및 베타-2-마이크로글로불린의 단일 쇄 융합 단백질을 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직한 실시양태에서, FcRn은 고체상에 부착되어, 예컨대, 크로마토그래피 및/또는 막-기반 정제를 가능하게 한다. 친화도 크로마토그래피는 일반적으로 고정화된 FcRn 리간드 및 표적 생체분자 상의 구조적 요소 (예컨대, FcRn 결합 폴리펩티드 상의 FcRn 결합 부위) 사이의 고도로 선택적인 상호작용에 기반한다. 일 실시양태에서, 상기 표적 생체분자는 본 개시내용의 FcRn 결합 폴리펩티드이고, 구조적 요소는 FcRn 결합 부위 (예컨대, 변형된 Fc 도메인)이다. 다른 실시양태에서, 상기 표적 생체분자는 본 개시내용의 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포이고, 구조적 요소는 변형된 Fc 도메인이다. 친화도 크로마토그래피의 높은 선택성은 적절한 매트릭스 (예컨대, 크로마토그래피 매트릭스) 상에 고정화된 FcRn 및 본 개시내용의 FcRn 결합 폴리펩티드의 일부를 형성하는 변형된 Fc 도메인 사이의 다중 분자 상호작용 (수소 결합, 소수성 상호작용, 이온 상호작용 및/또는 반데르 발스 상호작용 포함)에 의해 제공될 수 있다. FcRn 결합 폴리펩티드-함유 나노소포의 친화도-기반 정제에 적합한 제2 결합 파트너는 FcRn 수용체의 가용성 이종이합체 및 이의 임의의 조합, 유도체, 도메인 또는 일부이다.
추가 양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 FcRn을 제2 결합 파트너로서 포함하는 크로마토그래피 방법은 FcRn 결합 폴리펩티드를 전시하는 나노소포의 단리/분리를 위해 사용될 수 있고, 따라서 종래의 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 대한 대안을 제공한다. 또한, 본원에 기재된 바와 같은 크로마토그래피 재료를 사용함으로써, 종래의 단백질 A 친화도 크로마토그래피와 비교하여 pH 값과 같은 보다 생리학적 조건에서 분리가 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 사용된 바와 같은 단리 또는 정제는 생산자 세포를 함유하는 샘플로부터 FcRn 결합 폴리펩티드 또는 상기 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포를 제거, 부분적으로 제거 (예컨대, 분획 제거)하는 과정이다. 일부 실시양태에서, 본원에 사용된 바와 같은 단리 또는 정제는 생산자 세포의 제거 후 (예컨대, 원심분리 또는 심층 여과에 의한 세포의 제거 후) 샘플로부터 FcRn 결합 폴리펩티드 또는 상기 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포 (예컨대, EV)를 제거, 부분적으로 제거 (예컨대, 분획 제거)하는 과정이다.
FcRn은, FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포의 집단이 FcRn에 대한 특이적 친화도를 갖고 산성 pH에서 결합되도록 고체 지지체에 (예컨대, 비오틴-스트렙타비딘 결합을 통해) 화학적으로 고정화되거나 커플링될 수 있다. 다양한 형태의 고체 지지체, 예컨대, 다공성 아가로스 비드, 미세역가 플레이트, 자기 비드 또는 막이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 고체 지지체는 크로마토그래피 컬럼을 형성하고, FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포의 친화도 크로마토그래피에 사용될 수 있다.
"고체 지지체"는 비-유체 물질을 의미하며, 중합체, 금속 (상자성, 강자성 입자), 유리 및 세라믹과 같은 재료로 만들어진 입자 (미립자 및 비드 포함); 겔 물질, 예컨대, 실리카, 알루미나 및 중합체 겔; 중합체, 금속, 유리 및/또는 세라믹으로 만들어질 수 있는 모세관; 제올라이트 및 기타 다공성 물질; 전극; 미세역가 플레이트; 고체 스트립; 및 큐벳, 튜브 또는 기타 분광계 샘플 용기를 포함한다. 검정의 고체상 구성요소는 고체 지지체가 분자와 화학적으로 상호작용하도록 의도된, 표면 상의 하나 이상의 모이어티를 함유한다는 점에서 불활성 고체 표면과 구별된다. 고체상은 고정 구성요소, 예컨대, 칩, 튜브, 스트립, 큐벳 또는 미세역가 플레이트일 수 있거나, 비-고정 구성요소, 예컨대, 비드 및 마이크로입자일 수 있다. 마이크로입자는 또한 균일한 검정 형식을 위해 고체 지지체로서 사용될 수 있다. FcRn 복합체 및 다른 물질의 비-공유 또는 공유 부착 둘 모두를 허용하는 다양한 마이크로입자가 사용될 수 있다. 일 실시양태에서, 고체 지지체는 POROS™ 비드로 구성된다.
고체 지지체에 대한 FcRn의 컨쥬게이션은 N-말단 및/또는 ε-아미노기 (리신), 상이한 리신의 ε-아미노기, 단백질의 아미노산 백본의 카복시-, 설프하이드릴-, 하이드록실- 및/또는 페놀성 기능기, 및/또는 단백질의 탄수화물 구조의 당 알콜 기를 통해 화학적 결합에 의해 수행될 수 있다.
5.5.1 결합
본 개시내용의 일부 양태는 제1 결합 파트너 (예컨대, 나노소포 막 상에 존재하는 FcRn 결합 폴리펩티드) 및 제2 결합 파트너 (예컨대, 고정화된 FcRn) 사이의 특이적 결합 상호작용을 사용한 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포의 단리 및 정제에 관한 것이다.
일 실시양태에서, 본 개시내용의 FcRn 결합 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 포함하는 나노소포 (예컨대, EV 또는 하이브리도좀)를 함유하는 샘플은 제1 pH (즉, 산성 pH)로 조정된 다음, FcRn 친화도 컬럼에 적용된다. 일 실시양태에서, 본 개시내용의 FcRn 결합 폴리펩티드를 함유하는 생산 혼합물 또는 조질의 또는 부분 정제된 배양 상층액은 제1 pH (즉, 산성 pH)로 조정된 다음, FcRn 친화도 컬럼에 적용된다. 일 실시양태에서, 제1 pH는 약 pH 6.5 미만이다. 바람직한 실시양태에서, 제1 pH는 약 pH 6.5 미만이고 pH 5 초과이다.
일 실시양태에서 제1 pH 값은 약 pH 5 내지 약 pH 6이다. 일 실시양태에서, 제1 pH 값은 약 pH 5 또는 약 pH 5.5 또는 약 pH 6이다. 일 실시양태에서, 제1 pH 값은 약 pH 3.5, 약 pH 3.6, 약 pH 3.7, 약 pH 3.8, 약 pH 3.9, 약 pH 4.0, 약 pH 4.1, 약 pH 4.2, 약 pH 4.3, 약 pH 4.4, 약 pH 4.5, 약 pH 4.6, 약 pH 4.7, 약 pH 4.8, 약 pH 4.9, 약 pH 5.0, 약 pH 5.1, 약 pH 5.2, 약 pH 5.3, 약 pH 5.4, 약 pH 5.5, 약 pH 5.6, 약 pH 5.7, 약 pH 5.8, 약 pH 5.9, 약 pH 6.0, 약 pH 6.1, 약 pH 6.2, 약 pH 6.3 및 약 pH 6.4로부터 선택된다.
본원에 기재된 방법은 FcRn 결합 폴리펩티드 및 FcRn 정제 리간드 사이의 특이적 상호작용을 필요로 한다. 주로 pH를 변경하지만 임의로 유기 개질제, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 우레아를 이용하여 염 농도 및/또는 극성을 감소시킴으로써 - 특이적 결합에 이상적인 추가 완충 조건을 식별하기 위해 고-처리량 스크리닝을 수행할 수 있다. 본 개시내용의 FcRn 결합 폴리펩티드 및 결합제 (예컨대, FcRn) 사이의 상호작용은 또한 샘플 조건 (예컨대, 크로마토그래피 수지의 부피당 로딩된 샘플 양, FcRn 결합 폴리펩티드의 농도, FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 EV의 농도, 불순물의 농도), 로딩 완충액 (예컨대, pH, 염 농도, 염 아이덴티티, 극성) 및 기타 물리적 조건 (예컨대, 온도)에 따라 변할 수 있다. 또한, 체류 시간은 불순물 및 FcRn 결합 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 포함하는 나노소포 사이의 차등적 흡착 속도에 기반하여 조정될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 다양한 정제 조건을 테스트하여, 단계에 대한 이상적인 조건을 식별할 수 있다.
유사한 접근법을 사용하여, 순도 및 수율을 개선시키고, FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포의 하위-집단을 풍부화, 고갈 또는 단리하는 데 도움을 줄 수 있다. 이러한 특성은 로드 챌린지를 최대화하고 보다 엄격한 용리 조건을 적용하는 것과 함께, 엑소좀의 농도를 더욱 향상시키는 데 사용될 수 있다.
5.5.2 용리
일 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 용도 및 방법에서 FcRn 친화도 컬럼에 결합된 본 개시내용의 FcRn 결합 폴리펩티드 또는 상기 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포 (예컨대, EV 또는 하이브리도좀)의 회수는 주로 완충된 용액의 pH의 결합을 선호하는 제1 pH 값 (즉, 보다 산성인 pH)으로부터 결합 쌍 사이의 결합이 덜 선호되는 제2 pH 값 (즉, 덜 산성, 더 중성 또는 더 알칼리성)까지 변화시킴으로써 이루어진다.
일부 실시양태에서, 용리는 낮은 제1 pH 값 (즉, 보다 산성인 pH 값)에서 시작하여 제2의 더 높은 pH 값 (즉, 덜 산성, 중성 또는 알칼리성 pH 값)에서 끝나는 pH 구배를 나타내는 양의 선형 pH 구배에 의해 수행되는 pH의 변화에 의해 선호되며, 여기서 용리액의 pH는 시간의 함수에 따라 연속적으로 변화된다. 연속 pH 구배의 예는 선형 pH 구배이며, 여기서 pH의 변화는 시간의 선형 함수이다. 일 실시양태에서, 함께 혼합되어 용리액을 형성하는 상이한 pH의 2 개 이상의 완충액를 활용함으로써 연속 pH 구배를 확립할 수 있다. 따라서, 용리액 내 완충액의 비율, 따라서 용리액의 pH는 시간의 함수에 따라 연속적으로 달라질 수 있다. 완충액 혼합 과정의 제어는 전형적으로 원하는 pH 구배를 생산하도록 프로그래밍된 유동 제어기에 의해 제어된다. 일 실시양태에서, 양의 선형 pH 구배는 약 5.5의 제1 pH 값에서 시작하여 약 8.8의 제2 pH 값에서 끝난다.
일부 실시양태에서, pH의 변화는 낮은 (즉, 더 산성인 pH 값)에서 시작하여 더 높은 (즉, 덜 산성, 중성 또는 알칼리성 pH 값)에서 끝나는 양의 단계식 pH 구배에 의해 달성되며, 여기서 pH의 변화는 시간에 대해 불연속적이며, 하나 이상의 단계 또는 pH가 급격한 변화를 겪는 시점을 형성한다. 이는 용리액으로서 제1 완충액을 상이한 pH의 제2 완충액으로 간단히 교체함으로써 달성될 수 있다. 방법의 바람직한 실시양태에서, 사용된 구배는 단계식 pH 구배이다. 일 실시양태에서, 양의 단계식 pH 구배는 약 5.5의 제1 pH 값에서 시작하여 약 8.8의 제2 pH 값에서 끝난다.
일 실시양태에서 제2 pH 값은 약 pH 7.3 내지 약 pH 9.5이다. 일 실시양태에서, 제2 pH 값은 약 pH 8.5 내지 약 pH 9이다. 일 실시양태에서, 제2 pH 값은 약 pH 8.8이다.
일 실시양태에서 제2 pH 값은 약 pH 7.1, 약 pH 7.2, 약 pH 7.3, 약 pH 7.4, 약 pH 7.5, 약 pH 7.6, 약 pH 7.7, 약 pH 7.8., 약 pH 7.9, 약 pH 8.0, 약 pH 8.0, 약 pH 8.1, 약 pH 8.2, 약 pH 8.3, 약 pH 8.4, 약 pH 8.5, 약 pH 8.6, 약 pH 8.7, 약 pH 8.8, 약 pH 8.9, 약 pH 9.0, 약 pH 9.1, 약 pH 9.2, 약 pH 9.3, 약 pH 9.4 및 약 pH 9.5로부터 선택된다.
일 실시양태에서, 제1 pH 값은 약 pH 3.5, 약 pH 3.6, 약 pH 3.7, 약 pH 3.8, 약 pH 3.9, 약 pH 4.0, 약 pH 4.1, 약 pH 4.2, 약 pH 4.3, 약 pH 4.4, 약 pH 4.5, 약 pH 4.6, 약 pH 4.7, 약 pH 4.8, 약 pH 4.9, 약 pH 5.0, 약 pH 5.1, 약 pH 5.2, 약 pH 5.3, 약 pH 5.4, 약 pH 5.5, 약 pH 5.6, 약 pH 5.7, 약 pH 5.8, 약 pH 5.9, 약 pH 6.0, 약 pH 6.1, 약 pH 6.2, 약 pH 6.3, 또는 약 pH 6.4이고, 제2 pH 값은 약 7.1, 약 pH 7.2, 약 pH 7.3, 약 pH 7.4, 약 pH 7.5, 약 pH 7.6, 약 pH 7.7, 약 pH 7.8., 약 pH 7.9, 약 pH 8.0, 약 pH 8.0, 약 pH 8.1, 약 pH 8.2, 약 pH 8.3, 약 pH 8.4, 약 pH 8.5, 약 pH 8.6, 약 pH 8.7, 약 pH 8.8, 약 pH 8.9, 약 pH 9.0, 약 pH 9.1, 약 pH 9.2, 약 pH 9.3, 약 pH 9.4, 또는 약 pH 9.5이다.
일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 FcRn 결합된 나노소포의 용리는 염 농도 및/또는 유기 개질제, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 또는 우레아를 이용한 극성을 변경함으로써 대안적으로 달성될 수 있다.
일부 실시양태에서, pH 범위를 조정하는 것 외에도, 염, 유기 용매, 소분자, 세제, 양쪽성 이온, 아미노산, 중합체, 온도 및 위의 것들의 임의의 조합을 조정함으로써 용리가 또한 달성될 수 있다. 순도를 개선시키고, 수율을 개선시키고, FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포의 하위-집단을 단리하기 위해 유사한 용리제가 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 용리는 또한 pH, 염, 유기 용매, 소분자, 세제, 양쪽성 이온, 아미노산, 중합체, 온도 및 위의 것들의 임의의 조합과 같은 상이한 특성을 갖는 다중 용리 완충액을 이용하여 수행될 수 있다. 복수의 용리된 분획이 수집될 수 있으며, 여기서 각각의 분획 내 수집된 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포는 상이한 특성을 가지고 있다. 예를 들어, 하나의 분획 내 수집된 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포는 다른 분획 내 FcRn 결합 나노소포보다 더 높은 순도, 더 작거나 더 큰 평균 크기, 또는 바람직한 조성 등을 갖는다.
원칙적으로 임의의 완충 물질이 본원에 기재된 바와 같은 방법에 사용될 수 있다. 일 실시양태에서, 예컨대, 인산 또는 이의 염, 아세트산 또는 이의 염, 시트르산 또는 이의 염, 모르폴린, 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산 (MES) 또는 이의 염, 히스티딘 또는 이의 염, 글리신 또는 이의 염, 트리스 (하이드록시메틸) 아미노메탄 (TRIS) 또는 이의 염, (4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산 (HEPES) 또는 이의 염과 같은 약학적으로 허용가능한 완충 물질이 사용된다.
일 구체적인 실시양태는 FcRn 결합 폴리펩티드 및 고정화된 FcRn 결합제 사이의 특이적 결합 상호작용을 사용하여 샘플로부터 비-장식된 나노소포를 제거하는 방법에 관한 것이다. 이러한 경우, 결합제에 결합된 나노소포는 결합제로부터 용리되지 않으며 결합제에 결합하지 않는 분획이 수집될 수 있다.
FcRn 결합 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 포함하는 나노소포의 선택적 용리는 고정된 pH에서, 1가 양이온성 할라이드 염 (예컨대, 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 소듐 브로마이드, 리튬 클로라이드, 소듐 아이오다이드, 포타슘 브롬마이드, 리튬 브로마이드, 소듐 플루오라이드, 포타슘 플루오라이드, 리튬 플루오라이드, 리튬 아이오다이드, 소듐 아세테이트, 포타슘 아세테이트, 리튬 아세테이트 및 포타슘 아이오다이드), 2가 또는 3가 염 (예컨대, 칼슘 클로라이드, 마그네슘 클로라이드, 칼슘 설페이트, 소듐 설페이트, 마그네슘 설페이트, 크롬 트리클로라이드, 크롬 설페이트, 소듐 시트레이트, 철 (III) 클로라이드, 이트륨 (III) 클로라이드, 포타슘 포스페이트, 포타슘 설페이트, 소듐 포스페이트, 제1철 클로라이드, 칼슘 시트레이트, 마그네슘 포스페이트 및 제2철 클로라이드) 또는 이의 조합의 증가하는 구배 (단계식 또는 선형)의 사용을 통해, 용리 완충액 내, 1가 양이온성 할라이드 염 (예컨대, 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 소듐 브로마이드, 리튬 클로라이드, 소듐 아이오다이드, 포타슘 브롬마이드, 리튬 브로마이드, 소듐 플루오라이드, 포타슘 플루오라이드, 리튬 플루오라이드, 리튬 아이오다이드, 소듐 아세테이트, 포타슘 아세테이트, 리튬 아세테이트 및 포타슘 아이오다이드), 2가 또는 3가 염 (예컨대, 칼슘 클로라이드, 마그네슘 클로라이드, 칼슘 설페이트, 소듐 설페이트, 마그네슘 설페이트, 크롬 트리클로라이드, 크롬 설페이트, 소듐 시트레이트, 철 (III) 클로라이드, 이트륨 (III) 클로라이드, 포타슘 포스페이트, 포타슘 설페이트, 소듐 포스페이트, 제1철 클로라이드, 칼슘 시트레이트, 마그네슘 포스페이트 및 제2철 클로라이드) 또는 이의 조합의 농도를 증가시킴으로써 달성될 수 있다.
일 실시양태에서 완충 물질은 인산 또는 이의 염, 또는 아세트산 또는 이의 염, 또는 시트르산 또는 이의 염, 또는 히스티딘 또는 이의 염으로부터 선택된다.
일 실시양태에서 완충 물질은 5 mM 내지 500 mM의 농도를 갖는다. 일 실시양태에서 완충 물질은 10 mM 내지 300 mM의 농도를 갖는다. 일 실시양태에서 완충 물질은 10 mM 내지 250 mM의 농도를 갖는다. 일 실시양태에서 완충 물질은 10 mM 내지 100 mM의 농도를 갖는다. 일 실시양태에서 완충 물질은 15 mM 내지 50 mM의 농도를 갖는다. 일 실시양태에서 완충 물질은 약 20 mM의 농도를 갖는다.
일 실시양태에서 제1 완충된 용액 내 완충 물질 및 제2 완충된 용액 내 완충 물질은 동일한 완충 물질이다. 일 실시양태에서, 제1 용액 내 완충 물질 및 제2 용액 내 완충 물질은 상이한 완충 물질이다. 일 실시양태에서, 제1 용액은 약 pH 3.5 내지 약 pH 7.5의 pH 값을 갖는다. 일 실시양태에서, 제1 용액은 약 pH 5 내지 약 pH 6의 pH 값을 갖는다. 일 실시양태에서, 제1 용액은 약 pH 5.5의 pH 값을 갖는다.
일 실시양태에서 제2 용액은 약 pH 7.0 내지 약 pH 9.5의 pH 값을 갖는다. 일 실시양태에서, 제2 용액은 약 pH 8 내지 약 pH 9의 pH 값을 갖는다. 일 실시양태에서, 제2 용액은 약 pH 8.2 내지 약 pH 8.8의 pH 값을 갖는다.
예시적인 제1 용액은 pH 5.5로 조정된, 20 mM MES 및 150 mM NaCl을 포함한다. 예시적인 제2 용액은 pH 8.8로 조정된, 20 mM TRIS 및 150 mM NaCl을 포함한다. 예시적인 제2 용액은 pH 8.6으로 조정된 20 mM HEPES를 포함한다. 예시적인 제2 용액은 pH 8.2로 조정된 20 mM TRIS를 포함한다.
일 실시양태에서, 완충된 용액은 추가적인 염을 포함한다. 일 실시양태에서 추가적인 염은 소듐 클로라이드, 소듐 설페이트, 포타슘 클로라이드, 포타슘 설페이트, 소듐 시트레이트 또는 포타슘 시트레이트로부터 선택된다. 일 실시양태에서, 완충된 용액은 50 mM 내지 1000 mM의 추가적인 염을 포함한다. 일 실시양태에서, 완충된 용액은 50 mM 내지 750 mM의 추가적인 염을 포함한다. 일 실시양태에서, 완충된 용액은 50 mM 내지 500 mM의 추가적인 염을 포함한다. 일 실시양태에서, 완충된 용액은 50 mM 내지 750 mM의 추가적인 염을 포함한다. 일 실시양태에서, 완충된 용액은 약 50 mM 내지 약 300 mM의 추가적인 염을 포함한다.
일 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 용액은 소듐 클로라이드를 포함한다. 일 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 용액은 약 50 mM 내지 약 300 mM의 소듐 클로라이드를 포함한다.
5.5.3 세척
일부 실시양태에서, 컬럼 로딩 단계 동안 불순물을 관통하여 유동하게 하고, 선택적 부형제 세척 동안 불순물을 용리시키고, 컬럼에 결합된 추가적인 불순물을 남겨두면서 용리 동안 생성물을 선택적으로 용리시킴으로써 실질적인 나노소포 순도가 달성될 수 있다. 컬럼 용리액으로부터 측정된 흡광도는 방법에 의해 수득된 나노소포의 순도를 나타낼 수 있다.
임의로, FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포의 순도는 용리 전에 샘플을 세척함으로써 추가로 개선될 수 있다. 일부 실시양태에서, 부형제는 세척 완충액일 수 있다. 부형제는 특이적 pH 범위, 염, 유기 용매, 소분자, 세제, 양쪽성 이온, 아미노산, 중합체 및 위의 것들의 임의의 조합을 갖는 용액일 수 있다.
보다 구체적으로, 부형제는 아르기닌, 리신, 글리신, 히스티딘, 칼슘, 소듐, 리튬, 포타슘, 아이오다이드, 마그네슘, 철, 아연, 망간, 우레아, 프로필렌 글리콜, 알루미늄, 암모늄, 구아니디늄 폴리에틸렌 글리콜, EDTA, EGTA, 세제, 클로라이드, 설페이트, 카복실산, 시알산, 포스페이트, 아세테이트, 글리신, 보레이트, 포르메이트, 퍼클로레이트, 브롬, 니트레이트, 디티오트레이톨, 베타 머캅토에탄올 또는 트리-n-부틸 포스페이트를 포함할 수 있다.
부형제는 또한 세틸 트리메틸암모늄 클로라이드, 옥톡시놀-9, TRITON™ X-100 (즉, 폴리에틸렌 글리콜 p-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)-페닐 에테르) 및 Sigma-Aldrich로부터 이용가능한 TRITON™ CG-110; 소듐 도데실 설페이트; 소듐 라우릴 설페이트; 데옥시콜산; 폴리소르베이트 80 (즉, 폴리 옥시 에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트); 폴리소르베이트 20 (즉, 폴리 옥시 에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트); 알콜 에톡실레이트; 알킬 폴리에틸렌 글리콜 에테르; 데실 글루코시드; 옥토글루코시드; 세이프케어; DOW Chemical로부터 이용가능한 ECOSURF™ EH9, ECOSURF™ EH6, ECOSURF™ EH3, ECOSURF™ SA7 및 ECOSURF™ SA9; BASF로부터 이용가능한 LUTENSOL™ M5, LUTENSOL™ XL, LUTENSOL™ XP 및 APG™ 325N; AIR PRODUCTS로부터 이용가능한 TOMADOL™ 900; CRODA로부터 이용가능한 NATSURF™ 265; Bestchem으로부터 이용가능한 SAFECARE™1000, DOW로부터 이용가능한 TERGITOL™ L64; 카프릴산; Lubrizol로부터 이용가능한 CHEMBETAINE™ LEC; 및 Mackol DG로 이루어진 군으로부터 선택된 세제를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 정제 결과를 개선하기 위한 추가 방법이 적용될 수 있다. 예를 들어, 크로마토그래피 수지의 부피당 로딩될 수 있는 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포의 양은 공급 재료를 조정함으로써, 예를 들어, FcRn 결합 나노소포의 농도를 증가시킴으로써, 불순물의 농도를 감소시킴으로써, pH를 변경함으로써, 염 농도를 감소시킴으로써, 이온 강도를 감소시킴으로써, 또는 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포의 특이적 하위-집단을 변경시킴으로써 개선될 수 있다. 특정 실시양태에서, 수지 상의 나노소포의 물질 전달 제약 및 느린 흡착 및 탈착으로 인해, 크로마토그래피 수지의 부피당 로딩될 수 있는 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포의 양은, 체류 시간을 증가시키기 위해 더 긴 컬럼을 사용하여 컬럼 로딩 동안 유속을 늦춤으로써 증가될 수 있다.
다른 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드 조성물을 포함하는 단리된 나노소포는 허용가능한 양 및/또는 농도의 또는 그 초과의 원하는 FcRn 결합 나노소포 (예컨대, EV)의 양 및/또는 농도를 갖는다. 다른 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드 조성물을 포함하는 단리된 나노소포는, 조성물이 수득되는 출발 재료 (예컨대, 생산자 세포 컨디셔닝된 배지)와 비교하여 풍부하다. 이 풍부화는 출발 재료와 비교하여, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 99.99%, 또는 99.9999% 초과일 수 있다.
일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드 제제를 포함하는 단리된 나노소포에는 잔류 생물학적 산물이 실질적으로 없다. 일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드 제제를 포함하는 단리된 나노소포에는 임의의 오염된 생물학적 물질이 100% 없거나, 99% 없거나, 98% 없거나, 97% 없거나, 96% 없거나, 95% 없거나, 94% 없거나, 93% 없거나, 92% 없거나, 91% 없거나, 90% 없다. 잔류 생물학적 산물은 무생물적 재료 (화학물질 포함) 또는 원치 않는 핵산, 단백질, 지질 또는 대사산물을 포함할 수 있다. 잔류 생물학적 산물이 실질적으로 없다는 것은 또한 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 나노소포가 검출가능한 생산자 세포를 함유하지 않고 FcRn 결합 나노소포만이 검출가능하다는 것을 의미할 수 있다.
추가 양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 FcRn을 제2 결합 파트너로서 포함하는 크로마토그래피 방법은 융합되지 않은 지질 나노입자로부터 FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 하이브리도좀의 조질의 혼합물을 단리/풍부화하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드 제제를 포함하는 단리된 하이브리도좀에는 융합되지 않은 지질 나노입자가 실질적으로 없다. 일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드 제제를 포함하는 단리된 하이브리도좀은 임의의 융합되지 않은 지질 나노입자가 100% 없거나, 99% 없거나, 98% 없거나, 97% 없거나, 96% 없거나, 95% 없거나, 94% 없거나, 93% 없거나, 92% 없거나, 91% 없거나, 90% 없다.
5.6 조성물 및 키트
다른 양태에서, 본 개시내용의 (예컨대, 섹션 5.2-5.4에 기재된 바와 같은) 폴리펩티드, 나노소포, 핵산, 발현 벡터 및/또는 세포를 포함하는 조성물 및 키트가 제공된다. 이러한 조성물은 예컨대, 미용적, 진단적 또는 약학 조성물일 수 있다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 FcRn 결합 폴리펩티드 (예컨대, 막관통 단백질 및 FcRn에 특이적으로 결합할 수 있고 동종이합체를 형성하지 않는 변형된 Fc 도메인을 포함하는 FcRn 결합 폴리펩티드)를 포함하고, 추가로 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함한다. 제형 제조에 대한 가이던스는 당업자에게 알려진 약학적 제제 및 제형에 대한 임의의 수의 핸드북에서 찾아볼 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 의약으로서 유용하다. 전형적으로, 이러한 의약은 치료적 유효량의 본원에 제공된 조성물을 포함한다. 따라서, 각자의 조성물은 장애의 치료에 유용한 의약의 생산에 사용될 수 있다. 따라서, 일 실시양태에서, 본 개시내용의 폴리펩티드, 나노소포, 핵산, 발현 벡터 및/또는 세포를 포함하는 약학 조성물 및 키트가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 나노소포 (즉, 위에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 포함하는 나노소포)를 포함하는 약학 조성물 및 키트가 제공된다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 본원에 기재된 폴리펩티드, 나노소포, 핵산, 발현 벡터 및/또는 세포를 포함하고, 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및/또는 희석제를 추가로 포함한다. 제형 제조에 대한 가이던스는 당업자에게 알려진 약학 제제 및 제형에 대한 임의의 수의 핸드북에서 찾아볼 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체는 생리학적으로 적합하고 바람직하게는 활성제의 활성을 방해하거나 달리 억제하지 않는 임의의 용매, 분산 매질 또는 코팅을 포함한다. 다양한 약학적으로 허용가능한 부형제는 당업계에 잘 알려져 있다.
일부 실시양태에서, 약학적으로 허용가능한 담체는 정맥내, 근육내, 경구, 복강내, 척수강내, 경피, 국부 또는 피하 투여에 적합하다. 약학적으로 허용가능한 담체는 예를 들어, 조성물을 안정화시키거나 활성제(들)의 흡수를 증가 또는 감소시키도록 작용하는 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 화합물(들)을 함유할 수 있다. 생리학적으로 허용가능한 화합물은 예를 들어, 탄수화물, 예컨대, 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란, 항산화제, 예컨대, 아스코르브산 또는 글루타티온, 킬레이팅제, 저분자량 단백질, 활성제의 청소율 또는 가수분해를 감소시키는 조성물, 또는 부형제 또는 기타 안정화제 및/또는 완충액을 포함할 수 있다. 기타 약학적으로 허용가능한 담체 및 이들의 제형은 당업계에 잘 알려져 있다.
약학 조성물은 당업자에게 알려진 방식으로, 예를 들어, 종래의 혼합, 용해, 과립화, 당의정-제조, 유화, 캡슐화, 포획 또는 동결건조 공정에 의해 제조될 수 있다. 본원에 개시된 방법 및 부형제는 단지 예시일 뿐이며 결코 제한적이지 않다.
경구 투여를 위해, 본원에 개시된 바와 같은 FcRn 결합 폴리펩티드는 이를 당업계에 잘 알려진 약학적으로 허용가능한 담체와 조합함으로써 제형화될 수 있다. 이러한 담체는, 화합물이 치료될 환자의 경구 섭취를 위한, 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 유제, 친유성 및 친수성 현탁액, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁액 등으로서 제형화되는 것을 가능하게 한다. 경구 사용을 위한 약학 제제는 화합물을 고체 부형제와 혼합하고, 임의로 생성된 혼합물을 분쇄하고, 원하는 경우 적합한 보조제를 첨가한 후 과립의 혼합물을 가공하여, 정제 또는 당의정 코어를 수득함으로써 수득될 수 있다. 적합한 부형제는 예를 들어, 충전제, 예컨대, 락토스, 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨을 비롯한 당류; 예를 들어, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸스 검, 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로스, 소듐 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈 (PVP)과 같은 셀룰로스 제제를 포함한다. 원하는 경우, 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 또는 알긴산 또는 이의 염, 예컨대, 소듐 알기네이트와 같은 붕해제가 첨가될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 FcRn 결합 폴리펩티드는 주사, 예컨대, 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 주사를 위해, FcRn 결합 폴리펩티드는 원하는 경우, 종래의 첨가제, 예컨대, 가용화제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제 및 보존제와 함께, 수성 또는 비수성 용매, 예컨대, 식물성 또는 기타 유사한 오일, 합성 지방족 산성 글리세리드, 고급 지방족 산의 에스테르 또는 프로필렌 글리콜에서 이들을 용해, 현탁 또는 유화시킴으로써 제제로 제형화될 수 있다. 일부 실시양태에서, FcRn 결합 폴리펩티드는 수용액, 바람직하게는 생리학적으로 적합한 완충액, 예컨대, 행크스 용액, 링거 용액 또는 생리식염수 완충액에서 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 보존제가 첨가된 유닛 투여량 형태, 예컨대, 앰플 또는 다중-용량 용기로 제시될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 내 현탁액, 용액 또는 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있으며, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 FcRn 결합 폴리펩티드는 서방형, 제어 방출, 연장-방출, 시간-방출 또는 지연-방출 제형, 예를 들어, 활성제를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반-투과성 매트릭스로 전달하기 위해 제조된다. 다양한 유형의 서방형 재료가 확립되어 있으며, 이는 당업자에게 잘 알려져 있다. 현재 서방형 제형은 필름-코팅된 정제, 다중미립자 또는 펠렛 시스템, 친수성 또는 친유성 재료을 사용하는 매트릭스 기술, 및 공극-형성 부형제를 포함하는 왁스-기반 정제를 포함한다. 서방형 전달 시스템은 설계에 따라, 몇 시간 또는 며칠의 과정에 걸쳐, 예를 들어, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20 또는 24 시간 이상에 걸쳐 화합물을 방출할 수 있다. 일반적으로, 서방형 제형은 자연 발생 또는 합성 중합체, 예를 들어, 중합체성 비닐 피롤리돈, 예컨대, 폴리비닐 피롤리돈 (PVP); 카복시비닐 친수성 중합체; 소수성 및/또는 친수성 하이드로콜로이드, 예컨대, 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스 및 하이드록시프로필메틸셀룰로스; 및 카복시폴리메틸렌을 사용하여 제조될 수 있다.
전형적으로, 생체내 투여에 사용하기 위한 약학 조성물은 멸균되어 있다. 멸균은 당업계에 알려진 방법, 예컨대, 열 멸균, 증기 멸균, 멸균 여과 또는 조사에 따라 달성될 수 있다.
본 개시내용의 약학 조성물의 투여량 및 원하는 약물 농도는 구상되는 특정 용도에 따라 달라질 수 있다. 적절한 투여량 또는 투여 경로의 결정은 당업자의 기술 내에 있다. 예시적인 적합한 투여량은 또한 아래 섹션 5.7에 기재되어 있다.
5.7 치료적 및 진단적 용도
본 개시내용의 (예컨대, 섹션 5.4에 기재된 바와 같은) 폴리펩티드를 포함하는 나노소포뿐만 아니라 (예컨대, 섹션 5.3에 기재된 바와 같은) 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 및 발현 벡터, (예컨대, 섹션 5.3에 기재된 바와 같은) 이러한 폴리펩티드를 발현할 수 있는 세포, 및 (예컨대, 섹션 5.6에 기재된 바와 같은) 전술한 것들을 포함하는 조성물 및 키트는 다수의 질환 및 장애 (예컨대, 암, 염증, 또는 암과 연관된 염증)를 치료, 모니터링, 예방 및/또는 진단하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 일 양태에서, 표적 세포 또는 조직에 치료제 또는 진단제를 전달하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 방법은 본원에 기재된 세포외 소포 또는 하이브리도좀을 상기 표적 세포 또는 조직에 제공하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 방법은 약학적 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 조성물 (즉, 폴리펩티드를 포함하거나 발현할 수 있는 조성물)을 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시양태에서, 방법은 약학적 유효량의 위에 기재된 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
치료를 필요로 하는 대상체는 인간 또는 비-인간 동물일 수 있다. 전형적으로, 대상체는 포유류, 예컨대, 유인원, 개, 기니피그, 말, 원숭이, 마우스, 돼지, 토끼 또는 랫트이다. 동물 모델의 경우, 장애가 발달하거나 질환의 특질을 나타내도록 동물을 유전적으로 조작할 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상체는 암, 염증성 장애, 자가면역 질환, 만성 질환, 염증, 손상된 기관 기능, 감염성 질환, 대사 질환, 퇴행성 장애, 유전 질환 (예컨대, 유전적 결핍, 열성 유전 장애, 또는 우성 유전 장애) 또는 부상을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 감염성 질환을 가지고 있고, 나노소포는 감염성 질환에 대한 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 유전적 결핍을 가지고 있고, 나노소포는 대상체에 결핍된 단백질, 또는 단백질을 코딩하는 핵산 (예컨대, mRNA), 또는 단백질을 코딩하는 DNA, 또는 단백질을 코딩하는 염색체, 또는 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 핵을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 우성 유전 장애를 가지고 있고, 나노소포는 우성 돌연변이체 대립유전자의 핵산 억제제 (예컨대, shRNA, siRNA 또는 miRNA)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 우성 유전 장애를 가지고 있고/있거나, 나노소포는 우성 돌연변이체 대립유전자의 핵산 억제제 (예컨대, shRNA, siRNA 또는 miRNA)를 포함하고/하거나, 나노소포는 또한 핵산 억제제에 의해 표적화되지 않는 돌연변이된 유전자의 비-돌연변이된 대립유전자를 코딩하는 mRNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 백신접종이 필요하다. 일부 실시양태에서, 대상체는 예를 들어, 부상의 부위의 재생이 필요하다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 나노소포 또는 조성물은 대상체에 1, 2, 3, 4 또는 5 회 이상 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 나노소포는, 대상체, 예컨대, 마우스 또는 인간에 투여될 때 조직, 예컨대, 간, 폐, 심장, 비장, 췌장, 위장관, 신장, 고환, 난소, 뇌, 생식 기관, 중추신경계, 말초신경계, 골격근, 내피, 내이 또는 눈을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 투여된 조성물 내 본원에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 나노소포의 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이상이 24, 48, 또는 72 시간 후에 표적 조직에 존재한다.
일부 실시양태에서, 위에 기재된 바와 같은 나노소포 또는 조성물은 치료학적 유효량 또는 치료학적 유효 용량으로 대상체 투여된다. 예시적인 투여량은 약 0.01 mg/kg 내지 약 500 mg/kg, 또는 약 0.1 mg/kg 내지 약 200 mg/kg, 또는 약 1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 또는 약 10 mg/kg 내지 약 50 mg/kg의 일일 용량 범위를 포함한다. 그러나, 투여량은 선택된 투여 경로, 조성물의 제형, 환자 반응, 병태의 중증도, 대상체의 체중 및 처방 의사의 판단을 포함한 여러 인자에 따라 달라질 수 있다. 개별 환자의 필요에 따라 시간이 지남에 따라 투여량을 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 환자에 초기에 낮은 용량이 주어지며, 이어서 이는 환자에 용인가능한 효과적인 투여량까지 증가된다. 유효량의 결정은 당업자의 역량 내에 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 나노소포 또는 조성물은 암의 치료에 사용된다. 특정 실시양태에서, 암은 CNS의 원발성 암, 예컨대, 신경아교종, 다형성 교모세포종, 수막종, 성상세포종, 청신경종, 연골종, 희소돌기아교세포종, 수모세포종, 신경절교종, 신경초종, 신경섬유종, 신경모세포종, 또는 경막외, 골수내 또는 경막내 종양이다. 일부 실시양태에서, 암은 고형 종양이거나, 다른 실시양태에서 암은 비-고형 종양이다. 고형-종양 암은 중추신경계의 종양, 유방암, 전립선암, 피부암 (기저 세포 암종, 세포 암종, 편평 세포 암종 및 흑색종 포함), 자궁경부암, 자궁암, 폐암, 난소암, 고환암, 갑상선암, 성상세포종, 신경교종, 췌장암, 중피종, 위암, 간암, 결장암, 직장암, 신모세포종을 포함한 신장암, 방광암, 식도암, 후두의 암, 이하선의 암, 담도의 암, 자궁내막암, 선암종, 소세포 암종, 신경아세포종, 부신피질 암종, 상피 암종, 데스모이드 종양, 결합조직형성 소 원형 세포 종양, 내분비 종양, 유잉 육종 패밀리 종양, 생식세포 종양, 간모세포종, 간세포 암종, 비-횡문근육종 연조직 육종, 골육종, 말초 원시 신경외배엽 종양, 망막모세포종 및 횡문근육종을 포함한다. 일부 실시양태에서, 암 치료용 의약의 제조에 있어 본원에 개시된 바와 같은 나노소포의 용도가 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 나노소포 또는 조성물은 자가면역 또는 염증성 질환의 치료에 사용될 수 있다. 이러한 질환의 예는 강직성 척추염, 관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 천식, 피부경화증, 뇌졸중, 죽상동맥경화증, 크론병, 대장염, 궤양성 대장염, 피부염, 게실염, 섬유증, 특발성 폐섬유증, 섬유근육통, 간염, 과민성 대장 증후군 (IBS), 루푸스, 전신 홍반 루푸스 (SLE), 신장염, 다발성 경화증 및 궤양성 대장염을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 자가면역 또는 염증성 질환 치료용 의약의 제조에 있어 본원에 개시된 바와 같은 나노소포의 용도가 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 나노소포 또는 조성물은 심혈관 질환, 예컨대, 관상 동맥 질환, 심장 마비, 비정상적인 심장 박동 또는 부정맥, 심부전, 심장 판막 질환, 선천성 심장 질환, 심장 근육 질환, 심근병증, 심낭 질환, 대동맥 질환, 마르팡 증후군, 관다발 질환(vascular disease) 또는 혈관 질환의 치료에 사용될 수 있다 .
본 개시내용의 나노소포 또는 조성물은 다양한 상이한 투여 경로, 예를 들어, 심이 (귀), 협측, 결막, 피부, 치아, 전기-삼투, 자궁경부, 부비강내(endosinusial), 기관내, 장관, 경막외, 양막-외(extra-amniotic), 체외, 혈액투석, 침윤, 간질, 복강-내, 양막-내, 동맥-내, 관절-내, 쓸개내, 기관지내, 활액낭내, 심장내, 연골내, 미추내(intracaudal), 해면내, 강내, 뇌내, 뇌실내, 수조내, 각막내, 치관내(intracoronal)(치아), 관상동맥내, 해면체내, 피내, 추간판내, 관내, 십이지장내, 경막내, 표피내, 식도내, 위내, 치은내, 회장내, 병변내, 관내(intraluminal), 림프내, 수질내(intramedullary), 수막내, 근육내, 안구내, 난소내, 심낭내, 복강내, 흉강내, 전립선내, 폐내, 부비강내(intrasinal), 척수내, 윤활막내, 힘줄내, 고환내, 척수강내, 흉부내, 관내(intratubular), 종양내, 고막 내(intratympanic), 자궁내, 혈관내, 정맥내, 정맥내 볼루스, 정맥내 점적, 뇌실내, 방광내, 유리체강내, 이온영동, 관류, 후두, 비강, 비위(nasogastric), 밀봉 드레싱 기법, 안과적, 구강, 구강인두, 기타, 비경구, 경피, 관절주위, 경막외, 신경주위, 치주, 직장, 호흡기 (흡입), 안구후, 연조직, 거미막하, 결막하, 피하, 설하, 점막하, 국부, 경피, 경점막, 태반경유, 기관경관, 고실경유, 요관, 요도 및/또는 질 투여, 및/또는 전형적으로 치료될 질환, 및/또는 나노소포, 조성물 및/또는 치료적 분자의 특질에 따라 좌우되는 위의 투여 경로의 임의의 조합을 통해 인간 또는 동물 대상체에 투여될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 나노소포는 정량적 및/또는 정성적 검출을 포함하는 생체내 및/또는 시험관내 검출 또는 진단적 목적으로 사용될 수 있다. 마찬가지로, 이전의 텍스트에 기재된 폴리펩티드, 핵산, 발현 벡터 및/또는 세포는 이 섹션에 상세히 기재된 바와 같이 그에 맞춰 사용될 수 있다.
진단적 적용 또는 검출 목적을 위해, 나노소포는 검출가능한, 예컨대, 방사선학 또는 자기 공명 영상을 포함한 생물학적 영상을 통해 검출가능한 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 나노소포는 리포터 단백질 또는 검출가능한 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 나노소포는 검출기 물질에 의해 인식될 수 있는 하나 이상의 물질에 커플링된다. 예로서, 나노소포는 비오틴에 공유적으로 연결될 수 있으며, 이는 스트렙타비딘에 결합하는 이의 역량에 의해 검출될 수 있다.
특정 실시양태에서, 나노소포는 샘플, 바람직하게는 생물학적 기원의 샘플, 예컨대, 인간 대상체로부터의 샘플에서 이의 존재를 검출하는 데 유용하다. 생물학적 샘플의 비-제한적인 예는 혈액, 생검, 뇌척수액, 림프, 소변 및/또는 비-혈액 조직을 포함한다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 인간 환자로부터의 세포 또는 조직을 포함한다.
따라서, 일부 양태에서, 다음의 단계를 포함하는, 단계가 제공된다: (i) 대상체 또는 생물학적 샘플을 검출가능한 모이어티를 포함하는 본 개시내용의 나노소포와 접촉시키는 단계; (ii) 나노소포가 대상체 또는 샘플과 상호작용하도록 허용하는 단계; 및 (iii) 나노소포를 검출하는 단계. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 나노소포를 국소화하기 위한 방법이다.
6. 실시예
실시예는 본원에 개시된 방법 및 조성물을 예시한다. 위에 제공된 일반적인 설명을 고려하면, 다양한 다른 실시양태가 실시될 수 있다는 것이 이해된다.
6.1 실시예 1: 조작된 EV의 생산
막관통 스캐폴드 단백질 (EphA4)에 융합된 FcRn 결합 부위를 포함하는 융합 단백질에 대한 DNA 서열을 인 실리코(in silico)로 설계하였다. 다음의 아키텍처를 갖는 폴리펩티드에 대해 코딩된 DNA 서열:
융합 단백질 1: EphA4 신호 펩티드 - scFv - 링커1 - 변형된 단량체성 Fc - 링커2 - EphA4 단편 - 링커3 - EGFP, 도 3에 묘사된 바와 같은 세포외 도메인 포함, 및
융합 단백질 2: EphA4 신호 펩티드 - scFv - 링커1 - EphA4 단편 - 링커3 - EGFP.
상업적인 DNA 합성 공급업체에 의해 DNA 서열을 합성하고, 내부 리보솜 진입 부위 및 항생제 선택 마커를 포함하는 렌티바이러스 백본으로 클로닝하였다. 표준 프로토콜을 사용하여 렌티 입자를 생산하고, HEK293T 세포를 형질도입한 다음, GFP 발현에 대한 유세포 분석법으로 분류한 다음, 단클론 확장하였다.
세포주를 배양하고, 안정한 클론의 배양물의 상층액으로부터 EV를 단리하였다. 구체적으로, EV-함유 배지를 차등 원심분리에 의해 파편(debris)으로부터 수집하고 정화하였다. 그런 다음, 상층액을 0.22 um 주사기 또는 바틀-탑(bottle-top) 필터로 여과하고, 상이한 정제 단계에 의해 추가로 처리하였다. 대규모 생산을 위해, 고 밀도 배양물을 관류 모드의 교반 생물반응기에서 유지시켰으며, 이로써 수확된 관류 상층액을 0.2 um 중공 섬유 필터가 장착된 교대 접선 유동 시스템에 의해 사전-정화 및 여과하였다. EV를, 다양한 방법, 전형적으로 접선 유동 여과 (TFF)와 정용여과/한외여과 및 통과액 기반 멀티모달 크로마토그래피의 조합 및/또는 결합 및 용리 크로마토그래피 단계를 사용하여 정화된 컨디셔닝된 배지로부터 단리 및 정제하였다. 그런 다음, 정제된 EV를 냉동시키고, 다운스트림 분석을 위해 보관하였다. 정제된 EV에 대해 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, EV 상에 발현된 융합 단백질 1 (왼쪽 레인) 및 융합 단백질 2 (오른쪽 2)의 동일한 단백질 양을 변성 폴리아크릴아미드 겔에 로딩하였다. EphA4 세포외 도메인에 특이적인 항체를 사용하는 EphA4에 대한 웨스턴 블롯팅은 융합 단백질 1 및 2가 조작된 EV 상에 발현됨을 입증하였다.
6.2 실시예 2: FcRn 결합 폴리펩티드 발현 공급원 세포의 선택
실시예 1에서 생성된 생산자 세포주에 더하여, N-말단에서 C-말단으로, 표적화 모노바디-링커1-변형된 단량체성 Fc-링커2-EphB2 스캐폴드-링커3-터보루크(turboluc) (여기서 EphB2 스캐폴드는 EphB2의 잔기 195-905를 포함하였고 LBD가 결여되어 있으며 야생형 EphB2에 비해 다음의 아미노산 치환 L356A I395A S536E A562S, Y822F를 함유함)를 포함하는 FcRn 폴리펩티드 (융합 단백질 3)를 발현하는 세포의 안정한 풀을 동일한 렌티 백본을 사용하여 생성하였다. 전체 융합 단백질의 서열에 대해서는 서열번호 73을 참고한다. 이전의 2 개의 GFP 태깅된 세포주와 대조적으로, 이 세포주에 의해 발현된 FcRn 결합 폴리펩티드는 유세포 분석법 보조 세포 분류 (FACS)를 가능하게 하는 GFP 태그를 함유하지 않는다. 고 발현 세포 클론을 선택하기 위해, 형질도입된 세포를 한계 희석법 및 항생제 선택을 사용하여 단클론 확장하였다. 형광 항-인간 Fc 도메인 항체 (Invitrogen 카탈로그 12-4998-82)를 사용하는 유세포 분석법에 의해 FcRn 결합 폴리펩티드 발현 수준에 대해 상이한 클론을 스크리닝하였다. 도 5a-5d에 도시된 바와 같이, HEK293T 대조군 세포 및 융합 단백질 2를 발현하는 세포주 (실시예 1에 기재된 바와 같음) (각자, 도 5a 및 도 5b)는 항-인간 Fc 도메인 항체에 의해 염색되지 않은 반면, 융합 단백질 1을 발현하는 세포주의 모든 세포 (실시예 1에 기재된 바와 같음, 변형된 단량체성 Fc를 포함함) 및 이 실시예의 FcRn 결합 폴리펩티드를 발현하는 선택된 클론의 모든 세포는 형광 항-인간 Fc 도메인 항체에 의해 성공적으로 염색되었다 (각자, 도 5c 및 도 5d).
6.3 실시예 3: 조작된 EV의 저 pH 용리
실시예 2에서 생성된 생산자 세포의 고 발현 클론을 무혈청, 화학적으로 정의된 배지에서 배양하고, 조작된 EV를 실시예 1에 기재된 바와 같이 상층액으로부터 단리하였다. 단리된 조작된 EV를 단백질 A 친화도 크로마토그래피 컬럼에 로딩하였다. 컬럼 평형화, 샘플 로딩 및 컬럼 세척 인 플레이스(in place) 절차에 대한 유속 설정을 제조업체의 지침에 따라 선택하였다. 0.1 M 글리신-HCl, pH 3.0을 포함하는 용리 완충액을 활용하여, 단백질 A 결합된 FcRn 결합 EV를 미리-플레이팅된 pH 중화 완충액으로 용리하였다. 통과액 및 용리액을 96 웰 플레이트로 분별하고, 동적 광 산란 (DLS)에 의한 입자 계수를 위해 샘플링하였다. 컬럼에 로딩된 입자의 양과 비교하여, 통과액 분획 및 용리 분획 둘 모두에서의 UV 흡광도 및 입자수/ml 측정치 둘 모두가 최소화되어, 낮은 회수의 수율을 나타낸다.
저 회수율을 조사하기 위해, 대략 1.8x1012 개의 입자/ml의 정제된 EV 샘플을 pH가 감소하는 완충액으로 1:10으로 희석하고, 완전히 혼합하고, 실온에서 20 분 동안 항온처리하였다. 그런 다음, 항온처리된 EV 샘플을 희석 배수(dilution factor)의 중성 pH를 갖는 완충액 (50 mM Tris, 50 mM NaCl)으로 희석하여, 나노입자 추적 분석 (NTA) 기기의 선형 범위 (각자, 더 높은 pH에서 1:2500 내지 낮은 pH에서 1:500)에서 입자 농도를 달성한 다음, 입자 농도에 대해 샘플을 측정하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, 후속적으로 pH 7.4로 되돌아가는, 5 미만의 pH에서의 조작된 EV의 단순한 항온처리는 입자 농도의 대략 90% 감소 (대략 1.8x1011 내지 대략 1.8x1010)를 초래하고, 측정 비디오에서 큰 응집체가 가시화되었다. EV를 높은 pH 완충액으로 희석함으로써 응집이 역전되지 않았다. 따라서, pH 5 미만의 EV 용리는 비가역적인 응집으로 이어질 수 있으며, 매우 낮은 pH를 요구하는 친화도 정제 방법은 차선책이 될 수 있다.
6.4 실시예 4: 단일 쇄 FcRn 발현 벡터의 작제
분비 신호로서 마우스 IgG 카파 쇄 리더 서열에 이어 C-태그에 융합된 FCGRT 중쇄의 성숙한 서열에 3x(GGGGS)(서열번호 72)를 통해 연접된 성숙한 B2M 서열을 함유하는, 재조합 인간 및 마우스 단일 쇄 FcRn (scFcRn) 작제물을 인 실리코로 설계하고, 상업적 DNA 합성 공급업체에 의해 합성하고, 렌티 및 일시적 벡터에 클로닝하였다.
6.5 실시예 5: 재조합 scFcRn의 생산
재조합 인간 scFcRn 및 마우스 scFcRn 폴리펩티드는 맞춤형 화학적으로 정의된 배양 배지 (소분자만 함유)에서 성장한 HEK293 세포에서 각자 발현되었다. 농축된 상층액 내 scFcRn의 발현을 웨스턴 블롯 (인간: Invitrogen PA5-97738 항체, 마우스 R&D Systems AF6775)에 의해 검출하였다. 대규모 생산을 위해, 실시예 4의 벡터를 사용하여 재조합 scFcRn을 발현하는 안정한 세포주를 생성하였다. 상기 세포주를 중공 섬유 카트리지 (5 kDa 컷오프) 또는 오비탈 진탕기에서 배양하였다. 정화된 상층액 또는 부분적으로 정제된 정화된 상층액 (10 kDa 중공 섬유 유닛을 갖는 접선 유동 장치에서 농축되고 PBS에 대해 정용여과됨)을 Capture-Select C-TagXL 친화도 크로마토그래피 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 PBS로 세척하고, scFcRn을 i) 20 mM Tris, 2.0 M MgCl2 pH 7.4, ii) 50 mM 아세트산 pH 3.0 또는 iii) 20 mM Tris, 2 mM "S-E-P-E-A" 펩티드, pH 7.4에 의해 용리하였다. "S-E-P-E-A" 펩티드에 의해 용리된 scFcRn에 대해, 용리 분획을 투석하거나 탈염하여, 펩티드를 제거하였다. 정제된 scFcRn의 단백질 함량을 비신코닌산 검정 (BCA)에 의해 측정하고, 생성물을 -20℃에서 보관하였다. scFcRn의 순도를 웨스턴 블롯 및 SDS-Page에 의해 검사하였다. 도 7에 도시된 바와 같이, 마우스 FcRn 특이적 항체를 사용한, 정화된 상층액 (레인 1), 통과액 분획 (레인 2) 및 용리 분획 (레인 3)의 웨스턴 블롯팅은 scFcRn 생성물의 결합 및 용리를 확인하였다. 대안적으로, 기능적 단백질의 순도 및 선택성을 증가시키기 위해, 2-단계 친화도 크로마토그래피를 수행하였다. 제1 단계에서, 위와 같이 조질의 정화된 상층액 또는 부분적으로 정제된 정화된 상층액을 HCl을 이용하여 pH 5.8로 조정하고, 0.45 μm 필터를 통해 여과하고, 이전에 MES 완충액 pH 5.8로 평형화된 상업적으로 이용가능한 hIgG-세파로스 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 5 컬럼 부피의 MES 완충액 pH 5.8로 세척하였다. 마지막으로, 결합된 단백질을 pH 8.0 완충액 (50 mM Tris, pH 8.0, 100 mM NaCl)을 이용하여 컬럼으로부터 용리하였다. 그런 다음, 정제된 단백질을 Capture-Select C-TagXL 컬럼에 로딩하고, PBS로 세척하고, 임의로 위와 같이 i) 20 mM Tris, 2.0 M MgCl2 pH 7.4, ii) 50 mM 아세트산 pH 3.0, 또는 iii) 20 mM Tris, 2 mM "S-E-P-E-A" 펩티드, pH 7.4로 용리하였다.
6.6 실시예 6: 조작된 EV의 scFcRn 정제
실시예 5의 재조합 scFcRn 단백질을 지침 설명서로부터의 절차에 따라 C-태그XL 컬럼에 로딩하였다. 그런 다음, 수지를 25 mM MES pH 5.8, 150 mM NaCl로 세척하였다. N-말단에서 C-말단으로, 표적화 모노바디 - 링커 - 변형된 단량체성 Fc - 링커 - EphA4 단편 (EphA4의 잔기 29-590 및 야생형 EphA4에 비해 F154A의 아미노산 치환 함유)을 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 안정한 세포주를 생성 및 배양하고, 상층액을 수집하여, 정화하고, 농축하였다. 수확된 상층액의 pH를 pH 5.8로 조정한 다음, 평형화된 컬럼에 로딩하고, 25 mM MES pH 5.8, 150 mM NaCl로 추가 세척하였다. 결합된 샘플을 50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl로 용리하였다 (역류).
용리된 통과액 및 용리 샘플에서 막관통 FcRn 결합 폴리펩티드의 존재를 확인하기 위해, 용리 분획을 풀링하고, 농축하고, 후속적으로 항-EphA4 항체 (ECM Biosciences, 카탈로그 번호 EM2801)를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 탐침하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, 용리 샘플은 EphA4 신호의 풍부화를 보여주었다.
6.7 실시예 7: scFcRn에 의한 pH 의존적 풍부화
지침 설명서로부터의 절차에 따라 수지 재료 1 ml당 대략 5 mg의 scFcRN 단백질을 POROS 20 EP 수지에 공유 커플링시켰다. 그런 다음, 제조업체의 설명서에 의해 지시된 바와 같이 500 mM NaCl을 포함하는 pH 8.2의 10 컬럼 부피의 0.2 M Tris로 수지를 세척한 후, 25 mM Tris pH 8.2의 10 컬럼 부피로 세척하였다. Tris-NaCl로 최종 세척하고, 이어서 MES 완충액 pH 5.8로 컬럼을 평형화한 후, 사용할 준비가 되었다. 성공적인 수지 기능화를 정제된 인간 IgG1을 로딩함으로써 확인하였다.
FcRn 결합 폴리펩티드를 포함하는 조작된 EV의 풍부화의 pH 의존성을, pH의 사전 조정 없이 막관통 EphA4 스캐폴드 단백질을 포함하는 FcRn 결합 폴리펩티드 (즉, 실시예 1에 기재된 바와 같은 융합 단백질 1)를 발현하는 생산자 세포의 정화되고 정용여과된 상층액을 50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl로 사전평형화된 scFcRn 기능화된 POROS EP 수지에 로딩함으로써 결정하였다. 대안적으로, 동일한 배치의 상층액의 샘플을 25 mM MES pH 5.8로 사전평형화된 scFcRn 기능화된 POROS EP 수지에 로딩하기 전에 실시예 6에 기재된 바와 같이 pH 조정하였다. 실시예 6에 기재된 바와 같이 컬럼을 세척하고 용리하였다. 두 경우 모두에서, 통과액 분획 및 용리 분획을 풀링하고, 농축하였다. 용리된 통과액 및 용리 샘플에서 막관통 FcRn 결합 폴리펩티드의 존재를 확인하기 위해, 통과액 용리 분획을 풀링하고, 농축하고, 후속적으로 항-EphA4 항체 (ECM Biosciences, 카탈로그 번호 EM2801)를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 탐침하였다. 정화된 상층액은 농축되지 않았다. 도 9a에 도시된 바와 같이, pH가 조정되지 않은 상층액의 경우, 풀링되고 농축된 통과액 분획은 막관통 EphA4를 유지한 반면, 도 9b에서, 산성화된 상층액의 경우, 풀링되고 농축된 용리 분획은 막관통 EphA4 스캐폴드 단백질을 포함하는 FcRn 결합 폴리펩티드의 풍부화를 보여주었다.
6.8 실시예 8: FcRn 결합 면역검정
실시예 2에 기재된 정제된 EV 및 천연 Hek293 EV를 이용하여 Lumit™ FcRn 결합 면역검정 (Promega)을 수행하였다. 상기 EV의 샘플 및 대조군으로서의 인간 IgG1 및 마우스 IgG1을 각각 연속적으로 희석하고, 제조업체 지침에 따라 분할 FcRn/Tracer와 함께 항온처리하였다 (Tracer 및 FcRn은 10 배 희석되었다). 검출 시약을 첨가하고, 플레이트 판독기에서 발광을 검출하였다. 도 10a에 도시된 바와 같이, 실시예 1에 기재된 정제된 EV는 FcRn에 결합할 수 있었던 반면, 천연 EV는 FcRn에 결합하지 않았다. 도 10b에 도시된 바와 같이, 인간 IgG1은 FcRn에 결합할 수 있었던 반면, 마우스 IgG1은 그렇지 않았다.
6.9 실시예 9: 변형된 Fc 하이브리도좀의 IV 투여 후 혈액 청소율
EV (예컨대, 엑소좀)는 매우 짧은 반감기 및 순환 시간을 갖는 것으로 간주된다. 실시예 2에 기재된 EphB2 스캐폴드를 포함하는 하이브리도좀의 혈액 청소율을 테스트하기 위해, 면역적격 누드 SKH1 마우스 (6-8 주령, n=6/그룹)에 DNA 로딩된 지질 나노입자 또는 하이브리도좀 (0.5 mg/kg)을 정맥내 주사하였다. DNA 카고는 프로모터, 리포터 트랜스진 및 BGH 폴리(A)를 코딩한다. 제조업체의 지침에 따라 Nanoassemblr™ 미세유체 시스템 (Precision NanoSystems)에서 지질 나노입자를 제조하였다. 투여 후 21 일차에 동물에 재-투약하였다. 혈액 청소율을 모니터링하기 위해, 3 일차, 6 일차, 21 일차 (제2 투약-전) 및 24 일차에, 각자, 꼬리 정맥으로부터 20 마이크로리터의 혈액을 채취하고, 혈장으로 처리하였다. 동일한 플레이트에 대한 표준 곡선에 대해 비교함으로써 DNA 서열, 구체적으로 BGH 폴리 A 서열을 정량화하기 위해 Taqman qPCR 검정에 2 마이크로리터의 희석된 혈장을 사용하였다. 나이브 마우스 혈장으로부터 DNA의 회수 효율을, DNA 벡터를 마우스 혈장에 스파이킹함으로써 결정하였다. 도 11에 도시된 바와 같이, EphB2 스캐폴드 단백질에 융합된 표적화 모노바디-변형된 Fc 도메인을 포함하는 하이브리도좀은 투여 6 일 후에 마우스 혈장에서 검출될 수 있었던 반면, 같은 날 LNP 처리된 그룹의 혈장 카피수는 검출 한계 미만이었다.
SEQUENCE LISTING <110> ANJARIUM BIOSCIENCES AG <120> FC-DERIVED POLYPEPTIDES <130> 14497-004-228 <140> TBA <141> <150> US 63/174,855 <151> 2021-04-14 <160> 73 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <220> <221> REPEAT <222> (1)..(5) <223> the sequence can be repeated n times, where n can be an integer number from 1 to 10 <400> 1 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 2 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 3 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 4 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 5 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 6 <211> 20 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<220> <223> Mouse scFcRn <400> 72 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Val Arg Ser 20 25 30 Leu Val Pro Ser Ser Gly Leu Tyr Ala Ile Gln Lys Thr Pro Gln Ile 35 40 45 Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Pro Glu Asn Gly Lys Pro Asn Ile Leu 50 55 60 Asn Cys Tyr Val Thr Gln Phe His Pro Pro His Ile Glu Ile Gln Met 65 70 75 80 Leu Glu Asn Gly Lys Lys Ile Pro Lys Val Glu Met Ser Asp Met Ser 85 90 95 Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Ile Leu Ala His Thr Glu Phe Thr 100 105 110 Pro Thr Glu Thr Asp Thr Tyr Ala Cys Arg Val Lys His Ala Ser Met 115 120 125 Ala Glu Pro Lys Thr Val Tyr Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Pro Pro Leu Met 145 150 155 160 Tyr His Leu Thr Ala Val Ser Asn Pro Ser Thr Gly Leu Pro Ser Phe 165 170 175 Trp Ala Thr Gly Trp Leu Gly Pro Gln Gln Tyr Leu Thr Tyr Asn Ser 180 185 190 Leu Arg Gln Glu Ala Asp Pro Cys Gly Ala Trp Met Trp Glu Asn Gln 195 200 205 Val Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu Thr Thr Asp Leu Lys Ser Lys Glu 210 215 220 Gln Leu Phe Leu Glu Ala Leu Lys Thr Leu Glu Lys Ile Leu Asn Gly 225 230 235 240 Thr Tyr Thr Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys Glu Leu Ala Ser Asp Asn 245 250 255 Ser Ser Val Pro Thr Ala Val Phe Ala Leu Asn Gly Glu Glu Phe Met 260 265 270 Lys Phe Asn Pro Arg Ile Gly Asn Trp Thr Gly Glu Trp Pro Glu Thr 275 280 285 Glu Ile Val Ala Asn Leu Trp Met Lys Gln Pro Asp Ala Ala Arg Lys 290 295 300 Glu Ser Glu Phe Leu Leu Asn Ser Cys Pro Glu Arg Leu Leu Gly His 305 310 315 320 Leu Glu Arg Gly Arg Arg Asn Leu Glu Trp Lys Glu Pro Pro Ser Met 325 330 335 Arg Leu Lys Ala Arg Pro Gly Asn Ser Gly Ser Ser Val Leu Thr Cys 340 345 350 Ala Ala Phe Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu Lys Phe Arg Phe Leu Arg 355 360 365 Asn Gly Leu Ala Ser Gly Ser Gly Asn Cys Ser Thr Gly Pro Asn Gly 370 375 380 Asp Gly Ser Phe His Ala Trp Ser Leu Leu Glu Val Lys Arg Gly Asp 385 390 395 400 Glu His His Tyr Gln Cys Gln Val Glu His Glu Gly Leu Ala Gln Pro 405 410 415 Leu Thr Val Asp Leu Asp Ser Ser Ala Arg Ser Ser 420 425 <210> 73 <211> 1211 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of full fusion protein 3 <400> 73 Met Ala Leu Arg Arg Leu Gly Ala Ala Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu 1 5 10 15 Ala Ala Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 20 25 30 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Tyr Tyr Pro Phe Cys Ala Phe Tyr 35 40 45 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 50 55 60 Phe Thr Val Pro Arg Ser Pro Asp Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 65 70 75 80 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Cys Leu Gly 85 90 95 Ser Tyr Ser Arg Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 130 135 140 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 145 150 155 160 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 165 170 175 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 180 185 190 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 195 200 205 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys 210 215 220 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 225 230 235 240 Lys Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser 245 250 255 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 260 265 270 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Val Pro Val Leu 275 280 285 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Arg Leu Ala Ser Tyr Leu Thr Val Asp Lys 290 295 300 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 305 310 315 320 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 325 330 335 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg 340 345 350 Lys Cys Pro Arg Ile Ile Gln Asn Gly Ala Ile Phe Gln Glu Thr Leu 355 360 365 Ser Gly Ala Glu Ser Thr Ser Leu Val Ala Ala Arg Gly Ser Cys Ile 370 375 380 Ala Asn Ala Glu Glu Val Asp Val Pro Ile Lys Leu Tyr Cys Asn Gly 385 390 395 400 Asp Gly Glu Trp Leu Val Pro Ile Gly Arg Cys Met Cys Lys Ala Gly 405 410 415 Phe Glu Ala Val Glu Asn Gly Thr Val Cys Arg Gly Cys Pro Ser Gly 420 425 430 Thr Phe Lys Ala Asn Gln Gly Asp Glu Ala Cys Thr His Cys Pro Ile 435 440 445 Asn Ser Arg Thr Thr Ser Glu Gly Ala Thr Asn Cys Val Cys Arg Asn 450 455 460 Gly Tyr Tyr Arg Ala Asp Leu Asp Pro Leu Asp Met Pro Cys Thr Thr 465 470 475 480 Ile Pro Ser Ala Pro Gln Ala Val Ile Ser Ser Val Asn Glu Thr Ser 485 490 495 Leu Met Leu Glu Trp Thr Pro Pro Arg Asp Ser Gly Gly Arg Glu Asp 500 505 510 Ala Val Tyr Asn Ile Ile Cys Lys Ser Cys Gly Ser Gly Arg Gly Ala 515 520 525 Cys Thr Arg Cys Gly Asp Asn Val Gln Tyr Ala Pro Arg Gln Leu Gly 530 535 540 Leu Thr Glu Pro Arg Ile Tyr Ala Ser Asp Leu Leu Ala His Thr Gln 545 550 555 560 Tyr Thr Phe Glu Ile Gln Ala Val Asn Gly Val Thr Asp Gln Ser Pro 565 570 575 Phe Ser Pro Gln Phe Ala Ser Val Asn Ile Thr Thr Asn Gln Ala Ala 580 585 590 Pro Ser Ala Val Ser Ile Met His Gln Val Ser Arg Thr Val Asp Ser 595 600 605 Ile Thr Leu Ser Trp Ser Gln Pro Asp Gln Pro Asn Gly Val Ile Leu 610 615 620 Asp Tyr Glu Leu Gln Tyr Tyr Glu Lys Glu Leu Ser Glu Tyr Asn Ala 625 630 635 640 Thr Ala Ile Lys Ser Pro Thr Asn Thr Val Thr Val Gln Gly Leu Lys 645 650 655 Ala Gly Ala Ile Tyr Val Phe Gln Val Arg Ala Arg Thr Val Ala Gly 660 665 670 Tyr Gly Arg Tyr Ser Gly Lys Met Tyr Phe Gln Thr Met Thr Glu Ala 675 680 685 Glu Tyr Gln Thr Glu Ile Gln Glu Lys Leu Pro Leu Ile Ile Gly Ser 690 695 700 Ser Ala Ala Gly Leu Val Phe Leu Ile Ala Val Val Val Ile Ser Ile 705 710 715 720 Val Cys Asn Arg Arg Gly Phe Glu Arg Ala Asp Ser Glu Tyr Thr Asp 725 730 735 Lys Leu Gln His Tyr Thr Ser Gly His Met Thr Pro Gly Met Lys Ile 740 745 750 Tyr Ile Asp Pro Phe Thr Tyr Glu Asp Pro Asn Glu Ala Val Arg Glu 755 760 765 Phe Ala Lys Glu Ile Asp Ile Ser Cys Val Lys Ile Glu Gln Val Ile 770 775 780 Gly Ala Gly Glu Phe Gly Glu Val Cys Ser Gly His Leu Lys Leu Pro 785 790 795 800 Gly Lys Arg Glu Ile Phe Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys Ser Gly Tyr 805 810 815 Thr Glu Lys Gln Arg Arg Asp Phe Leu Ser Glu Ala Ser Ile Met Gly 820 825 830 Gln Phe Asp His Pro Asn Val Ile His Leu Glu Gly Val Val Thr Lys 835 840 845 Ser Thr Pro Val Met Ile Ile Thr Glu Phe Met Glu Asn Gly Ser Leu 850 855 860 Asp Ser Phe Leu Arg Gln Asn Asp Gly Gln Phe Thr Val Ile Gln Leu 865 870 875 880 Val Gly Met Leu Arg Gly Ile Ala Ala Gly Met Lys Tyr Leu Ala Asp 885 890 895 Met Asn Tyr Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Val Asn 900 905 910 Ser Asn Leu Val Cys Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Ser Arg Phe Leu 915 920 925 Glu Asp Asp Thr Ser Asp Pro Thr Tyr Thr Ser Ala Leu Gly Gly Lys 930 935 940 Ile Pro Ile Arg Trp Thr Ala Pro Glu Ala Ile Gln Tyr Arg Lys Phe 945 950 955 960 Thr Ser Ala Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Val Met Trp Glu Val 965 970 975 Met Ser Phe Gly Glu Arg Pro Tyr Trp Asp Met Thr Asn Gln Asp Val 980 985 990 Ile Asn Ala Ile Glu Gln Asp Tyr Arg Leu Pro Pro Pro Met Asp Cys 995 1000 1005 Pro Ser Ala Leu His Gln Leu Met Leu Asp Cys Trp Gln Lys Asp 1010 1015 1020 Arg Asn His Arg Pro Lys Phe Gly Gln Ile Val Asn Thr Leu Asp 1025 1030 1035 Lys Met Ile Arg Asn Pro Asn Ser Leu Lys Ala Met Ala Pro Leu 1040 1045 1050 Ser Ser Gly Ile Asn Leu Pro Leu Gly Gly Gly Glu Ala Glu Ala 1055 1060 1065 Glu Arg Gly Lys Leu Pro Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu 1070 1075 1080 Ile Glu Leu Glu Ala Asn Ala Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly 1085 1090 1095 Cys Leu Ile Cys Leu Ser Lys Ile Lys Cys Thr Ala Lys Met Lys 1100 1105 1110 Lys Tyr Ile Pro Gly Arg Cys Ala Asp Tyr Gly Gly Asp Lys Lys 1115 1120 1125 Thr Gly Gln Ala Gly Ile Val Gly Ala Ile Val Asp Ile Pro Glu 1130 1135 1140 Ile Ser Gly Phe Lys Glu Met Glu Pro Met Glu Gln Phe Ile Ala 1145 1150 1155 Gln Val Asp Arg Cys Ala Asp Cys Thr Thr Gly Cys Leu Lys Gly 1160 1165 1170 Leu Ala Asn Val Lys Cys Ser Asp Leu Leu Lys Lys Trp Leu Pro 1175 1180 1185 Gly Arg Cys Ala Thr Phe Ala Asp Lys Ile Gln Ser Glu Val Asp 1190 1195 1200 Asn Ile Lys Gly Leu Ala Gly Asp 1205 1210

Claims (25)

  1. 다음을 포함하는, 폴리펩티드:
    a. 막관통 도메인; 및
    b. 다음과 같은 면역글로불린의 변형된 Fc 도메인:
    i. FcRn의 Fc 결합 부위에 특이적으로 결합할 수 있고;
    ii. 동종이합체를 형성하는 능력이 결여됨.
  2. 제1항에 있어서,
    6.5의 pH에서 FcRn에 결합된 변형된 Fc 도메인의 평형 해리 상수가 최대 10-4 M의 값을 갖는, 폴리펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    7.4의 pH에서 FcRn에 결합된 변형된 Fc 도메인의 평형 해리 상수가 10-4 M 이상의 값을 갖는, 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    변형된 Fc 도메인이 인간 FcRn (서열번호 7) 및/또는 마우스 FcRn (서열번호 8)의 위치 135-158 사이의 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있는, 폴리펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    변형된 Fc 도메인이 아미노산 서열 LNGEEFMX1FX2X3X4X5GX6WX7GX8W (서열번호 6)에 특이적으로 결합할 수 있고, 여기서 X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7 및 X8 각각이 임의의 아미노산인, 폴리펩티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드가 C1q, FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII에 실질적으로 결합하지 않는, 폴리펩티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. 변형된 Fc 도메인의 보체 의존적 세포독성 (CDC) 활성;
    b. 변형된 Fc 도메인의 항체 의존적 세포 매개된 세포독성 (ADCC) 활성;
    c. 변형된 Fc 도메인의 항체 의존적 세포 매개된 식세포작용 (ADCP) 활성; 및/또는
    d. 변형된 Fc 도메인의 항체 의존적 세포내 중화 (ADIN) 활성이
    미변형된 Fc 도메인과 비교하여 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이상 감소되는, 폴리펩티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. 변형된 Fc 도메인의 보체 의존적 세포독성 (CDC) 활성;
    b. 변형된 Fc 도메인의 항체 의존적 세포 매개된 세포독성 (ADCC) 활성;
    c. 변형된 Fc 도메인의 항체 의존적 세포 매개된 식세포작용 (ADCP) 활성; 및/또는
    d. 변형된 Fc 도메인의 항체 의존적 세포내 중화 (ADIN) 활성이
    미변형된 Fc 도메인과 비교하여 1.5, 2, 3, 4 또는 5-배 이상 감소되는, 폴리펩티드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    FcRn 결합 폴리펩티드가 N-말단에서 C-말단으로, 다음을 포함하는, 폴리펩티드:
    a. 미변형된 CH2 도메인에 비해 이펙터 기능이 감소되도록 변형되는 변형된 CH2 도메인;
    b. 미변형된 CH3 도메인에 비해 동종이합체화가 결여되도록 변형되는 변형된 CH3 도메인;
    c. 링커 서열; 및
    d. 막관통 도메인.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    FcRn 결합 폴리펩티드가 C-말단에서 N-말단으로, 다음을 포함하는, 폴리펩티드:
    a. 미변형된 CH3 도메인에 비해 동종이합체화가 결여되도록 변형되는 변형된 CH3 도메인;
    b. 미변형된 CH2 도메인에 비해 이펙터 기능이 감소되도록 변형되는 변형된 CH2 도메인;
    c. 링커 서열; 및
    d. 막관통 도메인.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    막관통 도메인이 다중통과 막관통 도메인인, 폴리펩티드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적화 도메인을 추가로 포함하는, 폴리펩티드: scFv, (scFv)2, Fab, Fab', F(ab')2, F(abl)2, Fv, dAb, Fd 단편, 디아바디, F(ab)2, F(ab'), F(ab')3, Fd, Fv, 디설파이드 연결된 Fv, dAb, sdAb, 나노바디, CDR, di-scFv, bi-scFv, tascFv (탠덤 scFv), 아비바디 (예컨대, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디), T-세포 관여자 (BiTE), V-NAR 도메인, Fcab, IgGACH2, DVD-Ig, 프로바디, 인트라바디, DARPin, 센티린, 아피바디, 아필린, 아피틴, 안티칼린, 아비머, 파이노머, Kunitz 도메인 펩티드, 모노바디, 아드넥틴, 트리바디 및 나노피틴.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산.
  14. 제13항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  15. 제13항의 핵산 또는 제14항의 발현 벡터를 포함하는 세포.
  16. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 세포외 소포.
  17. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 하이브리도좀.
  18. 세포외 소포 (EV)를 정제하는 방법으로서, 상기 방법은 다음을 포함하는 것인, 방법:
    a. 제1 결합 파트너와 회합되어 있는 EV를 제공하는 단계이되, 여기서 제1 결합 파트너는 pH 의존적 방식으로 FcRn의 Fc 결합 부위에 결합할 수 있는, 단계; 및
    b. 제1 결합 파트너와 회합된 EV를 제2 결합 파트너와 제1 pH에서 접촉시키는 단계이되, 여기서 제2 결합 파트너는 FcRn의 Fc 결합 부위를 포함하고 고체 매트릭스와 회합되어 있는, 단계; 및
    c. 제2 pH에서 고체 매트릭스로부터 제1 결합 파트너와 회합된 EV를 용리하는 단계.
  19. 제18항에 있어서,
    방법이 제1 pH에서의 세척 단계를 포함하는 것인, 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서,
    제1 pH가 6.5 미만인, 방법.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 pH가 7.4 초과인, 방법.
  22. EV를 정제하는 방법으로서, 상기 방법은 다음을 포함하는 것인, 방법:
    a. 제1 결합 파트너와 회합되어 있는 EV를 제공하는 단계이되, 여기서 제1 결합 파트너는 pH 의존적 방식으로 FcRn의 Fc 결합 부위에 결합할 수 있고 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진, 단계; 및
    b. 제1 결합 파트너와 회합된 EV를 제2 결합 파트너와 제1 pH에서 접촉시키는 단계이되, 여기서 제2 결합 파트너는 FcRn의 Fc 결합 부위를 포함하고 고체 매트릭스와 회합되어 있는, 단계; 및
    c. 제2 pH에서 고체 매트릭스로부터 제1 결합 파트너와 회합된 EV를 용리하는 단계.
  23. 제22항에 있어서,
    방법이 제1 pH에서의 세척 단계를 포함하는 것인, 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서,
    제1 pH가 6.5 미만인, 방법.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 pH가 7.4 초과인, 방법.
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