JP2024517671A - ヘテロ二量体抗体およびその抗原結合断片 - Google Patents

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Abstract

二特異性または多特異性分子における正確な軽鎖対合の増強に有用な新規のポリペプチド複合体を提供する。ポリペプチド複合体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、その核酸を含むベクター、その核酸またはそのベクターを含む宿主細胞、そのポリペプチド複合体を含む医薬組成物、ならびに疾患、症状または症候を治療または予防するためのそのポリペプチド複合体の使用をさらに提供する。【選択図】図１３

Description

[0001]本開示は概して、タンパク質改変の分野、詳細には、改変抗体の領域、より詳細には、免疫グロブリン軽および重鎖のコグネート対合において高選択性を有するように改変した二特異性抗体に関する。
[0002]免疫グロブリン（Ｉｇ）としても知られる抗体は、脊椎動物の血漿または他の体液に存在する大型のタンパク質であり、形質細胞（すなわち、分化Ｂ細胞）により産生され、宿主に侵入する外来物質（例えば、病原性細菌、ウイルスおよび寄生虫等）に結合して中和するために免疫系により利用される。主に、種々の標的分子（すなわち、抗原）を認識して結合する高度に特異的な能力により、抗体は、科学的研究のための重大な研究ツールならびに重要な疾患スクリーニングおよび診断ツールとして従来から使用されており、特定の自己免疫／炎症障害、例えば、乾癬、関節リウマチおよび多発性硬化症等、ならびに最も注目すべきは、がん（例えば、乳がん、結腸直腸がん、非ホジキンリンパ腫等）を含む多様なヒト疾患を管理または治療する有望な治療物質として最近登場した。
[0003]天然抗体は、免疫グロブリンユニットに同一の２つの重（Ｈ）鎖および同一の２つの軽（Ｌ）鎖を一般に含み、これにより、２つの抗原結合部位の存在にもかかわらず、このような天然に存在する抗体は、一抗原のみを特異的に標的とする。このような単一抗原標的（すなわち、単一特異性）抗体医薬は、相当数のヒト疾患の治療において成功を成したが、複数の因子により通常引き起こされる多くの複雑性疾患、例えば、がんの治療における著しい有効性を成すには至らなかった。
[0004]したがって、一治療分子において、２つ以上の異なる抗原に同時に結合し、これにより、個々の単一特異性抗体の作用に勝る相加的、相補的または相乗的作用を生み出すことが可能な多特異性抗体医薬を設計する大きな必要性が存在する。このような多特異性抗体は、例えば、２つ以上を超える異なる抗原を直近に接近させ、これにより、それらの相互作用を促進するのに有用であり得る。一例では、免疫細胞を腫瘍関連抗原または病原体抗原の直近に接近させることにより、免疫系による腫瘍または病原体細胞の認識または除去を促進することができる。別の例では、多特異的抗体は、一抗原の異なる（かつ好ましくは、非重複）エピトープに結合することができ、これは、標的抗原、特には、変異しやすい抗原（例えば、ウイルス抗原）に対する認識または結合の増強において有用であり得る。
[0005]この目標に向かって、２つ以上のエピトープに同時に結合する多特異性、最も注目すべきは、二特異性を示す免疫グロブリンの新たなフォーマットを設計する多くの試みが成された。優勢型の多特異性抗体である二特異性抗体に関しては、多様な二特異性フォーマットが設計されており、これらは、ＩｇＧ様特異性抗体および非ＩｇＧ様二特異性抗体（例えば、ＤＶＤ－Ｉｇ、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＢｉＴＥ等）に分類することができる（Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６７（２），ｐｐ．９５－１０６（２０１５））。しかし、このようなフォーマットは通常、特異性、安定性、溶解性、収率、短半減期および免疫原性において限界を有する。
[0006]このような二特異性抗体フォーマットの中でも、ＩｇＧ様二特異性抗体は実質的に、１つのＦｃ領域、および２つの異なる抗原または単一抗原の２つの異なるエピトープをそれぞれ特異的に標的として結合する２つのＦａｂアームを有するモノクローナル抗体である。下流の開発を促進するために、このような二特異性分子を通常のＩｇＧのように好都合に生成すること、すなわち、単一宿主細胞（例えば、クアドローマ）から高い発現レベルおよび純度で生成することが可能であることが望ましい。しかし、コグネート軽－重鎖の対合ならびに２つの異なる半抗体のアセンブリが典型的に自動制御不可能であるため、この伝統的方法では、産物の著しい不均一性が生じる誤対合の可能性が高く、このため、かなり非効率かつ低品質となり得る。
[0007]軽鎖誤対合を減少させるために、いくつかの戦略が設計された。Ｒｏｃｈｅ社により開発されたＣｒｏｓｓＭａｂプラットフォームでは、ＣＨ１およびＣＬ領域のドメインを実質的にスワップする（Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，１０８（２７），ｐｐ．１１１８７－１１１９２（２０１１））。ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ社により開発された別の戦略では、代替ジスルフィド結合をＣＨ１およびＣＬ領域に導入する（Ｍａｚｏｒ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ，７（２），ｐｐ．３７７－３８９（２０１５）；米国特許第９５２７９２７号；および米国特許出願公開第２０１８００２２８０７号明細書）。Ａｍｇｅｎ社により開発されたまた別の戦略では、新たな静電気をＣＨ１－ＣＬ領域に導入する（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９０（１２），ｐｐ．７５３５－７５６２（２０１５）；および米国特許出願公開第２０１４０１５４２５４号明細書）。Ｌｉｌｌｙ社（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３２（２），ｐｐ．１９１－１９８（２０１４））およびＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社（Ｄｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ，９（２），ｐｐ．２１３－２３０（２０１７））により開発されたまた別の戦略では、可変および定常ドメインの両方に変異を導入する。しかし、このような既存の解法は、独自の不都合をそれぞれ有し、このため、軽鎖誤対合を減少させるより良い解法に対する大きな必要性がなお存在する。
[0008]本開示では、二特異性または多特異性分子における正確な軽鎖対合の増強に有用な新規のポリペプチド複合体を提供する。
[0009]一態様では、第１の定常部分に動作可能に連結されている第１の標的結合部分を含む第１の標的結合ドメインを含むポリペプチド複合体であって、第１の定常部分が、第１の軽鎖定常領域（ＣＬ）と会合している第１の重鎖定常領域１（ＣＨ１）を含み、第１のＣＨ１領域が、ＥＵ位置ｎ１に第１のアミノ酸残基を含み、第１のＣＬ領域が、ＥＵ位置ｎ２に第２のアミノ酸残基を含み、ｎ１：ｎ２位置対が、１２８：１１８および１７３：１６０からなる群から選択され、第１のアミノ酸残基および第２のアミノ酸残基が、共有結合を形成する、ポリペプチド複合体を本開示により提供する。このような実施形態の一部では、第１のＣＨ１領域は、ＥＵ位置ｎ３に第３のアミノ酸残基をさらに含み、第１のＣＬ領域は、ＥＵ位置ｎ４に第４のアミノ酸残基をさらに含み、ｎ３：ｎ４位置対は、１８３：１７６、１４１：１１６、１２６：１２１および２１８：１２２からなる群から選択され、第３のアミノ酸残基および第４のアミノ酸残基は、非共有結合を形成する。一部の実施形態では、第１のＣＨ１領域は、ＥＵ位置ｎ３に第３のアミノ酸残基をさらに含み、第１のＣＬ領域は、ＥＵ位置ｎ４に第４のアミノ酸残基をさらに含み、ｎ３：ｎ４位置対は、１８３：１７６、１４１：１１６、１２６：１２１および２１８：１２２からなる群から選択され、第３のアミノ酸残基および第４のアミノ酸残基は、反対に荷電する。
[0010]一部の実施形態では、第１の標的結合ドメインは、抗原結合ドメインを含むか、または抗原結合ドメインである。一部の実施形態では、第１の標的結合部分は、抗原結合部分を含むか、または抗原結合部分である。
[0011]一部の実施形態では、本明細書に提供するポリペプチド複合体は、第２の定常部分に動作可能に連結されている第２の標的結合部分を含む第２の標的結合ドメインをさらに含み、第２の定常部分は、第２のＣＬ領域と会合している第２のＣＨ１領域を含み、第１のＣＨ１領域は、第２のＣＬ領域に実質的に結合せず、第２のＣＨ１領域は、第１のＣＬ領域に実質的に結合しない。
[0012]一部の実施形態では、第２の標的結合ドメインは、抗原結合ドメインを含むか、または抗原結合ドメインである。一部の実施形態では、第２の標的結合部分は、抗原結合部分を含むか、または抗原結合部分である。
[0013]一部の実施形態では、第２のＣＨ１領域は、ＥＵ位置ｎ１’に第１の対応するアミノ酸残基を含み、第２のＣＬ領域は、ＥＵ位置ｎ２’に第２の対応するアミノ酸残基を含み、ｎ１’：ｎ２’位置対は、ｎ１：ｎ２位置対と同一であり、ＥＵ位置ｎ１’の第１の対応するアミノ酸残基は、ＥＵ位置ｎ２の第２のアミノ酸残基と共有結合を形成せず、および／またはＥＵ位置ｎ２’の第２の対応するアミノ酸残基は、ＥＵ位置ｎ１の第１のアミノ酸残基と共有結合を形成しない。
[0014]一部の実施形態では、ＥＵ位置ｎ１’の第１の対応するアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ２’の第２の対応するアミノ酸残基は、共有結合を形成しない。
[0015]一部の実施形態では、第２のＣＨ１領域は、ＥＵ位置ｎ３’に第３の対応するアミノ酸残基をさらに含み、第２のＣＬ領域は、ＥＵ位置ｎ４’に第４の対応するアミノ酸残基をさらに含み、ｎ３’：ｎ４’位置対は、ｎ３：ｎ４位置対と同一であり、
（ａ）ＥＵ位置ｎ４’の第４の対応するアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ３の第３のアミノ酸残基は、反対に荷電しないか、もしくは同様に荷電し、ならびに／または
（ｂ）ＥＵ位置ｎ３’の第３の対応するアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ４の第４のアミノ酸残基は、反対に荷電しないか、もしくは同様に荷電する。
[0016]一部の実施形態では、ＥＵ位置ｎ３’の第３の対応するアミノ酸残基および／またはＥＵ位置ｎ４’の第４の対応するアミノ酸残基は、荷電しない。
[0017]一部の実施形態では、第２のＣＨ１領域は、ＥＵ位置ｎ５’に第５の対応するアミノ酸残基をさらに含み、第２のＣＬ領域は、ＥＵ位置ｎ６’に第６の対応するアミノ酸残基をさらに含み、第５の対応するアミノ酸残基および第６の対応するアミノ酸残基は、共有結合を形成し、ｎ５’：ｎ６’位置対は、ｎ１：ｎ２位置対とは異なる。
[0018]一部の実施形態では、ｎ５’：ｎ６’位置対は、２２０：２１４（ＩｇＧ１）、１３１：２１４（ＩｇＧ２およびＩｇＧ４）、１２８：１１８ならびに１７３：１６０からなる群から選択される。一部の実施形態では、ｎ５’：ｎ６’位置対は、２２０：２１４（ＩｇＧ１）である。一部の実施形態では、ｎ５’：ｎ６’位置対は、１３１：２１４（ＩｇＧ２およびＩｇＧ４）である。一部の実施形態では、ｎ５’：ｎ６’位置対が１２８：１１８であり、ｎ１：ｎ２位置対が１７３：１６０であるか、またはｎ５’：ｎ６’位置対が１７３：１６０であり、ｎ１：ｎ２位置対が１２８：１１８である。
[0019]このような実施形態の一部では、第１のＣＨ１領域は、ＥＵ位置２２０（ＩｇＧ１）または１３１（ＩｇＧ２およびＩｇＧ４）にシステイン以外のアミノ酸残基を有し、第１のＣＬ領域は、ＥＵ位置２１４にシステイン以外のアミノ酸残基を有する。このような実施形態の一部では、第２のＣＨ１領域は、ＥＵ位置２２０（ＩｇＧ１）または１３１（ＩｇＧ２およびＩｇＧ４）にシステイン以外のアミノ酸残基を有し、第２のＣＬ領域は、ＥＵ位置２１４にシステイン以外のアミノ酸残基を有する。このような実施形態の一部では、第１のＣＨ１領域も第２のＣＨ１領域もＥＵ位置２２０（ＩｇＧ１）もしくは１３１（ＩｇＧ２およびＩｇＧ４）にシステイン残基を有せず、ならびに／または第１のＣＬ領域も第２のＣＬ領域もＥＵ位置２１４にシステイン残基を有しない。
[0020]一部の実施形態では、第１のＣＨ１領域は、ＥＵ位置ｎ５に第５のアミノ酸残基をさらに含み、第１のＣＬ領域は、ＥＵ位置ｎ６に第６のアミノ酸残基をさらに含み、ｎ５：ｎ６位置対は、ｎ５’：ｎ６’位置対と同一であり、ＥＵ位置ｎ５’の第５の対応するアミノ酸残基は、ＥＵ位置ｎ６の第６のアミノ酸残基と共有結合を形成せず、および／またはＥＵ位置ｎ６’の第６の対応するアミノ酸残基は、ＥＵ位置ｎ５の第５のアミノ酸残基と共有結合を形成しない。
[0021]一部の実施形態では、ＥＵ位置ｎ５の第５のアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ６の第６のアミノ酸残基は、共有結合を形成しない。
[0022]一部の実施形態では、第２のＣＨ１領域は、ＥＵ位置ｎ７’に第７の対応するアミノ酸残基をさらに含み、第２のＣＬ領域は、ＥＵ位置ｎ８’に第８の対応するアミノ酸残基をさらに含み、ｎ７’：ｎ８’位置対は、１８３：１７６、１４１：１１６、１２６：１２１および２１８：１２２からなる群から選択され、第７の対応するアミノ酸残基および第８の対応するアミノ酸残基は、反対に荷電し、ｎ７’：ｎ８’位置対は、ｎ３：ｎ４位置対とは異なる。
[0023]一部の実施形態では、ｎ７’：ｎ８’位置対は、１８３：１７６、１４１：１１６および１２６：１２１からなる群から選択される。
[0024]一部の実施形態では、ｎ７’：ｎ８’位置対は、１８３：１７６であり、ｎ３：ｎ４位置対は、１４１：１１６、１２６：１２１および２１８：１２２からなる群から選択される。一部の実施形態では、ｎ７’：ｎ８’位置対は、１４１：１１６であり、ｎ３：ｎ４位置対は、１８３：１７６、１２６：１２１および２１８：１２２からなる群から選択される。一部の実施形態では、ｎ７’：ｎ８’位置対は、１２６：１２１であり、ｎ３：ｎ４位置対は、１８３：１７６、１４１：１１６および２１８：１２２からなる群から選択される。一部の実施形態では、ｎ７’：ｎ８’位置対は、２１８：１２２であり、ｎ３：ｎ４位置対は、１８３：１７６、１４１：１１６および１２６：１２１からなる群から選択される。
[0025]一部の実施形態では、第１のＣＨ１領域は、ＥＵ位置ｎ７に第７のアミノ酸残基をさらに含み、第２のＣＬ領域は、ＥＵ位置ｎ８に第８のアミノ酸残基をさらに含み、ｎ７：ｎ８位置対は、ｎ７’：ｎ８’位置対と同一であり、ＥＵ位置ｎ７’の第７の対応するアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ８の第８のアミノ酸残基は、反対に荷電しないか、もしくは同様に荷電し、ならびに／またはＥＵ位置ｎ８’の第８の対応するアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ７の第７のアミノ酸残基は、反対に荷電しないか、もしくは同様に荷電する。
[0026]一部の実施形態では、ＥＵ位置ｎ７の第７のアミノ酸残基および／またはＥＵ位置ｎ８の第８のアミノ酸残基は、荷電しない。
[0027]本明細書では、共有結合は実質的に、第１のアミノ酸残基および第２のアミノ酸残基の間に形成されて、ポリペプチド複合体における第１のＣＨ１領域および第１のＣＬ領域を共有結合により連結する化学結合である。このような化学結合は、２つのシステイン残基間に形成されるジスルフィド結合であり得るが、このような化学結合が、異なる種類である可能性も有する。
[0028]一部の実施形態では、共有結合は、ジスルフィド結合である。
[0029]一部の実施形態では、ジスルフィド結合は、２つのシステイン残基間に形成される。
[0030]一部の実施形態では、ＥＵ位置ｎ１の第１のアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ２の第２のアミノ酸残基は、ともにシステイン残基であり、ならびに／またはＥＵ位置ｎ５’の第５の対応するアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ６’の第６の対応するアミノ酸残基は、ともにシステイン残基である。
[0031]一部の実施形態では、第１のＣＨ１領域は、Ｌ１２８Ｃ（ＥＵ位置ｎ１）の置換を含み、第１のＣＬ領域は、Ｆ１１８Ｃ（ＥＵ位置ｎ２）の置換を含む。このような実施形態の一部では、第２のＣＨ１領域は、Ｖ１７３Ｃ（ＥＵ位置ｎ５’）の置換を含み、第２のＣＬ領域は、カッパ軽鎖のＱ１６０Ｃ（ＥＵ位置ｎ６’）またはラムダ軽鎖のＥ１６０Ｃ（ＥＵ位置ｎ６’）の置換を含む。
[0032]一部の実施形態では、第１のＣＨ１領域は、Ｖ１７３Ｃ（ＥＵ位置ｎ１）の置換を含み、第１のＣＬ領域は、カッパ軽鎖のＱ１６０Ｃ（ＥＵ位置ｎ２）またはラムダ軽鎖のＥ１６０Ｃ（ＥＵ位置ｎ２）の置換を含む。このような実施形態の一部では、第２のＣＨ１領域は、Ｌ１２８Ｃ（ＥＵ位置ｎ５’）の置換を含み、第２のＣＬ領域は、Ｆ１１８Ｃ（ＥＵ位置ｎ６’）の置換を含む。
[0033]一部の実施形態では、ＥＵ位置ｎ３の第３のアミノ酸残基は、正荷電アミノ酸残基であり、ＥＵ位置ｎ４の第４のアミノ酸残基は、負荷電アミノ酸残基である。一部の実施形態では、ＥＵ位置ｎ３の第３のアミノ酸残基は、負荷電アミノ酸残基であり、ＥＵ位置ｎ４の第４のアミノ酸残基は、正荷電アミノ酸残基である。
[0034]一部の実施形態では、ＥＵ位置ｎ７’の第７の対応するアミノ酸残基は、正荷電アミノ酸残基であり、ＥＵ位置ｎ８’の第８の対応するアミノ酸残基は、負荷電アミノ酸残基である。一部の実施形態では、ＥＵ位置ｎ７’の第７の対応するアミノ酸残基は、負荷電アミノ酸残基であり、ＥＵ位置ｎ８’の第８の対応するアミノ酸残基は、正荷電アミノ酸残基である。
[0035]一部の実施形態では、正荷電アミノ酸残基は、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）およびアルギニン（Ｒ）からなる群から選択され、ならびに／または負荷電アミノ酸残基は、アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）からなる群から選択される。
[0036]一部の実施形態では、ＥＵ位置ｎ１の第１のアミノ酸残基、ＥＵ位置ｎ２の第２のアミノ酸残基、ＥＵ位置ｎ３の第３のアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ４の第４のアミノ酸残基の少なくとも１、２、３または４つは、置換により導入されている。
[0037]一部の実施形態では、ｎ３：ｎ４位置対の第３のアミノ酸残基および第４のアミノ酸残基は、Ｓ１８３Ｋ：Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１８３Ｋ：Ｓ１７６Ｅ、Ｓ１８３Ｒ：Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１８３Ｒ：Ｓ１７６Ｅ、Ｓ１８３Ｈ：Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１８３Ｈ：Ｓ１７６Ｅ、Ｓ１８３Ｄ：Ｓ１７６Ｋ、Ｓ１８３Ｄ：Ｓ１７６Ｒ、Ｓ１８３Ｄ：Ｓ１７６Ｈ、Ｓ１８３Ｅ：Ｓ１７６Ｋ、Ｓ１８３Ｅ：Ｓ１７６Ｒ、Ｓ１８３Ｅ：Ｓ１７６Ｈ、Ａ１４１Ｋ：Ｆ１１６Ｄ、Ａ１４１Ｋ：Ｆ１１６Ｅ、Ａ１４１Ｒ：Ｆ１１６Ｄ、Ａ１４１Ｒ：Ｆ１１６Ｅ、Ａ１４１Ｈ：Ｆ１１６Ｄ、Ａ１４１Ｈ：Ｆ１１６Ｅ、Ａ１４１Ｄ：Ｆ１１６Ｋ、Ａ１４１Ｄ：Ｆ１１６Ｒ、Ａ１４１Ｄ：Ｆ１１６Ｈ、Ａ１４１Ｅ：Ｆ１１６Ｋ、Ａ１４１Ｅ：Ｆ１１６Ｒ、Ａ１４１Ｅ：Ｆ１１６Ｈ、Ｆ１２６Ｋ：Ｓ１２１Ｄ、Ｆ１２６Ｋ：Ｓ１２１Ｅ、Ｆ１２６Ｒ：Ｓ１２１Ｄ、Ｆ１２６Ｒ：Ｓ１２１Ｅ、Ｆ１２６Ｈ：Ｓ１２１Ｄ、Ｆ１２６Ｈ：Ｓ１２１Ｅ、Ｆ１２６Ｄ：Ｓ１２１Ｋ、Ｆ１２６Ｄ：Ｓ１２１Ｒ、Ｆ１２６Ｄ：Ｓ１２１Ｈ、Ｆ１２６Ｅ：Ｓ１２１Ｋ、Ｆ１２６Ｅ：Ｓ１２１Ｒ、Ｆ１２６Ｅ：Ｓ１２１Ｈ、Ｋ２１８Ｄ：Ｄ１２２Ｋ、Ｋ２１８Ｄ：Ｄ１２２Ｈ、Ｋ２１８Ｄ：Ｄ１２２Ｒ、Ｋ２１８Ｅ：Ｄ１２２Ｋ、Ｋ２１８Ｅ：Ｄ１２２Ｈ、およびＫ２１８Ｅ：Ｄ１２２Ｒからなる群から選択される置換である。
[0038]一部の実施形態では、ＥＵ位置ｎ５’の第５の対応するアミノ酸残基、ＥＵ位置ｎ６’の第６の対応するアミノ酸残基、ＥＵ位置ｎ７’の第７の対応するアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ８’の第８の対応するアミノ酸残基の少なくとも１、２、３または４つは、置換により導入されている。
[0039]一部の実施形態では、ｎ７’：ｎ８’位置対の第７の対応するアミノ酸残基および第８の対応するアミノ酸残基は、Ｓ１８３Ｋ：Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１８３Ｋ：Ｓ１７６Ｅ、Ｓ１８３Ｒ：Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１８３Ｒ：Ｓ１７６Ｅ、Ｓ１８３Ｈ：Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１８３Ｈ：Ｓ１７６Ｅ、Ｓ１８３Ｄ：Ｓ１７６Ｋ、Ｓ１８３Ｄ：Ｓ１７６Ｒ、Ｓ１８３Ｄ：Ｓ１７６Ｈ、Ｓ１８３Ｅ：Ｓ１７６Ｋ、Ｓ１８３Ｅ：Ｓ１７６Ｒ、Ｓ１８３Ｅ：Ｓ１７６Ｈ、Ａ１４１Ｋ：Ｆ１１６Ｄ、Ａ１４１Ｋ：Ｆ１１６Ｅ、Ａ１４１Ｒ：Ｆ１１６Ｄ、Ａ１４１Ｒ：Ｆ１１６Ｅ、Ａ１４１Ｈ：Ｆ１１６Ｄ、Ａ１４１Ｈ：Ｆ１１６Ｅ、Ａ１４１Ｄ：Ｆ１１６Ｋ、Ａ１４１Ｄ：Ｆ１１６Ｒ、Ａ１４１Ｄ：Ｆ１１６Ｈ、Ａ１４１Ｅ：Ｆ１１６Ｋ、Ａ１４１Ｅ：Ｆ１１６Ｒ、Ａ１４１Ｅ：Ｆ１１６Ｈ、Ｆ１２６Ｋ：Ｓ１２１Ｄ、Ｆ１２６Ｋ：Ｓ１２１Ｅ、Ｆ１２６Ｒ：Ｓ１２１Ｄ、Ｆ１２６Ｒ：Ｓ１２１Ｅ、Ｆ１２６Ｈ：Ｓ１２１Ｄ、Ｆ１２６Ｈ：Ｓ１２１Ｅ、Ｆ１２６Ｄ：Ｓ１２１Ｋ、Ｆ１２６Ｄ：Ｓ１２１Ｒ、Ｆ１２６Ｄ：Ｓ１２１Ｈ、Ｆ１２６Ｅ：Ｓ１２１Ｋ、Ｆ１２６Ｅ：Ｓ１２１Ｒ、Ｆ１２６Ｅ：Ｓ１２１Ｈ、Ｋ２１８Ｄ：Ｄ１２２Ｋ、Ｋ２１８Ｄ：Ｄ１２２Ｈ、Ｋ２１８Ｄ：Ｄ１２２Ｒ、Ｋ２１８Ｅ：Ｄ１２２Ｋ、Ｋ２１８Ｅ：Ｄ１２２Ｈ、およびＫ２１８Ｅ：Ｄ１２２Ｒからなる群から選択される置換であり、ｎ７’：ｎ８’位置対は、ｎ３：ｎ４位置対とは異なる。
[0040]一部の実施形態では、第１の標的結合ドメインは、（ｎ１＋ｎ２）：（ｎ３＋ｎ４）位置における第１の置換の組合せを含み、および／または第２の標的結合ドメインは、（ｎ５’＋ｎ６’）：（ｎ７’＋ｎ８’）位置における第２の置換の組合せを含み、第１の置換の組合せおよび／または第２の置換の組合せは、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｋ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｄ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｋ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｅ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｒ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｄ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｒ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｅ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｈ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｄ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｈ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｅ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｄ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｋ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｄ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｒ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｄ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｈ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｅ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｋ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｅ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｒ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｅ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｈ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｋ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｄ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｋ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｅ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｒ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｄ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｒ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｅ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｈ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｄ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｈ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｅ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｋ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｒ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｈ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｋ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｒ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｈ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｋ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｄ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｋ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｅ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｒ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｄ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｒ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｅ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｈ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｄ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｈ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｅ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｋ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｒ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｈ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｋ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｒ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｈ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｋ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｄ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｋ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｅ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｒ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｄ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｒ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｅ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｈ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｄ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｈ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｅ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｄ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｋ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｄ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｒ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｄ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｈ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｅ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｋ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｅ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｒ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｅ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｈ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｋ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｄ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｋ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｅ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｒ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｄ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｒ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｅ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｈ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｄ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｈ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｅ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｋ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｒ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｈ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｋ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｒ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｈ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｋ２１８Ｄ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｄ１２２Ｋ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｋ２１８Ｄ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｄ１２２Ｈ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｋ２１８Ｄ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｄ１２２Ｒ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｋ２１８Ｅ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｄ１２２Ｋ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｋ２１８Ｅ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｄ１２２Ｈ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｋ２１８Ｅ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｄ１２２Ｒ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｋ２１８Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｄ１２２Ｋ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｋ２１８Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｄ１２２Ｈ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｋ２１８Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｄ１２２Ｒ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｋ２１８Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｄ１２２Ｋ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｋ２１８Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｄ１２２Ｈ）および（Ｖ１７３Ｃ＋Ｋ２１８Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｄ１２２Ｒ）からなる群から選択されるが、ただし、第１の置換の組合せおよび第２の置換の組合せの両方が選択される場合、ｎ５’：ｎ６’位置対は、ｎ１：ｎ２位置対とは異なり、ｎ７’：ｎ８’位置対は、ｎ３：ｎ４位置対とは異なる。
[0041]一部の実施形態では、第１の標的結合部分は、第１のＣＬ領域に動作可能に連結されている第１のポリペプチド断片を含み、第２の標的結合部分は、第２のＣＬ領域に動作可能に連結されている第２のポリペプチド断片を含み、第１のポリペプチド断片は、第２のポリペプチド断片とは異なるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、第１のポリペプチド断片または第２のポリペプチド断片のいずれかは、ポリペプチド複合体に存在しない。
[0042]一部の実施形態では、ポリペプチド複合体は、ＣＨ１領域およびＣＬ領域にそれぞれ動作可能に連結されている２つ以上のポリペプチド断片を含む融合タンパク質であり得る。一部の実施形態では、第１の標的結合部分は、第１のＣＨ１領域に動作可能に連結されている第３のポリペプチド断片をさらに含み、第２の標的結合部分は、第２のＣＨ１領域に動作可能に連結されている第４のポリペプチド断片を含む。一部の実施形態では、第３のポリペプチド断片は、第４のポリペプチド断片とは異なるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、第３のポリペプチド断片または第４のポリペプチド断片のいずれかは、ポリペプチド複合体に存在しない。
[0043]一部の実施形態では、第１のポリペプチド断片および第３のポリペプチド断片は、標的結合部位をそれぞれ含み、その標的分子に結合し得る。例えば、第１のポリペプチド断片および第３のポリペプチド断片は、同一の標的分子に結合するか、あるいは異なる標的分子に結合し得る。別の例では、第１のポリペプチド断片および第３のポリペプチド断片は、同一または異なるアミノ酸配列のいずれかを有し得る。一部の実施形態では、第１のポリペプチド断片または第３のポリペプチド断片のいずれかは、ポリペプチド複合体に存在しない。
[0044]同様に、第２のポリペプチド断片および第４のポリペプチド断片は、標的結合部位をそれぞれ含み、その標的分子に結合し得る。例えば、第２のポリペプチド断片および第４のポリペプチド断片は、同一の標的分子に結合するか、あるいは異なる標的分子に結合し得る。別の例では、第２のポリペプチド断片および第４のポリペプチド断片は、同一または異なるアミノ酸配列のいずれかを有し得る。一部の実施形態では、第２のポリペプチド断片または第４のポリペプチド断片のいずれかは、ポリペプチド複合体に存在しない。一部の実施形態では、４つのポリペプチド断片の１、２または３つは、ポリペプチド複合体に存在しない。
[0045]一部の実施形態では、第１のポリペプチド断片および第３のポリペプチド断片は、会合して第１の標的結合部位を形成し得る。同様に、第２のポリペプチド断片および第４のポリペプチド断片は、会合して第２の標的結合部位を形成し得る。一部の実施形態では、第１の標的結合部位および第２の標的結合部位は、同一の標的分子、または同一の標的分子上の異なる部分、または異なる標的分子に結合し得る。
[0046]一部の実施形態では、第１のポリペプチド断片および第３のポリペプチド断片は、第１の標的結合部位をそれぞれ含むか、もしくは相互に会合して第１の標的結合部位を形成し、ならびに／または第２のポリペプチド断片および第４のポリペプチド断片は、第２の標的結合部位をそれぞれ含むか、もしくは相互に会合して第２の標的結合部位を形成する。
[0047]一部の実施形態では、第１の標的結合部分は、第１の抗原結合部分であってもよく、および／または第２の標的結合部分は、第２の抗原結合部分であり得る。一部の実施形態では、抗原結合部分は、１つまたは複数の抗体断片に由来する。
[0048]一部の実施形態では、第１の抗原結合部分は、第１のＶＬ領域および第１のＶＨ領域を含んでもよく、これらは、会合して第１の抗原結合部位を形成する。一部の実施形態では、第２の抗原結合部分は、第２のＶＬ領域および第２のＶＨ領域を含んでもよく、これらは、会合して第２の抗原結合部位を形成する。第１の抗原結合部位および第２の抗原結合部位は、同一の抗原、または同一の抗原上の異なるエピトープ、または異なる抗原に結合し得る。
[0049]一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインおよび／または第２の抗原結合ドメインは、抗体、任意選択で、二特異性抗体または多特異性抗体内に含まれる。
[0050]一部の実施形態では、第２の抗原結合ドメインおよび第１の抗原結合ドメインは、異なる抗原に結合するか、または同一の抗原上の異なるエピトープに結合する。
[0051]一部の実施形態では、
（ａ）第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインの１つが、腫瘍関連抗原に結合し、その他が、免疫関連標的に結合するか、または
（ｂ）第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインの１つが、第１の腫瘍関連抗原に結合し、その他が、第２の腫瘍関連抗原に結合する。
[0052]一部の実施形態では、第１および／または第２の抗原結合ドメインは、キメラ、ヒト化または完全ヒト抗原結合ドメインである。
[0053]一部の実施形態では、第１および／または第２の抗原結合部分は、ナノボディ、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片、（ｄｓＦｖ）２、二特異性ｄｓＦｖおよびダイアボディからなる群から選択される。
[0054]一部の実施形態では、第１および／または第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂドメイン、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２からなる群から選択される。
[0055]一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインおよび／または第２の抗原結合ドメインは、ＣＨ１領域およびＣＬ領域に動作可能に連結されている１つまたは複数のＣＤＲを含む。
[0056]一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、第１のＦａｂドメインであり、および／または第２の抗原結合ドメインは、第２のＦａｂドメインである。
[0057]本明細書では、ポリペプチド複合体は、Ｆａｂドメインを有する抗体またはその断片であり得る。ポリペプチド複合体の例としては、単一特異性抗体、二特異性抗体、三官能性抗体、Ｆａｂ、ＦＡｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等が挙げられ得るが、本開示の範囲に制限されない。ポリペプチド複合体は、Ｆａｂドメイン／領域を含む他の任意の分子に拡大することができる。
[0058]一部の実施形態では、第２のＦａｂドメインは、
（ａ）第１のＦａｂドメインとは異なる１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲおよび／または軽鎖フレームワーク領域、ならびに任意選択で、
（ｂ）第１のＦａｂドメインとは異なる１つまたは複数の重鎖ＣＤＲおよび／または重鎖フレームワーク領域を含む。
[0059]一部の実施形態では、ポリペプチド複合体は、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインに動作可能に連結されているＦｃ領域をさらに含む。
[0060]一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはＩｇＤに由来する。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧに由来する。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に由来する。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１に由来する。
[0061]一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ヘテロ二量体である。
[0062]一部の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、ヘテロ二量体化を促進する１つまたは複数の変異を含む。
[0063]一部の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、第１のＦｃ変異を含む第１のＦｃポリペプチド、および／または第２のＦｃ変異を含む第２のＦｃポリペプチドを含み、
ａ）第１のＦｃ変異が、Ｔ３６６ＷもしくはＳ３５４Ｃを含み、第２のＦｃ変異が、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡもしくはＹ４０７Ｖを含むか、
ｂ）第１のＦｃ変異が、Ｄ３９９ＫもしくはＥ３５６Ｋを含み、第２のＦｃ変異が、Ｋ３９２ＤもしくはＫ４０９Ｄを含むか、
ｃ）第１のＦｃ変異が、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７ＫもしくはＤ３９９Ｋを含み、第２のＦｃ変異が、Ｋ３７０Ｅ、Ｋ４０９ＤもしくはＫ４３９Ｅを含むか、
ｄ）第１のＦｃ変異が、Ｓ３６４ＨもしくはＦ４０５Ａを含み、第２のＦｃ変異が、Ｙ３４９ＴもしくはＴ３９４Ｆを含むか、
ｅ）第１のＦｃ変異が、Ｓ３６４ＨもしくはＴ３９４Ｆを含み、第２のＦｃ変異が、Ｙ３９４ＴもしくはＦ４０５Ａを含むか、
ｆ）第１のＦｃ変異が、Ｋ３７０ＤもしくはＫ４０９Ｄを含み、第２のＦｃ変異が、Ｅ３５７ＫもしくはＤ３９９Ｋを含むか、または
ｇ）第１のＦｃ変異が、Ｌ３５１ＤもしくはＬ３６８Ｅを含み、第２のＦｃ変異が、Ｌ３５１ＫもしくはＴ３６６Ｋを含み、
付番は、ＥＵインデックスに従う。
[0064]別の態様では、本明細書において提供するポリペプチド複合体またはその部分をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を本開示により提供する。
[0065]別の態様では、本明細書において提供する核酸を含むベクターを本開示により提供する。
[0066]別の態様では、本明細書において提供する核酸または本明細書において提供するベクターを含む宿主細胞を本開示により提供する。
[0067]別の態様では、本明細書において提供するポリペプチド複合体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を本開示により提供する。
[0068]別の態様では、本明細書において提供するポリペプチド複合体およびそれにコンジュゲートするペイロードを含むコンジュゲートを本開示により提供し、このペイロードは、放射性標識、蛍光標識、酵素基質標識、親和性精製タグ、トレーサー分子、抗がん薬および細胞傷害性分子からなる群から選択される。
[0069]別の態様では、本明細書において提供するポリペプチド複合体または本明細書において提供するコンジュゲートおよび薬学的に許容される担体を含む組成物を本開示により提供する。
[0070]別の態様では、疾患、症状または症候を治療または予防する方法を本開示により提供する。方法は、本明細書において提供する治療有効量のポリペプチド複合体、本明細書において提供する医薬組成物、本明細書において提供するコンジュゲートまたは本明細書において提供する組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。
[0071]一部の実施形態では、疾患は、がん、炎症性疾患、感染性もしくは寄生性疾患、心血管疾患、神経障害、精神神経性症状、傷害、自己免疫疾患、代謝疾患、神経変性疾患または血液凝固障害からなる群から選択される。
[0072]別の態様では、抗原の含有が疑われる試料を、本明細書において提供するポリペプチド複合体と接触させるステップと、抗原およびポリペプチド複合体の間の複合体形成を判定するステップとを含む、抗原の存在またはレベルを検出する方法を本開示により提供する。
[0073]本発明の前述および他の特徴は、添付の図面を参照して進行するいくつかの実施形態の次の詳細な説明から、さらに明らかとなる。
[0074]図１は、ＤＩＣ００２（図１Ａ）、ＤＩＣ００７（図１Ｂ）およびＤＩＣ００１４（図１Ｃ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す。 [0075]図２は、ＤＩＣ００２（図２Ａ）、ＤＩＣ００７（図２Ｂ）およびＤＩＣ０１４（図２Ｃ）のＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果を示す。 図２は、ＤＩＣ００２（図２Ａ）、ＤＩＣ００７（図２Ｂ）およびＤＩＣ０１４（図２Ｃ）のＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果を示す。 図２は、ＤＩＣ００２（図２Ａ）、ＤＩＣ００７（図２Ｂ）およびＤＩＣ０１４（図２Ｃ）のＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果を示す。 [0076]図３は、インタクトＤＩＣ０１４（図３Ａ）および脱グリコシル化ＤＩＣ０１４（図３Ｂ）のＬＣ－ＭＳ結果を示す。 [0077]図４は、ＤＩＣ００３（図４Ａ）、ＤＩＣ００４（図４Ｂ）、ＤＩＣ００５（図４Ｃ）、ＤＩＣ００６（図４Ｄ）、ＤＩＣ００９（図４Ｅ）およびＤＩＣ０１０（図４Ｆ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す。 図４は、ＤＩＣ００３（図４Ａ）、ＤＩＣ００４（図４Ｂ）、ＤＩＣ００５（図４Ｃ）、ＤＩＣ００６（図４Ｄ）、ＤＩＣ００９（図４Ｅ）およびＤＩＣ０１０（図４Ｆ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す。 [0078]図５は、ＤＩＣ００３（図５Ａ）、ＤＩＣ００４（図５Ｂ）、ＤＩＣ００５（図５Ｃ）、ＤＩＣ００６（図５Ｄ）、ＤＩＣ００９（図５Ｅ）およびＤＩＣ０１０（図５Ｆ）のＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果を示す。 図５は、ＤＩＣ００３（図５Ａ）、ＤＩＣ００４（図５Ｂ）、ＤＩＣ００５（図５Ｃ）、ＤＩＣ００６（図５Ｄ）、ＤＩＣ００９（図５Ｅ）およびＤＩＣ０１０（図５Ｆ）のＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果を示す。 図５は、ＤＩＣ００３（図５Ａ）、ＤＩＣ００４（図５Ｂ）、ＤＩＣ００５（図５Ｃ）、ＤＩＣ００６（図５Ｄ）、ＤＩＣ００９（図５Ｅ）およびＤＩＣ０１０（図５Ｆ）のＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果を示す。 図５は、ＤＩＣ００３（図５Ａ）、ＤＩＣ００４（図５Ｂ）、ＤＩＣ００５（図５Ｃ）、ＤＩＣ００６（図５Ｄ）、ＤＩＣ００９（図５Ｅ）およびＤＩＣ０１０（図５Ｆ）のＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果を示す。 図５は、ＤＩＣ００３（図５Ａ）、ＤＩＣ００４（図５Ｂ）、ＤＩＣ００５（図５Ｃ）、ＤＩＣ００６（図５Ｄ）、ＤＩＣ００９（図５Ｅ）およびＤＩＣ０１０（図５Ｆ）のＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果を示す。 図５は、ＤＩＣ００３（図５Ａ）、ＤＩＣ００４（図５Ｂ）、ＤＩＣ００５（図５Ｃ）、ＤＩＣ００６（図５Ｄ）、ＤＩＣ００９（図５Ｅ）およびＤＩＣ０１０（図５Ｆ）のＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果を示す。 [0079]図６は、ＤＩＣ０１５（図６Ａ）およびＤＩＣ０１６（図６Ｂ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す。 [0080]図７は、ＤＩＣ０１５（図７Ａ）およびＤＩＣ０１６（図７Ｂ）のＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果を示す。 図７は、ＤＩＣ０１５（図７Ａ）およびＤＩＣ０１６（図７Ｂ）のＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果を示す。 [0081]図８は、インタクトＤＩＣ０１５（図８Ａ）および脱グリコシル化ＤＩＣ０１５（図８Ｂ）のＬＣ－ＭＳ結果を示す。 [0082]図９は、インタクトＤＩＣ０１６（図９Ａ）および脱グリコシル化ＤＩＣ０１６（図９Ｂ）のＬＣ－ＭＳ結果を示す。 [0083]図１０は、インタクトＤＩＣ００９（図１０Ａ）および脱グリコシル化ＤＩＣ００９（図１０Ｂ）のＬＣ－ＭＳ結果を示す。図１０Ｃは、図１０Ｂの部分的拡大を示す。 図１０は、インタクトＤＩＣ００９（図１０Ａ）および脱グリコシル化ＤＩＣ００９（図１０Ｂ）のＬＣ－ＭＳ結果を示す。図１０Ｃは、図１０Ｂの部分的拡大を示す。 [0084]図１１は、インタクトＤＩＣ０１０（図１１Ａ）および脱グリコシル化ＤＩＣ０１０（図１１Ｂ）のＬＣ－ＭＳ結果を示す。図１１Ｃは、図１１Ｂの部分的拡大を示す。 図１１は、インタクトＤＩＣ０１０（図１１Ａ）および脱グリコシル化ＤＩＣ０１０（図１１Ｂ）のＬＣ－ＭＳ結果を示す。図１１Ｃは、図１１Ｂの部分的拡大を示す。 [0085]図１２は、ＳＰＲアッセイにより測定した、ヒトＰＤ１（図１２Ａ）、ヒトＴＧＦβＲ２（図１２Ｂ）およびヒトＴＧＦβＲ３（図１２Ｃ）に対するＤＩＣ０１０の結合親和性を示す。 図１２は、ＳＰＲアッセイにより測定した、ヒトＰＤ１（図１２Ａ）、ヒトＴＧＦβＲ２（図１２Ｂ）およびヒトＴＧＦβＲ３（図１２Ｃ）に対するＤＩＣ０１０の結合親和性を示す。 [0086]図１３は、ヒトＰＤ１－ＭＣ３８同系マウスモデルに対する種々の投与量（０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）のＤＩＣ０１０の有効性を示す。 [0087]図１４は、ＣＨ－ＣＬ界面の結合面積解析を示す。 [0088]図１５は、ＣＨ１－ＶＨおよびＣＬ－ＶＬ界面の結合面積解析を示す。 [0089]図１６は、変異試験のために選択されたアミノ酸残基を示す。
[0090]本明細書において提供するものは、改変標的結合ドメインを有するポリペプチド複合体、および免疫グロブリン軽鎖－重鎖コグネート対合に対する高選択性を有するように改変した二特異性抗体を含む。
[0091]本発明の詳細な説明を提供する前に、次に留意し定義する。
[0092]本明細書において提供するすべての説明は、本開示において提供する本発明の種々の実施形態を例示することを単に意図する。したがって、考察する特定の修正は、本開示の範囲の制限として解釈されるべきではない。本開示の範囲から逸脱することなく種々の均等物、変更および修正が成され得ることが当業者に明らかとなり、このような均等な実施形態を本明細書に含むべきことが理解される。
[0093]特許出願、発行済みの特許、公表された論文または他の公表文献を含む本開示に引用するすべての参考文献は、その全体を参照により本明細書に組み込まれ、これらは、本明細書において提供する説明と関連して使用し得る方法を提供する目的のためのものである。本開示に明示的に定義した用語と類似するかまたは同一である１つまたは複数の公表文献において提示する任意の用語に関しては、あらゆる点において、本開示において明示的に提供する用語の定義が優先される。
[0094]使用するすべての技術的および科学的用語は、本開示において、他に明示的に定義しない限り、本開示が属する技術分野の当業者に通常理解されるものと同一の意味を有するものと一般に考える。
[0095]本明細書において、すなわち、本開示全体を通じて使用する場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」の冠詞は、他に特定しない限り「１つまたは複数」または「少なくとも１つ」を意味するものと解釈されるべきである。例として、「ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐｌｅｘ」は、１つのポリペプチド複合体または２つ以上のポリペプチド複合体を意味する。
[0096]本明細書において使用する場合、「ａｂｏｕｔ」、「ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ」、「ａｒｏｕｎｄ」（約／およそ）等の用語は、参照する量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量（ａｍｏｕｎｔ）、重量または長さに対して３０、２５、２０、２５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％の程度まで変動する量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量（ａｍｏｕｎｔ）、重量または長さを指す。特定の実施形態では、「ａｂｏｕｔ」または「ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ」の用語は、数値の前に付く場合、プラスマイナス１５％、１０％、５％または１％の範囲の値を示す。
[0097]本明細書において使用する場合、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、「ｃｏｎｔａｉｎ」、「ｃｏｎｔａｉｎｓ」、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」（含む）、「ｈａｖｅ」、「ｈａｓ」、「ｈａｖｉｎｇ」（有する）等の用語は、同義であり、無制限で包括的に使用し、さらなる要素、特徴、ステップ、作用、操作等は除外しない。
[0098]本明細書において使用する場合、「または」の用語は、使用する場合、例えば、要素のリストを関連づけるように包括的意味において使用し（排他的な意味ではなく）、「または」の用語は、リスト内の要素の１つ、一部またはすべてを意味する。
[0099]本明細書において使用する場合、「少なくとも１つ」の句は、１つまたは複数、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上を意味する。項目のリスト「の少なくとも１つ」を指す句は、単一のメンバーを含むこのような項目の任意の組合せを指すものと解釈される。例としては、「Ａ、ＢまたはＣの少なくとも１つ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡおよびＢ、ＡおよびＣ、ＢおよびＣ、ならびにＡ、ＢおよびＣを包含することを意図する。接続的言語、例えば、「Ｘ、ＹおよびＺの少なくとも１つ」の句は、他に詳細に述べない限り、一般に使用する文脈によって、項目、用語等がＸ、ＹまたはＺの少なくとも１つであり得ることを伝えるものとさもなければ理解される。したがって、このような接続的言語は、特定の実施形態が、存在するそれぞれに対してＸの少なくとも１つ、Ｙの少なくとも１つ、およびＺの少なくとも１つを必要とするという暗示を概して意図するものではない。
[00100]本明細書において使用する場合、「一実施形態」、「ある実施形態」、「ある特定の実施形態（ａ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態（ａ ｃｅｒｔａｉｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「追加の実施形態」、「一部の実施形態」、「特定の実施形態」もしくは「さらなる実施形態」またはそれらの組合せを参照する場合、この特定の実施形態と関連して記載するある特定の特徴、構造または特性が、本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味すると理解されるべきである。したがって、本開示を通じた種々の位置において前述の句が存在または出現する場合、必ずしもすべてが同一の実施形態を参照しているものではない。その上、特定の特徴、構造または特性は、１つまたは複数の実施形態において適するように任意で組み合わせ得る。
[00101]本明細書において使用する条件的言語、例えば、とりわけ「ｃａｎ」、「ｃｏｕｌｄ」、「ｍｉｇｈｔ」、「ｍａｙ」、「例えば、」等は、他に明示的に述べない限り、または使用する文脈において他に理解されない限り、他の実施形態では含まないが、特定の実施形態が特定の特徴、要素および／またはステップを含むことを伝えるものであることを概して意図する。したがって、このような条件的言語は、特徴、要素および／またはステップが１つまたは複数の実施形態に任意で必要とされるという暗示を概して意図するものではない。
Ｉ．用語法および定義
[00102]この節では、一部の一般用語の定義を提供する。他の用語の定義は、以下の本開示の他の節に見出すことができる。
[00103]本明細書において使用する場合および本開示の他の部分を通じても、「ポリペプチド」の用語は「ペプチド」、「タンパク質」等と互換的に使用し、アミノ酸残基のポリマーまたはアミノ酸残基の多重ポリマーのアセンブリを指すために使用する。この用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然には存在しないアミノ酸ポリマーの両方に適用し、１つまたは複数のアミノ酸残基が天然に存在する対応するアミノ酸の人工または合成化学ミメティックであるアミノ酸ポリマーをも包含するものと解釈される。「タンパク質」の用語は、大型のポリペプチドを典型的に指す。「ペプチド」の用語は、短いポリペプチドを典型的に指す。ポリペプチド配列は通常、ポリペプチド配列の左側の末端がアミノ末端（Ｎ末端）であり、ポリペプチド配列の右側の末端がカルボキシル末端（Ｃ末端）であるとして記載する。
[00104]本明細書において使用する場合、「ポリペプチド複合体」、「タンパク質複合体」等の用語は、相互に会合する１つまたは複数のポリペプチド／タンパク質サブユニットを含む複合体を指し、これは、特定の機能を果たすこと、例えば、特定の標的抗原に特異的に認識して結合することが可能である。
[00105]本明細書において使用する場合、「アミノ酸」の用語は、タンパク質、ペプチド、ポリペプチドまたはアミノ酸ポリマーの基本単位を指し、「アミノ酸」の用語はさらに、天然に存在するかまたは合成のアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様に機能する任意のアミノ酸類似体およびアミノ酸ミメティックを指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによりコードされるもの、ならびに後に修飾したアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、ガンマ－カルボキシグルタミン酸およびＯ－ホスホセリンである。本出願において使用する場合、天然に存在するアミノ酸は、アラニン（３文字コード：Ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）およびバリン（Ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシアルファ－アミノ酸の群を含む。本明細書では、「アミノ酸類似体」は、天然に存在するアミノ酸と同一の基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基に結合するアルファ炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は、修飾したＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾したペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同一の基本的化学構造を保持する。アルファ炭素は、官能基、例えば、カルボニルに結合する第１の炭素原子を指す。ベータ炭素は、アルファ炭素に連結された第２の炭素原子を指し、この系では、ギリシャ文字によりアルファベット順に原子の呼称は続く。本明細書では、「アミノ酸ミメティック」は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化合物を指す。
[00106]本明細書において使用する場合、「核酸」、「核酸分子」、「ヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」等の用語は、任意の長さのヌクレオチドポリマーを指すものと解釈され、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含んでもよく、一本鎖または二本鎖であり得る。本明細書では、核酸におけるヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾したヌクレオチド（例えば、メチル化ヌクレオチド）もしくは塩基またはそれらの類似体を含み得る。核酸またはポリヌクレオチドは典型的に、ＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼまたは合成反応を用いた重合により得る。本明細書では、この用語は、合成および／または天然には存在しない核酸分子（例えば、ヌクレオチド類似体または修飾した骨格残基もしくは連結を含む）をも指す。この用語は、天然ヌクレオチドの類似体を含む核酸を包含する。また、この用語は、合成骨格を有する核酸様構造を包含する。他に指示しない限り、ある特定のポリヌクレオチド配列は、保存的に修飾したそのバリアント（例えば、縮重コドン置換）、アレル、オルソログ、ＳＮＰおよび相補配列ならびに明示的に示す配列をも黙示的に包含する。詳細には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択した（またはすべての）コドンの３番目の位置を混合基および／またはデオキシイノシン残基と置換した配列を生成することにより達成し得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８（１９８５）；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ８：９１－９８（１９９４）を参照）。
[00107]「抗体」の用語は、本明細書において使用する場合、特定の抗原に結合する任意の免疫グロブリン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体、二特異性抗体、二価抗体または多価抗体を包含する。以下では、抗体の説明ならびにそれに関連する用語をより詳細に提供する。
[00108]哺乳動物、例えば、ヒトでは、免疫グロブリンに存在する種々の重鎖型に応じて、５つの異なる抗体クラス／アイソタイプ（すなわち、５つのＩｇ重鎖型α、δ、ε、γおよびμにそれぞれ対応するＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）が存在し、これらは典型的に、種々の分子および生物学的特性、官能基の位置、生理学的機能性および疾患における病理学的意味を有する。特定の抗体クラスは、サブクラスをさらに含み得る。例えば、ヒトでは、ＩｇＡは、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブクラスを含んでもよく、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４としてそれぞれ表す４つのサブクラスを含み得る。基本的機能単位としての免疫グロブリン単量体では、哺乳動物抗体は、単量体（例えば、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＧ）、二量体（ＩｇＡ）、四量体（ＩｇＭ）または五量体（ＩｇＭ）として存在し得る。哺乳動物では、２つの型の軽鎖が存在し、カッパ（κ）鎖およびラムダ（λ）鎖を含む。
[00109]天然または天然に存在する抗体、例えば、ＩｇＧは一般に、免疫グロブリン基本単位において、同一の２つの重（Ｈ）鎖および同一の２つの軽（Ｌ）鎖を含む。各軽鎖は、１つのジスルフィド共有結合、または各軽鎖および重鎖にそれぞれ存在する一対のシステイン残基間に形成される連結により重鎖に連結され、さらに２つの重鎖は、各重鎖のシステイン残基間に形成されるいくつかのジスルフィド結合により相互に連結される。このように形成された四量体は、抗体では、Ｙ字のような形を実質的にとり、分岐した各フォークアームの末端は、抗原の対応するエピトープと特異的に相互作用する同一の抗原結合部位（すなわち、パラトープ）を含む。
[00110]本明細書において使用する場合、「ドメイン」の用語は、ペプチドループを含む（例えば、３～４つのペプチドループを含む）１つまたは複数のポリペプチド鎖の１つまたは複数の領域により形成される球状構造を指し、これは、例えば、βプリーツシートおよび／または鎖内ジスルフィド結合（複数可）により安定化される。例としては、Ｆａｂドメインが挙げられ得る（より詳細には以下を参照）。本開示では、「ドメイン」および「領域」の２つの用語を互換的に使用し得ることに留意されたい。
[00111]より詳細には、天然抗体では、Ｎ末端からＣ末端方向において、各重鎖は、可変領域（ＶＨまたはＨＣＶＲ）の後、３または４つの定常領域（「ＣＨ」、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＧでは、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の３つのＣＨ領域を含み、ＩｇＥおよびＩｇＭでは、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４の４つのＣＨ領域を含む）を含み、各軽鎖は、可変領域（ＶＬまたはＬＣＶＲ）および定常領域（ＣＬ）を含む。Ｙ字型抗体では、各軽鎖の可変領域（すなわち、ＶＬ領域）は、対合する重鎖の可変領域（すなわち、ＶＨ領域）と並列するか、またはそれと会合して抗体の抗原結合部位をともに形成する。
[00112]「可変領域」または「ＶＲ」の用語は、本明細書において使用する場合、抗原結合を司る、抗体の重鎖または軽鎖における領域を意味する。天然抗体では、重鎖可変領域（ＶＨまたはＨＣＶＲ）は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの高度可変ループ、すなわち、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む重（Ｈ）鎖ＣＤＲを含み、軽鎖可変領域（ＶＬまたはＬＣＶＲ）は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む軽（Ｌ）鎖ＣＤＲを含む。抗体のＣＤＲ境界は、Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａまたはＡｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉの従来法により定義または同定し得る（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ，Ｂ．，Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３（４），９２７（１９９７）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｄｅｃ ５；１８６（３）：６５１－６３（１９８５）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９０１（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．Ｄｅｃ ２１－２８；３４２（６２５２）：８７７－８３（１９８９）；Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。３つのＣＤＲは、ＣＤＲよりも高度に保存され、超可変ループを支持する足場を形成する「フレームワーク領域」（ＦＲ）として知られる隣接する区間に挿入される。天然抗体では、各ＶＨおよびＶＬは、４つのＦＲを含み、ＣＤＲおよびＦＲは、アミノ末端からカルボキシル末端にＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で配列される。しかし、「可変領域」の用語は、本明細書において使用する場合、３つのＣＤＲのすべてまたは４つのＦＲのすべてを含む必要が必ずしもないものと理解されるべきであり、天然抗体の天然可変領域の任意のバリアントまたは誘導体が抗原結合活性を保持する限り、天然抗体の天然可変領域の任意のバリアントまたは誘導体を包含するものと解釈されるべきである。
[00113]ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関する「バリアント」の用語は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのあらゆる種類の種々の形態を包含し、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの断片、変異体、融合体、誘導体、ミメティックまたはそれらの任意の組合せを含むが、これらに制限されない。
[00114]ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関する「誘導体」の用語は、１つまたは複数の明確に定義された数の置換基が、ポリペプチドの１つもしくは複数の特定のアミノ酸残基またはポリヌクレオチドの１つもしくは複数の特定のヌクレオチドに共有結合している、化学的に修飾したポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指す。ポリペプチドに対する例となる化学修飾は、例えば、１つもしくは複数のアミノ酸のアルキル化、アシル化、エステル化、アミド化、リン酸化、グリコシル化、標識化、メチル化、または１つもしくは複数の部分とのコンジュゲーションであり得る。ポリヌクレオチドの例となる化学修飾は、（ａ）末端修飾、例えば、５’末端修飾または３’末端修飾、（ｂ）塩基の交換または除去を含む核酸塩基（または「塩基」）修飾、（ｃ）２’、３’および／または４’番目の位置における修飾を含む糖修飾、ならびに（ｄ）ホスホジエステル連結の修飾または交換を含む骨格修飾であり得る。
[00115]「定常領域」または「定常部分」の用語は、本明細書において使用する場合、抗原結合には直接関与しない、抗体の重鎖または軽鎖における領域を意味する。本明細書において使用する「定常領域」または「定常部分」の用語は、天然抗体の完全長の天然定常領域を含むことを必ずしも必要としないことが理解されるべきであり、このようなバリアントまたは誘導体が、例えば、抗原結合ドメインの安定性を支持するか、または意図する生物学的機能、例えば、エフェクター機能、分泌、経胎盤可動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合等を保持する能力を保つ限り、このような天然定常領域または定常部分の任意のバリアントまたは誘導体を包含するものと解釈されるべきである。
[00116]「ＣＬ領域」の用語は、ＶＬ領域に隣接する免疫グロブリン軽鎖の定常領域を指す。ＣＬ領域は、免疫グロブリン軽鎖においておよそＥＵ位置１０８からおよそＥＵ位置２１６に及び得る。天然抗体では、軽鎖の定常領域（すなわち、ＣＬ領域）は、対合する重鎖の第１の定常領域（すなわち、ＣＨ１領域）と会合する。
[00117]「ＣＨ１領域」の用語は、本明細書において使用する場合、免疫グロブリン重鎖の第１（アミノ最末端）の定常領域を包含し、これは、およそＥＵ位置１１８から少なくともおよそＥＵ位置２２０に及ぶ（例えば、ＥＵ位置２２１等に及び得る）。ＣＨ１領域は、ＶＨ領域に隣接し、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に対してアミノ末端である。
[00118]抗体に関する「ヒンジ領域」の用語は、ＣＨ１領域をＣＨ２領域に繋ぐ重鎖分子の部分を含む。ヒンジ領域の長さは、ＣＨ１領域およびＣＨ２領域の定義の境界に応じて異なり得る。ヒンジ領域は通常、可動性であり、したがって、２つのＮ末端抗原結合領域を独立的に移動させることが可能である。
[00119]「ＣＨ２領域」の用語は、本明細書において使用する場合、例えば、およそＥＵ位置２３１からＥＵ位置３４０に及ぶ重鎖免疫グロブリン分子の部分を指す。
[00120]「ＣＨ３領域」の用語は、本明細書において使用する場合、ＣＨ２ドメインのＮ末端からおよそ１１０残基、例えば、およそＥＵ位置３４１からＥＵ位置４４５、４４６または４４７に及ぶ重鎖免疫グロブリン分子の部分を指す。ＣＨ３ドメインは典型的に、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤのような抗体のＣ末端部分を形成する。しかし、ＩｇＥおよびＩｇＭのような一部の免疫グロブリンでは、さらなるドメインはＣＨ３ドメインから及んで、この分子のＣ末端部分を形成し得る（例えば、ＩｇＭのμ鎖およびＩｇＥのε鎖におけるＣＨ４ドメイン）。
[00121]本開示を通じて、抗体の定常領域におけるアミノ酸残基、例えば、定常部分における重鎖定常領域１（ＣＨ１）および軽鎖定常領域（ＣＬ）におけるアミノ酸残基の位置を示す数は、Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ，６３，７８－８５（１９６９）；およびＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）に記載のようにＥＵ付番システムまたはＥＵインデックスに基づく。また、ＥＵ付番は、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍのウェブサイトからアクセス可能なＩＭＧＴ科学チャートから利用可能である。
[00122]「Ｆａｂ」は、本明細書において使用する場合、抗体に由来する単一の抗原結合ドメインを指し、この場合、ドメインは、ペプチド結合ではない１つまたは複数の共有結合を介して単一の軽鎖断片と会合する単一の重鎖断片を有する。一部の実施形態では、Ｆａｂドメインにおける単一重鎖断片は、ＨＣＶＲおよびＣＨ１領域を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂドメインにおける単一軽鎖断片は、ＬＣＶＲおよびＣＬドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＨ１領域は、共有結合、例えば、ジスルフィド結合によりＨＣＶＲと会合する。天然抗体では、抗体の１つのアームに実質的に対応するＦａｂドメインは典型的に、対応する抗原を認識して結合する能力を保持する。
[00123]「Ｆｃ」は、本明細書において使用する場合、ＩｇＧの例では、ペプチド結合ではない１つまたは複数の共有結合、例えば、ジスルフィド結合を介して第２の重鎖の第２および第３の定常領域に結合する第１の重鎖の第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の定常領域からなる抗体に由来する部分を指す。抗体のＦｃ部分は、種々のエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）等を司るが、抗原結合においては機能しない。
[00124]「抗原」または「Ａｇ」は、本明細書において使用する場合、細胞培養物または動物における抗体の産生またはＴ細胞応答を刺激することが可能な化合物、組成物、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または物質（例えば、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質または天然に存在するかもしくは合成の他の化合物）を指し、細胞培養物（例えば、ハイブリドーマ）に加えるかまたは動物に注射もしくは吸収させる組成物（例えば、がん特異的タンパク質を含む組成物）を含む。抗原は、異種抗原により誘導されるものを含む特定の液性または細胞性免疫の産物（例えば、抗体）と反応する。抗原は、外因性抗原、内因性抗原、自己抗原、新生抗原、および特定の病原体または疾患と関連する抗原を含み得る。外因性抗原は、吸入、経口摂取または注射により体に進入し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）により、エンドサイトーシスまたはファゴサイトーシスによって提示され、ＭＨＣＩＩ複合体を形成し得る。内因性抗原は、細胞代謝、細胞内ウイルスまたは細菌感染の結果として正常細胞内で産生され、これは、ＭＨＣＩ複合体を形成し得る。自己抗原（例えば、ペプチド、ＤＮＡまたはＲＮＡ等）は、自己免疫疾患に罹患している患者の免疫系により認識されるが、正常な状態では、この抗原は免疫系の標的にはならないはずである。新生抗原は、正常な体にはまったく存在せず、ある特定の疾患、例えば、腫瘍またはがんにより産生される。特定の実施形態では、抗原は、ある特定の疾患（例えば、腫瘍またはがん、自己免疫疾患、感染性および寄生性疾患、心血管疾患、神経障害、精神神経性症状、傷害、炎症、血液凝固障害）と関連する。特定の実施形態では、抗原は、免疫系（例えば、免疫細胞、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ等）と関連する。
[00125]「エピトープ」は、結合物質（例えば、抗体）が結合する抗原の領域を指す。エピトープは、連続するアミノ酸（線状または連続エピトープとも呼ばれる）またはタンパク質の三次折畳みにより並置される非連続アミノ酸（立体配置または立体構造エピトープとも呼ばれる）の両方から形成され得る。連続アミノ酸から形成されるエピトープは典型的に、タンパク質上の主要なアミノ酸残基に沿って直線的に配列され、連続アミノ酸の小セグメントは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子との抗原結合から分解されるかまたは変性溶媒への曝露時に保持され得るが、三次折畳みにより形成されるエピトープは典型的に、変性溶媒による処理時に失われる。エピトープは典型的に、少なくとも３つまたはそれ以上、通常、少なくとも５、およそ７、またはおよそ８～１０個のアミノ酸をユニークな空間立体構造内に含む。
[00126]本明細書において使用する場合、「抗体断片」の用語は、完全長抗体の部分、一般には、抗原結合断片またはその可変領域を指す。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子、ならびに抗体断片から形成される多特異性抗体が挙げられ、すべてではないが、上に示すこのような抗体断片の定義のほとんどは、以下にさらに提供する。
[00127]本明細書において使用する場合、「抗原結合断片」等の用語は、１つもしくは複数のＣＤＲを含む抗体の部分から形成される抗体断片、または抗原に結合するがインタクトな天然抗体構造を含まない他の任意の抗体断片を指す。抗原結合断片の例としては、可変ドメイン、可変領域、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、多特異性抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体および二価ドメイン抗体等が挙げられ得るが、これらに制限されない。抗原結合断片は、親抗体が結合する同一の抗原に結合可能である。抗原結合断片は、１つまたは複数の異なるヒト抗体由来のフレームワーク領域に移植したある特定のヒト抗体由来の１つまたは複数のＣＤＲを含み得る。抗原結合部分のさらなる詳細なフォーマットは、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５（上記参照）およびＢｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ，９（２），ｐｐ．１８２－２１２（２０１７）に記載されており、これらは、全体の参照により本明細書に組み込まれる。
[00128]本明細書において使用する場合、「標的結合部分」の用語は、任意の種類の化学的または生物学的実体であり得る、標的分子に結合可能なタンパク質またはポリペプチド断片またはドメインを指す。例えば、標的分子は、低分子化合物または高分子、例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または核酸であり得る。標的分子は、疾患関連分子、例えば、腫瘍表面抗原、免疫チェックポイント分子、細胞表面受容体、感染病原体、サイトカイン、増殖因子等であり得る。当業者は、幅広い種類の目的の標的から容易に選択することができる。一部の実施形態では、本開示の標的結合部分は、抗原結合部分を含むか、または抗原結合部分である。
[00129]本明細書において使用する場合、「抗原結合部分」の用語は、抗原結合ドメインにおける抗原結合を司る部分を意味する。例えば、抗原結合部分は、１つまたは複数のＣＤＲを含み得るが、定常領域／定常部分は必ずしも含まない。抗原結合部分の例としては、可変ドメイン、可変領域、ナノボディ、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片、（ｄｓＦｖ）２、二特異性ｄｓＦｖまたはダイアボディが挙げられ得るが、これらに制限されない。
[00130]本明細書において使用する場合、「標的結合ドメイン」の用語は、標的結合部分ならびにＣＨ１領域およびＣＬ領域を含む定常部分を含むドメインを指す。例えば、標的結合ドメインは、標的結合部分および定常部分を含む融合タンパク質であり得る。一部の実施形態では、本開示の標的結合ドメインは、抗原結合ドメインを含むか、または抗原結合ドメインである。
[00131]本明細書において使用する場合、「抗原結合ドメイン」の用語は、抗原結合部分および定常部分を含む抗原結合断片を指す。抗原結合ドメインの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２が挙げられ得るが、これらに制限されない。
[00132]「Ｆｃａｂ」は、抗原結合部位をも含む改変Ｆｃ断片を指す。Ｆｃａｂは、断片として存在し得るか、またはＦｃ領域をスワップし、これにより二特異性またはさらには三特異性活性を有する抗体を得ることにより完全免疫グロブリンに挿入し得る。
[00133]抗体に関する「困難断片（Ｆｄ）」は、軽鎖と結合してＦａｂを形成することが可能な重鎖断片のアミノ末端半分を指す。
[00134]抗体に関する「Ｆｖ」は、完全抗原結合部位を有する抗体の最小断片を指す。Ｆｖ断片は、単一重鎖の可変ドメインに結合する単一軽鎖の可変ドメインからなる。多くのＦｖ設計が提供されており、２つのドメイン間の会合がジスルフィド結合の導入により増強されるｄｓＦｖ、および２つのドメインを単一ポリペプチドとして結合するペプチドリンカーを使用して形成可能なｓｃＦｖを含む。対応する免疫グロブリン重または軽鎖の可変および定常ドメインと会合する重または軽免疫グロブリン鎖の可変ドメインを含むＦｖ構築物も生成されている。また、Ｆｖは、多量体化して、ダイアボディおよびトリアボディを形成する（Ｍａｙｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ ２ ３３９－３７６（２０００））。
[00135]「ＣｒｏｓｓＭａｂ」は、非修飾軽鎖を対応する非修飾重鎖と対合させ、修飾軽鎖を対応する修飾重鎖と対合させ、これにより、軽鎖における誤対合が減少した抗体を生じさせる技術を指す。
[00136]「ＢｉＴＥ（登録商標）」は、ＨＣＶＲ－ＬＣＶＲ配向性の第２の特異性を有する第２のｓｃＦｖに連結されている、ＬＣＶＲ－ＨＣＶＲ配向性の第１の抗原特異性を有する第１のｓｃＦｖを含む二特異性Ｔ細胞結合分子である。
[00137]本明細書において使用する場合、「多特異性抗体」の用語は、少なくとも２つの異なるエピトープに同時に結合可能な人工または改変抗体を指す。二特異性抗体は実質的に、多特異性抗体の一種である。加えて、他の多特異性抗体としては、３つの異なる抗原結合特異性を有する三特異性抗体、４つの異なる抗原結合特異性を有する四特異性抗体等が挙げられ得る。
[00138]本明細書において使用する場合、「二特異性抗体」の用語は、抗原特異性において相互に異なる２つの物理的に分離可能な抗原結合部分／部位を含む抗体を指す。通常、二特異性抗体は、２つの異なるモノクローナル抗体に由来する断片を有し、２つの異なるエピトープに結合可能な人工抗体である。２つのエピトープは同一の抗原上に存在し得るか、またはこれらは２つの異なる抗原上に存在し得る。構造的に同一であり、このため同一の抗原特異性を有することは、２つの物理的に分離可能な抗原結合部分を有する天然に存在する抗体とは対照的である。本明細書に開示のヘテロ二量体抗体では、２つの異なるＦａｂドメイン（すなわち、第１のＦａｂドメインおよび第２のＦａｂドメイン）のそれぞれは、異なるエピトープに特異的に結合する異なる抗原結合部分を含み、典型的には、配列が相互で異なる免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）および免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。適切にコグネート対合して二特異性抗体を高度に選択的かつ効率的に得る確立を高める試みでは、軽鎖－重鎖のコグネート対合および重鎖－重鎖のコグネート対合を促進するためのいくつかの戦略が存在する。
[00139]「親和性」の用語は、本明細書において使用する場合、免疫グロブリン分子（すなわち、抗体）またはその断片および抗原の間の非共有相互作用の強度を指す。
ＩＩ．ポリペプチド複合体
[00140]本開示では、１つまたは複数の非ペプチド結合を介してそれぞれの重鎖（複数可）と会合する少なくとも２つの異なる軽鎖を含む構築物における軽鎖および重鎖の選択的対合（すなわち、コグネート対合）を促進するのに有用な新規のポリペプチド複合体を提供する。
[00141]一態様では、第１の定常部分に動作可能に連結されている第１の標的結合部分を含む第１の標的結合ドメインを含むポリペプチド複合体であって、第１の定常部分が、第１の軽鎖定常領域（ＣＬ）と会合している第１の重鎖定常領域１（ＣＨ１）を含み、第１のＣＨ１領域が、ＥＵ位置ｎ１に第１のアミノ酸残基を含み、第１のＣＬ領域が、ＥＵ位置ｎ２に第２のアミノ酸残基を含み、ｎ１：ｎ２位置対が、１２８：１１８および１７３：１６０からなる群から選択され、第１のアミノ酸残基および第２のアミノ酸残基が、共有結合を形成する、ポリペプチド複合体を本開示により提供する。
[00142]本明細書において使用する場合、「動作可能に連結する」または「動作可能に連結された」の用語は、目的の２つ以上の生物学的配列が意図的に機能することが可能な関係性にあるような、スペーサーまたはリンカー有り無しによる並置を指す。ポリペプチドに関して使用する場合、ポリペプチド配列が、連結された産物が意図する生物学的機能を有することが可能となるように連結されていることを意味することを意図する。例えば、標的結合部分は、抗原結合活性を有する安定な産物をもたらすように定常部分に動作可能に連結されていてもよい。この用語は、ポリヌクレオチドに関しても使用し得る。一例では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列等）に動作可能に連結されている場合、ポリヌクレオチド配列が、このポリヌクレオチド由来のポリペプチドの発現調節が可能となるように連結されていることを意味することを意図する。
[00143]特定の実施形態では、本明細書において使用するリンカーは、切断可能リンカー、非切断可能リンカー、ペプチドリンカー、可動性リンカー、リジッドリンカー、ヘリカルリンカーおよび非ヘリカルリンカーからなる群から選択される。当技術分野において公知の任意の適するリンカーを使用することができる。特定の実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーを含む。例えば、本開示において有用なリンカーは、グリシンおよびセリン残基が豊富であり得る。例としては、トレオニン／セリンおよびグリシンを含む単一または反復配列を有するリンカー、例えば、ＴＧＧＧＧ（配列番号２４）、ＧＧＧＧＳ（配列番号２５）もしくはＳＧＧＧＧ（配列番号２６）またはそのタンデム反復（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回またはそれ以上の反復）が挙げられる。特定の実施形態では、本開示において使用するリンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２７）を含む。あるいは、リンカーは、ＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧ（配列番号２８）のアミノ酸配列の１つまたは複数の連続またはタンデム反復を含むペプチド長鎖であり得る。特定の実施形態では、リンカーは、配列番号２８の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回またはそれ以上の連続またはタンデム反復を含む。特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、ＧＳリンカーを含む。特定の実施形態では、ＧＳリンカーは、ＧＧＧＳ（配列番号２９）または配列番号２５の１または複数回の反復を含む。特定の実施形態では、リンカーは、配列番号２４～２９のいずれか１つに対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそのアミノ酸配列からなる。
[00144]本明細書において使用する場合、数を後に伴う「ｎ」の文字は、本明細書において提供する第１の標的結合ドメインにおける所与のアミノ酸残基の位置を示す。例えば、「ｎ１」の位置は、第１の標的結合ドメインにおける第１の特定の位置を示し、「ｎ２」の位置は、第１の標的結合ドメインにおける第２の特定の位置を示す。抗体配列に関するすべての位置は、ＥＵ付番システムまたはＥＵインデックスに基づき、このため、この位置は、本明細書においてＥＵ位置と呼ぶこともある。この位置は、第１の標的結合ドメインの重鎖部分内または第１の標的結合ドメインの軽鎖部分内であり得る。例えば、この文脈によれば、ｎ１の位置は、第１のＣＨ１領域内であってもよく、ｎ２の位置は、第１のＣＬ領域内であり得る。
[00145]本明細書において使用する場合、「位置対」の用語は、抗体断片、例えば、標的結合ドメインにおける一対のＥＵ位置を意味する。位置対は本明細書において、コロン（：）により分離した２つの数を使用して表現する。例えば、１２８：１１８のｎ１：ｎ２位置対は、ｎ１がＥＵ位置１２８（例えば、第１のＣＨ１領域内の）であり、ｎ２がＥＵ位置１１８（例えば、第１のＣＬ領域内の）であることを意味する。
[00146]本明細書では、ＥＵ位置対１２８：１１８および１７３：１６０の１つに第１および第２のアミノ酸残基を構成して共有結合（例えば、ジスルフィド結合）を形成することにより、重鎖および軽鎖のコグネート対合に対する特異性を向上させることができる。天然抗体におけるこのようなＥＵ位置対のアミノ酸残基は、天然共有結合、例えば、ジスルフィド結合の形成には関与しない。したがって、本明細書において提供するポリペプチド複合体は、第１の標的結合ドメインと第２の標的結合ドメインとの誤対合を減少させるのに有用であり、このようなＥＵ位置対の共有結合形成に干渉しない可能性を有する。
[00147]本明細書において使用する場合、「ジスルフィド結合」は、構造Ｒ－Ｓ－Ｓ－Ｒ’による共有結合を指す。アミノ酸システインは、例えば、別のシステイン残基由来の第２のチオール基とジスルフィド結合を形成可能なチオール基を含む。ジスルフィド結合は、生理学的条件下で２つのポリペプチド鎖上にそれぞれ存在する２つのシステイン残基のチオール基間に形成することができ、これにより鎖間架橋または鎖間結合を形成して鎖間（ともに異なる鎖に由来する場合）または鎖内（ともに同一の鎖に由来する場合）ジスルフィド結合を形成する。抗体に関しては、「鎖間ジスルフィド結合」の用語は、免疫グロブリンヒンジ領域内のジスルフィド結合形成システイン対におけるシステイン残基のスルフヒドリル基間、またはそれぞれの定常領域の軽鎖および重鎖の間に形成されるジスルフィド結合を指す。本開示では、他に指示しない限り、「ジスルフィド結合」は、ＣＨ１およびＣＬ領域の免疫グロブリン重鎖および軽鎖の間にそれぞれ形成されるジスルフィド結合を指し、これは天然／天然に存在するジスルフィド結合（例えば、ＥＵ位置対２２０：２１４（ＩｇＧ１）もしくは１３１：２１４（ＩｇＧ２およびＩｇＧ４））またはＥＵ位置対１２８：１１８および／もしくは１７３：１６０のジスルフィド結合のいずれかであり得る。
[00148]一部の実施形態によれば、第１のアミノ酸残基および第２のアミノ酸残基の間に形成される共有結合はジスルフィド結合であり、さらに任意選択で、ジスルフィド結合は２つのシステイン残基間に形成される。換言すれば、ポリペプチド複合体のこの実施形態では、第１の標的結合ドメインにおける第１のＣＨ１および第１のＣＬ領域の間に形成される共有結合は、ＥＵ位置対１２８：１１８または１７３：１６０の２つのシステイン残基間に形成されるジスルフィド結合である。一実施形態では、第１および第２のアミノ酸残基の一方または両方は、第１のＣＨ１および第１のＣＬ領域内の上に指示した２つの位置対の１つにおけるＥＵ位置の対応する天然または野生型アミノ酸残基の、システイン残基との置換により導入する。例えば、ＥＵ位置ｎ１の第１のアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ２の第２のアミノ酸残基は、ともにシステイン残基である。より詳細には、このような置換は、（ｉ）Ｌ１２８Ｃ：Ｆ１１８Ｃまたは（ｉｉ）Ｖ１７３Ｃ：Ｑ１６０Ｃ（もしくはＥ１６０Ｃ）のいずれかであり得る。一部の実施形態では、第１のＣＨ１領域は、Ｌ１２８Ｃ（ＥＵ位置ｎ１）の置換を含み、第１のＣＬ領域は、Ｆ１１８Ｃ（ＥＵ位置ｎ２）の置換を含む。しかし、ジスルフィド結合の導入に加えて、共有結合も異なる種類の共有結合であり得ることに留意されたい。したがって例としては、リジンおよびアスパラギンもしくはアスパラギン酸の間に形成されるイソペプチド結合、または非天然アミノ酸（Ｕａａ）およびシステイン残基の間に形成される共有結合（Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３；１０（９）：ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２５９５）等が挙げられ得る。
[00149]本明細書において使用する場合、「ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ」、「ｉｎｔｒｏｄｕｃｅ」（導入する）等の単語は、より大型の実体または構造の原バージョンに存在しない要素または構造の状態を指し、変更、修飾または新たに加えた要素または構造として新バージョンにもたらされるものと解釈される。
[00150]「ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ」、「ｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ」（と会合している）等の用語は、ポリペプチド複合体（例えば、抗体またはその抗原結合断片）の２つの領域に関する場合、それらが意図的に機能することが可能な関係性にあるように、スペーサーまたはリンカー有り無しにより２つの領域が相互に動作可能に連結されている状況を指す。例えば、抗体の可変領域は、抗原結合活性を有する安定な産物をもたらすように定常領域が会合し得る。「ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ」、「ｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ」（と会合している）、「ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ」（に連結されている）、「ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｏ」（にカップリングする）、「ｆｕｓｅｄ ｔｏ」（に融合する）、「ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ ｔｏ」、「ｂｏｕｎｄ ｔｏ」（に結合する）は、本開示において互換的に使用し得る。
[00151]ポリペプチド複合体の好ましい一部の実施形態によれば、第１の標的結合ドメインは、第１の標的結合ドメインにおける天然ジスルフィド結合が破壊されるように、さらに修飾する（例えば、変異させる）。したがって一実施形態では、第１の標的結合ドメインは、重鎖のＥＵ位置２２０（ＩｇＧ１）もしくはＥＵ位置１３１（ＩｇＧ２およびＩｇＧ４）にシステイン残基の置換もしくは欠失を含み、ならびに／または軽鎖のＥＵ位置２１４にシステイン残基の別の置換もしくは欠失を含む。
[00152]本開示において使用する場合、ポリペプチド複合体は、標的結合ドメインを含む抗体または抗体の断片であり得る。ポリペプチド複合体の例としては、完全長抗体（例えば、単一特異性抗体、二特異性抗体、三重特異性抗体、二価抗体、多価抗体等）、その断片を含む抗原結合ドメイン（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等）、または抗体もしくはその断片を含むタンパク質複合体が挙げられ得るが、本開示の範囲に制限されない。また、ポリペプチド複合体は、このような分子が、上記の特徴を有する標的結合ドメイン／領域を含む限り、他の任意の種類の分子であり得る。
[00153]このような実施形態の一部では、第１のＣＨ１領域は、ＥＵ位置ｎ３に第３のアミノ酸残基をさらに含み、第１のＣＬ領域は、ＥＵ位置ｎ４に第４のアミノ酸残基をさらに含み、ｎ３：ｎ４位置対は、１８３：１７６、１４１：１１６および１２６：１２１からなる群から選択され、第３のアミノ酸残基および第４のアミノ酸残基は、非共有結合を形成する。
[00154]ｎ１：ｎ２位置対の残基間の共有結合およびｎ３：ｎ４位置対の非共有結合（例えば、静電相互作用）を組み合わせることにより、本明細書において提供するポリペプチド複合体が、軽鎖誤対合の減少および発現産物の純度の著しい向上において予想外に有利であることが、本発明者らにより予想外に見出される。このようなユニークな構築物は、製造が容易であるだけでなく、このような組合せを欠く比較可能な構築物よりもはるかに高い純度および収率をもたらす。
[00155]本明細書において使用する場合、「非共有結合」の用語は、タンパク質複合体における２つのペプチド鎖間の非共有相互作用を指す。非共有結合の例としては、水素結合、静電相互作用、塩橋もしくは疎水性－親水性相互作用、ノブと穴（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）、またはそれらの組合せが挙げられる。非共有結合および共有結合（例えば、ジスルフィド結合）はともに、一種の鎖間結合を形成し、これらは、任意のタンパク質、ポリペプチドまたはそれらの複合体の折畳み、立体構造、安定性、可動性および機能に有益である。
[00156]一部の実施形態では、非共有結合は、静電相互作用である。一部の実施形態では、第３のアミノ酸残基および第４のアミノ酸残基は、反対に荷電する。本明細書では、４つのＥＵ位置対１８３：１７６、１４１：１１６、１２６：１２１および２１８：１２２の１つまたは複数の第３のアミノ酸残基および第４のアミノ酸残基が反対に荷電するように構成することによって、反対に荷電したアミノ酸残基の各対間の１つまたは複数の相互作用が、各対間の１つまたは複数の非共有結合を形成し、次いで、本明細書に開示のポリペプチド複合体における重鎖および軽鎖の特定のコグネート対合を促進するように実質的に生成される。
[00157]本明細書において使用する場合、「静電相互作用」は、非共有結合であり、通常、イオン相互作用、水素結合およびハロゲン結合を含む。静電相互作用は、ポリペプチドにおいて、あるいはタンパク質複合体の種々のサブユニット／鎖間に、例えば、Ｌｙｓ（Ｋ）およびＡｓｐ（Ｄ）の間、Ｌｙｓ（Ｋ）およびＧｌｕ（Ｅ）の間、Ｇｌｕ（Ｅ）およびＡｒｇ（Ｒ）の間、または第１の鎖上のＧｌｕ（Ｅ）、Ｔｒｐ（Ｗ）および第２の鎖上のＡｒｇ（Ｒ）、Ｖａｌ（Ｖ）もしくはＴｈｒ（Ｔ）間に形成され得る。
[00158]「塩橋」は、Ａｓｐ（Ｄ）もしくはＧｌｕ（Ｅ）のいずれかのアニオン性カルボン酸およびＬｙｓ（Ｋ）に由来するカチオン性アンモニウムまたはＡｒｇ（Ｒ）のグアニジウムに主に起因する近距離静電相互作用であり、これらは、タンパク質またはポリペプチド構造における反対荷電残基の空間的に近位の対である。大部分が疎水性の界面における荷電および極性残基は、結合のホットスポットとして作用し得る。とりわけ、イオン化可能な側鎖を有する残基、例えば、Ｈｉｓ、ＴｙｒおよびＳｅｒも、塩橋の形成に関与し得る。
[00159]「ノブと穴」は、本明細書において使用する場合、２つのポリペプチド間の相互作用を指し、この場合、一方のポリペプチドは嵩高い側鎖を有するアミノ酸残基（例えば、チロシンまたはトリプトファン）の存在により隆起（すなわち、「ノブ」）を有し、他方のポリペプチドは、小型側鎖のアミノ酸残基（例えば、アラニンまたはトレオニン）が存在する空洞（すなわち、「ホール」）を有し、その隆起は、２つのポリペプチドの相互作用を促進してヘテロ二量体または複合体を形成するように空洞内に配置可能である。一般には、「ノブと穴」技術により、Ｆｃ領域内の２つのポリペプチドのそれぞれに変異を実質的に導入して重鎖－重鎖の組合せを制限する（Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９（７），ｐｐ．６１７－２１（１９９６）；Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６（７），ｐｐ．６７７－６８１（１９９８））。ノブと穴を有するポリペプチドを生成する方法は、当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号に記載されている。３つのＥＵ位置対１８３：１７６、１４１：１１６および１２６：１２１の１つまたは複数における反対に荷電した第３および第４のアミノ酸残基はノブと穴型の非共有相互作用を形成しないが、第１のＣＨ１および第１のＣＬ領域が、それを実現する他の導入残基（置換、挿入、修飾等）を含む可能性を有することに留意されたい。
[00160]本明細書において使用する場合、２つのアミノ酸残基に関する「反対に荷電」の用語は、２つのアミノ酸残基の両方が荷電し、生理学的ｐＨ（例えば、およそ７～７．５、好ましくは、７．４のｐＨ値）において、一方の残基は正荷電するが、他方は負荷電することを意味する。例えば、第１のアミノ酸残基は正荷電するが、第２のアミノ酸残基は負荷電するか、または第１のアミノ酸残基は負荷電するが、第２のアミノ酸残基は正荷電する場合がある。明確には、（ａ）一方のアミノ酸残基が荷電し、他方のアミノ酸残基が荷電せず、（ｂ）両方のアミノ酸残基が荷電せず、（ｃ）両方のアミノ酸残基が「同様に荷電」する、すなわち、一方のアミノ酸残基が正荷電し、他方のアミノ酸残基も正荷電するか、または一方のアミノ酸残基が負荷電し、他方のアミノ酸残基も負荷電する場合、２つのアミノ酸残基は、「反対に荷電」しない。
[00161]本明細書において使用する場合、「正荷電アミノ酸残基」または「正に荷電するアミノ酸残基」の用語は、生理学的条件下（例えば、およそ７～７．５、好ましくは、７．４のｐＨ）で正に荷電する側鎖を有するアミノ酸残基を指す。このような正荷電アミノ酸残基は典型的に、天然アミノ酸残基、例えば、リジン残基（Ｋ）、アルギニン残基（Ｒ）およびヒスチジン残基（Ｈ）であるが、これらは、生理学的条件下で正荷電を示す他のアミノ酸の類似体、ミメティック、修飾をも含み得る。
[00162]本明細書において使用する場合、「負荷電アミノ酸残基」または「負に荷電するアミノ酸残基」の用語は、生理学的条件下（例えば、およそ７～７．５、好ましくは、７．４のｐＨ）で負に荷電する側鎖を有するアミノ酸残基を指す。このような負荷電アミノ酸残基は典型的に、天然アミノ酸残基、例えば、アスパラギン酸残基（Ｄ）およびグルタミン酸残基（Ｅ）であるが、これらは、生理学的条件下で負荷電を示す他のアミノ酸の類似体、ミメティック、修飾をも含み得る。
[00163]一部の実施形態では、本明細書において提供するポリペプチド複合体は、第２の定常部分に動作可能に連結されている第２の標的結合部分を含む第２の標的結合ドメインをさらに含み、第２の定常部分は、第２のＣＬ領域と会合している第２のＣＨ１領域を含み、第１のＣＨ１領域は、第２のＣＬ領域に実質的に結合せず、第２のＣＨ１領域は、第１のＣＬ領域に実質的に結合しない。
[00164]「に実質的に結合しない」の用語は、本明細書において使用する場合、所与のＣＨ１領域および誤対合したＣＬ領域が、所与のＣＨ１領域およびその対合したＣＬ領域と比較して、相互に結合して結合複合体を形成する傾向が著しく少ないことを意味する。例えば、第１のＣＨ１領域は、第１のＣＬ領域と対となり、第２のＣＬ領域に実質的に結合せず、このような場合、第１のＣＨ１領域および第２のＣＬ領域は、相互に結合して結合複合体を形成する傾向が著しく少なく、例えば、第１のＣＨ１領域および第２のＣＬ領域の間の結合複合体の量は、第１のＣＨ１領域および第１のＣＬ領域の間の結合複合体の量よりもはるかに少ない（例えば、少なくとも３０％未満、少なくとも４０％未満、少なくとも５０％未満、少なくとも６０％未満、少なくとも７０％未満、少なくとも８０％未満）。一部の実施形態では、要素Ａが要素Ｂに実質的に結合しないとは、要素Ａが要素Ｂに共有結合しないことを意味する。例えば、一部の実施形態では、第１のＣＨ１領域は、第２のＣＬ領域に共有結合せず、第２のＣＨ１領域は、第１のＣＬ領域に共有結合しない。
[00165]一部の実施形態では、第２のＣＨ１領域は、ＥＵ位置ｎ１’に第１の対応するアミノ酸残基を含み、第２のＣＬ領域は、ＥＵ位置ｎ２’に第２の対応するアミノ酸残基を含み、ｎ１’：ｎ２’位置対は、ｎ１：ｎ２位置対と同一であり、ＥＵ位置ｎ１’の第１の対応するアミノ酸残基は、ＥＵ位置ｎ２の第２のアミノ酸残基と共有結合を形成せず、および／またはＥＵ位置ｎ２’の第２の対応するアミノ酸残基は、ＥＵ位置ｎ１の第１のアミノ酸残基と共有結合を形成しない。
[00166]いかなる理論にも拘束されないが、このような状況により、第１および第２の標的結合ドメインを形成するそれぞれの重鎖部分および軽鎖部分の交差結合が回避され、これによってそれらの誤対合が回避または減少すると考えられる。それにもかかわらず、第２の標的結合ドメインでは、ＥＵ位置ｎ１’の第１の対応するアミノ酸残基は、ＥＵ位置ｎ２’の第２の対応するアミノ酸残基と共有結合を形成し得ることに留意すべきである。例えば、ＥＵ位置ｎ１の第１のアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ２の第２のアミノ酸残基がジスルフィド結合を形成する場合、ＥＵ位置ｎ１’の第１の対応するアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ２’の第２の対応するアミノ酸残基は、ジスルフィド結合ではない共有結合を形成する可能性があり、ＥＵ位置ｎ１’およびｎ２’に非ジスルフィド結合を形成する第１および第２の対応するアミノ酸残基は、ＥＵ位置ｎ１およびｎ２にジスルフィド結合を形成する第１および第２のアミノ酸残基にそれぞれ結合しない。
[00167]本明細書において使用する場合、アポストロフィ（’）を有する数を後に伴う「ｎ」の文字は、本明細書において提供する第２の標的結合ドメイン内の所与のアミノ酸残基の位置を示し、この位置は、第１の標的結合ドメイン内の所与の位置に対応する。例えば、位置「ｎ１’」は、第１の標的結合ドメイン内の位置ｎ１に対応する、第２の標的結合ドメイン内の位置を示し、位置「ｎ２’」は、第１の標的結合ドメイン内の位置ｎ２に対応する、第２の標的結合ドメイン内の位置を示す。換言すれば、位置ｎ１が決定すると位置ｎ１’も決定し、逆もまた同様である。例えば、ＥＵ位置ｎ１が第１の標的結合ドメインの第１のＣＨ１領域内のＥＵ位置１２８であれば、ＥＵ位置ｎ１’は、第２の標的結合ドメインの第２のＣＨ１領域内のＥＵ位置１２８である。
[00168]第１の標的結合ドメイン内の相対物に対応する第２の標的結合ドメイン内のアミノ酸残基は、本明細書において「対応するアミノ酸残基」と呼ばれる。位置ｎ１が決定すると、位置ｎ１’が決定し、位置ｎ１の残基ならびに位置ｎ１’の対応するアミノ酸残基の両方が決定される。
[00169]一部の実施形態では、ＥＵ位置ｎ１’の第１の対応するアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ２’の第２の対応するアミノ酸残基は、共有結合を形成しない。このような実施形態では、第２の標的結合ドメインのＣＨ１領域およびＣＬ領域は、ＥＵ位置ｎ１’およびｎ２’における共有結合によっては相互に会合しない。例えば、ＥＵ位置ｎ１’およびｎ２’の第１および第２の対応するアミノ酸残基は、天然／野生型アミノ酸残基であり、例えば、Ｌ１２８：Ｆ１１８、Ｖ１７３：Ｑ１６０（またはＥ１６０）のアミノ酸対から選択される。別の例では、ＥＵ位置ｎ１’およびｎ２’の第１および第２の対応するアミノ酸残基は、共有結合を形成しない変異したアミノ酸残基である。
[00170]アミノ酸残基に関する「変異」または「変異した」の用語は、本明細書において使用する場合、アミノ酸残基の置換、交換、挿入、付加または修飾を指す。アミノ酸残基に関する「置換」または「置換した」の用語は、本明細書において使用する場合、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質における位置ｐのアミノ酸残基Ｘ（すなわち、交換前のアミノ酸残基、「Ｘ」）とアミノ酸残基Ｚ（すなわち、交換後のアミノ酸残基、「Ｚ」）との交換を指し、ＸｐＺにより表す。一例では、Ｓ１８３Ｋは、免疫グロブリン重鎖のＣＨ１領域のＥＵ位置１８３における元の天然セリン残基（Ｓ）がリジン残基（Ｋ）により置換されたことを表す。
[00171]一部の実施形態では、第２のＣＨ１領域は、ＥＵ位置ｎ３’に第３の対応するアミノ酸残基をさらに含み、第２のＣＬ領域は、ＥＵ位置ｎ４’に第４の対応するアミノ酸残基をさらに含み、ｎ３’：ｎ４’位置対は、ｎ３：ｎ４位置対と同一であり、ＥＵ位置ｎ４’の第４の対応するアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ３の第３のアミノ酸残基は、反対に荷電しないか、または同様に荷電する。
[00172]一部の実施形態では、第２のＣＨ１領域は、ＥＵ位置ｎ３’に第３の対応するアミノ酸残基をさらに含み、第２のＣＬ領域は、ＥＵ位置ｎ４’に第４の対応するアミノ酸残基をさらに含み、ｎ３’：ｎ４’位置対は、ｎ３：ｎ４位置対と同一であり、ＥＵ位置ｎ３’の第３の対応するアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ４の第４のアミノ酸残基は、反対に荷電しないか、または同様に荷電する。
[00173]本明細書では、第２の標的結合ドメインのＥＵ位置ｎ３’およびｎ４’における第３および第４の対応するアミノ酸残基は、第１の標的結合ドメインのＥＵ位置ｎ３およびｎ４における第３および第４のアミノ酸残基の静電相互作用に干渉しない。
[00174]一部の実施形態では、ＥＵ位置ｎ３’およびｎ４’の第３および第４の対応するアミノ酸残基は、天然／野生型アミノ酸残基であり、例えば、Ｓ１８３：Ｓ１７６、Ａ１４１：Ｆ１１６、Ｆ１２６：Ｓ１２１、Ｋ２１８：Ｄ１２２のアミノ酸対から選択される。一部の実施形態では、ＥＵ位置ｎ３’およびｎ４’の第３および第４の対応するアミノ酸残基の一方または両方は、第２の標的結合ドメインの重または軽鎖のＣＨ１またはＣＬ領域における変異したアミノ酸残基である。例えば、ＥＵ位置ｎ３’およびｎ４’における第３および第４の対応するアミノ酸残基の一方または両方は、第１の標的結合ドメインのＥＵ位置ｎ４およびｎ３における第４および第３のアミノ酸残基と同様にそれぞれ荷電する、変異したアミノ酸残基である。
[00175]一部の実施形態では、ＥＵ位置ｎ３’の第３の対応するアミノ酸残基および／またはＥＵ位置ｎ４’の第４の対応するアミノ酸残基は、荷電しない。例えば、第２の標的結合ドメインは、ＥＵ位置ｎ３’の第３の対応するアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ４’の第４の対応するアミノ酸残基の間の静電相互作用を有しない。
[00176]一部の実施形態では、第２のＣＨ１領域は、ＥＵ位置ｎ５’に第５の対応するアミノ酸残基をさらに含み、第２のＣＬ領域は、ＥＵ位置ｎ６’に第６の対応するアミノ酸残基をさらに含み、第５の対応するアミノ酸残基および第６の対応するアミノ酸残基が、共有結合を形成し、ｎ５’：ｎ６’位置対は、ｎ１：ｎ２位置対とは異なる。
[00177]本明細書では、第２のＣＨ１領域および第２のＣＬ領域はまた、共有結合により相互に会合するが、共有結合を形成するアミノ酸残基の位置は、第１の標的結合ドメインにおいて共有結合を形成するアミノ酸残基の位置とは異なる。例えば、ｎ５’：ｎ６’位置対およびｎ１：ｎ２位置対の両方は、２２０：２１４（ＩｇＧ１）、１３１：２１４（ＩｇＧ２およびＩｇＧ４）、１２８：１１８ならびに１７３：１６０からなる群から独立的に選択されるが、ただし、ｎ５’：ｎ６’位置対は、ｎ１：ｎ２位置対とは異なる。例えば、ｎ５’：ｎ６’位置対が２２０：２１４（ＩｇＧ１）または１３１：２１４（ＩｇＧ２およびＩｇＧ４）であれば、ｎ１：ｎ２位置対は、１２８：１１８または１７３：１６０である。別の例では、ｎ５’：ｎ６’位置対は１２８：１１８であり、ｎ１：ｎ２位置対は１７３：１６０である。また別の例では、ｎ５’：ｎ６’位置対は１７３：１６０であり、ｎ１：ｎ２位置対は１２８：１１８である。
[00178]一部の実施形態では、ＥＵ位置ｎ５’およびｎ６’の第５および第６の対応するアミノ酸残基は、天然／野生型アミノ酸残基であり、例えば、Ｃ２２０：Ｃ２１４（ＩｇＧ１）、Ｃ１３１：Ｃ２１４（ＩｇＧ２およびＩｇＧ４）、Ｌ１２８：Ｆ１１８、Ｖ１７３：Ｑ１６０（またはＥ１６０）のアミノ酸残基から選択されるが、ただし、ｎ５’：ｎ６’位置対は、ｎ１：ｎ２位置対とは異なる。一部の実施形態では、ＥＵ位置ｎ５’の第５の対応するアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ６’の第６の対応するアミノ酸残基は、ともにシステイン残基である。例えば、第２のＣＨ１領域は、Ｌ１２８Ｃ（ＥＵ位置ｎ５’）の置換を含み、第２のＣＬ領域は、Ｆ１１８Ｃ（ＥＵ位置ｎ６’）の置換を含む。別の例では、第２のＣＨ１領域は、Ｖ１７３Ｃ（ＥＵ位置ｎ５’）の置換を含み、第２のＣＬ領域は、カッパ軽鎖のＱ１６０Ｃ（ＥＵ位置ｎ６’）またはラムダ軽鎖のＥ１６０Ｃ（ＥＵ位置ｎ６’）の置換を含む。
[00179]一部の実施形態では、ＥＵ位置ｎ５’およびｎ６’の第５および第６の対応するアミノ酸残基の一方または両方は、第２の標的結合ドメインの重または軽鎖のＣＨ１領域またはＣＬ領域における変異したアミノ酸残基である。例えば、ＥＵ位置ｎ５’およびｎ６’の第５および第６の対応するアミノ酸残基の一方または両方は、共有結合を形成する変異したアミノ酸残基であるが、ただし、ｎ５’：ｎ６’位置対は、ｎ１：ｎ２位置対とは異なる。
[00180]当技術分野において公知のように、天然／野生型ジスルフィド結合は、重鎖のＥＵ位置２２０（ＩｇＧ１）または１３１（ＩｇＧ２およびＩｇＧ４）のシステインと軽鎖のＥＵ位置２１４のシステインとの間に形成される。一部の実施形態では、第１のＣＨ１領域および第２のＣＨ１領域の少なくとも１つは、ＥＵ位置２２０（ＩｇＧ１）もしくは１３１（ＩｇＧ２およびＩｇＧ４）にシステイン以外のアミノ酸残基を有し、ならびに／または第１のＣＬ領域および第２のＣＬ領域の少なくとも１つは、ＥＵ位置２１４にシステイン以外のアミノ酸残基を有する。そのようにすることにより、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインの少なくとも１つにおける天然／野生型ジスルフィド結合は破壊される。例えば、第１のＣＨ１領域は、ＥＵ位置２２０（ＩｇＧ１）または１３１（ＩｇＧ２およびＩｇＧ４）にシステイン以外のアミノ酸残基を有し、第１のＣＬ領域は、ＥＵ位置２１４にシステイン以外のアミノ酸残基を有する。別の例では、第２のＣＨ１領域は、ＥＵ位置２２０（ＩｇＧ１）または１３１（ＩｇＧ２およびＩｇＧ４）にシステイン以外のアミノ酸残基を有し、第２のＣＬ領域は、ＥＵ位置２１４にシステイン以外のアミノ酸残基を有する。
[00181]本明細書では、それぞれのＣＬおよびＣＨ１領域の免疫グロブリン軽および重鎖間に共有結合（例えば、ジスルフィド結合）および１つまたは複数の非共有結合を構成し、さらに好ましくは、天然ジスルフィド結合を同時に破壊することにより、ポリペプチド複合体における軽および重鎖に対する対合の正確性および特異性を最大化し、次いでこれにより、以下により詳細に記載する二特異性活性を有するヘテロ二量体抗体またはその抗原結合断片の生成がさらに増加し得る。
[00182]上記の好ましい実施形態では、同一ドメイン（すなわち、第１の標的結合ドメイン）のＥＵ位置対２２０：２１４（ＩｇＧ１）または１３１：２１４（ＩｇＧ２およびＩｇＧ４）における天然ジスルフィド結合を同時に破壊することにより、位置２２０（ＩｇＧ１）もしくは１３１（ＩｇＧ２およびＩｇＧ４）または２１４における任意の天然システイン残基による導入システイン残基のいずれかに対する潜在的干渉が減少または除去可能であり、これにより、コグネート対合の正確性および特異性がさらに向上可能であることにさらに留意されたい。
[00183]一部の実施形態では、第１のＣＨ１領域も第２のＣＨ１領域もＥＵ位置２２０（ＩｇＧ１）もしくは１３１（ＩｇＧ２およびＩｇＧ４）にシステイン残基を有せず、ならびに／または第１のＣＬ領域も第２のＣＬ領域もＥＵ位置２１４にシステイン残基を有しない。そのようにすることにより、第１の標的結合ドメインおよび第２の標的結合ドメインの両方における天然／野生型ジスルフィド結合が破壊される。
[00184]一部の実施形態では、第１のＣＨ１領域は、ＥＵ位置ｎ５に第５のアミノ酸残基をさらに含み、第１のＣＬ領域は、ＥＵ位置ｎ６に第６のアミノ酸残基をさらに含み、ｎ５：ｎ６位置対は、ｎ５’：ｎ６’位置対と同一であり、ＥＵ位置ｎ５’の第５の対応するアミノ酸残基は、ＥＵ位置ｎ６の第６のアミノ酸残基と共有結合を形成せず、および／またはＥＵ位置ｎ６’の第６の対応するアミノ酸残基は、ＥＵ位置ｎ５の第５のアミノ酸残基と共有結合を形成しない。いかなる理論にも拘束されないが、このような状況により、第１および第２の標的結合ドメインを形成するそれぞれの重鎖部分および軽鎖部分の交差結合が回避され、これによってそれらの誤対合が回避または減少すると考えられる。それにもかかわらず、第１の標的結合ドメインでは、ＥＵ位置ｎ５の第５のアミノ酸残基は、ＥＵ位置ｎ６の第６のアミノ酸残基と共有結合を形成し得ることに留意すべきである。例えば、ＥＵ位置ｎ５’の第５の対応するアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ６’の第６の対応するアミノ酸残基がジスルフィド結合を形成する場合、ＥＵ位置ｎ５の第５のアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ６の第６のアミノ酸残基は、ジスルフィド結合ではない共有結合を形成する可能性があり、ＥＵ位置ｎ５およびｎ６に非ジスルフィド結合を形成する第５および第６のアミノ酸残基は、ＥＵ位置ｎ５’およびｎ６’にジスルフィド結合を形成する第５および第６の対応するアミノ酸残基にそれぞれ結合しない。
[00185]一部の実施形態では、ＥＵ位置ｎ５の第５のアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ６の第６のアミノ酸残基は、共有結合を形成しない。このような実施計多では、第１の標的結合ドメインのＣＨ１領域およびＣＬ領域は、ＥＵ位置ｎ５およびｎ６において共有結合によっては相互に会合しない。例えば、ＥＵ位置ｎ５およびｎ６の第５および第６のアミノ酸残基は、天然／野生型アミノ酸残基であり、例えば、Ｌ１２８：Ｆ１１８、Ｖ１７３：Ｑ１６０（またはＥ１６０）のアミノ酸対から選択される。別の例では、ＥＵ位置ｎ５およびｎ６の第５および第６のアミノ酸残基は、共有結合を形成しない変異したアミノ酸残基である。
[00186]一部の実施形態では、第２のＣＨ１領域は、ＥＵ位置ｎ７’に第７の対応するアミノ酸残基をさらに含み、第２のＣＬ領域は、ＥＵ位置ｎ８’に第８の対応するアミノ酸残基をさらに含み、ｎ７’：ｎ８’位置対は、１８３：１７６、１４１：１１６、１２６：１２１および２１８：１２２からなる群から選択され、第７の対応するアミノ酸残基および第８の対応するアミノ酸残基は、反対に荷電し、ｎ７’：ｎ８’位置対は、ｎ３：ｎ４位置対とは異なる。
[00187]本明細書では、第２のＣＨ１領域および第２のＣＬ領域はまた、静電相互作用により相互に会合するが、静電相互作用を形成するアミノ酸残基の位置は、第１の標的結合ドメインにおいて静電相互作用を形成するアミノ酸残基の位置とは異なる。例えば、ｎ７’：ｎ８’位置対およびｎ３：ｎ４位置対の両方は、１８３：１７６、１４１：１１６、１２６：１２１および２１８：１２２からなる群から独立的に選択されるが、ただし、ｎ７’：ｎ８’位置対は、ｎ３：ｎ４位置対とは異なる。一部の実施形態では、ｎ７’：ｎ８’位置対およびｎ３：ｎ４位置対の両方は、１８３：１７６、１４１：１１６および１２６：１２１からなる群から独立的に選択されるが、ただし、ｎ７’：ｎ８’位置対は、ｎ３：ｎ４位置対とは異なる。一部の実施形態では、ｎ７’：ｎ８’位置対は、１８３：１７６、１４１：１１６および１２６：１２１からなる群から選択される。例えば、ｎ７’：ｎ８’位置対は、１８３：１７６であり、ｎ３：ｎ４位置対は、１４１：１１６、１２６：１２１および２１８：１２２からなる群から選択される。別の例では、ｎ７’：ｎ８’位置対は、１４１：１１６であり、ｎ３：ｎ４位置対は、１８３：１７６、１２６：１２１および２１８：１２２からなる群から選択される。また別の例では、ｎ７’：ｎ８’位置対は、１２６：１２１であり、ｎ３：ｎ４位置対は、１８３：１７６、１４１：１１６および２１８：１２２からなる群から選択される。また別の例では、ｎ７’：ｎ８’位置対は、２１８：１２２であり、ｎ３：ｎ４位置対は、１８３：１７６、１４１：１１６および１２６：１２１からなる群から選択される。
[00188]一部の実施形態では、ＥＵ位置ｎ７’およびｎ８’の第７および第８の対応するアミノ酸残基は、天然／野生型アミノ酸残基であり、例えば、Ｓ１８３：Ｓ１７６、Ａ１４１：Ｆ１１６、Ｆ１２６：Ｓ１２１およびＫ２１８：Ｄ１２２のアミノ酸対から選択されるが、ただし、ｎ７’：ｎ８’位置対は、ｎ３：ｎ４位置対とは異なる。一部の実施形態では、ＥＵ位置ｎ７’およびｎ８’の第７および第８の対応するアミノ酸残基の一方または両方は、第２の標的結合ドメインの重または軽鎖のＣＨ１またはＣＬ領域における変異したアミノ酸残基である。例えば、ＥＵ位置ｎ７’およびｎ８’の第７および第８の対応するアミノ酸残基の一方または両方は、反対に荷電する変異したアミノ酸残基であるが、ただし、ｎ７’：ｎ８’位置対は、ｎ３：ｎ４位置対とは異なる。
[00189]一部の実施形態では、第１のＣＨ１領域は、ＥＵ位置ｎ７に第７のアミノ酸残基をさらに含み、第２のＣＬ領域は、ＥＵ位置ｎ８に第８のアミノ酸残基をさらに含み、ｎ７：ｎ８位置対は、ｎ７’：ｎ８’位置対と同一であり、ＥＵ位置ｎ７’の第７の対応するアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ８の第８のアミノ酸残基は、反対に荷電しないか、もしくは同様に荷電し、ならびに／またはＥＵ位置ｎ８’の第８の対応するアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ７の第７のアミノ酸残基は、反対に荷電しないか、もしくは同様に荷電する。
[00190]本明細書では、第１の標的結合ドメインのＥＵ位置ｎ７およびｎ８における第７および第８のアミノ酸残基は、第２の標的結合ドメインのＥＵ位置ｎ７’およびｎ８’における第７および第８の対応するアミノ酸残基の静電相互作用に干渉しない。
[00191]一部の実施形態では、ＥＵ位置ｎ７およびｎ８の第７および第８のアミノ酸残基は、天然／野生型アミノ酸残基であり、例えば、Ｓ１８３：Ｓ１７６、Ａ１４１：Ｆ１１６、Ｆ１２６：Ｓ１２１およびＫ２１８：Ｄ１２２のアミノ酸対から選択される。一部の実施形態では、ＥＵ位置ｎ７およびｎ８の第７および第８のアミノ酸残基の一方または両方は、第２の標的結合ドメインの重または軽鎖のＣＨ１またはＣＬ領域における変異したアミノ酸残基である。例えば、ＥＵ位置ｎ７およびｎ８における第７および第８のアミノ酸残基の一方または両方は、第２の標的結合ドメインのＥＵ位置ｎ８’およびｎ７’における第８および第７の対応するアミノ酸残基と同様に荷電する変異したアミノ酸残基である。
[00192]一部の実施形態では、ＥＵ位置ｎ７の第７のアミノ酸残基および／またはＥＵ位置ｎ８の第８のアミノ酸残基は、荷電しない。例えば、第１の標的結合ドメインは、ＥＵ位置ｎ７の第７のアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ８の第８のアミノ酸残基の間に静電相互作用を有しない。
[00193]一部の実施形態では、ＥＵ位置ｎ１の第１のアミノ酸残基、ＥＵ位置ｎ２の第２のアミノ酸残基、ＥＵ位置ｎ３の第３のアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ４の第４のアミノ酸残基の少なくとも１、２、３または４つは、置換により導入されている。
[00194]本明細書では、第１、第２、第３および第４の導入アミノ酸残基のそれぞれは、天然／野生型バージョンのアミノ酸には存在しないアミノ酸残基であってもよく、したがって、免疫グロブリンの第１のＣＨ１または第１のＣＬ領域における上に示すＥＵ位置（すなわち、第１および第２の導入アミノ酸残基では１２８：１１８および１７３：１６０ならびに第３および第４の導入アミノ酸残基では１８３：１７６、１４１：１１６、１２６：１２１および２１８：１２２）のいずれかに「導入」する。そのような任意の導入アミノ酸残基は、野生型残基を交換する置換したアミノ酸であり得るか、または野生型ポリペプチドには存在しない新たに付加／挿入した残基であり得るか、または修飾残基もしくは人工残基であり得る。
[00195]他の一部の実施形態では、ＥＵ位置ｎ１の第１のアミノ酸残基、ＥＵ位置ｎ２の第２のアミノ酸残基、ＥＵ位置ｎ３の第３のアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ４の第４のアミノ酸残基の少なくとも１、２、３または４つは、置換（複数可）ではなくＥＵ位置ｎ１、ｎ２、ｎ３および／またはｎ４に新たに挿入／付加したアミノ酸残基（複数可）であり得る。
[00196]一部のまた他の実施形態では、ＥＵ位置ｎ３およびｎ４の第３および第４のアミノ酸残基の一方または両方は、非天然アミノ酸類似体（複数可）もしくはミメティック（複数可）または正もしくは負に荷電する化学的に修飾したアミノ酸残基（複数可）であり得る。
[00197]特定の実施形態では、ＥＵ位置対１８３：１７６、１４１：１１６、１２６：１２１および２１８：１２２に２対以上の反対に荷電する第３および第４のアミノ酸残基が存在し得る。一例では、ポリペプチド複合体は、ＥＵ位置対１８３：１７６および１４１：１１６の両方の２つのアミノ酸残基対のそれぞれを変異（例えば、置換、挿入または修飾）させて反対に荷電するように構成し得る。別の例では、ＥＵ位置対１８３：１７６、１４１：１１６、１２６：１２１および２１８：１２２の４つのアミノ酸残基対のすべてを変異（例えば、置換、挿入または修飾）させて反対に荷電させる。
[00198]したがって、ＥＵ位置対１８３：１７６、１４１：１１６、１２６：１２１および２１８：１２２から選択されるそれぞれのｎ３：ｎ４対では、２つの代替スキームを適用することができる。第１のスキームでは、ＥＵ位置ｎ３の第３のアミノ酸残基は、正荷電アミノ酸残基、例えば、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）であり、ＥＵ位置ｎ４の第４のアミノ酸残基は、負荷電アミノ酸残基、例えば、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）である。第２のスキームでは、ＥＵ位置ｎ３の第３のアミノ酸残基は、負荷電アミノ酸残基、例えば、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）であり、ＥＵ位置ｎ４の第４のアミノ酸残基は、正荷電アミノ酸残基、例えば、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）である。
[00199]上の２つのスキームにおける組合せのすべてを要約すると、ｎ３：ｎ４位置対の第３のアミノ酸残基および第４のアミノ酸残基は、Ｓ１８３Ｋ：Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１８３Ｋ：Ｓ１７６Ｅ、Ｓ１８３Ｒ：Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１８３Ｒ：Ｓ１７６Ｅ、Ｓ１８３Ｈ：Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１８３Ｈ：Ｓ１７６Ｅ、Ｓ１８３Ｄ：Ｓ１７６Ｋ、Ｓ１８３Ｄ：Ｓ１７６Ｒ、Ｓ１８３Ｄ：Ｓ１７６Ｈ、Ｓ１８３Ｅ：Ｓ１７６Ｋ、Ｓ１８３Ｅ：Ｓ１７６Ｒ、Ｓ１８３Ｅ：Ｓ１７６Ｈ、Ａ１４１Ｋ：Ｆ１１６Ｄ、Ａ１４１Ｋ：Ｆ１１６Ｅ、Ａ１４１Ｒ：Ｆ１１６Ｄ、Ａ１４１Ｒ：Ｆ１１６Ｅ、Ａ１４１Ｈ：Ｆ１１６Ｄ、Ａ１４１Ｈ：Ｆ１１６Ｅ、Ａ１４１Ｄ：Ｆ１１６Ｋ、Ａ１４１Ｄ：Ｆ１１６Ｒ、Ａ１４１Ｄ：Ｆ１１６Ｈ、Ａ１４１Ｅ：Ｆ１１６Ｋ、Ａ１４１Ｅ：Ｆ１１６Ｒ、Ａ１４１Ｅ：Ｆ１１６Ｈ、Ｆ１２６Ｋ：Ｓ１２１Ｄ、Ｆ１２６Ｋ：Ｓ１２１Ｅ、Ｆ１２６Ｒ：Ｓ１２１Ｄ、Ｆ１２６Ｒ：Ｓ１２１Ｅ、Ｆ１２６Ｈ：Ｓ１２１Ｄ、Ｆ１２６Ｈ：Ｓ１２１Ｅ、Ｆ１２６Ｄ：Ｓ１２１Ｋ、Ｆ１２６Ｄ：Ｓ１２１Ｒ、Ｆ１２６Ｄ：Ｓ１２１Ｈ、Ｆ１２６Ｅ：Ｓ１２１Ｋ、Ｆ１２６Ｅ：Ｓ１２１Ｒ、Ｆ１２６Ｅ：Ｓ１２１Ｈ、Ｋ２１８Ｄ：Ｄ１２２Ｋ、Ｋ２１８Ｄ：Ｄ１２２Ｈ、Ｋ２１８Ｄ：Ｄ１２２Ｒ、Ｋ２１８Ｅ：Ｄ１２２Ｋ、Ｋ２１８Ｅ：Ｄ１２２Ｈ、およびＫ２１８Ｅ：Ｄ１２２Ｒからなる群から選択される置換である。
[00200]同様に、他の一部の実施形態では、ＥＵ位置ｎ７’の第７の対応するアミノ酸残基は、正荷電アミノ酸残基であり、ＥＵ位置ｎ８’の第８の対応するアミノ酸残基は、負荷電アミノ酸残基である。他の一部の実施形態では、ＥＵ位置ｎ７’の第７の対応するアミノ酸残基は、負荷電アミノ酸残基であり、ＥＵ位置ｎ８’の第８の対応するアミノ酸残基は、正荷電アミノ酸残基である。
[00201]一部の実施形態では、ＥＵ位置ｎ５’の第５の対応するアミノ酸残基、ＥＵ位置ｎ６’の第６の対応するアミノ酸残基、ＥＵ位置ｎ７’の第７の対応するアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ８’の第８の対応するアミノ酸残基の少なくとも１、２、３または４つは、置換により導入されている。
[00202]他の一部の実施形態では、ＥＵ位置ｎ５’の第５の対応するアミノ酸残基、ＥＵ位置ｎ６’の第６の対応するアミノ酸残基、ＥＵ位置ｎ７’の第７の対応するアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ８’の第８の対応するアミノ酸残基の少なくとも１、２、３または４つは、置換（複数可）ではなくＥＵ位置ｎ５’、ｎ６’、ｎ７’および／またはｎ８’に新たに挿入／付加したアミノ酸残基（複数可）であり得る。
[00203]一部のまた他の実施形態では、ＥＵ位置ｎ７’およびｎ８’の第７および第８の対応するアミノ酸残基の一方または両方は、非天然アミノ酸類似体（複数可）もしくはミメティック（複数可）または正もしくは負に荷電する化学的に修飾したアミノ酸残基（複数可）であり得る。
[00204]特定の実施形態では、ＥＵ位置対１８３：１７６、１４１：１１６、１２６：１２１および２１８：１２２に２対以上の反対に荷電する第７および第８の対応するアミノ酸残基が存在し得る。一例では、ポリペプチド複合体は、ＥＵ位置対１８３：１７６および１４１：１１６の両方の２つのアミノ酸残基対のそれぞれを変異（例えば、置換、挿入または修飾）させて反対に荷電するように構成し得る。別の例では、ＥＵ位置対１８３：１７６、１４１：１１６、１２６：１２１および２１８：１２２の４つのアミノ酸残基対のすべてを変異（例えば、置換、挿入または修飾）させて反対に荷電させる。
[00205]したがって、ＥＵ位置対１８３：１７６、１４１：１１６および１２６：１２１から選択されるそれぞれのｎ７’：ｎ８’対では、２つの代替スキームを適用することができる。第１のスキームでは、ＥＵ位置ｎ７’の第７の対応するアミノ酸残基は、正荷電アミノ酸残基、例えば、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）であり、ＥＵ位置ｎ８’の第８の対応するアミノ酸残基は、負荷電アミノ酸残基、例えば、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）である。第２のスキームでは、ＥＵ位置ｎ７’の第７の対応するアミノ酸残基は、負荷電アミノ酸残基、例えば、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）であり、ＥＵ位置ｎ８’の第８のアミノ酸残基は、正荷電アミノ酸残基、例えば、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）である。
[00206]上の２つのスキームにおける組合せのすべてを要約すると、ｎ７’：ｎ８’位置対の第７の対応するアミノ酸残基および第８の対応するアミノ酸残基は、Ｓ１８３Ｋ：Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１８３Ｋ：Ｓ１７６Ｅ、Ｓ１８３Ｒ：Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１８３Ｒ：Ｓ１７６Ｅ、Ｓ１８３Ｈ：Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１８３Ｈ：Ｓ１７６Ｅ、Ｓ１８３Ｄ：Ｓ１７６Ｋ、Ｓ１８３Ｄ：Ｓ１７６Ｒ、Ｓ１８３Ｄ：Ｓ１７６Ｈ、Ｓ１８３Ｅ：Ｓ１７６Ｋ、Ｓ１８３Ｅ：Ｓ１７６Ｒ、Ｓ１８３Ｅ：Ｓ１７６Ｈ、Ａ１４１Ｋ：Ｆ１１６Ｄ、Ａ１４１Ｋ：Ｆ１１６Ｅ、Ａ１４１Ｒ：Ｆ１１６Ｄ、Ａ１４１Ｒ：Ｆ１１６Ｅ、Ａ１４１Ｈ：Ｆ１１６Ｄ、Ａ１４１Ｈ：Ｆ１１６Ｅ、Ａ１４１Ｄ：Ｆ１１６Ｋ、Ａ１４１Ｄ：Ｆ１１６Ｒ、Ａ１４１Ｄ：Ｆ１１６Ｈ、Ａ１４１Ｅ：Ｆ１１６Ｋ、Ａ１４１Ｅ：Ｆ１１６Ｒ、Ａ１４１Ｅ：Ｆ１１６Ｈ、Ｆ１２６Ｋ：Ｓ１２１Ｄ、Ｆ１２６Ｋ：Ｓ１２１Ｅ、Ｆ１２６Ｒ：Ｓ１２１Ｄ、Ｆ１２６Ｒ：Ｓ１２１Ｅ、Ｆ１２６Ｈ：Ｓ１２１Ｄ、Ｆ１２６Ｈ：Ｓ１２１Ｅ、Ｆ１２６Ｄ：Ｓ１２１Ｋ、Ｆ１２６Ｄ：Ｓ１２１Ｒ、Ｆ１２６Ｄ：Ｓ１２１Ｈ、Ｆ１２６Ｅ：Ｓ１２１Ｋ、Ｆ１２６Ｅ：Ｓ１２１Ｒ、Ｆ１２６Ｅ：Ｓ１２１Ｈ、Ｋ２１８Ｄ：Ｄ１２２Ｋ、Ｋ２１８Ｄ：Ｄ１２２Ｈ、Ｋ２１８Ｄ：Ｄ１２２Ｒ、Ｋ２１８Ｅ：Ｄ１２２Ｋ、Ｋ２１８Ｅ：Ｄ１２２Ｈ、およびＫ２１８Ｅ：Ｄ１２２Ｒからなる群から選択される置換であり、ｎ７’：ｎ８’位置対は、ｎ３：ｎ４位置対とは異なる。
[00207]一部の実施形態では、第１の標的結合ドメインは、（ｎ１＋ｎ２）：（ｎ３＋ｎ４）位置における第１の置換の組合せを含み、および／または第２の標的結合ドメインは、（ｎ５’＋ｎ６’）：（ｎ７’＋ｎ８’）位置における第２の置換の組合せを含み、第１の置換の組合せおよび／または第２の置換の組合せは、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｋ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｄ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｋ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｅ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｒ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｄ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｒ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｅ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｈ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｄ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｈ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｅ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｄ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｋ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｄ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｒ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｄ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｈ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｅ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｋ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｅ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｒ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｅ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｈ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｋ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｄ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｋ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｅ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｒ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｄ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｒ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｅ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｈ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｄ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｈ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｅ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｋ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｒ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｈ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｋ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｒ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｈ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｋ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｄ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｋ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｅ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｒ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｄ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｒ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｅ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｈ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｄ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｈ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｅ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｋ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｒ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｈ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｋ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｒ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｈ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｋ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｄ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｋ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｅ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｒ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｄ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｒ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｅ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｈ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｄ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｈ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｅ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｄ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｋ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｄ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｒ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｄ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｈ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｅ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｋ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｅ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｒ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｅ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｈ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｋ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｄ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｋ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｅ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｒ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｄ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｒ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｅ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｈ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｄ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｈ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｅ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｋ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｒ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｈ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｋ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｒ）および（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｈ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｋ２１８Ｄ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｄ１２２Ｋ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｋ２１８Ｄ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｄ１２２Ｈ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｋ２１８Ｄ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｄ１２２Ｒ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｋ２１８Ｅ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｄ１２２Ｋ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｋ２１８Ｅ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｄ１２２Ｈ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｋ２１８Ｅ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｄ１２２Ｒ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｋ２１８Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｄ１２２Ｋ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｋ２１８Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｄ１２２Ｈ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｋ２１８Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｄ１２２Ｒ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｋ２１８Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｄ１２２Ｋ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｋ２１８Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｄ１２２Ｈ）、ならびに（Ｖ１７３Ｃ＋Ｋ２１８Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｄ１２２Ｒ）からなる群から選択されるが、ただし、第１の置換の組合せおよび第２の置換の組合せの両方が選択される場合、ｎ５’：ｎ６’位置対は、ｎ１：ｎ２位置対とは異なり、ｎ７’：ｎ８’位置対は、ｎ３：ｎ４位置対とは異なる。
[00208]一部の実施形態では、第１または第２の標的結合ドメインは、第１または第２のＣＨ１領域においてＬ１２８Ｃの置換を含み、第１または第２のＣＬ領域においてＦ１１８Ｃの置換を含む。
[00209]一部の実施形態では、第１または第２の標的結合ドメインは、第１または第２のＣＨ１領域においてＶ１７３Ｃの置換を含み、第１または第２のＣＬ領域においてＱ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）の置換を含む。
[00210]一部の実施形態では、第１または第２の標的結合ドメインは、第１または第２のＣＨ１領域においてＬ１２８ＣおよびＳ１８３Ｄの置換を含み、第１または第２のＣＬ領域においてＦ１１８ＣおよびＳ１７６Ｋの置換を含む。
[00211]一部の実施形態では、第１または第２の標的結合ドメインは、第１または第２のＣＨ１領域においてＬ１２８ＣおよびＦ１２６Ｄの置換を含み、第１または第２のＣＬ領域においてＦ１１８ＣおよびＳ１２１Ｋの置換を含む。
[00212]一部の実施形態では、第１または第２の標的結合ドメインは、第１または第２のＣＨ１領域においてＬ１２８ＣおよびＡ１４１Ｄの置換を含み、第１または第２のＣＬ領域においてＦ１１８ＣおよびＦ１１６Ｋの置換を含む。
[00213]一部の実施形態では、第１または第２の標的結合ドメインは、第１または第２のＣＨ１領域においてＬ１２８ＣおよびＫ２１８Ｄの置換を含み、第１または第２のＣＬ領域においてＦ１１８ＣおよびＤ１２２Ｋの置換を含む。
[00214]一部の実施形態では、第１または第２の標的結合ドメインは、第１または第２のＣＨ１領域においてＶ１７３ＣおよびＳ１８３Ｄの置換を含み、第１または第２のＣＬ領域においてＱ１６０ＣおよびＳ１７６Ｋの置換を含む。
[00215]一部の実施形態では、第１または第２の標的結合ドメインは、第１または第２のＣＨ１領域においてＶ１７３ＣおよびＡ１４１Ｄの置換を含み、第１または第２のＣＬ領域においてＱ１６０ＣおよびＦ１１６Ｋの置換を含む。
[00216]一部の実施形態では、第１または第２の標的結合ドメインは、第１または第２のＣＨ１領域においてＶ１７３ＣおよびＳ１８３Ｄの置換を含む。
[00217]一部の実施形態では、第１または第２の標的結合ドメインは、第１または第２のＣＨ１領域においてＶ１７３ＣおよびＳ１８３Ｄの置換を含み、第１または第２のＣＬ領域においてＱ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）およびＳ１７６Ｋの置換を含む。
[00218]一部の実施形態では、第１または第２の標的結合ドメインは、第１または第２のＣＨ１領域においてＬ１２８ＣおよびＣ２２０Ｓ（ＩｇＧ１）またはＣ１３１Ｓ（ＩｇＧ２およびＩｇＧ４）の置換を含み、第１または第２のＣＬ領域においてＦ１１８ＣおよびＣ２１４Ｓの置換を含む。
[00219]一部の実施形態では、第１または第２の標的結合ドメインは、第１または第２のＣＨ１領域においてＶ１７３ＣおよびＣ２２０Ｓ（ＩｇＧ１）またはＣ１３１Ｓ（ＩｇＧ２およびＩｇＧ４）の置換を含み、第１または第２のＣＬ領域においてＱ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）およびＣ２１４Ｓの置換を含む。
[00220]一部の実施形態では、第１または第２の標的結合ドメインは、第１または第２のＣＨ１領域においてＬ１２８Ｃ、ＩｇＧ１ではＣ２２０Ｓ（またはＩｇＧ２およびＩｇＧ４ではＣ１３１Ｓ）ならびにＳ１８３Ｄの置換を含み、第１または第２のＣＬ領域においてＦ１１８Ｃ、Ｃ２１４ＳおよびＳ１７６Ｋの置換を含む。
[00221]一部の実施形態では、第１または第２の標的結合ドメインは、第１または第２のＣＨ１領域においてＬ１２８Ｃ、ＩｇＧ１ではＣ２２０Ｓ（またはＩｇＧ２およびＩｇＧ４ではＣ１３１Ｓ）ならびにＦ１２６Ｄの置換を含み、第１または第２のＣＬ領域においてＦ１１８Ｃ、Ｃ２１４ＳおよびＳ１２１Ｋの置換を含む。
[00222]一部の実施形態では、第１または第２の標的結合ドメインは、第１または第２のＣＨ１領域においてＬ１２８Ｃ、ＩｇＧ１ではＣ２２０Ｓ（またはＩｇＧ２およびＩｇＧ４ではＣ１３１Ｓ）ならびにＡ１４１Ｄの置換を含み、第１または第２のＣＬ領域においてＦ１１８Ｃ、Ｃ２１４ＳおよびＦ１１６Ｋの置換を含む。
[00223]一部の実施形態では、第１または第２の標的結合ドメインは、第１または第２のＣＨ１領域においてＬ１２８Ｃ、ＩｇＧ１ではＣ２２０Ｓ（またはＩｇＧ２およびＩｇＧ４ではＣ１３１Ｓ）ならびにＫ２１８Ｄの置換を含み、第１または第２のＣＬ領域においてＦ１１８Ｃ、Ｃ２１４ＳおよびＤ１２２Ｋの置換を含む。
[00224]一部の実施形態では、第１または第２の標的結合ドメインは、第１または第２のＣＨ１領域においてＶ１７３Ｃ、ＩｇＧ１ではＣ２２０Ｓ（またはＩｇＧ２およびＩｇＧ４ではＣ１３１Ｓ）ならびにＳ１８３Ｄの置換を含み、第１または第２のＣＬ領域においてＱ１６０Ｃ、Ｃ２１４ＳおよびＳ１７６Ｋの置換を含む。
[00225]一部の実施形態では、第１または第２の標的結合ドメインは、第１または第２のＣＨ１領域においてＶ１７３Ｃ、ＩｇＧ１ではＣ２２０Ｓ（またはＩｇＧ２およびＩｇＧ４ではＣ１３１Ｓ）ならびにＡ１４１Ｄの置換を含み、第１または第２のＣＬ領域においてＱ１６０Ｃ、Ｃ２１４ＳおよびＦ１１６Ｋの置換を含む。
[00226]一部の実施形態では、第１または第２の標的結合ドメインは、第１または第２のＣＨ１領域においてＶ１７３Ｃ、ＩｇＧ１ではＣ２２０Ｓ（またはＩｇＧ２およびＩｇＧ４ではＣ１３１Ｓ）ならびにＳ１８３Ｄの置換を含む。
[00227]一部の実施形態では、第１または第２の標的結合ドメインは、第１または第２のＣＨ１領域においてＶ１７３Ｃ、ＩｇＧ１ではＣ２２０Ｓ（またはＩｇＧ２およびＩｇＧ４ではＣ１３１Ｓ）ならびにＳ１８３Ｄの置換を含み、第１または第２のＣＬ領域においてＱ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）、Ｃ２１４ＳおよびＳ１７６Ｋを含む。
[00228]一部の実施形態では、本明細書において提供する第１の標的結合部分は、第１のＣＬ領域に動作可能に連結されている第１のポリペプチド断片を含み、本明細書において提供する第２の標的結合部分は、第２のＣＬ領域に動作可能に連結されている第２のポリペプチド断片を含み、第１のポリペプチド断片は、第２のポリペプチド断片とは異なるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、第１のポリペプチド断片または第２のポリペプチド断片のいずれかは、ポリペプチド複合体に存在しない。
[00229]本明細書において使用する場合、「異なるアミノ酸配列」は、一方のアミノ酸配列が、例えば、長さ、アミノ酸の種類または機能において他方のアミノ酸配列とは異なることを指す。
[00230]一部の実施形態では、ポリペプチド複合体は、ＣＨ１領域およびＣＬ領域にそれぞれ動作可能に連結されている２つ以上のポリペプチド断片を含む融合タンパク質であり得る。一部の実施形態では、第１の標的結合部分は、第１のＣＨ１領域に動作可能に連結されている第３のポリペプチド断片をさらに含み、第２の標的結合部分は、第２のＣＨ１領域に動作可能に連結されている第４のポリペプチド断片を含む。一部の実施形態では、第３のポリペプチド断片は、第４のポリペプチド断片とは異なるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、第３のポリペプチド断片または第４のポリペプチド断片のいずれかは、ポリペプチド複合体に存在しない。
[00231]一部の実施形態では、第１のポリペプチド断片および第３のポリペプチド断片はそれぞれ、標的結合部位を含み、その標的分子に結合し得る。例えば、第１のポリペプチド断片および第３のポリペプチド断片は、同一の標的分子に結合するか、あるいは異なる標的分子に結合し得る。別の例では、第１のポリペプチド断片および第３のポリペプチド断片は、同一または異なるアミノ酸配列のいずれかを有し得る。
[00232]同様に、第２のポリペプチド断片および第４のポリペプチド断片はそれぞれ、標的結合部位を含み、その標的分子に結合し得る。例えば、第２のポリペプチド断片および第４のポリペプチド断片は、同一の標的分子に結合するか、あるいは異なる標的分子に結合し得る。別の例では、第２のポリペプチド断片および第４のポリペプチド断片は、同一または異なるアミノ酸配列のいずれかを有し得る。
[00233]一部の実施形態では、第１のポリペプチド断片および第３のポリペプチド断片は、会合して第１の標的結合部位を形成し得る。同様に、第２のポリペプチド断片および第４のポリペプチド断片は、会合して第２の標的結合部位を形成し得る。一部の実施形態では、第１の標的結合部位および第２の標的結合部位は、同一の標的分子、または同一の標的分子上の異なる部分、または異なる標的分子に結合し得る。
[00234]一部の実施形態では、第１の標的結合部分は、第１の抗原結合部分であってもよく、および／または第２の標的結合部分は、第２の抗原結合部分であり得る。一部の実施形態では、抗原結合部分は、１つまたは複数の抗体断片に由来する。
[00235]一部の実施形態では、第１の抗原結合部分は、第１のＶＬ領域および第１のＶＨ領域を含んでもよく、これらは、会合して第１の抗原結合部位を形成する。一部の実施形態では、第２の抗原結合部分は、第２のＶＬ領域および第２のＶＨ領域を含んでもよく、これらは、会合して第２の抗原結合部位を形成する。第１の抗原結合部位および第２の抗原結合部位は、同一の抗原、または同一の抗原上の異なるエピトープ、または異なる抗原に結合し得る。
[00236]一部の実施形態では、本明細書において提供する第１および／または第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂドメイン、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２からなる群から選択される。第１の抗原結合ドメインおよび／または第２の抗原結合ドメインは、ＣＨ１領域およびＣＬ領域に動作可能に連結されている１つまたは複数のＣＤＲを含む。一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、第１のＦａｂドメインを含む。一部の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、第２のＦａｂドメインを含む。一部の実施形態では、第２のＦａｂドメインは、第１のＦａｂドメインとは異なる１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲおよび／または軽鎖フレームワーク領域を含む。一部の実施形態では、第２のＦａｂドメインは、第１のＦａｂドメインとは異なる１つまたは複数の重鎖ＣＤＲおよび／または重鎖フレームワーク領域をさらに含む。
[00237]一部の実施形態では、本明細書において提供する第１のＦａｂドメインおよび／または第２のＦａｂドメインは、Ｆａｂドメインの種々のバリアントも包含する。例えば、Ｆａｂドメインのバリアントは、ＣＨ１領域および／またはＣＬ領域のアミノ酸残基の１つまたは複数における１つまたは複数の修飾または置換を含み得る。このようなバリアントは、修飾（複数可）または置換（複数可）により付与される１つまたは複数の望ましい特性、例えば、抗原結合親和性の向上、グリコシル化パターンの向上、グリコシル化リスクの減少、脱アミノ化の減少、エフェクター機能（複数可）の増強、ＦｃＲｎ受容体結合の向上、薬物動態半減期の延長、ｐＨ感受性および／またはコンジュゲーション（例えば、１つまたは複数のシステイン残基の導入）に対する適合性を有し得る。一部の実施形態では、本明細書において提供するＦａｂドメインは、ＨＣＶＲまたはＬＣＶＲを含まない。一部の実施形態では、本明細書において提供するＦａｂドメインは、ＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＣＨ１領域およびＣＬ領域を含む。
[00238]一部の実施形態では、本明細書に開示の第１のＦａｂドメインおよび第２のＦａｂドメインは、２つの異なるＦａｂドメインであり、これは一次配列、側鎖修飾、またはＦａｂドメインを構成する軽鎖部分および重鎖部分の両方の立体構造に関する、１つまたは複数の差異を、２つのＦａｂドメインがそれぞれ有することを意味する。
ＩＩＩ．ヘテロ二量体抗体またはその抗原結合断片
[00239]一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインおよび／または第２の抗原結合ドメインは、抗体、任意選択で、二特異性抗体または多特異性抗体内に含まれる。
[00240]一部の実施形態では、本明細書において提供する第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを含むヘテロ二量体タンパク質複合体を本開示により提供する。一部の実施形態では、本明細書において提供するヘテロ二量体タンパク質複合体は、ヘテロ二量体抗体を含む。
[00241]本明細書において使用する場合、「ヘテロ二量体抗体」の用語は、相互に会合する２つの異なるサブユニットを有する非対称性抗体を指し、これは、本質的にはホモ二量体である天然または天然に存在する抗体とは対照的である。このようなホモ二量体は、同一の２つの軽鎖および同一の２つの重鎖からなり、これは、同一の２つのサブユニットを構成する軽鎖および重鎖の第１の対ならびに同一の軽鎖および重鎖の第２の対に立体構造的に群化され、Ｙ字型抗体の２つのアームのそれぞれとして同一の抗原結合ドメインをそれぞれ含む。本開示の文脈では、ヘテロ二量体抗体は、２つの異なる抗原結合領域／ドメイン（すなわち、第１および第２の抗原結合ドメイン）を少なくとも含み、これらはそれぞれ、可変ドメインに動作可能に連結されている定常部分を含む。各定常部分は、免疫グロブリン重鎖定常領域１（ＣＨ１）および免疫グロブリン軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。各抗原結合ドメインは、異なるエピトープに特異的に結合する異なる抗原結合部分を含み、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）および免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を典型的に含む。ＶＨ領域およびＣＨ１領域は、相互に動作可能に連結され、ＶＬ領域およびＣＬ領域は、相互に動作可能に連結されている。各抗原結合ドメインでは、ＣＬ領域およびＣＨ１領域は、少なくとも１つの非天然鎖間共有結合（例えば、ジスルフィド結合）および少なくとも１つの非天然非共有結合（例えば、静電相互作用または塩橋）により相互に会合する。さらに本開示の文脈では、ヘテロ二量体抗体は、任意選択で、第１および第２の抗原結合ドメインに作動可能に連結されているＦｃドメインをさらに含み得る。Ｆｃドメインは、第１のＦｃポリペプチドおよび第２のＦｃポリペプチドを含み、これらはそれぞれ、例えば、免疫グロブリン重鎖のＣＨ２およびＣＨ３領域を含む。Ｆｃドメインは、ヘテロ二量体化を促進するように改変（すなわち、変異または修飾）し得る。さらに、２つの異なる抗原結合ドメインが、Ｆｃドメイン以外の方法、例えば、ポリペプチド、化学共有結合等により相互に会合する可能性を有する。
[00242]本明細書において使用するヘテロ二量体抗体は、本質的に、改変モノクローナル抗体である。本明細書において使用する場合、「モノクローナル抗体」の用語は、すべてがユニークな親細胞に属するクローンである同一の免疫細胞により生成される抗体の一種を指す。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一エピトープに対して生成される。本明細書では、「モノクローナル」の修飾語は、特定の任意の方法による抗体の生成を必要とするものとして解釈すべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ方法により生成され得るか、または組換えＤＮＡ方法により生成され得る（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）。また、「モノクローナル抗体」は、ファージ抗体ライブラリーから、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７（１９９１）に記載の技術を使用して単離し得る。
[00243]ヘテロ二量体抗体またはその抗原結合断片は、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを含む。第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、２つの異なるドメインである。この立体配置は、第１のＣＨ１領域が第１のＣＬ領域と選択的と会合して第１の抗原結合ドメインを形成し、第１のＣＨ１領域と第２のＣＬ領域との間または第１のＣＬ領域と第２のＣＨ１領域との間で実質的に結合しないため、ヘテロ二量体抗体またはその抗原結合断片の形成に好ましい。次いでこれにより、２つの異なる抗原結合ドメインを有し、それぞれが異なる抗原結合部分を潜在的に有する、ヘテロ二量体抗体またはその抗原結合断片の効率的形成が可能となる。
[00244]上記のＩＩ．ポリペプチド複合体の節の下に記載の第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、本明細書に記載のヘテロ二量体抗体にも適用することができる。
[00245]特定の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、第１の抗原結合ドメインのそれとは異なる１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲおよび／または軽鎖フレームワーク領域を含む。特定の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、第１の抗原結合ドメインのそれとは異なる１つまたは複数の重鎖ＣＤＲおよび／または重鎖フレームワーク領域を含む。このような立体配置により、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、種々の抗原または同一の抗原の種々のエピトープを特異的に標的として結合するように構成する。
[00246]一部の実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、二特異性抗体である。本明細書では、ヘテロ二量体抗体は、２つの異なる抗原または単一抗原の２つの異なるエピトープをそれぞれ特異的に標的とする２つの抗原結合ドメインを有し得る。
[00247]他の一部の実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、多特異性抗体である。本明細書では、２つの異なる抗原または単一抗原の２つの異なるエピトープをそれぞれ特異的に標的とする２つの抗原結合ドメインに加えて、ヘテロ二量体抗体は、他の抗原または他のエピトープを特異的に標的とする１つまたは複数の他の抗原結合部分をさらに含み得る。非制限的な一例では、抗原結合部位を改変して、Ｆｃａｂと呼ばれるように、元は二特異性抗体のＦｃ領域に導入することにより、さらなる一抗原結合部位を獲得させ（Ｗｏｚｎｉａｋ－Ｋｎｏｐｐ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，（２０１０）．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ．２３（４）：２８９－２９７）、このように得られた抗体を、３つの抗原結合部位を有する多特異性抗体とすることができる。他の例も存在し得る。
[00248]一部の実施形態では、第２の抗原結合ドメインおよび第１の抗原結合ドメインは、異なる抗原に結合するか、あるいは同一の抗原上の異なるエピトープに結合する。
[00249]一部の実施形態では、抗原は、腫瘍関連抗原、免疫関連標的または感染病原体関連標的であり得る。
[00250]一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインの一方は、腫瘍関連抗原に結合し、他方は、免疫関連標的に結合する。一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインの一方は、第１の腫瘍関連抗原に結合し、他方は、第２の腫瘍関連抗原に結合する。腫瘍関連抗原の詳細な説明については、ＶＩＩＩ．治療の節を参照されたい。本明細書において提供する免疫関連標的は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＣＤ２８、ＣＤ８０（Ｂ７－１）、ＣＤ８６（Ｂ７－２）、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、ＣＤ４７、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２）、ＮＫＧ２Ｃ、４－１ＢＢ、ＬＩＧＨＴ、ＰＶＲＩＧ、ＳＬＡＭＦ７、ＨＶＥＭ、ＢＡＦＦＲ、ＩＣＡＭ－１、２Ｂ４、ＬＦＡ－１、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＩＣＯＳＬＧ（ＣＤ２７５）、ＬＡＧ３（ＣＤ２２３）、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＴＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＩＲ－１、ＮＯＸ２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＧＬＥＣ－７（ＣＤ３２８）、ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ＴＧＦβ、ＳＩＧＬＥＣ９（ＣＤ３２９）およびそれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。
[00251]一部の実施形態では、第１のＣＬ領域または第２のＣＬ領域のそれぞれは、カッパ軽鎖に由来する。一部の実施形態では、第１のＣＬ領域または第２のＣＬ領域のそれぞれは、ラムダ軽鎖に由来する。一部の実施形態では、第１のＣＬ領域または第２のＣＬ領域は、カッパ軽鎖およびラムダ軽鎖にそれぞれ由来する。
[00252]抗体またはその抗原結合断片の種々の実施形態によれば、第１および／または第２の抗原結合ドメインは、キメラ、ヒト化または完全ヒト抗原結合ドメインであり得る。
[00253]本明細書において使用する場合、「キメラ」の用語は、重および／または軽鎖の部分が、ある特定の種に由来するかまたはある特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において対応する配列と同一または相同であり、その上、鎖（複数可）の残りが、所望の生物学的活性を示す限り、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびにこのような抗体の断片において対応する配列と同一であるかまたは相同である状況を指す（米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１－６８５５（１９８４））。
[00254]本明細書において使用する場合、「ヒト化」の用語は、非ヒト種由来のポリペプチド（例えば、抗体）の配列を修飾して、キメラポリペプチドの特殊形態である、ヒトにおいて天然に生成される抗体バリアントに対する、それらの類似性を向上させる状況を指す。例えば、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基を、所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類の超可変領域由来の残基により交換する、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の場合では、ヒト免疫グロブリンのＦｖ断片領域（ＦＲ）残基を、対応する非ヒト残基により交換する。その上、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体には見出されない残基を含み得る。このような修飾は、抗体の性能をさらに改良するために行う。一般にはヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的すべてを含み、これによって、超可変ループのすべてまたは実質的すべてが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的すべてがヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域となる。ヒト化抗体は任意選択で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンのＦｃの少なくとも一部をも含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３－５９６（１９９２）を参照されたい。
[00255]「ヒト抗体」の用語は、本明細書において使用する場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する抗体を含むことを意図する。ヒト抗体は、最先端技術分野において周知である（ｖａｎ Ｄｉｊｋ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｊ．Ｇ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５（２００１）３６８－３７４）。また、ヒト抗体は、遺伝子導入動物（例えば、マウス）において生成することができ、これにより免疫時、内因性免疫グロブリンを産生せずにヒト抗体の十分なレパトワまたはセレクションを生成することができる。このような生殖系列変異マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの導入により、抗原曝露時にヒト抗体の生成が生じる（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（１９９３）２５５１－２５５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６２（１９９３）２５５－２５８；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（１９９３）３３－４０を参照）。また、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーにより生成することができる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．，ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７（１９９２）３８１－３８８；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２（１９９１）５８１－５９７）。ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらの技術もヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である（Ｃｏｌｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；およびＢｏｅｒｎｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１９９１）８６－９５）。本発明によるキメラおよびヒト化抗体について既に言及したように、「ヒト抗体」の用語は、本明細書において使用する場合、定常領域において、本発明による特性、特には、例えば「クラススイッチ」、すなわち、Ｆｃ部分の変化または変異（例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ４へ、および／またはＩｇＧ１／ＩｇＧ４変異）によるＣｌｑ結合および／またはＦｃＲ結合に関する特性をもたらすように修飾した抗体をも含む。「組換えヒト抗体」の用語は、本明細書において使用する場合、組換え方法により調製、発現、生成または単離するすべてのヒト抗体、例えば、宿主細胞、例えば、ＮＳＯもしくはＣＨＯ細胞、またはヒト免疫グロブリン遺伝子を遺伝子導入した動物（例えば、マウス）から単離した抗体、あるいは宿主細胞にトランスフェクトした組換え発現ベクターを使用して発現させた抗体を含むことを意図する。このような組換えヒト抗体は、再配列形態による可変および定常領域を有する。本発明による組換えヒト抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞超変異に供した。したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し関連するが、ｉｎ ｖｉｖｏでのヒト抗体生殖系列レパトワに天然には存在しない可能性を有する配列である。
[00256]特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、第１および第２の抗原結合ドメインに動作可能に連結されているＦｃ領域／ドメインをさらに含み、これにより抗体またはその抗原結合断片の安定性が向上し得るがまた、種々のエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）等を、細胞表面受容体（すなわち、Ｆｃ受容体）および補体系における特定のタンパク質との相互作用により媒介し得る。
[00257]特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインの両方にスペーサー／リンカーにより動作可能に連結されている。任意選択で、および好ましくは、このようなスペーサーは、免疫グロブリンの２つの重鎖に存在する天然ヒンジ領域であり、これは、それぞれのＣＨ１領域とＣＨ２領域とを繋ぎ、２つの重鎖を接続する鎖間架橋を形成する１つまたは複数の鎖間ジスルフィド結合を含む。また代替的には、スペーサーは、およそ１０～４０個のアミノ酸残基を含む人工ポリペプチドライナーであってもよく、これはＦｃ領域が、それぞれの官能性に干渉することなく第１および第２の両抗原結合ドメインと結合可能となるように可動性である。さらに代替的には、スペーサーは、単に化学的架橋となり得る。
[00258]任意選択で、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはＩｇＤに由来し、好ましくは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に由来し、より好ましくは、ＩｇＧ１に由来する。
[00259]本明細書では、Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域またはバリアントＦｃ領域であり得る。
[00260]特定の好ましい実施形態では、Ｆｃ領域は、第１のＦｃポリペプチドおよび第２のＦｃポリペプチドを含むヘテロ二量体のバリアントＦｃ領域である。バリアントＦｃ領域は、ヘテロ二量体化を促進する１つまたは複数の変異をさらに含む。
[00261]Ｆｃ領域、最も注目すべきは、ＣＨ３領域内の界面における２つの免疫グロブリン重鎖の複数のアミノ酸残基の改変により、組換え細胞培養物から回収したヘテロ二量体の割合を上昇させることが可能であることが示された。このように採用した一戦略は、「ノブと穴」戦略と呼ばれることがあり、この場合、１つまたは複数の突出（すなわち、「ノブ」）は、第１の重鎖の界面上の小型の側鎖を有する１つまたは複数のアミノ酸残基（例えば、グリシン、アラニン、トレオニン）を、大型の側鎖を有するアミノ酸残基（チロシンまたはトリプトファン）と置換することにより生成することができ、大型の側鎖（複数可）と類似のサイズを有する代償性の「空洞」（すなわち、「穴」）は、大型の側鎖を有するアミノ酸残基を、小型の側鎖を有するアミノ酸残基（例えば、アラニンまたはトレオニン）と置換することにより第２の重鎖の界面上に同時に生成する。別の戦略では、ＣＨ３領域は、ジスルフィド結合を形成可能なシステイン残基を導入する変異を含むように修飾し得る。このような修飾により、他の不必要な最終産物、例えば、ホモ二量体を上回ってヘテロ二量体の収率を上昇させるための機構がもたらされる。ヘテロ二量体化を増強するＣＨ３修飾は、例えば、一方の重鎖上のＹ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａおよび他方の重鎖上のＴ３６６Ｗ；一方の重鎖上のＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗおよび他方の重鎖上のＹ３４９Ｃ／Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａを含む。一方の鎖上の突出および他方上の空洞が生じるさらなる修飾は、米国特許第７，１８３，０７６号および米国特許第９，５２７，９２７号ならびにＭｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ １６：６７７－６８１に記載されている。ヘテロ二量体の形成を促進するようにアミノ酸残基を改変するためのまた別の戦略は、Ｆｃ二量体界面にわたり荷電極性を変更して、静電的に適合するＦｃ領域の同時発現によりヘテロ二量体化を生じさせるものを含む。このような荷電対の一変異としては、Ｔ３６６Ｋ＋Ｌ３５１ＤおよびＬ３５１Ｋ＋Ｙ３４９Ｅ／Ｙ３４９Ｄ／Ｌ３６８Ｅが挙げられ（国際公開第２０１３／１５７９５３号）、他のこのような荷電対変異は、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２０１２／０５８７６８号、米国特許第９，５２７，９２７号、国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、欧州特許出願公開第１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２／０５８７６８号、国際公開第２０１３／１５７９５４号、国際公開第２０１３／０９６２９１号およびＧｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，ＪＢＣ ２８５：１９６３７－４６に記載されている。ヘテロ二量体Ｆｃ形成を促進するまた別の戦略は、国際公開第２００７／１１０２０５号およびＤａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２３：１９５－２０２に記載されており、この場合、ヒトＩｇＧおよびＩｇＡ ＣＨ３ドメインの誘導体である鎖交換改変ドメイン（ＳＥＥＤ）ＣＨ３領域を使用する。
[00262]本明細書では、任意選択で、バリアントＦｃ領域は、第１のＦｃポリペプチドにおける第１のＦｃ変異および／または第２のＦｃポリペプチドにおける第２のＦｃ変異を含む。
[00263]さらに任意選択で、第１のＦｃ変異および第２のＦｃ変異は、次の組合せのいずれか１つから選択される：
[00264]ａ）Ｔ３６６ＷもしくはＳ３５４Ｃを含む第１のＦｃ変異、およびＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡもしくはＹ４０７Ｖを含む第２のＦｃ変異、
[00265]ｂ）Ｄ３９９ＫもしくはＥ３５６Ｋを含む第１のＦｃ変異、およびＫ３９２ＤもしくはＫ４０９Ｄを含む第２の変異、
[00266]ｃ）Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７ＫもしくはＤ３９９Ｋを含む第１のＦｃ変異、およびＫ３７０Ｅ、Ｋ４０９ＤもしくはＫ４３９Ｅを含む第２のＦｃ変異、
[00267]ｄ）Ｓ３６４ＨもしくはＦ４０５Ａを含む第１のＦｃ変異、およびＹ３４９ＴもしくはＴ３９４Ｆを含む第２のＦｃ変異、
[00268]ｅ）Ｓ３６４ＨもしくはＴ３９４Ｆを含む第１のＦｃ変異、およびＹ３９４ＴもしくはＦ４０５Ａを含む第２のＦｃ変異、
[00269]ｆ）Ｋ３７０ＤもしくはＫ４０９Ｄを含む第１のＦｃ変異、およびＥ３５７ＫもしくはＤ３９９Ｋを含む第２のＦｃ変異、または
[00270]ｇ）Ｌ３５１ＤもしくはＬ３６８Ｅを含む第１のＦｃ変異、およびＬ３５１ＫもしくはＴ３６６Ｋを含む第２のＦｃ変異。
[00271]上のいずれかでは、付番は、ＥＵインデックスに従う。
ＩＶ．抗体コンジュゲート
[00272]本明細書において提供するポリペプチド複合体は、非コンジュゲート形態またはコンジュゲート形態で使用することができる。
[00273]コンジュゲート形態では、ポリペプチド複合体は、１つまたは複数の所望のコンジュゲート、すなわち、異種部分にコンジュゲートして、例えば、標的検出を促進するため、またはイメージングもしくは療法のための特定の機能を実現させる。
[00274]本明細書では、本明細書において提供するポリペプチド複合体およびそれにコンジュゲートするペイロードを含むコンジュゲートを本開示により提供する。ペイロードは、放射性標識、蛍光標識、酵素基質標識、親和性精製タグ、トレーサー分子、抗がん薬および細胞傷害性分子からなる群のいずれか１つであり得る。
[00275]多様なコンジュゲートを、とりわけ共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合、複合体形成、会合、ブレンディングまたは付加により、本明細書において提供するポリペプチド複合体に連結させることができる（例えば、“Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ”，Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｍ．Ｃｒｕｓｅ ａｎｄ Ｒ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ，Ｊｒ．（ｅｄｓ．），Ｃａｒｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８９）を参照）。
[00276]特定の実施形態では、本明細書において提供するポリペプチド複合体は、エピトープ結合部分の外部に特異的部位を含むように改変してもよく、これは、１つまたは複数のコンジュゲートへの連結に特異的に利用され得る。例えば、このような部位は、コンジュゲートへの共有結合による連結を促進する、例えば、システインまたはヒスチジン残基のような１つまたは複数の反応性アミノ酸残基を含み得る。
[00277]特定の実施形態では、本明細書において提供するポリペプチド複合体のＮ末端および／またはＣ末端はまた、コンジュゲーションのための反応基をもたらすように作用し得る。例えば、Ｎ末端は、ある部分（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等）にコンジュゲートしてもよく、Ｃ末端は、別の部分（例えば、ビオチン等）にコンジュゲートする。
[00278]特定の実施形態では、本明細書において提供するポリペプチド複合体は、直接的または間接的に、例えば、別のコンジュゲートまたはリンカーにより、コンジュゲートに連結され得る。
[00279]例えば、反応性残基、例えば、システインを有する本明細書において提供するポリペプチド複合体は、反応基が、例えば、マレイミド、ヨードアセトアミド、ピリジルジスルフィドまたは他のチオール反応性コンジュゲーションパートナーであるチオール反応物質に連結され得る（Ｈａｕｇｌａｎｄ，２００３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，１９９２，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．３：２；Ｇａｒｍａｎ，１９９７，Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ；Ｍｅａｎｓ（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１：２；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．ｉｎ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９６）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ．４０－５５，６４３－６７１）。
[00280]別の例では、本明細書において提供するポリペプチド複合体は、ビオチンにコンジュゲートし、次いで、アビジンにコンジュゲートする第２のコンジュゲートに間接的にコンジュゲートし得る。なお別の例では、ポリペプチド複合体はリンカーに連結され、これがさらにコンジュゲートに連結され得る。リンカーの例としては、二官能性カップリング剤、例えば、Ｎ－サクシンイミジルｌ－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、サクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジサクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス－アジド化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアン酸（例えば、トルエン２，６－ジイソシアネート）およびｈｉｓ活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）が挙げられる。特に好ましいカップリング剤としては、ジスルフィド連結をもたらすＮ－サクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３：７２３－７３７（１９７８））およびＮ－サクシンイミジル－４－（２－ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）が挙げられる。
[00281]コンジュゲートは、検出可能な標識、薬物動態修飾部分、精製部分または細胞傷害性部分であり得る。検出可能な標識の例としては、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリトリンまたはテキサスレッド）、酵素基質標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼまたはβ－Ｄ－ガラクトシダーゼ）、放射性同位元素（例えば、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ、１１１Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１４Ｃ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、８６Ｙ、８８Ｙ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉおよび３２Ｐ、他のランタニド、発光標識）、発色団部分、ジゴキシゲニン、ビオチン／アビジン、ＤＮＡ分子または検出用の金が挙げられ得る。特定の実施形態では、コンジュゲートは、抗体半減期の延長に役立つ薬物動態修飾部分、例えば、ＰＥＧであり得る。他の適するポリマーとしては、例えば、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー等が挙げられる。特定の実施形態では、コンジュゲートは、精製部分、例えば、磁気ビーズであり得る。「細胞傷害性部分」は、細胞に対して有害であるか、または細胞を傷害もしくは殺傷し得る任意の物質であり得る。細胞傷害性部分の例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシンおよびその類似体、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキセート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、５－フルオロウラシル、ダカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ（ｔｈｉｏｅｐａ）、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣならびにｃｉｓ－ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（かつてはダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（かつてはアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられるが、これらに制限されない。
[00282]特定の実施形態では、本明細書において提供するポリペプチド複合体は、シグナルペプチドにコンジュゲートし得る。シグナルペプチド（シグナル配列、リーダー配列またはリーダーペプチドと呼ばれることもある）を使用して、本明細書において提供するポリペプチド複合体の分泌および単離を促進し得る。シグナルペプチドは典型的に、１回または複数の切断現象における分泌中に成熟タンパク質から一般に切断される、疎水性アミノ酸のコアにより特徴づけられる。このようなシグナルペプチドは、分泌経路を通過する際に成熟タンパク質からのシグナル配列の切断が可能となる、プロセシング部位を含む。したがって、本発明は、シグナル配列を有する記載のポリペプチド、ならびにシグナル配列がタンパク質分解により切断されたポリペプチド（すなわち、切断産物）に関する。一実施形態では、シグナル配列をコードする核酸配列は、発現ベクターにおいて目的のタンパク質、例えば、通常分泌されないか、さもなければ単離困難なタンパク質に動作可能に連結されていてもよい。シグナル配列は、例えば、発現ベクターを形質転換する真核生物宿主からの、タンパク質の分泌を方向づけ、シグナル配列は、引き続いてまたは同時に切断される。次いでタンパク質は、当技術分野において承認されている方法により細胞外培地から容易に精製することができる。あるいは、シグナル配列は、精製を促進する配列を使用して、例えばＧＳＴドメインを用いて、目的のタンパク質に連結され得る。
[00283]コンジュゲートをタンパク質、例えば、抗体、免疫グロブリンまたはその断片へコンジュゲートするための方法は、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号、米国特許第６，４４１１，１６３号、国際公開第ＷＯ２００５０３７９９２号、国際公開第２００５０８１７１１号および国際公開第２００６／０３４４８８号に見出され、これらは、その全体を参照により本明細書に組み込まれる。
Ｖ．医薬組成物
[00284]また本開示では、医薬組成物を提供する。上記のポリペプチド複合体に加えて、医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
[00285]本明細書において使用する場合、「薬学的に許容される」の用語は、指定の担体、媒体、希釈剤、賦形剤（複数可）、塩および／または培地が一般に、他の成分、例えば、製剤を含む活性成分（すなわち、ポリペプチド複合体もしくはヘテロ二量体抗体またはその抗原結合断片）と化学的および／または生理学的に適合し、医薬組成物を摂取する対象と生理学的に適合することを示す。
[00286]「薬学的に許容される担体」は、活性成分以外の医薬製剤中の成分を指し、その生物活性は、対象に対して許容され、かつ非毒性である。本開示の文脈では、本明細書に開示の医薬組成物における使用のための薬学的に許容される担体は、例えば、薬学的に許容される液体、ゲルまたは固形担体、水性媒体、非水性媒体、抗菌剤、等張剤、緩衝液、抗酸化物質、麻酔剤、懸濁／分散剤、シーケンシングもしくはキレート剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤、または非毒性補助物質、当技術分野において公知の他の成分、あるいはこれらの種々の組合せを含み得る。
[00287]本明細書では、適する「成分」としては、例えば、抗酸化物質、充填剤、結合剤、崩壊剤、緩衝液、保存剤、潤滑剤、香味料、増粘剤、着色剤、乳化剤または安定剤、例えば、糖およびシクロデキストリンが挙げられ得る。適する「抗酸化物質」としては、例えば、メチオニン、アスコルビン酸、ＥＤＴＡ、チオ硫酸ナトリウム、白金、カタラーゼ、クエン酸、システイン、チオグリセロール、チオグリコール酸、チオソルビトール、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエンおよび／または没食子酸プロピルが挙げられ得る。本明細書に開示のように、本明細書において提供する医薬組成物における１つまたは複数の抗酸化物質、例えば、メチオニンの含有により、ポリペプチド複合体もしくはヘテロ二量体抗体またはその抗原結合断片の酸化が低減する。この酸化減少により、結合親和性の消失が予防されるかまたは減少し、これによってタンパク質安定性が向上し、有効期間が最大化する。したがって、特定の実施形態では、活性成分（すなわち、本明細書に開示のポリペプチド複合体もしくはヘテロ二量体抗体またはその抗原結合断片）に加えて、１つまたは複数の抗酸化物質、例えば、メチオニンを含む医薬組成物を提供する。
[00288]薬学的に許容される担体は、例えば、水性媒体、例えば、塩化ナトリウム注射剤、リンゲル注射剤、等張デキストロース注射剤、滅菌水注射剤もしくはデキストロースおよび乳酸リンゲル注射剤、非水性媒体、例えば、植物由来の固定油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油もしくはピーナツ油、静菌的もしくは静真菌的濃度の抗菌剤、等張剤、例えば、塩化ナトリウムもしくはデキストロース、緩衝液、例えば、リン酸もしくはクエン酸緩衝液、抗酸化物質、例えば、重硫酸ナトリウム、局所麻酔剤、例えば、塩酸プロカイン、懸濁および分散剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロースもしくはポリビニルピロリドン、乳化剤、例えば、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ－８０）、シーケンシングもしくはキレート剤、例えば、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）もしくはＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸を含み得る。担体として利用される抗菌剤は、複数回用量の容器内の医薬組成物に加えてもよく、これは、フェノールまたはクレゾール、水銀、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウムならびに塩化ベンゼトニウムを含む。適する賦形剤としては、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロールまたはエタノールが挙げられ得る。適する非毒性補助物質としては、例えば、湿潤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、溶解性増強剤または酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンまたはシクロデキストリンのような物質が挙げられ得る。
[00289]薬学的に許容される「希釈剤」は、食塩水および緩衝水溶液を含み得る。
[00290]薬学的に許容される「アジュバント」は、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤を含み得る。微生物の存在の予防は、上記の滅菌手順ならびに種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等の含有の両方により確実とし得る。組成物中に等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウム等を含むことも望ましい場合がある。加えて、注射用医薬剤形の持続的吸収は、吸収を遅延させる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの含有によりもたらされ得る。
[00291]医薬組成物は、溶液、懸濁剤、乳濁剤、丸剤、カプセル、錠剤、持続放出製剤または散剤であり得る。経口製剤は、標準担体、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等を含み得る。
[00292]実施形態では、医薬組成物は、注射用組成物に製剤化する。注射用医薬組成物は、溶液、懸濁剤または乳濁剤の生成に適する任意の従来の剤形、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液または固形の剤形等に調製し得る。注射用製剤は、注射用の滅菌および／または非発熱性溶液、皮下投与錠剤を含む使用直前の溶媒との混合用の滅菌乾燥可溶性製剤、例えば、凍結乾燥散剤、注射用の滅菌懸濁液、使用直前の媒体との混合用の滅菌乾燥不溶性製剤、ならびに滅菌および／または非発熱性乳濁液を含み得る。溶液は、水性または非水性のいずれかであり得る。
[00293]特定の実施形態では、単位用量非経口製剤は、針でアンプル、バイアルまたはシリンジに充填する。非経口投与のためのすべての製剤は、当技術分野において公知かつ実践されるように滅菌し、非発熱性とすべきである。
[00294]特定の実施形態では、滅菌の凍結乾燥した散剤は、本明細書に開示のポリペプチド複合体を適する溶媒に溶解することにより調製する。溶媒は、安定性を向上させる賦形剤または散剤の他の薬理学的成分または散剤から調製した再構成溶液を含み得る。使用され得る賦形剤は、水、デキストロース、ソルビトール、フルクトース、コーンシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、スクロースまたは他の適する物質を含むが、これらに制限されない。溶媒は、緩衝液、例えば、クエン酸、リン酸ナトリウムもしくはカリウム緩衝液、または当業者に公知の他の緩衝液、一実施形態では、およそ中性ｐＨの緩衝液を含み得る。引き続く溶液の滅菌濾過の後、当業者に公知の標準条件下での凍結乾燥により、望ましい製剤がもたらされる。一実施形態では、生じる溶液は、凍結乾燥のためにバイアル内に分配する。各バイアルは、単回投与量または複数回投与量のポリペプチド複合体を含み得る。用量または１組の用量に必要とされる量（例えば、約１０％）を少量超える量を有する高充填バイアルは、試料の的確な退薬および的確な投薬を促進するために許容される。凍結乾燥散剤は、適切な条件下、例えば、約４℃から室温で保存することができる。
[00295]注射用の水による凍結乾燥散剤の再構成により、非経口投与における使用のための製剤が生成される。一実施形態では、再構成において、滅菌および／または非発熱性の水または担体に適する他の液体を凍結乾燥散剤に加える。的確な量は、施術される選択された療法に依存し、経験的に決定することができる。
[00296]特定の実施形態では、薬学的に許容される担体、希釈剤またはアジュバントおよび活性成分を含む組成物をさらに提供する。活性成分は、本明細書に開示のポリペプチド複合体、抗体もしくはその抗原結合断片、または本明細書に開示の抗体コンジュゲートであり得る。
ＶＩ．調製方法
[00297]本開示では、本明細書において提供するポリペプチド複合体を調製するための方法を提供する。
[00298]方法は概して、次のステップを含む：
[00299]（１）ポリペプチド複合体をコードする核酸を用意するステップ、
[00300]（２）核酸を含むベクターを構築するステップ、
[00301]（３）ベクターを宿主細胞に導入してポリペプチド複合体を発現させるステップ、および
[00302]（４）宿主細胞からポリペプチド複合体を単離するステップ。
[00303]この節の第１の態様では、本明細書に開示のポリペプチド複合体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を本開示により提供する。
[00304]本明細書に開示のポリペプチド複合体をコードする核酸は、次の手法の１つにより得ることができる。
[00305]第１の手法では、本明細書に開示のポリペプチド複合体をコードする核酸は、本明細書に開示のポリペプチド複合体のポリペプチドと相同の配列を有するポリペプチドをコードする入手可能な別の核酸（以後、「親抗体」と呼ぶ）から生成し得る。次いで、ＤＮＡ操作プロセスを適用して親抗体をコードする核酸の配列を操作、例えば、変異、挿入、欠失等を導入することにより、本明細書に開示のポリペプチド複合体をコードする核酸を得ることができる。
[00306]本明細書では、「親抗体」は、本明細書に開示のポリペプチド複合体を得ることが可能な抗体またはその断片として定義する。親抗体は、本明細書に開示のポリペプチド複合体の重鎖ＣＨ１領域および／または軽鎖ＣＬ領域と相同の重鎖ＣＨ１領域および／または軽鎖ＣＬ領域のポリペプチド配列を有し得る。「相同」の用語は、本明細書において使用する場合、第１の配列がアラインメントする際、第２の配列に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する状況を指す。ＣｌｕｓｔａｌＷ（欧州バイオインフォマティクス研究所のウェブサイト）のような共通配列アラインメントソフトウェアは、容易に入手可能であり、ＤＮＡ操作方法は、当技術分野において周知であり、これは、部位特異的変異誘発、組換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ等を含み得る。親抗体は、任意の型であってもよく、例えば、完全ヒト抗体、ヒト化抗体または動物抗体（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、イヌ等）を含む。抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。
[00307]親抗体をコードする核酸が入手不可能である場合、任意選択で、いくつかの異なる手法を適用して、本明細書に開示のポリペプチド複合体をコードする核酸を得ることができる。例えば、ｍＲＮＡを含む、親抗体を発現する宿主細胞（例えば、ハイブリドーマ）またはその溶解物が入手可能である場合、逆転写酵素ＰＣＲ手法を適用して、宿主細胞からｃＤＮＡを得た後、高忠実度ＰＣＲ増幅およびシーケンシングの確認を行い、これにより親抗体をコードする核酸を得ることができる。この親抗体宿主細胞由来のｃＤＮＡライブラリーが入手可能である場合、単に高忠実度ＰＣＲおよびシーケンシングの確認を必要とする。
[00308]しかし、本明細書に開示のポリペプチド複合体のポリペプチド配列のみがわかっており、その上、宿主細胞、またはその細胞溶解物もしくはｃＤＮＡライブラリーが入手可能である場合、これらをコードする核酸は、化学合成により代替的に生成することができ、これは、ポリペプチド配列をヌクレオチド配列に翻訳するステップを含み得る。この課題に対する知識、例えば、特定のアミノ酸をコードすることがわかっているヌクレオチドコドンは、当技術分野において周知である。
[00309]上記の種々の手法を組み合わせて、本明細書に開示のポリペプチド複合体をコードする核酸を得ることが可能であることは、注目に値する。
[00310]この節の第２の態様では、本明細書に開示のポリペプチド複合体をコードする核酸を含むベクターをも本開示により提供する。
[00311]この点について、本明細書に開示のポリペプチド複合体をコードする核酸は、ベクター内に動作可能に挿入する。
[00312]本明細書において使用する場合、「ベクター」の用語は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを動作可能に挿入して、そのタンパク質の発現をもたらし（すなわち、発現ベクターと呼ばれる）、ならびに／または導入するとポリヌクレオチドの複製および増幅をもたらし得る（すなわち、クローニングベクターと呼ばれる）媒体を指す。種々の発現系に応じて、ベクターは任意選択で、１つまたは複数の調節配列を含んでもよく、これは、プロモーター、エンハンサーエレメント、ターミネーターエレメント、複製起点または１つもしくは複数の他の調節エレメントを含む。
[00313]「プロモーター」は、本明細書において使用する場合、典型的には、ベクター内のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の上流の調節配列であり、ベクターを有する宿主細胞による認識によって標的ヌクレオチド配列の転写を促進するように作用する。ベクターのプロモーターは典型的に、宿主細胞と適合する。プロモーターは、宿主細胞が細菌発現系である場合、細菌プロモーターであり得るか、または宿主細胞が真核生物発現系である場合、真核生物プロモーターであり得る。一般に使用されるプロモーターは、当技術分野において周知である。
[00314]「エンハンサーエレメント」は、本明細書において使用する場合、宿主細胞内で発現する際、標的ヌクレオチド配列の転写を増強することが可能な、ベクター内の特殊な配列を指す。エンハンサーエレメントの例としては、哺乳動物遺伝子（例えば、グロブリン、エラスターゼ、アルブミンおよびインスリン等）から得られるものが挙げられ得るが、さらに真核細胞ウイルス、例えば、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサー等をも含み得る（Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ，２９７：１７－１８（１９８２）をも参照）。エンハンサーエレメントは、ポリペプチドコード配列の５’または３’末端のいずれかに位置し得るが、好ましくは、その５’末端位置に位置する。
[00315]「ターミネーター配列」は、本明細書において使用する場合、転写を終結し、ｍＲＮＡを安定化するのに必要とされるベクター内の配列を指す。このような配列は一般に、５’から、時々３’から、または真核生物もしくはウイルスのＤＮＡもしくはｃＤＮＡの非翻訳領域から得ることができる。ターミネーター配列の特定の一例は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域によるものである（例えば、国際公開第９４／１１０２６号を参照）。
[00316]多くのベクターは、このようなベクターが、宿主細胞において宿主染色体ＤＮＡから独立的に複製可能な特殊な核酸配列である「複製起点」をも含むことが多い。複製起点配列は、多くの細菌、酵母およびウイルスについて周知である。複製起点の例としては、ほとんどのグラム陰性細菌に適するプラスミドｐＢＲ３２２起点、酵母に適する２μプラスミド起点、および哺乳動物細胞におけるクローニングベクターのための種々のウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、ＢＰＶ等）が挙げられる。一般には、哺乳動物発現ベクターは、複製起点を必要としない（実際、ＳＶ４０起点は典型的に、プロモーターとして使用されることが多い）。
[00317]任意選択で、他の一部の調節エレメントも存在する。例えば、ほとんどの真核生物遺伝子の３’末端は、ＡＡＴＡＡＡ配列を有し、これは、ｍＲＮＡの３’末端にポリＡを加えるシグナルであり、したがって、この配列は一般に、真核生物の発現ベクター内に挿入されることが見出される。他には、シグナル倍列、転写開始配列、選択可能なマーカーおよびレポーター遺伝子等が挙げられる。
[00318]典型的には、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が調節配列に動作可能に連結され、その結果、標的ポリペプチドの発現が実現可能であり、かつ適切な制御下に置かれるように、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、適切な座位に挿入される必要がある。
[00319]ベクターは、宿主細胞内にそれが保有する遺伝エレメントの発現をもたらし（すなわち、「発現ベクター」）、および／またはベクターの複製をもたらす（「クローニングベクター」）ように宿主細胞を形質転換、形質導入またはトランスフェクトするために使用し得る。
[00320]ベクターの例としては、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体、例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）、バクテリオファージ、例えば、ラムダファージまたはＭ１３ファージ、および動物ウイルスが挙げられる。ベクターとして使用される動物ウイルスの分類は、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルスおよびパポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）を含む。
[00321]コードするポリヌクレオチド配列（複数可）は、当技術分野において公知の組換え技術を使用して、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のためにベクター内に挿入することができる。別の実施形態では、本明細書において提供するポリペプチド複合体および二特異性ポリペプチド複合体は、当技術分野において公知の相同組換えにより生成し得る。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分は一般に、次：シグナル配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＥＦ－１α）および転写終結配列の１つまたは複数を含むが、これらに制限されない。
[00322]一部の実施形態では、ベクター系は、哺乳動物、細菌、酵母系等を含み、プラスミド、例えば、ｐＡＬＴＥＲ、ｐＢＡＤ、ｐｃＤＮＡ、ｐＣａｌ、ｐＬ、ｐＥＴ、ｐＧＥＭＥＸ、ｐＧＥＸ、ｐＣＩ、ｐＣＭＶ、ｐＥＧＦＰ、ｐＥＧＦＴ、ｐＳＶ２、ｐＦＵＳＥ、ｐＶＩＴＲＯ、ｐＶＩＶＯ、ｐＭＡＬ、ｐＭＯＮＯ、ｐＳＥＬＥＣＴ、ｐＵＮＯ、ｐＤＵＯ、Ｐｓｇ５Ｌ、ｐＢＡＢＥ、ｐＷＰＸＬ、ｐＢＩ、ｐ１５ＴＶ－Ｌ、ｐＰｒｏ１８、ｐＴＤ、ｐＲＳ４２０、ｐＬｅｘＡ、ｐＡＣＴ２．２等、ならびに他の実験用および市販のベクターを含むがこれらに制限されない。適するベクターとしては、プラスミドまたはウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）が挙げられ得る。
[00323]この節の第３の態様では、上記の核酸を含み、本明細書に開示のポリペプチド複合体、抗体またはその抗原結合断片を核酸の誘導に基づいて発現する、宿主細胞をも本開示により提供する。
[00324]本明細書において使用する場合、「宿主細胞」の用語は、外因性ポリペプチド（例えば、上記のベクター）を導入した細胞を指す。ベクターにおけるＤＮＡのクローニングまたは発現に適する宿主細胞は、原核生物、酵母または上記の高等真核生物の細胞であり得る。
[00325]この目的に適する原核生物としては、グラム陰性またはグラム陽性菌である真正細菌が挙げられる。例としては、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）等が挙げられる。
[00326]糸状菌または酵母を含む真核微生物（サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）等）は、本明細書において提供するベクターのためのクローニングまたは発現宿主に適する。
[00327]本明細書において提供するベクターの発現に適する無脊椎動物宿主細胞の例としては、植物および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株およびバリアントならびに宿主、例えば、イモムシ、蚊、ショウジョウバエ（ｆｒｕｉｆｆｌｙ）およびカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）由来の対応する昆虫許容宿主細胞が同定されている。また、綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマトおよびタバコの植物細胞培養物を宿主として利用することができる。
[00328]本明細書において提供するベクターの発現に適する脊椎動物宿主細胞、特には、哺乳動物宿主細胞株の例としては、ＳＶ４０により形質転換したサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚性腎臓株（２９３または懸濁培養による増殖のためにサブクローニングした２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））、例えば、Ｅｘｐｉ２９３；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞腫株（ＨｅｐＧ２）が挙げられる。脊椎動物細胞および培養（組織培養）による脊椎動物細胞の増殖は、常用手順となっている。
[00329]特定の実施形態では、本明細書において提供するポリペプチド複合体、ヘテロ二量体抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を含む発現ベクターは、一過的トランスフェクションにより宿主細胞に導入する。したがって、宿主細胞における本明細書において提供するポリペプチド複合体、ヘテロ二量体抗体またはその抗原結合断片の発現および生成は、一過的であり、長期間持続しない。本明細書において使用する場合、「一過的トランスフェクション」の用語は、宿主細胞に導入する外因性核酸を宿主細胞のゲノムまたは染色体ＤＮＡに組み込まないプロセスを指す。一過的トランスフェクションの後、このように導入された核酸は、宿主細胞の染色体外エレメント（例えば、エピソーム）として維持され、これにより宿主細胞において、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への核酸の転写と、引き続く核酸がコードするポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳とのための鋳型が、なおもたらされ得る。したがって、一過的トランスフェクションにより、本明細書において提供するポリペプチド複合体、ヘテロ二量体抗体またはその抗原結合断片の生成は、単に一過的であって安定なものではなく、通常、長期間持続しない。
[00330]特定の実施形態では、本明細書において提供するポリペプチド複合体、ヘテロ二量体抗体またはその抗原結合断片の長期かつ高収率の生成を実現するために、本明細書において提供するポリペプチド複合体、ヘテロ二量体抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を安定に発現する細胞株を改変する。この目的のために、宿主細胞は、選択可能なマーカーを含む発現ベクターにより形質転換し得る。本明細書において使用する場合、「選択可能なマーカー」の用語は、発現ベクターを安定に発現する細胞に対して特定の選択性をもたらす機能性ポリペプチド、例えば、酵素をコードする、ベクター内のポリヌクレオチド配列を指す。
[00331]一部の実施形態では、選択可能なマーカーは、抗生物質または別の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリン等）に対する耐性をもたらす酵素をコードし、これは、発現ベクターを発現する細胞を選択する選択培地中で使用される。より詳細には、発現ベクターのトランスフェクション後、宿主細胞は、数日間、第１の培養培地中で増殖させてもよく、次いで、この培地を、対応する抗生物質／毒素を含む選択培地に交換する。発現ベクター内の選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を付与して、細胞が、ベクターを染色体内に安定に組み込み、増殖して巣を形成することを可能とし、次いで、これがクローン化して細胞株内に拡大し得る。この方法は、外来タンパク質を安定に発現する細胞株を改変するのに当技術分野において一般に使用されており、本明細書において提供するポリペプチド複合体、ヘテロ二量体抗体またはその抗原結合断片を安定に発現する細胞株のスクリーニングに有用であり得る。
[00332]任意選択で、選択可能なマーカーは、宿主細胞が示す栄養要求不全を補完する遺伝子をコードし、このため、発現ベクターを発現する細胞を選択するのに使用することができる。さらに任意選択で、選択可能なマーカーは、与えられ得る（特定の）培地から得ることができない重要な栄養を供給する遺伝子をコードする。
[00333]上記のベクターにより形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞は、従来の栄養培地中で培養して、本明細書において提供するポリペプチド複合体、抗体もしくはその抗原結合断片を発現させるか、またはベクターそれ自体を増幅することができる。
[00334]この節の第４の態様では、本明細書に開示のポリペプチド複合体を発現させる方法を本開示により提供する。
[00335]概して方法は、本明細書に開示のポリペプチド複合体が発現する適切な培養条件下で、本明細書において提供する宿主細胞を培養するステップを含む。
[00336]一部の実施形態では、一過的発現系を適用し、したがって方法は、次のステップを含む：
[00337]（ａ）ポリペプチド複合体の各ポリペプチドを発現するように構成した発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトするステップ、および
[00338]（ｂ）宿主細胞を培養し、各ポリペプチドを発現させて、ポリペプチド複合体の生成を可能とするステップ。
[00339]他の一部の実施形態では、安定な発現系を適用し、したがって方法は、次のステップを含む：
[00340]（ａ）ポリペプチド複合体の各ポリペプチドを発現するように構成した発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトするステップであって、発現ベクターが、選択マーカーを含む、ステップ、
[00341]（ｂ）選択マーカーに対応する選択培地中で、トランスフェクトした宿主細胞を培養することにより安定な細胞株を得るステップ、および
[00342]（ｃ）安定な細胞株を培養し、各ポリペプチドを発現させて、ポリペプチド複合体の生成を可能とするステップ。
[00343]上の実施形態のいずれかでは、上記の発現ベクターにより形質転換した宿主細胞、または本明細書において提供するポリペプチド複合体を安定に発現する安定な宿主細胞株は、多様な培地中で培養し得る。市販の培地の例としては、宿主細胞の培養に適するＨａｍ’ｓＦ１０（Ｓｉｇｍａ社）、最少必須培地（ＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ社）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ社）およびダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）が挙げられる。あるいは、Ｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号、第４，６５７，８６６号、第４，９２７，７６２号、第４，５６０，６５５号もしくは第５，１２２，４６９号、国際公開第９０／０３４３０号、国際公開第８７／００１９５号または米国特許再発行出願第３０，９８５号に記載の培地のいずれかをも宿主細胞の培養培地として使用し得る。
[00344]培養中、上記の培地のいずれかは、適切な場合または必要に応じて、１つまたは複数のサプリメントをさらに加え得る。このようなサプリメントの非制限的な例としては、とりわけ、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩等）、グルコースまたは等価なエネルギー源、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシンおよびチミジン等）、選択的抗生物質（例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬物）、ホルモンおよび／または成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリンもしくは上皮成長因子等）が挙げられる。このようなサプリメントは、当業者に公知の適切な濃度で加えるべきである。培養条件、例えば、温度、ｐＨ等は、発現のために選択された宿主細胞とともに、これまでに使用されているものであり、当業者に明らかである。
[00345]この節の第５の態様では、本明細書に開示のポリペプチド複合体を単離する方法を本開示により提供する。
[00346]特定の実施形態では、方法は、本明細書に開示のポリペプチド複合体を回収するステップを含む。
[00347]本明細書において使用する場合、「回収」の用語は、「精製」、「分離」、「単離」等と等価であると考え、これは概して、目的の分子（すなわち、本明細書に開示のポリペプチド複合体、ヘテロ二量体抗体またはその抗原結合断片）を濃縮、回収、または環境中に分子および他の付随する成分を含む混合物から分離する状況を指す。
[00348]使用される発現系（すなわち、発現ベクターおよび宿主細胞）に応じて、ポリペプチド複合体、ヘテロ二量体抗体またはその抗原結合断片（以後、「所望の分子」と呼ぶ）は、宿主細胞内の細胞膜周辺腔で生成されるか、または培地内に直接分泌されることがあり、回収方法は、次のように、異なる第１のステップを含む。
[00349]細胞内で（ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌまたはｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｌｙ）所望の分子を生成する特定の実施形態では、本明細書に開示の回収方法は、第１のステップとして遠心分離または限外濾過プロセスを含み、これは、断片または他の不必要な物質を含む細胞片を除去するように作用する。
[00350]宿主細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）の細胞膜周辺腔内に所望の分子が分泌される他の一部の実施形態では、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１０：１６３－１６７（１９９２）による手法を第１のステップとして適用することができる。簡潔には、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡおよびフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間冷却融解する。次いで、細胞片を遠心分離により除去することができる。
[00351]培地中に所望の分子が分泌される、また他の一部の実施形態では、回収プロセスは、第１のステップに、このような発現系の上清をタンパク質濃縮フィルター（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＰｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過膜）を使用して濃縮するステップを含んでもよく、この第１のステップおよび他のステップは、抗体の分解を阻害するプロテアーゼ阻害物質（例えば、ＰＭＳＦ）および外因性汚染生物の増殖を阻害する抗生物質の存在を必要とし得る。
[00352]上記の第１のステップ後、宿主細胞から調製した組成物は、さらに精製してもよく、これは例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、ＤＥＡＥセルロースイオン交換クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、塩析および親和性クロマトグラフィーを使用して実現することができ、親和性クロマトグラフィーは好ましい精製技術である。
[00353]所望の分子（すなわち、本明細書に開示のポリペプチド複合体、ヘテロ二量体抗体またはその抗原結合断片）が免疫グロブリンＦｃドメインを含む特定の実施形態では、分子に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種およびアイソタイプに応じて、プロテインＡおよび／またはプロテインＧを親和性クロマトグラフィーにおける親和性リガンドとして使用することができる。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖に基づいて所望の分子の親和性精製に使用することができ（Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１－１３（１９８３））、一方、プロテインＧは、すべてのマウスアイソタイプおよびヒトγ３に使用することができる（Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７ １５７５（１９８６））。
[00354]免疫グロブリンＦｃ領域が精製する所望の分子に存在しない他の実施形態では、所望の分子上の他のエピトープを特異的に標的とすることが可能な他の親和性リガンドをも親和性クロマトグラフィーに使用することができる。例えば、所望の分子がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ（登録商標）ＡＢＸ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）を精製に適用することができる。
[00355]所望の分子が免疫グロブリンカッパまたはラムダ型軽鎖を含む特定の実施形態では、特異的な親和性クロマトグラフィーマトリックス（例えば、樹脂）（例えば、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔカッパおよびＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔラムダ親和性マトリックス（ＢＡＣ ＢＶ社、蘭国））を精製に使用することができる。
[00356]本明細書では、親和性リガンドが結合するマトリックスは典型的に、アガロースを含むが、他の材料も含み得る。力学的に安定なマトリックス、例えば、制御ポアガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンによって、アガロースにより達成可能なものよりも高速な流量および短いプロセシング時間が可能となる。
[00357]タンパク質精製のための他の技術、例えば、イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリン上でのクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび硫酸アンモニウム沈殿をも回収する抗体に応じて利用可能である。
[00358]上の予備精製ステップ（複数可）のいずれかの後、所望の分子を含む混合物は、ｐＨ約２．５～４．５の溶出緩衝液を使用し、好ましくは、低塩濃度（例えば、約０～０．２５ＭのＮａＣｌ）で実施する、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーにさらに供し得る。
[00359]所望の分子（すなわち、ポリペプチド複合体およびヘテロ二量体抗体またはその抗原結合断片）の利点の１つは、重鎖および軽鎖の間の不必要な誤対合を著しく減少可能であり、このため典型的に、上記のような相対的に単純な精製プロセスを使用しても不必要な副産物の生成を最小化可能であることである。したがって、特定の実施形態において高収率で高純度の産物を得ることは、実現可能である。
ＶＩＩ．スクリーニングおよび診断
[00360]本明細書に開示のポリペプチド複合体は、標的とする抗原（複数可）と関連する疾患の診断またはスクリーニングのためにｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏで使用することができる。
[00361]一態様では、抗原の存在またはレベルを検出する方法を提供する。方法は、次を含む：
[00362]（１）抗原の含有が疑われる試料を本明細書に開示のポリペプチド複合体と接触させるステップ、および
[00363]（２）抗原およびポリペプチド複合体の間の複合体形成を判定するステップ。
[00364]一部の実施形態では、ステップ（１）は典型的に、抗原およびポリペプチド複合体の間の複合体形成が可能となる条件下で実施し、ステップ（２）では、複合体形成の検出は、多種多様な公知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタン・ブロット、ＦＩＳＨアッセイ、免疫蛍光等を使用して実現可能である。試料は、生体試料、例えば、目的の疾患を有することが疑われる対象の血漿、血清、尿、細胞溶解物、生検試料等であり得る。本明細書において提供するポリペプチド複合体は、疾患と関連する、試料中の１つまたは複数の抗原を標的とするように構成する。
[00365]特定の実施形態では、複合体形成を定量し得る。試料中の標的抗原分子の量が予め設定した閾値よりも増加または減少する場合、対象が疾患と接触し得ることを判定する。
[00366]特定の実施形態では、対照試料を検査試料とともに使用する場合、ステップ（２）における複合体形成の判定に統計学的解析を必要とすることがあり、この場合、複合体形成は両方の試料において検出および比較し、試料間の複合体形成における統計学的有意差（例えば、Ｐ＜０．０５）は検査試料中の目的の分子の存在を示す。本明細書では、対照試料は、疾患を有しない対象由来であり得るが、検査試料は、疾患を保有することが疑われる。
ＶＩＩＩ．治療
[00367]特異的に標的とされる抗原に応じて、本明細書に開示のポリペプチド複合体は、広範な疾患、症状または症候を治療する治療物質として使用することができる。
[00368]一態様では、疾患、症状または症候を治療または予防するための方法を本開示により提供する。方法は、治療有効量の上に提供するポリペプチド複合体を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。
[00369]本明細書では、本明細書において提供するポリペプチド複合体は、上に提供する医薬組成物中に存在し得るか、または上に提供するコンジュゲートにコンジュゲートし得るか、または治療製剤の形態の上に提供する組成物中に存在し得る。
[00370]本明細書において使用する場合、「対象」または「個体」または「動物」または「患者」の用語は、ヒトまたは非ヒト動物を指し、疾患または障害の診断、予後判定、軽快、予防および／または治療を必要とする哺乳動物または霊長類を含む。哺乳動物対象は、ヒト、飼育動物、家畜および動物園、競技用または愛玩動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ブタ、ウシ、クマ等を含む。
[00371]本明細書において使用する場合、「障害」、「疾患」、「症状」等の用語は、罹患しているとは言ってもポリペプチド複合体による治療から利益を得る対象を侵す、症状を指す。「症候」の用語は、疾患を有する患者の身体的、精神的または生理学的特徴を指し、これは、そのような疾患症状を示すものと考える。
[00372]「治療」の用語は、治療的処置および予防的処置の両方を包含することを意図し、このため、治療を必要とするものは、既に障害を有するものならびに障害を予防すべきものを含む。本明細書において使用する場合、症状の「治療」は、症状の予防もしくは軽減、症状の発生もしくは発症速度の緩徐化、症状発症リスクの減少、症状と関連する症候の発症の予防もしくは遅延、症状と関連する症候の減少もしくは終了、症状の完全もしくは部分的退縮をもたらすこと、症状の治癒またはこれらの一部の組合せを含み得る。
[00373]本明細書において使用する場合、治療物質の「治療有効量」の用語は、対象により適切な方法で摂取された場合、対象に十分な治療作用をもたらすことが可能な治療物質の量を指す。他の治療薬とまったく同様に、治療有効量の上に提供するポリペプチド複合体は、例えば、対象の体重、年齢、過去の病歴、現在の服薬、健康状態および潜在的交差反応、アレルギー、感受性および有害な副作用ならびに投与経路および疾患発症の程度のような当技術分野において公知の種々の因子に影響されることが理解されるべきである。投与量は、このようなおよび他の状況または要件により示すように、当業者（例えば、医師または獣医師）により比例的に削減または増加させ得る。
[00374]特定の実施形態では、本明細書において提供するポリペプチド複合体は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約５５ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約６５ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約８５ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約９５ｍｇ／ｋｇまたは約１００ｍｇ／ｋｇ）の治療的に有効な投与量で投与し得る。特定のこのような実施形態では、本明細書において提供するポリペプチド複合体または二特異性ポリペプチド複合体は、約５０ｍｇ／ｋｇ以下の投与量で投与し、特定のこのような実施形態では、投与量は、１０ｍｇ／ｋｇ以下、５ｍｇ／ｋｇ以下、１ｍｇ／ｋｇ以下、０．５ｍｇ／ｋｇ以下または０．１ｍｇ／ｋｇ以下である。特定の実施形態では、投与量は、治療の間に調整し得る。例えば、特定の実施形態では、初回投与量は、その後の投与量よりも高いことがある。特定の実施形態では、投与量は、対象の反応に応じて治療の間に変動し得る。
[00375]投与計画は、最適な所望の応答（例えば、治療応答）をもたらすように調整し得る。例えば、単回用量を投与し得るか、またはいくつかの分割用量を経時的に投与し得る。
[00376]本明細書において提供するポリペプチド複合体は、例えば、非経口（例えば、静脈内注入、筋肉内もしくは皮内注射を含む皮下、腹腔内、静脈内）または非経口（例えば、経口、鼻腔内、眼内、舌下、直腸内もしくは局所）経路のような当技術分野において公知の任意の経路により投与し得る。
[00377]本明細書において提供するポリペプチド複合体は、単独で、または１つもしくは複数のさらなる治療方法または物質と組み合わせて投与し得る。
[00378]本明細書では、上記のポリペプチド複合体およびヘテロ二量体抗体またはその抗原結合断片ならびに本明細書に開示の方法を適用して幅広い種類の疾患を治療することができる。ヒトおよび他の霊長類も同様に、上記のポリペプチド複合体およびヘテロ二量体抗体またはその抗原結合断片ならびに本明細書に開示の方法により治療可能であると検討される疾患は、次を含み得る。
[00379]（１）良性または悪性の両腫瘍、白血病およびリンパ系腫瘍を含む、がんおよび他の過剰増殖障害。がんまたは過剰増殖障害を有する細胞型に応じて、例としては、神経細胞、膠細胞、アストロサイト、視床下部、腺、マクロファージ、上皮、内皮および間質性悪性腫瘍が挙げられる。がんまたは過剰増殖障害に侵された臓器／位置に応じて、例としては、頭部、頸部、眼、口腔、咽喉、食道、胸部、皮膚、骨、肺、結腸、直腸、大腸、胃、脾臓、腎臓、骨格筋、皮下組織、転移性メラノーマ、子宮内膜、前立腺、乳房、卵巣、精巣、甲状腺、血液、リンパ節、腎臓、肝臓、膵臓、脳または中枢神経系のがんが挙げられる。
[00380]（２）円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎および精巣炎、シェーグレン症候群、乾癬、アテローム性動脈硬化、糖尿病性または他の網膜症、後水晶体線維増殖症、加齢性黄斑変性症、血管新生緑内障、血管腫、甲状腺過形成（グレーブス病を含む）、角膜および他組織移植ならびに慢性炎症、セプシス、関節リウマチ、腹膜炎、クローン病、再灌流傷害、敗血症、内毒素ショック、嚢胞性線維症、心内膜炎、乾癬、関節炎（例えば、乾癬性関節炎）、アナフィラキシーショック、臓器虚血、再灌流傷害、脊髄損傷および同種移植片拒絶、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、真菌症、セリアック病皮膚炎、慢性疲労免疫不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡（ｃｉｃａｔｒｉｃａｌ ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ）、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素症、円板状ループス、本態性混合性クリオグロブリン血症、線維筋痛・線維筋炎、糸球体腎炎、ギラン・バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ神経障害、若年性関節炎、扁平苔癬、エリテマトーデス、メニエール病、混合性結合組織疾患、多発性硬化症、１型または免疫媒介真性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎（ｐｏｌｙｃｈｒｏｎｄｒｉｔｉｓ）、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象（Ｒａｙｎａｕｌｄ’ｓ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティフ・マン症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎（ｔｅｍｐｏｒａｌ ａｒｔｅｒｉｓｔｉｓ）／巨細胞動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、例えば、疱疹状皮膚血管炎、白斑症ならびにウェゲナー肉芽腫症を含む自己免疫および／または炎症性障害。炎症性障害は、喘息、脳炎（ｅｎｃｅｐｈｉｌｉｔｉｓ）、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー障害、敗血性ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解症、および慢性ウイルスまたは細菌感染症から生じる慢性炎症をさらに含み得るが、これらに制限されない。
[00381]（３）感染性および寄生性疾患、例えば、ウイルス（例えば、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＲＳＶ、ｈＭＰＶ、ＰＩＶ、コロナウイルスまたはインフルエンザウイルス等）、真菌（例えば、ネグレリア属（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ブラストミセス属（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、ヒストプラズマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）またはヒロズコガ属（Ｔｉｎｅａ）等）、真核微生物（例えば、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）、トキゾプラズマ属（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）、プラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、トリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）およびエントアメーバ属（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）等）ならびに細菌（スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｏ／Ｖｉｂｒｉｏ）およびナイセリア属（Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ／Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）等）により生じるもの。
[00382]（４）（１）～（３）の上記により包含されないものを含む他の疾患または障害、例えば、心血管疾患、神経障害、精神神経症状、傷害または血液凝固障害等。
[00383]上記のポリペプチド複合体または本明細書に開示の治療方法により治療可能な上に列挙した疾患と関連する抗原は、次を含む。
[00384]（１）腫瘍関連抗原。これは、腫瘍細胞表面上に提示され、腫瘍細胞上または腫瘍細胞内に位置し、正常細胞、すなわち、非腫瘍細胞ではなく腫瘍細胞のみにより提示され、非腫瘍細胞と比較して１つまたは複数の腫瘍特異的変異を内包するタンパク質を表し、非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞において高発現し、非腫瘍組織と比較して緻密ではない腫瘍組織構造のため腫瘍細胞内での抗体結合において接触可能であり、腫瘍の脈管構造上に提示される等の抗原を指す。例としては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ３０、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ／ＥＲＢＢ２、ＣＡ１２５、ＭＵＣ－１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤ４４表面接着分子、メソテリン、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ－ＭＡＡ）、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＩＬ－１３Ｒ－ａ２、ＧＤ２等が挙げられるが、これらに制限されない。また、がん関連抗原は、例えば、４－１ＢＢ、５Ｔ４、腺癌抗原、アルファ・フェトプロテイン、ＢＡＦＦ、Ｂリンパ腫細胞、Ｃ２４２抗原、ＣＡ－１２５、炭酸脱水酵素９（ＣＡ－ＩＸ）、Ｃ－ＭＥＴ、ＣＣＲ４、ＣＤ１５２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤ２２１、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＥＡ、ＣＮＴＯ８８８、ＣＴＬＡ－４、ＤＲＳ、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３、ＦＡＰ、フィブロネクチンエクストラドメインＢ、葉酸受容体１、ＧＤ２、ＧＤ３ガングリオシド、糖タンパク質７５、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ヒト散乱因子受容体キナーゼ、ＩＧＦ－１受容体、ＩＧＦ－Ｉ、ＩｇＧ１、Ｌ１－ＣＡＭ、ＩＬ－１３、ＩＬ－６、インスリン様成長因子Ｉ受容体、インテグリンα５β１、インテグリンαｖβ３、ＭＯＲＡｂ－００９、ＭＳ４Ａ１、ＭＵＣ１、ムチンＣａｎＡｇ、Ｎ－グリコリルノイラミン酸、ＮＰＣ－１Ｃ、ＰＤＧＦ－Ｒα、ＰＤＬ１９２、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ１、ＳＣＨ９００１０５、ＳＤＣ１、ＳＬＡＭＦ７、ＴＡＧ－７２、テネイシンＣ、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦ－β、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦＲ－１、ＶＥＧＦＲ２およびビメンチン等を含む。
[00385]（２）制限されないが、ＡＯＣ３（ＶＡＰ－１）、ＣＡＭ－３００１、ＣＣＬ１１（エオタキシン－１）、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７（ベイシジン）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２５（ＩＬ－２受容体の鎖）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩｇＥ、ＩｇＥ Ｆｃ領域、ＩＬ－１、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－６受容体、インテグリンα４、インテグリンα４β７、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ）、ミオスタチン、ＯＸ－４０、スクレロスチン（ｓｃｌｅｒｏｓｃｉｎ）、ＳＯＳＴ、ＴＧＦベータ１、ＴＮＦ－αおよびＶＥＧＦ－Ａ等を含む自己免疫疾患または炎症性疾患と関連する抗原。
[00386]本明細書に開示のヘテロ二量体抗体またはその抗原結合断片は、２つ以上の抗原を同時に特異的に標的とすることが可能であり、これは、特定の疾患の有効な治療に使用することができる。
[00387]本明細書において提供するヘテロ二量体抗体またはその抗原結合断片の好ましい一部の実施形態では、一方の抗原結合部分は、細胞傷害性Ｔリンパ球上の受容体（例えば、ＣＤ３）を標的とし、他方の抗原結合部分は、次の腫瘍細胞発現抗原：ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＣＥＡ、ジシアロガングリオシドＧＤ２、ＰＳＭＡ、ｇｐＡ３３、ＥｐＣＡＭ、Ｐ－カドヘリンおよびＢ７Ｈ３の１つを標的とする（Ｓｅｄｙｋｈ ＳＥ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ Ｄｅｖｅｌ Ｔｈｅｒ．２０１８；１２：１９５－２０８）。したがって、二特異性抗体またはその抗原結合断片を使用してＴ細胞および腫瘍細胞の間の連結を形成することができ、これはＴ細胞に、腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を発揮させ得る。
[00388]ヘテロ二量体抗体またはその抗原結合断片により標的とされることによって潜在的治療作用を有し得る、抗原対の他の例としては、ＰＤ－Ｌ１：ＴＧＦβ、ＣＤ３８：ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２：ＶＥＧＦ、ＨＥＲ２：ＥＧＦＲ、ＰＤ－１：ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１：ＴＩＭ３、ＯＸ４０：ＰＤ－Ｌ１、ＦＩＸａ：ＦＸ、ＣＤ３２Ｂ：ＣＤ７９Ｂ、アンジオポエチン２：ＶＥＧＦ、ＩＬ１３：ＩＬ４、ＴＮＦ：ＩＬ１７Ａ、ＤＬＬ４：ＶＥＧＦ、ＩＬ１α：ＩＬ１β、ＦＡＰ：ＤＲ５、ＣＤ３０：ｇｐＡ３３、ＴＮＦ：ＨＳＡ、ＩＬ６Ｒ：ＨＳＡ、ＩＬ１７Ａ／Ｆ：ＨＳＡ、ＲＡＮＫＬ：ＨＳＡ、Ａβ４０：Ａβ４２、ＩＬ１３：ＩＬ１７、ＦＧＦＲ１：ＫＬＢ、ＰｓＩ：ＰｃｒＶ、ＢＡＦＦ：Ｂ７ＲＰ１、ＮＧＦ：ＴＮＦおよびＴＮＦ：ＩＬ１７Ａが挙げられ得るが、これらに制限されない（Ｓｅｄｙｋｈ ＳＥ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ Ｄｅｖｅｌ Ｔｈｅｒ．２０１８；１２：１９５－２０８）。
[00389]次の例は、特許請求する発明のより良い例示のために提供し、本発明の範囲の制限として解釈されるべきではない。以下に記載するすべての特定の組成物、材料および方法は、全体的または部分的に、本発明の範囲に含まれる。このような特定の組成物、材料および方法は、本発明を制限することは意図しないが、本発明の範囲に含まれる特定の実施形態を単に例示することを意図する。当業者は、独創的能力を行使せずかつ本発明の範囲から逸脱することなく、均等な組成物、材料および方法を開発し得る。本発明による拘束がなお残存するものの、本明細書に記載の手順において多くの変形形態が成され得ることが理解される。本発明者らは、このような変形形態が本発明の範囲に含まれることを意図する。
実施例１：ＣＨ－ＣＬ界面試験
[00390]ＣＨ１のＣ２２０（ＩｇＧ２およびＩｇＧ４ではＣ１３１）およびＣＬのＣ２１４（カッパ鎖またはラムダ鎖）により形成されるジスルフィド結合は、ＣＨ１およびＣＬ領域の間の会合の基礎である。したがって、ＬＣ（Ｂ）－ＨＣ（Ｂ）のＣＨ１およびＣＬ領域の間のジスルフィド結合の会合モードを変更すると、ＬＣ（Ａ）－ＨＣ（Ｂ）およびＬＣ（Ｂ）－ＨＣ（Ａ）の誤対合を回避することが可能であり、これにより４つの鎖、すなわち、ＬＣ（Ａ）、ＨＣ（Ａ）、ＨＣ（Ｂ）およびＬＣ（Ｂ）を１つの細胞株において発現させ、これによって発現および精製プロセスを単純化することができる。
[00391]ＬＣ（Ｂ）－ＨＣ（Ｂ）の会合モードを変更するために、発明者らは、ＣＨ－ＣＬ界面を試験し、関連するアミノ酸列挙して、界面におけるそれぞれの比率を解析した（図１４を参照）。これは、引き続く構築の基礎として使用する。
実施例２：ＣＨ１－ＶＨおよびＣＬ－ＶＬ界面試験
[00392]ＣＨ１およびＣＬ領域はＶＨおよびＶＬ領域とそれぞれ会合するものであるため、ＣＨ１－ＶＨおよびＣＬ－ＶＬ界面も存在する。元のＶＨおよびＶＬ領域の空間構造を可能な限り維持して安定性を維持し、その上、変異部位がＣＨ１およびＣＬ領域の親水性表面に曝露される（これにより薬物の可能性および免疫原性の変化が引き起こされ得る）ことを回避するために、発明者らは、ＣＨ１－ＶＨおよびＣＬ－ＶＬ界面を解析し、結果を図１５に示した。関連するアミノ酸の結合率をも解析して、定常領域および可変領域の界面に含まれる一部のアミノ酸を除外した。
実施例３：距離測定
[00393]変異試験に使用可能な残基を、図１４および図１５を解析することにより選択した。結果は、図１６に示した。４０％を超える結合面積を有する残基を解析し、ソフトウェアを使用してＣＨ１およびＣＬ領域上のこのような残基の距離を測定した。結果は、以下の表１に示した。
Figure 2024517671000002
実施例４：計算
[00394]変異した残基ならびにＣ２２０（ＣＨ１）およびＣ２１４（ＣＬ）の間のジスルフィド結合の形成を回避するために、Ｌ１２８－Ｆ１１８およびＶ１７３－Ｑ１６０を網羅的解析により変異のために選択した。これに基づいて新規のＣＨ１－ＣＬ結合モードを構築し、野生型ＣＨ１／ＣＬとの誤対合の形成を回避した。
実施例５：Ｌ１２８Ｃ－Ｆ１１８ＣまたはＶ１７３Ｃ－Ｑ１６０Ｃ構築物に基づく二特異性抗体の発現
[00395]以下の表２に示す配列を、二特異性抗体を構築するための鋳型として利用した。以下の表１では、「抗体Ａ」は、「抗ＰＤ１抗体」を指し、「抗体Ｂ」は、「抗ＴＧＦβＲ抗体」を指し、「ＨＣ（Ａ）」は、抗体Ａの重鎖を指し、「ＬＣ（Ａ）」は、抗体Ａの軽鎖を指し、「ＨＣ（Ｂ）」は、抗体Ｂの重鎖を指し、「ＬＣ（Ｂ）」は、抗体Ｂの軽鎖を指す。
Figure 2024517671000003
[00396]ＨＣ（Ａ）およびＨＣ（Ｂ）のホモ二量体形成を防ぐために、Ｋ３９２ＤおよびＫ４０９Ｄ変異をＨＣ（Ａ）のＣＨ３に導入し、Ｄ３９９ＫおよびＥ３５６Ｋ変異をＨＣ（Ｂ）のＣＨ３に導入した。ＣＨ３ドメインに変異を有するＨＣ（Ａ）およびＨＣ（Ｂ）の配列を以下の表３に示し、変異したアミノ酸に下線を引いた。
Figure 2024517671000004
[00397]誤対合に対する種々のＣＨ１－ＣＬ界面残基変異の作用を評価するために、抗体ＤＩＣ０１４、ＤＩＣ００２およびＤＩＣ００７を構築した。以下の表４に示すように、ＤＩＣ０１４では、ＣＨ１およびＣＬ領域に変異は導入せず、ＤＩＣ００２では、Ｌ１２８ＣおよびＣ２２０Ｓ変異をＣＨ１（Ａ）領域に導入し、Ｆ１１８ＣおよびＣ２１４Ｓ変異をＬＣ（Ａ）領域に導入し、ＣＨ１（Ｂ）およびＬＣ（Ｂ）領域に変異は導入せず、ＤＩＣ００７では、Ｖ１７３ＣおよびＣ２２０Ｓ変異をＣＨ１（Ａ）領域に導入し、Ｑ１６０ＣおよびＣ２１４Ｓ変異をＬＣ（Ａ）領域に導入し、ＣＨ１（Ｂ）およびＬＣ（Ｂ）領域に変異は導入しなかった。
Figure 2024517671000005
[00398]ＤＩＣ０１４、ＤＩＣ００２およびＤＩＣ００７のＬＣ（Ａ）、ＨＣ（Ａ）、ＬＣ（Ｂ）およびＨＣ（Ｂ）領域の配列情報を以下の表５に示す。表５に示すように、ＤＩＣ０１４は、配列番号２、７、４および８にそれぞれ記載するＬＣ（Ａ）、ＨＣ（Ａ）、ＬＣ（Ｂ）およびＨＣ（Ｂ）領域を含み、ＤＩＣ００２は、配列番号９、１０、４および８にそれぞれ記載するＬＣ（Ａ）、ＨＣ（Ａ）、ＬＣ（Ｂ）およびＨＣ（Ｂ）領域を含み、ＤＩＣ００７は、配列番号３０、１１、４および８にそれぞれ記載するＬＣ（Ａ）、ＨＣ（Ａ）、ＬＣ（Ｂ）およびＨＣ（Ｂ）領域を含む。
Figure 2024517671000006
Figure 2024517671000007
Figure 2024517671000008
[00399]ａ）発現
[00400]ＤＩＣ０１４、ＤＩＣ００２およびＤＩＣ００７の４つの鎖をコードするＤＮＡ配列をベクターにクローニングし（１：１：１：１の比率で）、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞にトランスフェクトして一過的に発現させ、次いで、親和性クロマトグラフィー精製後に解析した。
[00401]ｂ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳＥＣ－ＨＰＬＣ解析
[00402]上の精製抗体をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳＥＣ－ＨＰＬＣによりそれぞれ検出した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果は、図１Ａ（ＤＩＣ００２）、図１Ｂ（ＤＩＣ００７）および図１Ｃ（ＤＩＣ０１４）に示す。ＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果は、図２Ａ（ＤＩＣ００２）、図２Ｂ（ＤＩＣ００７）および図２Ｃ（ＤＩＣ０１４）に示す。
[00403]左および右側のＣＬおよびＣＨが種々の方法で会合するため、上の非対称性抗体の構築中にＨＣ（Ａ）－ＬＣ（Ｂ）および／またはＨＣ（Ｂ）－ＬＣ（Ａ）誤対合が生じた場合、このような誤対合は、安定なジスルフィド結合による連結を形成することができず、これにより例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、１２５ＫＤａおよび１００ＫＤａの低分子バンドが生じるだけでなく、ＳＥＣ－ＨＰＬＣでは、主要ピークの右側に肩ピークおよび／または小型のピークも生じる。
[00404]ＤＩＣ０１４に関しては、Ｃ２２０（ＣＨ１）－Ｃ２１４（ＣＬ）によりＨＣ（Ａ）－ＬＣ（Ａ）およびＨＣ（Ｂ）－ＬＣ（Ｂ）の両方が結合してジスルフィド結合による連結を形成するため、発現産物中に形成されたＨＣ（Ａ）－ＬＣ（Ｂ）およびＨＣ（Ｂ）－ＬＣ（Ａ）誤対合も共有結合し、これによりＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳＥＣ－ＨＰＬＣにおけるＤＩＣ０１４の性能は、通常の抗体の性能と類似した。したがって、ＤＩＣ０１４は、ＬＣ－ＭＳにより解析し、これにより高い誤対合率が同定された。この主な誤対合型は、ＨＣ（Ｂ）－ＨＣ（Ｂ）－ＬＣ（Ａ）－ＬＣ（Ｂ）である。インタクトなＤＩＣ０１４および脱グリコシル化ＤＩＣ０１４のＬＣ－ＭＳ結果は、図３Ａ（インタクトＤＩＣ０１４）および図３Ｂ（脱グリコシル化ＤＩＣ０１４）に示した。結果は、ＨＣ（Ａ）－ＬＣ（Ｂ）および／またはＨＣ（Ｂ）－ＬＣ（Ａ）誤対合がＤＩＣ００２、ＤＩＣ００７およびＤＩＣ０１４の構築中に生じることを示した。
実施例６：電荷を導入してＬ１２８Ｃ－Ｆ１１８ＣまたはＶ１７３Ｃ－Ｑ１６０Ｃに基づいて構築した二特異性抗体における誤対合を減少させた
[00405]ＨＣ（Ａ）－ＬＣ（Ｂ）および／またはＨＣ（Ｂ）－ＬＣ（Ａ）誤対合は、Ｌ１２８Ｃ－Ｆ１１８ＣまたはＶ１７３Ｃ－Ｑ１６０Ｃに基づいて構築した二特異性抗体においてなお生じる。誤対合率を減少させるために、発明者らは、Ｌ１２８Ｃ－Ｆ１１８ＣまたはＶ１７３Ｃ－Ｑ１６０Ｃ変異に加えて、ＣＨ１（Ａ）－ＬＣ（Ａ）およびＣＨ１（Ｂ）－ＬＣ（Ｂ）の界面間の電荷を調整した。
[00406]ＣＨ１－ＣＬのタンパク質構造をモデリングすることにより、Ｌ１２８Ｃ－Ｆ１１８ＣまたはＶ１７３Ｃ－Ｑ１６０Ｃ変異に加えて電荷変異を導入した。以下の表６に示すように、ある残基に正荷電アミノ酸（例えば、Ｒ、ＨまたはＫ）を導入した場合は、他の残基に負荷電アミノ酸（例えば、ＤまたはＥ）を導入した。例えば、表６のＮｏ．１では、ＣＨ１（Ａ）のＳ１８３に正荷電アミノ酸（例えば、Ｒ、ＨまたはＫ）を導入した場合、ＬＣ（Ａ）のＳ１７６に負荷電アミノ酸（例えば、ＤまたはＥ）を導入した。
Figure 2024517671000009
[00407]一部の残基の変異がＣＨ１－ＬＣジスルフィド結合による連結に影響するため、計算後、Ｖ１７３Ｃ－Ｑ１６０Ｃ変異によりＦ１２６－Ｓ１２１対合変異が増加しない可能性が見出された。したがって、以下の表７に示す変異の組合せを解析した（正荷電および負荷電残基を相互交換し得る）。表７に示すように、各抗体のＣＨ１（Ｂ）およびＬＣ（Ｂ）領域に変異は導入しなかった。ＤＩＣ００３では、ＣＨ１（Ａ）領域にＬ１２８Ｃ、Ｃ２２０ＳおよびＳ１８３Ｄ変異を導入して、ＬＣ（Ａ）領域にＦ１１８Ｃ、Ｃ２１４ＳおよびＳ１７６Ｋ変異を導入し、ＤＩＣ００４では、ＣＨ１（Ａ）領域にＬ１２８Ｃ、Ｃ２２０ＳおよびＦ１２６Ｄ変異を導入して、ＬＣ（Ａ）領域にＦ１１８Ｃ、Ｃ２１４ＳおよびＳ１２１Ｋ変異を導入し、ＤＩＣ００５では、ＣＨ１（Ａ）領域にＬ１２８Ｃ、Ｃ２２０ＳおよびＡ１４１Ｄ変異を導入して、ＬＣ（Ａ）領域にＦ１１８Ｃ、Ｃ２１４ＳおよびＦ１１６Ｋ変異を導入し、ＤＩＣ００６では、ＣＨ１（Ａ）領域にＬ１２８Ｃ、Ｃ２２０ＳおよびＫ２１８Ｄ変異を導入して、ＬＣ（Ａ）領域にＦ１１８Ｃ、Ｃ２１４ＳおよびＤ１２２Ｋ変異を導入し、ＤＩＣ００９領域では、ＣＨ１（Ａ）領域にＶ１７３Ｃ、Ｃ２２０ＳおよびＳ１８３Ｄ変異を導入して、ＬＣ（Ａ）領域にＱ１６０Ｃ、Ｃ２１４ＳおよびＳ１７６Ｋ変異を導入し、ＤＩＣ０１０では、ＣＨ１（Ａ）領域にＶ１７３Ｃ、Ｃ２２０ＳおよびＡ１４１Ｄ変異を導入して、ＬＣ（Ａ）領域にＱ１６０Ｃ、Ｃ２１４ＳおよびＦ１１６Ｋ変異を導入した。
Figure 2024517671000010
[00408]ＤＩＣ００３、ＤＩＣ００４、ＤＩＣ００５、ＤＩＣ００６、ＤＩＣ００９およびＤＩＣ０１０のＬＣ（Ａ）、ＨＣ（Ａ）、ＬＣ（Ｂ）およびＨＣ（Ｂ）領域の配列情報は、以下の表８に示す。
Figure 2024517671000011
Figure 2024517671000012
Figure 2024517671000013
Figure 2024517671000014
Figure 2024517671000015
[00409]ａ）発現
[00410]ＤＩＣ００３、ＤＩＣ００４、ＤＩＣ００５、ＤＩＣ００６、ＤＩＣ００９およびＤＩＣ０１０の４つの鎖をコードするＤＮＡ配列をベクターにクローニングし（１：１：１：１の比率で）、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞にトランスフェクトして一過的に発現させ、次いで、ＡＣ精製後に解析した。
[00411]ｂ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳＥＣ－ＨＰＬＣ解析
[00412]上の精製抗体をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳＥＣ－ＨＰＬＣによりそれぞれ検出した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果は、図４Ａ（ＤＩＣ００３）、図４Ｂ（ＤＩＣ００４）、図４Ｃ（ＤＩＣ００５）、図４Ｄ（ＤＩＣ００６）、図４Ｅ（ＤＩＣ００９）および図４Ｆ（ＤＩＣ０１０）に示す。ＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果は、図５Ａ（ＤＩＣ００３）、図５Ｂ（ＤＩＣ００４）、図５Ｃ（ＤＩＣ００５）、図５Ｄ（ＤＩＣ００６）、図５Ｅ（ＤＩＣ００９）および図５Ｆ（ＤＩＣ０１０）に示す。
[00413]上の抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳＥＣ－ＨＰＬＣ解析結果は、ＤＩＣ００６、ＤＩＣ００９およびＤＩＣ０１０が、ＤＩＣ００７およびＤＩＣ００２よりも著しく高い純度を示すことを示した。しかし上の方法は、誤対合の含量および種類の定量に関する明らかな限界を有する。例えば、ホモ二量体およびＣＨ１－ＬＣ誤対合は、それらの分子量が標的産物と近似するため、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳＥＣ－ＨＰＬＣによって標的産物から識別不可能である。したがって、ＬＣ－ＭＳ法を使用して識別および同定した。
[00414]ＤＩＣ０１４の左および右側がＣ２２０－Ｃ２１４により結合し、これによりＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳＥＣ－ＨＰＬＣの性能は、通常の抗体の性能と類似した。このため、任意の誤対合が存在するかどうかを観察することは不可能である。各誤対合産物の実際の分子量を同定して、ＤＩＣ００９産物における種々の誤対合産物の組成物を試験するために、ＤＩＣ００９の４つの鎖（ＬＣ（Ａ）－ＨＣ（Ａ）－ＨＣ（Ｂ）－ＬＣ（Ｂ））に基づいて、ＨＣ（Ａ）－ＨＣ（Ｂ）－ＬＣ（Ｂ）の３つの鎖を発現するＤＩＣ０１５およびＬＣ（Ａ）－ＨＣ（Ａ）－ＨＣ（Ｂ）の３つの鎖を発現するＤＩＣ０１６を対照として構築した。以下の表９に示すように、ＤＩＣ０１６は、ＬＣ（Ａ）領域を有せず、ＤＩＣ０１６は、ＬＣ（Ｂ）領域を有しなかった。ＤＩＣ０１５では、ＣＨ１（Ａ）領域にＶ１７３Ｃ、Ｃ２２０ＳおよびＳ１８３Ｄを導入し、ＤＩＣ０１６では、ＣＨ１（Ａ）領域にＶ１７３Ｃ、Ｃ２２０ＳおよびＳ１８３Ｄを導入して、ＬＣ（Ａ）領域にＱ１６０Ｃ、Ｃ２１４ＳおよびＳ１７６Ｋを導入した。
Figure 2024517671000016
[00415]ＤＩＣ０１５およびＤＩＣ０１６のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果は、図６Ａ（ＤＩＣ０１５）および図６Ｂ（ＤＩＣ０１６）にそれぞれ示した。図６Ａおよび６Ｂに示すように、ＤＩＣ０１５およびＤＩＣ０１６の両方は、１５０ＫＤａ、１２５ＫＤａおよび１００ＫＤａのバンドを有した。１５０ＫＤａの産物がそれぞれＤＩＣ０１５およびＤＩＣ０１６のＨＣ（Ａ）－ＬＣ（Ｂ）およびＨＣ（Ｂ）－ＬＣ（Ａ）の誤対合産物であるため、それらの量は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて示すように少なくなった。
[00416]ＤＩＣ０１５およびＤＩＣ０１６のＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果は、図７Ａ（ＤＩＣ０１５）および図７Ｂ（ＤＩＣ０１６）にそれぞれ示した。図７Ａおよび７Ｂに示すように、明らかな二量体がＤＩＣ０１５およびＤＩＣ０１６について観察された。ＤＩＣ０１５では、標的分子量あたりで明らかな肩ピークおよび主要ピークを示し、ＨＣ（Ａ）－ＬＣ（Ｂ）誤対合の一部が、共有結合は形成しないが、タンパク質親和性結合形態を示し、約１５０ＫＤａ（１２．２分）の分子量を示す一方、ＬＣ（Ｂ）に結合しないＨＣ（Ａ）の部分が、１２５ＫＤａ（１２．８分）の産物を形成し、ＨＣ（Ａ）－ＨＣ（Ｂ）の１００ＫＤａ産物（１３．５分）を少量有することを示した。ＤＩＣ０１６では、単一のピークを示し、大量のＨＣ（Ｂ）－ＬＣ（Ａ）誤対合が、タンパク質親和性結合により１５０ＫＤａ（１２．２分）の誤対合産物を形成することを示した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳＥＣ－ＨＰＬＣ法の結果は、上の方法により、標的最終産物から非共有誤対合結合産物を効率的に分離することが不可能であることを示した。これに基づけば、ＤＩＣ０１５およびＤＩＣ０１６のＬＣ－ＭＳ解析は、種々の誤対合の分子量の決定およびＤＩＣ００９における誤対合産物の含量の同定に有用であり得る。
[00417]ＤＩＣ００９、ＤＩＣ０１５およびＤＩＣ０１６の組成物によって、生じ得る種々の誤対合の分子量を計算して最終産物の組成物を同定した。生じ得る各誤対合の分子量は、以下の表１０に示した。インタクトなＤＩＣ０１５および脱グリコシル化ＤＩＣ０１５のＬＣ－ＭＳ結果は、図８Ａ（インタクトＤＩＣ０１５）および図８Ｂ（脱グリコシル化ＤＩＣ０１５）にそれぞれ示した。インタクトなＤＩＣ０１６および脱グリコシル化ＤＩＣ０１６のＬＣ－ＭＳ結果は、図９Ａ（インタクトＤＩＣ０１５）および図９Ｂ（脱グリコシル化ＤＩＣ０１６）にそれぞれ示した。
Figure 2024517671000017
[00418]上のデータによれば、ＬＣ－ＭＳ解析は、４つの鎖を発現するＤＩＣ００９に対して行ってＤＩＣ００９産物の誤対合率を同定した。ＬＣ－ＭＳ結果は、図１０Ａ（インタクトＤＩＣ００９）、図１０Ｂ（脱グリコシル化ＤＩＣ００９）および図１０Ｃ（図１０Ｂの部分的拡大）に示した。図１０に示すように、ＨＣ（Ａ）－ＨＣ（Ｂ）－ＬＣ（Ａ）－ＬＣ（Ｂ）に加えて、最終産物は、ＨＣ（Ａ）－ＨＣ（Ｂ）－ＬＣ（Ｂ）－ＬＣ（Ｂ）およびＨＣ（Ｂ）－ＨＣ（Ｂ）－ＬＣ（Ｂ）－ＬＣ（Ｂ）を含む他の一部の副産物を含んだ。
[00419]ＤＩＣ０１０もＬＣ－ＭＳにより検出し、最終産物の組成物を、上に類似の方法を使用することにより解析した。ＬＣ－ＭＳ結果は、図１１Ａ（インタクトＤＩＣ０１０）および図１１Ｂ（脱グリコシル化ＤＩＣ０１０）ならびに図１１Ｃ（図１１Ｂの部分的拡大）に示した。図１１に示すように、ＤＩＣ０１０の最終産物も、ＨＣ（Ａ）－ＨＣ（Ｂ）－ＬＣ（Ｂ）－ＬＣ（Ｂ）およびＨＣ（Ｂ）－ＨＣ（Ｂ）－ＬＣ（Ｂ）－ＬＣ（Ｂ）の誤対合産物を少量含んだ。
[00420]ＤＩＣ０１４（無変異）と比較して、ＤＩＣ００９およびＤＩＣ０１０の純度が著しく高まり、誤対合産物の量が減少することを見出すことができる。したがって、ＤＩＣ００９およびＤＩＣ０１０の構築方法により、ＨＣ（Ａ）－ＬＣ（Ｂ）およびＨＣ（Ｂ）－ＬＣ（Ａ）の誤対合が著しく減少し得る。
実施例７：ＤＩＣ０１０の生物学的活性
[00421]上の方法により構築したＤＩＣ０１０を発現および精製し、構築産物の生物学的活性を評価した。
[00422]ａ）親和性
[00423]ＳＰＲ法を使用して、ヒトＰＤ１、ＴＧＦβＲ２およびＴＧＦβＲ３に対するＤＩＣ０１０の結合親和性を検出し、構築した二特異性産物が、それぞれの標的に対する元のモノクローナル抗体の親和性をなお保持するかどうかを観察した。ＳＰＲ結果を図１２Ａ（ヒトＰＤ１）、図１２Ｂ（ヒトＴＧＦβＲ２）、図１２Ｃ（ヒトＴＧＦβＲ３）に示した。図１２に示すように、ＤＩＣ０１０は、ヒトＰＤ１、ヒトＴＧＦβＲ２およびヒトＴＧＦβＲ３に対する良好な親和性をなお示した。
[00424]ｂ）ｉｎ ｖｉｖｏでの活性
[00425]ＭＣ３８／Ｈ－１１マウス結腸がん細胞１×１０６細胞をＰＤ－１ヒト化マウス一匹の左腋に注射した。腫瘍が５０～１００ｍｍ３の平均容量に増殖後、腫瘍量に従って動物をランダムに群化した。マウスは、４群（６マウス／群）：陰性対照群、ＤＩＣ０１０（１ｍｇ／ｋｇ）群、ＤＩＣ０１０（３ｍｇ／ｋｇ）群およびＤＩＣ０１０（１０ｍｇ／ｋｇ）群に分けた。各群の動物に対応する濃度の検査産物を１０ｍｌ／ｋｇの投与量で週２回、合計４回の投与により腹腔内注射し、投与サイクルを１５日とした。
[00426]マウスを腫瘍量について週２回秤量および測定した。１５日目に、マウスを秤量し、腫瘍量を測定して、相対腫瘍量（ＲＴＶ）、相対腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ）および腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ）を計算した。結果は、図１３に示した。図１３に示すように、１０ｍｇ／ｋｇのＤＩＣ０１０は、ＭＣ３８マウスモデルにおいて腫瘍増殖を有意に阻害し、ｉｎ ｖｉｖｏでの良好な生物学的活性を有した。

Claims (62)

  1. 第１の定常部分に動作可能に連結されている第１の標的結合部分を含む第１の標的結合ドメインを含むポリペプチド複合体であって、前記第１の定常部分が、第１の軽鎖定常領域（ＣＬ）と会合している第１の重鎖定常領域１（ＣＨ１）を含み、
    ａ）前記第１のＣＨ１領域が、ＥＵ位置ｎ１に第１のアミノ酸残基を含み、前記第１のＣＬ領域が、ＥＵ位置ｎ２に第２のアミノ酸残基を含み、ｎ１：ｎ２位置対が、１２８：１１８および１７３：１６０からなる群から選択され、前記第１のアミノ酸残基および前記第２のアミノ酸残基が、共有結合を形成し、
    ｂ）前記第１のＣＨ１領域が、ＥＵ位置ｎ３に第３のアミノ酸残基をさらに含み、前記第１のＣＬ領域が、ＥＵ位置ｎ４に第４のアミノ酸残基をさらに含み、ｎ３：ｎ４位置対が、１８３：１７６、１４１：１１６、１２６：１２１および２１８：１２２からなる群から選択され、前記第３のアミノ酸残基および前記第４のアミノ酸残基が、非共有結合を形成する、ポリペプチド複合体。
  2. ＥＵ位置ｎ３の前記第３のアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ４の前記第４のアミノ酸残基が、反対に荷電する、請求項１に記載のポリペプチド複合体。
  3. 第２の定常部分に動作可能に連結されている第２の標的結合部分を含む第２の標的結合ドメインをさらに含み、前記第２の定常部分が、第２のＣＬ領域と会合している第２のＣＨ１領域を含み、前記第１のＣＨ１領域が、前記第２のＣＬ領域に実質的に結合せず、前記第２のＣＨ１領域が、前記第１のＣＬ領域に実質的に結合しない、請求項１または２に記載のポリペプチド複合体。
  4. 前記第１もしくは第２の標的結合ドメインが、抗原結合ドメインを含むか、もしくは抗原結合ドメインであり、および／または前記第１もしくは第２の標的結合部分が、抗原結合部分を含むか、もしくは抗原結合部分である、請求項３に記載のポリペプチド複合体。
  5. 前記第２のＣＨ１領域が、ＥＵ位置ｎ１’に第１の対応するアミノ酸残基を含み、前記第２のＣＬ領域が、ＥＵ位置ｎ２’に第２の対応するアミノ酸残基を含み、ｎ１’：ｎ２’位置対が、前記ｎ１：ｎ２位置対と同一であり、ＥＵ位置ｎ１’の前記第１の対応するアミノ酸残基が、ＥＵ位置ｎ２の前記第２のアミノ酸残基と共有結合を形成せず、および／またはＥＵ位置ｎ２’の前記第２の対応するアミノ酸残基が、ＥＵ位置ｎ１の前記第１のアミノ酸残基と共有結合を形成しない、請求項３または４に記載のポリペプチド複合体。
  6. ＥＵ位置ｎ１’の前記第１の対応するアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ２’の前記第２の対応するアミノ酸残基が、共有結合を形成しない、請求項５に記載のポリペプチド複合体。
  7. 前記第２のＣＨ１領域が、ＥＵ位置ｎ３’に第３の対応するアミノ酸残基をさらに含み、前記第２のＣＬ領域が、ＥＵ位置ｎ４’に第４の対応するアミノ酸残基をさらに含み、ｎ３’：ｎ４’位置対が、前記ｎ３：ｎ４位置対と同一であり、
    （ａ）ＥＵ位置ｎ４’の前記第４の対応するアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ３の前記第３のアミノ酸残基が、反対に荷電しないか、もしくは同様に荷電し、ならびに／または
    （ｂ）ＥＵ位置ｎ３’の前記第３の対応するアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ４の前記第４のアミノ酸残基が、反対に荷電しないか、もしくは同様に荷電する、請求項５または６に記載のポリペプチド複合体。
  8. ＥＵ位置ｎ３’の前記第３の対応するアミノ酸残基および／またはＥＵ位置ｎ４’の前記第４の対応するアミノ酸残基が、荷電しない、請求項７に記載のポリペプチド複合体。
  9. 前記第２のＣＨ１領域が、ＥＵ位置ｎ５’に第５の対応するアミノ酸残基をさらに含み、前記第２のＣＬ領域が、ＥＵ位置ｎ６’に第６の対応するアミノ酸残基をさらに含み、前記第５の対応するアミノ酸残基および前記第６の対応するアミノ酸残基が、共有結合を形成し、ｎ５’：ｎ６’位置対が、前記ｎ１：ｎ２位置対とは異なる、請求項３から８のいずれかに記載のポリペプチド複合体。
  10. 前記ｎ５’：ｎ６’位置対が、２２０：２１４（ＩｇＧ１）または１３１：２１４（ＩｇＧ２およびＩｇＧ４）、１２８：１１８ならびに１７３：１６０からなる群から選択される、請求項９に記載のポリペプチド複合体。
  11. 前記ｎ５’：ｎ６’位置対が、２２０：２１４（ＩｇＧ１）または１３１：２１４（ＩｇＧ２およびＩｇＧ４）である、請求項１０に記載のポリペプチド複合体。
  12. 前記ｎ５’：ｎ６’位置対が１２８：１１８であり、前記ｎ１：ｎ２位置対が１７３：１６０であるか、または前記ｎ５’：ｎ６’位置対が１７３：１６０であり、前記ｎ１：ｎ２位置対が１２８：１１８である、請求項１０に記載のポリペプチド複合体。
  13. （ａ）前記第１のＣＨ１領域および前記第２のＣＨ１領域の少なくとも１つが、ＥＵ位置２２０（ＩｇＧ１）もしくは１３１（ＩｇＧ２およびＩｇＧ４）にシステイン以外のアミノ酸残基を有し、ならびに／または前記第１のＣＬ領域および前記第２のＣＬ領域の少なくとも１つが、ＥＵ位置２１４にシステイン以外のアミノ酸残基を有し、あるいは
    （ｂ）前記第１のＣＨ１領域も前記第２のＣＨ１領域も、ＥＵ位置２２０（ＩｇＧ１）もしくは１３１（ＩｇＧ２およびＩｇＧ４）にシステイン残基を有せず、ならびに／または前記第１のＣＬ領域も前記第２のＣＬ領域も、ＥＵ位置２１４にシステイン残基を有しない、請求項１２に記載のポリペプチド複合体。
  14. 前記第１のＣＨ１領域が、ＥＵ位置２２０（ＩｇＧ１）または１３１（ＩｇＧ２およびＩｇＧ４）にシステイン以外のアミノ酸残基を有し、前記第１のＣＬ領域が、ＥＵ位置２１４にシステイン以外のアミノ酸残基を有する、請求項１３に記載のポリペプチド複合体。
  15. 前記第２のＣＨ１領域が、ＥＵ位置２２０（ＩｇＧ１）または１３１（ＩｇＧ２およびＩｇＧ４）にシステイン以外のアミノ酸残基を有し、前記第２のＣＬ領域が、ＥＵ位置２１４にシステイン以外のアミノ酸残基を有する、請求項１３に記載のポリペプチド複合体。
  16. 前記第１のＣＨ１領域が、ＥＵ位置ｎ５に第５のアミノ酸残基をさらに含み、前記第１のＣＬ領域が、ＥＵ位置ｎ６に第６のアミノ酸残基をさらに含み、ｎ５：ｎ６位置対が、前記ｎ５’：ｎ６’位置対と同一であり、ＥＵ位置ｎ５’の前記第５の対応するアミノ酸残基が、ＥＵ位置ｎ６の前記第６のアミノ酸残基と共有結合を形成せず、および／またはＥＵ位置ｎ６’の前記第６の対応するアミノ酸残基が、ＥＵ位置ｎ５の前記第５のアミノ酸残基と共有結合を形成しない、請求項９から１５のいずれかに記載のポリペプチド複合体。
  17. ＥＵ位置ｎ５の前記第５のアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ６の前記第６のアミノ酸残基が、共有結合を形成しない、請求項１６に記載のポリペプチド複合体。
  18. 前記第２のＣＨ１領域が、ＥＵ位置ｎ７’に第７の対応するアミノ酸残基をさらに含み、前記第２のＣＬ領域が、ＥＵ位置ｎ８’に第８の対応するアミノ酸残基をさらに含み、ｎ７’：ｎ８’位置対が、１８３：１７６、１４１：１１６、１２６：１２１および２１８：１２２からなる群から選択され、前記第７の対応するアミノ酸残基および前記第８の対応するアミノ酸残基が、反対に荷電し、前記ｎ７’：ｎ８’位置対が、前記ｎ３：ｎ４位置対とは異なる、請求項３から１７のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
  19. （ａ）前記ｎ７’：ｎ８’位置対が、１８３：１７６であり、前記ｎ３：ｎ４位置対が、１４１：１１６、１２６：１２１および２１８：１２２からなる群から選択されるか、
    （ｂ）前記ｎ７’：ｎ８’位置対が、１４１：１１６であり、前記ｎ３：ｎ４位置対が、１８３：１７６、１２６：１２１および２１８：１２２からなる群から選択されるか、
    （ｃ）前記ｎ７’：ｎ８’位置対が、１２６：１２１であり、前記ｎ３：ｎ４位置対が、１８３：１７６、１４１：１１６および２１８：１２２からなる群から選択されるか、または
    （ｄ）前記ｎ７’：ｎ８’位置対が、２１８：１２２であり、前記ｎ３：ｎ４位置対が、１８３：１７６、１４１：１１６および１２６：１２１からなる群から選択される、請求項１８に記載のポリペプチド複合体。
  20. 前記第１のＣＨ１領域が、ＥＵ位置ｎ７に第７のアミノ酸残基をさらに含み、前記第２のＣＬ領域が、ＥＵ位置ｎ８に第８のアミノ酸残基をさらに含み、ｎ７：ｎ８位置対が、前記ｎ７’：ｎ８’位置対と同一であり、ＥＵ位置ｎ７’の前記第７の対応するアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ８の前記第８のアミノ酸残基が、反対に荷電しないか、もしくは同様に荷電し、ならびに／またはＥＵ位置ｎ８’の前記第８の対応するアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ７の前記第７のアミノ酸残基が、反対に荷電しないか、もしくは同様に荷電する、請求項１８に記載のポリペプチド複合体。
  21. ＥＵ位置ｎ７の前記第７のアミノ酸残基および／またはＥＵ位置ｎ８の前記第８のアミノ酸残基が、荷電しない、請求項２０に記載のポリペプチド複合体。
  22. 共有結合が、ジスルフィド結合である、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド複合体。
  23. 前記ジスルフィド結合が、２つのシステイン残基間に形成される、請求項２２に記載のポリペプチド複合体。
  24. ＥＵ位置ｎ１の前記第１のアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ２の前記第２のアミノ酸残基が、ともにシステイン残基であり、ならびに／またはＥＵ位置ｎ５’の前記第５の対応するアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ６’の前記第６の対応するアミノ酸残基が、ともにシステイン残基である、請求項２３に記載のポリペプチド複合体。
  25. 前記第１のＣＨ１領域が、Ｌ１２８Ｃ（ＥＵ位置ｎ１）の置換を含み、前記第１のＣＬ領域が、Ｆ１１８Ｃ（ＥＵ位置ｎ２）の置換を含む、請求項２４に記載のポリペプチド複合体。
  26. 前記第２のＣＨ１領域が、Ｖ１７３Ｃ（ＥＵ位置ｎ５’）の置換を含み、前記第２のＣＬ領域が、カッパ軽鎖のＱ１６０Ｃ（ＥＵ位置ｎ６’）またはラムダ軽鎖のＥ１６０Ｃ（ＥＵ位置ｎ６’）の置換を含む、請求項２４に記載のポリペプチド複合体。
  27. （ａ）ＥＵ位置ｎ３の前記第３のアミノ酸残基が、正荷電アミノ酸残基であり、ＥＵ位置ｎ４の前記第４のアミノ酸残基が、負荷電アミノ酸残基であるか、または
    （ｂ）ＥＵ位置ｎ３の前記第３のアミノ酸残基が、負荷電アミノ酸残基であり、ＥＵ位置ｎ４の前記第４のアミノ酸残基が、正荷電アミノ酸残基である、
    前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド複合体。
  28. （ｃ）ＥＵ位置ｎ７’の前記第７の対応するアミノ酸残基が、正荷電アミノ酸残基であり、ＥＵ位置ｎ８’の前記第８の対応するアミノ酸残基が、負荷電アミノ酸残基であるか、または
    （ｄ）ＥＵ位置ｎ７’の前記第７の対応するアミノ酸残基が、負荷電アミノ酸残基であり、ＥＵ位置ｎ８’の前記第８の対応するアミノ酸残基が、正荷電アミノ酸残基である、
    請求項１８から２７のいずれかに記載のポリペプチド複合体。
  29. 前記正荷電アミノ酸残基が、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）およびアルギニン（Ｒ）からなる群から選択され、ならびに／または前記負荷電アミノ酸残基が、アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）からなる群から選択される、請求項２７または２８に記載のポリペプチド複合体。
  30. ＥＵ位置ｎ１の前記第１のアミノ酸残基、ＥＵ位置ｎ２の前記第２のアミノ酸残基、ＥＵ位置ｎ３の前記第３のアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ４の前記第４のアミノ酸残基の少なくとも１、２、３または４つが、置換により導入されている、前記請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
  31. ｎ３：ｎ４位置対の前記第３のアミノ酸残基および前記第４のアミノ酸残基が、Ｓ１８３Ｋ：Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１８３Ｋ：Ｓ１７６Ｅ、Ｓ１８３Ｒ：Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１８３Ｒ：Ｓ１７６Ｅ、Ｓ１８３Ｈ：Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１８３Ｈ：Ｓ１７６Ｅ、Ｓ１８３Ｄ：Ｓ１７６Ｋ、Ｓ１８３Ｄ：Ｓ１７６Ｒ、Ｓ１８３Ｄ：Ｓ１７６Ｈ、Ｓ１８３Ｅ：Ｓ１７６Ｋ、Ｓ１８３Ｅ：Ｓ１７６Ｒ、Ｓ１８３Ｅ：Ｓ１７６Ｈ、Ａ１４１Ｋ：Ｆ１１６Ｄ、Ａ１４１Ｋ：Ｆ１１６Ｅ、Ａ１４１Ｒ：Ｆ１１６Ｄ、Ａ１４１Ｒ：Ｆ１１６Ｅ、Ａ１４１Ｈ：Ｆ１１６Ｄ、Ａ１４１Ｈ：Ｆ１１６Ｅ、Ａ１４１Ｄ：Ｆ１１６Ｋ、Ａ１４１Ｄ：Ｆ１１６Ｒ、Ａ１４１Ｄ：Ｆ１１６Ｈ、Ａ１４１Ｅ：Ｆ１１６Ｋ、Ａ１４１Ｅ：Ｆ１１６Ｒ、Ａ１４１Ｅ：Ｆ１１６Ｈ、Ｆ１２６Ｋ：Ｓ１２１Ｄ、Ｆ１２６Ｋ：Ｓ１２１Ｅ、Ｆ１２６Ｒ：Ｓ１２１Ｄ、Ｆ１２６Ｒ：Ｓ１２１Ｅ、Ｆ１２６Ｈ：Ｓ１２１Ｄ、Ｆ１２６Ｈ：Ｓ１２１Ｅ、Ｆ１２６Ｄ：Ｓ１２１Ｋ、Ｆ１２６Ｄ：Ｓ１２１Ｒ、Ｆ１２６Ｄ：Ｓ１２１Ｈ、Ｆ１２６Ｅ：Ｓ１２１Ｋ、Ｆ１２６Ｅ：Ｓ１２１Ｒ、Ｆ１２６Ｅ：Ｓ１２１Ｈ、Ｋ２１８Ｄ：Ｄ１２２Ｋ、Ｋ２１８Ｄ：Ｄ１２２Ｈ、Ｋ２１８Ｄ：Ｄ１２２Ｒ、Ｋ２１８Ｅ：Ｄ１２２Ｋ、Ｋ２１８Ｅ：Ｄ１２２Ｈ、およびＫ２１８Ｅ：Ｄ１２２Ｒからなる群から選択される置換である、請求項３０に記載のポリペプチド複合体。
  32. ＥＵ位置ｎ５’の前記第５の対応するアミノ酸残基、ＥＵ位置ｎ６’の前記第６の対応するアミノ酸残基、ＥＵ位置ｎ７’の前記第７の対応するアミノ酸残基およびＥＵ位置ｎ８’の前記第８の対応するアミノ酸残基の少なくとも１、２、３または４つが、置換により導入されている、請求項１６から３１のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
  33. ｎ７’：ｎ８’位置対の前記第７の対応するアミノ酸残基および前記第８の対応するアミノ酸残基が、Ｓ１８３Ｋ：Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１８３Ｋ：Ｓ１７６Ｅ、Ｓ１８３Ｒ：Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１８３Ｒ：Ｓ１７６Ｅ、Ｓ１８３Ｈ：Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１８３Ｈ：Ｓ１７６Ｅ、Ｓ１８３Ｄ：Ｓ１７６Ｋ、Ｓ１８３Ｄ：Ｓ１７６Ｒ、Ｓ１８３Ｄ：Ｓ１７６Ｈ、Ｓ１８３Ｅ：Ｓ１７６Ｋ、Ｓ１８３Ｅ：Ｓ１７６Ｒ、Ｓ１８３Ｅ：Ｓ１７６Ｈ、Ａ１４１Ｋ：Ｆ１１６Ｄ、Ａ１４１Ｋ：Ｆ１１６Ｅ、Ａ１４１Ｒ：Ｆ１１６Ｄ、Ａ１４１Ｒ：Ｆ１１６Ｅ、Ａ１４１Ｈ：Ｆ１１６Ｄ、Ａ１４１Ｈ：Ｆ１１６Ｅ、Ａ１４１Ｄ：Ｆ１１６Ｋ、Ａ１４１Ｄ：Ｆ１１６Ｒ、Ａ１４１Ｄ：Ｆ１１６Ｈ、Ａ１４１Ｅ：Ｆ１１６Ｋ、Ａ１４１Ｅ：Ｆ１１６Ｒ、Ａ１４１Ｅ：Ｆ１１６Ｈ、Ｆ１２６Ｋ：Ｓ１２１Ｄ、Ｆ１２６Ｋ：Ｓ１２１Ｅ、Ｆ１２６Ｒ：Ｓ１２１Ｄ、Ｆ１２６Ｒ：Ｓ１２１Ｅ、Ｆ１２６Ｈ：Ｓ１２１Ｄ、Ｆ１２６Ｈ：Ｓ１２１Ｅ、Ｆ１２６Ｄ：Ｓ１２１Ｋ、Ｆ１２６Ｄ：Ｓ１２１Ｒ、Ｆ１２６Ｄ：Ｓ１２１Ｈ、Ｆ１２６Ｅ：Ｓ１２１Ｋ、Ｆ１２６Ｅ：Ｓ１２１Ｒ、Ｆ１２６Ｅ：Ｓ１２１Ｈ、Ｋ２１８Ｄ：Ｄ１２２Ｋ、Ｋ２１８Ｄ：Ｄ１２２Ｈ、Ｋ２１８Ｄ：Ｄ１２２Ｒ、Ｋ２１８Ｅ：Ｄ１２２Ｋ、Ｋ２１８Ｅ：Ｄ１２２Ｈ、およびＫ２１８Ｅ：Ｄ１２２Ｒからなる群から選択される置換であり、前記ｎ７’：ｎ８’位置対が、前記ｎ３：ｎ４位置対とは異なる、請求項３２に記載のポリペプチド複合体。
  34. 前記第１の標的結合ドメインが、（ｎ１＋ｎ２）：（ｎ３＋ｎ４）位置における第１の置換の組合せを含み、および／または前記第２の標的結合ドメインが、（ｎ５’＋ｎ６’）：（ｎ７’＋ｎ８’）位置における第２の置換の組合せを含み、前記第１の置換の組合せおよび／または前記第２の置換の組合せが、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｋ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｄ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｋ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｅ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｒ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｄ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｒ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｅ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｈ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｄ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｈ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｅ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｄ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｋ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｄ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｒ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｄ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｈ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｅ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｋ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｅ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｒ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｓ１８３Ｅ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１７６Ｈ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｋ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｄ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｋ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｅ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｒ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｄ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｒ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｅ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｈ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｄ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｈ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｅ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｋ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｒ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｈ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｋ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｒ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ａ１４１Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｆ１１６Ｈ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｋ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｄ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｋ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｅ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｒ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｄ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｒ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｅ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｈ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｄ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｈ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｅ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｋ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｒ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｈ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｋ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｒ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｓ１８３Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１７６Ｈ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｋ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｄ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｋ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｅ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｒ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｄ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｒ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｅ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｈ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｄ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｈ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｅ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｄ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｋ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｄ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｒ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｄ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｈ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｅ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｋ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｅ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｒ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｆ１２６Ｅ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｓ１２１Ｈ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｋ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｄ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｋ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｅ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｒ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｄ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｒ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｅ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｈ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｄ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｈ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｅ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｋ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｒ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｈ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｋ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｒ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｆ１２６Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｓ１２１Ｈ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｋ２１８Ｄ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｄ１２２Ｋ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｋ２１８Ｄ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｄ１２２Ｈ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｋ２１８Ｄ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｄ１２２Ｒ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｋ２１８Ｅ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｄ１２２Ｋ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｋ２１８Ｅ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｄ１２２Ｈ）、（Ｌ１２８Ｃ＋Ｋ２１８Ｅ）：（Ｆ１１８Ｃ＋Ｄ１２２Ｒ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｋ２１８Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｄ１２２Ｋ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｋ２１８Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｄ１２２Ｈ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｋ２１８Ｄ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｄ１２２Ｒ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｋ２１８Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｄ１２２Ｋ）、（Ｖ１７３Ｃ＋Ｋ２１８Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｄ１２２Ｈ）および（Ｖ１７３Ｃ＋Ｋ２１８Ｅ）：（Ｑ１６０Ｃ（またはＥ１６０Ｃ）＋Ｄ１２２Ｒ）からなる群から選択されるが、ただし、前記第１の置換の組合せおよび前記第２の置換の組合せの両方が選択される場合、前記ｎ５’：ｎ６’位置対は、前記ｎ１：ｎ２位置対とは異なり、前記ｎ７’：ｎ８’位置対は、前記ｎ３：ｎ４位置対とは異なる、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド複合体。
  35. 前記第１の標的結合部分が、前記第１のＣＬ領域に動作可能に連結されている第１のポリペプチド断片を含み、および／または前記第２の標的結合部分が、前記第２のＣＬ領域に動作可能に連結されている第２のポリペプチド断片を含み、前記第１のポリペプチド断片が、前記第２のポリペプチド断片とは異なるアミノ酸配列を有するか、または前記第１のポリペプチド断片もしくは前記第２のポリペプチド断片のいずれかが、前記ポリペプチド複合体に存在しない、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド複合体。
  36. 前記第１の標的結合部分が、前記第１のＣＨ１領域に動作可能に連結されている第３のポリペプチド断片をさらに含み、および／または前記第２の標的結合部分が、前記第２のＣＨ１領域に動作可能に連結されている第４のポリペプチド断片を含む、請求項３５に記載のポリペプチド複合体。
  37. 前記第３のポリペプチド断片が、前記第４のポリペプチド断片とは異なるアミノ酸配列を有するか、または前記第３のポリペプチド断片もしくは前記第４のポリペプチド断片のいずれかが、前記ポリペプチド複合体に存在しない、請求項３６に記載のポリペプチド複合体。
  38. 前記第１のポリペプチド断片および前記第３のポリペプチド断片が、第１の標的結合部位をそれぞれ含むか、もしくは相互に会合して第１の標的結合部位を形成し、ならびに／または前記第２のポリペプチド断片および前記第４のポリペプチド断片が、第２の標的結合部位をそれぞれ含むか、もしくは相互に会合して第２の標的結合部位を形成する、請求項３５から３７のいずれかに記載のポリペプチド複合体。
  39. 前記第１の標的結合部位および前記第２の標的結合部位が、同一の標的分子、または同一の標的分子上の異なる部分、または異なる標的分子に結合し得る、請求項３５から３７のいずれかに記載のポリペプチド複合体。
  40. 前記第１の抗原結合ドメインおよび／または前記第２の抗原結合ドメインが、抗体、任意選択で、二特異性抗体または多特異性抗体内に含まれる、請求項４から３９のいずれかに記載のポリペプチド複合体。
  41. 前記第２の抗原結合ドメインおよび前記第１の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合するか、または同一の抗原上の異なるエピトープに結合する、請求項４から４０のいずれかに記載のポリペプチド複合体。
  42. 前記抗原が、腫瘍関連抗原、免疫関連標的または感染病原体関連標的であり得る、請求項４１に記載のポリペプチド複合体。
  43. 前記第１および／または前記第２の抗原結合ドメインが、キメラ、ヒト化または完全ヒト抗原結合ドメインである、請求項４から４２のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
  44. 前記第１および／または前記第２の抗原結合部分が、ナノボディ、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片、（ｄｓＦｖ）２、二特異性ｄｓＦｖおよびダイアボディからなる群から選択される、請求項４から４３のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
  45. 前記第１および／または前記第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂドメイン、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２からなる群から選択される、請求項４から４４のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
  46. 前記第１の抗原結合ドメインおよび／または前記第２の抗原結合ドメインが、ＣＨ１領域およびＣＬ領域に動作可能に連結されている１つまたは複数のＣＤＲを含む、請求項４５に記載のポリペプチド複合体。
  47. 前記第１の抗原結合ドメインが、第１のＦａｂドメインであり、および／または前記第２の抗原結合ドメインが、第２のＦａｂドメインである、請求項４から４６のいずれかに記載のポリペプチド複合体。
  48. 前記第２のＦａｂドメインが、
    （ａ）前記第１のＦａｂドメインとは異なる１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲおよび／または軽鎖フレームワーク領域、ならびに任意選択で、
    （ｂ）前記第１のＦａｂドメインとは異なる１つまたは複数の重鎖ＣＤＲおよび／または重鎖フレームワーク領域
    を含む、請求項４７に記載のポリペプチド複合体。
  49. 前記第１の標的結合ドメインおよび前記第２の標的結合ドメインに動作可能に連結されているＦｃ領域をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド複合体。
  50. 前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に由来する、請求項４９に記載のポリペプチド複合体。
  51. 前記Ｆｃ領域が、ヘテロ二量体である、請求項４９または５０に記載のポリペプチド複合体。
  52. 前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、ヘテロ二量体化を促進する１つまたは複数の変異を含む、請求項４９に記載のポリペプチド複合体。
  53. 前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、第１のＦｃ変異を含む第１のＦｃポリペプチド、および／または第２のＦｃ変異を含む第２のＦｃポリペプチドを含み、
    ａ）前記第１のＦｃ変異が、Ｔ３６６ＷもしくはＳ３５４Ｃを含み、前記第２のＦｃ変異が、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡもしくはＹ４０７Ｖを含むか、
    ｂ）前記第１のＦｃ変異が、Ｄ３９９ＫもしくはＥ３５６Ｋを含み、前記第２のＦｃ変異が、Ｋ３９２ＤもしくはＫ４０９Ｄを含むか、
    ｃ）前記第１のＦｃ変異が、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７ＫもしくはＤ３９９Ｋを含み、前記第２のＦｃ変異が、Ｋ３７０Ｅ、Ｋ４０９ＤもしくはＫ４３９Ｅを含むか、
    ｄ）前記第１のＦｃ変異が、Ｓ３６４ＨもしくはＦ４０５Ａを含み、前記第２のＦｃ変異が、Ｙ３４９ＴもしくはＴ３９４Ｆを含むか、
    ｅ）前記第１のＦｃ変異が、Ｓ３６４ＨもしくはＴ３９４Ｆを含み、前記第２のＦｃ変異が、Ｙ３９４ＴもしくはＦ４０５Ａを含むか、
    ｆ）前記第１のＦｃ変異が、Ｋ３７０ＤもしくはＫ４０９Ｄを含み、前記第２のＦｃ変異が、Ｅ３５７ＫもしくはＤ３９９Ｋを含むか、または
    ｇ）前記第１のＦｃ変異が、Ｌ３５１ＤもしくはＬ３６８Ｅを含み、前記第２のＦｃ変異が、Ｌ３５１ＫもしくはＴ３６６Ｋを含み、
    付番が、ＥＵインデックスに従う、請求項５２に記載のポリペプチド複合体。
  54. 請求項１から５３のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体またはその部分をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
  55. 請求項５４に記載の核酸を含むベクター。
  56. 請求項５４に記載の核酸または請求項５５に記載のベクターを含む宿主細胞。
  57. 請求項１から５３のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  58. 請求項１から５３のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体およびそれにコンジュゲートするペイロードを含むコンジュゲートであって、前記ペイロードが、放射性標識、蛍光標識、酵素基質標識、親和性精製タグ、トレーサー分子、抗がん薬および細胞傷害性分子からなる群から選択される、コンジュゲート。
  59. 請求項１から５３のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体または請求項５８に記載のコンジュゲートおよび薬学的に許容される担体を含む組成物。
  60. 治療有効量の請求項１から５３のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体、請求項５１に記載の医薬組成物、請求項５８に記載のコンジュゲートまたは請求項５９に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、疾患、症状または症候を治療または予防する方法。
  61. 前記疾患が、がん、炎症性疾患、感染性もしくは寄生性疾患、心血管疾患、神経障害、精神神経性症状、傷害、自己免疫疾患、代謝疾患、神経変性疾患または血液凝固障害からなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
  62. 抗原の含有が疑われる試料を、請求項１から５３のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体と接触させるステップと、前記抗原および前記ポリペプチド複合体の間の複合体形成を判定するステップとを含む、抗原の存在またはレベルを検出する方法。
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