JP2013128452A - 定量分析装置、定量分析方法、脂質膜小胞、及び試薬 - Google Patents

Abstract

【課題】エキソソーム中のＲＮＡの定量分析におけるオペレータの負担の軽減。
【解決手段】アーム２５は、反応管Ｃ２に測定対象のＲＮＡを包含するエキソソームを吐出する。アーム３３は、反応管Ｃ２に本実施形態に係るリポソームを吐出する。リポソームは、測定対象のＲＮＡの逆転写のための逆転写酵素、プライマー、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、及び緩衝液を内包する脂質膜小胞である。融合用印加部３５は、エキソソームとリポソームとからなる融合膜小胞を生成するために、反応管Ｃ２内のエキソソームと脂質膜小胞とにエネルギーを印加する。破砕用印加部３７は、融合膜小胞から測定対象のＲＮＡの逆転写により合成された測定対象のＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを取り出すために、反応管Ｃ２内の融合膜小胞にエネルギーを印加する。ｃＤＮＡ検出部５０は、ｃＤＮＡを検出する。
【選択図】 図４

Description

本発明の実施形態は、定量分析装置、定量分析方法、脂質膜小胞、及び試薬に関する。

近年、腫瘍マーカーとしてマイクロＲＮＡ（micro ribonucleic acid：以下、ｍｉＲＮＡと呼ぶ）が注目されている。ｍｉＲＮＡは、腫瘍の発生に伴い組成比が変化し、血中量が増加する。そのため、ｍｉＲＮＡを診断に利用する場合、ｍｉＲＮＡの定量分析が重要となる。血中ｍｉＲＮＡは、タンパク質と結合した状態でエキソソームと呼ばれる脂質膜小胞に内包されている。ｍｉＲＮＡは、エキソソーム内に存在することで分解されづらく、エキソソーム内において安定して存在している。近年、血中ｍｉＲＮＡの定量方法が研究レベルで確立されつつある。

ＲＮＡの定量方法としてｑＲＴ−ＰＣＲ（quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction：定量的逆転写ＰＣＲ法：エフ・ホフマン・ロシュ）が知られている。ｑＲＴ−ＰＣＲのプロトコルでは、ＲＮａｓｅによりＲＮＡが分解されやすい。そのため、徹底したＲＮａｓｅ対策を施す必要があり、操作が煩雑になってしまう。

特開２００８−８１４８６号公報 特許第４０３３５０２号公報 特許第４１０２４５９号公報 特許第４７１８４３１号公報

Oberholzer T、Albrizio M、及びLuisi PL、「Polymerase chain reaction in liposomes」、Chem Biol、１９９５年、Ｏｃｔ、２（１０）、ｐ６７７−６８２

目的は、エキソソーム中のＲＮＡの定量分析におけるオペレータの負担を軽減可能な定量分析装置、定量分析方法、脂質膜小胞、及び試薬を提供することにある。

本実施形態に係る定量分析装置は、第１の反応管を保持し、前記第１の反応管を回動する合成用テーブルと、前記合成用テーブル上の第１の合成用吐出位置に配置された前記第１の反応管に測定対象のＲＮＡを包含するエキソソームを吐出する第１のアームと、前記合成用テーブル上の第２の合成用吐出位置に配置された前記第１の反応管に、前記測定対象のＲＮＡの逆転写のための逆転写酵素、プライマー、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、及び緩衝液を内包する脂質膜小胞を吐出する第２のアームと、前記エキソソームと前記脂質膜小胞とからなる融合膜小胞を生成するために、前記第１の反応管内の前記エキソソームと前記脂質膜小胞とに第１のエネルギーを印加する第１のエネルギー印加部と、前記融合膜小胞から前記測定対象のＲＮＡの逆転写により合成された前記測定対象のＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを取り出すために、前記第１の反応管内の前記融合膜小胞に第２のエネルギーを印加する第２のエネルギー印加部と、前記取り出されたｃＤＮＡを検出するｃＤＮＡ検出部と、を具備する。

本実施形態において利用されるエキソソームの断面を模式的に示す図。 本実施形態に係る定量分析装置の構成を示す図。 図２の定量分析機構の模式的な斜視図。 図２の定量分析機構の模式的な平面図。 図２のシステム制御部の制御のもとに行われる自動定量分析処理の大局的な流れを示す図。 図２の機構制御部の制御のもとに実行される前処理工程の典型的な流れを示す図。 図６の続きを示す図。 図２の機構制御部の制御のもとに実行される前処理工程の典型的な流れを模式的に示す図。 図２の機構制御部の制御のもとに実行される融合工程の典型的な流れを示す図。 図２の機構制御部の制御のもとに実行される融合工程の典型的な流れを模式的に示す図。 本実施形態において利用されるリポソームの断面を模式的に示す図。 本実施形態において利用される他のリポソームの断面を模式的に示す図。 図９の融合工程におけるエキソソームとリポソームとの融合により開始されるｃＤＮＡ合成反応を模式的に示す図。 図２の機構制御部の制御のもとに実行される破砕工程の典型的な流れを示す図。 図２の機構制御部の制御のもとに実行される検出工程の典型的な流れを示す図。 図１５の検出工程に係るウェルへのｃＤＮＡ溶液とＰＣＲ試薬との分注を模式的に示す図。 図２の計算部により利用される、サイクル数に伴うｃＤＮＡ量（ｍｉＲＮＡ量）の増幅曲線を示す図。 図２の計算部により初発のｃＤＮＡ量（ｍｉＲＮＡ量）の算出に利用される検量線を示す図。

以下、図面を参照しながら本実施形態に係わる定量分析装置、定量分析方法、脂質膜小胞、及び試薬を説明する。

本実施形態に係る定量分析装置は、遺伝子工学的手法を利用して測定対象を定量分析する装置である。主な測定対象としてはマイクロＲＮＡ（以下、ｍｉＲＮＡと呼ぶ）が挙げられる。ｍｉＲＮＡは、生体内に存在する２０塩基程度の短い１本鎖ＲＮＡである。本実施形態の測定対象となるｍｉＲＮＡは、がん等の腫瘍由来のｍｉＲＮＡであるとする。がん細胞は、自己のｍｉＲＮＡをエキソソームと呼ばれる脂質膜小胞に封入して体内に分泌している。なお、測定対象となるｍｉＲＮＡは、がん等の腫瘍由来のｍｉＲＮＡに限定されず、脂質膜小胞に封入にされている如何なるｍｉＲＮＡにも適用可能である。

図１は、本実施形態において利用されるエキソソーム１０１の断面を模式的に示す図である。図１に示すように、エキソソーム１０１は、球状の脂質二分子膜からなる。エキソソーム１０１の内側には、ｍｉＲＮＡ１０３が封入されている。ｍｉＲＮＡ１０３は、タンパク質（ｍｉＲＮＡ結合タンパク質）１０５に結合された状態でエキソソーム１０１に内包されている。また、エキソソーム１０１の表面には、タンパク質（エキソソーム特異的タンパク質）１０７が結合されている。例えば、腫瘍由来のエキソソーム１０１の場合、エキソソーム特異的タンパク質１０７としてＥｐＣＡＭ等が挙げられる。このように、ｍｉＲＮＡ１０３は、エキソソーム１０１に封入された状態で血液中に輸送される。この際、エキソソーム１０１に封入されているので、ｍｉＲＮＡ１０３は、ＲＮａｓｅにより分解されにくい。なお、通常、エキソソーム１０１には測定対象のｍｉＲＮＡのほか、複数種類のメッセンジャーＲＮＡやタンパク質が内包されている。

本実施形態に係る定量分析装置は、ＲＮａｓｅによるｍｉＲＮＡの分解による定量結果への影響を低減するための工夫を有している。以下、本実施形態に係る定量分析装置について詳細に説明する。

図２は、本実施形態に係る定量分析装置１の構成を示す図である。図２に示すように、定量分析装置１は、定量分析機構２、機構制御部３、計算部４、表示部５、操作部６、記憶部７、及びシステム制御部８を有する。定量分析機構２は、定量分析装置１の筐体のステージに設けられている。定量分析機構２は、機構制御部３による制御に従って動作し、検体の分注から、ｍｉＲＮＡの検出、より厳密には、ｍｉＲＮＡに相補的なｃＤＮＡの検出までを自動的に行う。定量分析機構２は、前処理部１０、合成・破砕部３０、及びｃＤＮＡ検出部５０を搭載している。前処理部１０は、ｍｉＲＮＡを含むエキソソームを検体から単離するための機械である。合成・破砕部３０は、脂質膜小胞内においてｍｉＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡを封入している脂質膜小胞を破砕する機械である。ｃＤＮＡ検出部５０は、ｃＤＮＡを検出する機械である。

機構制御部３は、ｍｉＲＮＡの定量分析のための所定のシーケンスに従って定量分析機構２の各部・各機構を制御する。計算部４は、定量分析機構２からのｃＤＮＡの検出結果に基づいてｍｉＲＮＡを定量分析する。表示部５は、計算部４によるｍｉＲＮＡの定量分析結果を表示機器に表示する。表示機器としては、例えばＣＲＴディスプレイや、液晶ディスプレイ、有機ＥＬディスプレイ、プラズマディスプレイ等が適用可能である。操作部６は、オペレータからの各種指示を入力するための入力機器を搭載している。入力機器としては、トラックボール、各種スイッチ、ボタン、マウス、キーボード等が適用可能である。記憶部７は、本実施形態に係る定量分析処理のための動作プログラムを記憶している。システム制御部８は、定量分析装置１の中枢として機能する。システム制御部８は、記憶部から動作プログラムを読み出し、このプログラムに従って各部を制御する。

次に、定量分析機構２の構成について詳細に説明する。図３は定量分析機構２の模式的な斜視図であり、図４は定量分析機構２の模式的な平面図である。なお、図３の点線で示されている部分は筐体の内部に収容されている部分である。

図３及び図４に示すように、例えば、合成・破砕部３０は、ステージ９の略中央に設けられる。前処理部１０とｃＤＮＡ検出部５０とは、合成・破砕部３０を挟むようにステージ９に設けられている。

前処理部１０は、磁気ビーズと磁石とを利用して検体からエキソソームを単離する。具体的には、前処理部１０は、前処理用テーブル１１、サンプルラック１３、サンプリングアーム１５、磁気ビーズ試薬アーム１７、磁気式攪拌部１９、磁気ビーズ洗浄部２１、エキソソーム溶出部２３、エキソソーム搬送アーム２５、及び第１反応管洗浄部２７を備える。

前処理用テーブル１１は、円周状に配列された複数の第１反応管Ｃ１を保持する。前処理用テーブル１１は、機構制御部３による制御に従って、一定の時間間隔で回転軸回りに所定角度だけ回動する。これにより、第１反応管Ｃ１は、回動と停止とを繰り返しながら円周状軌道を周回する。

サンプルラック１３は、ステージ９上の所定位置に配置される。サンプルラック１３は、サンプル管ＣＳを着脱可能に保持する。サンプル管ＣＳは、エキソソームを含む生体由来の溶液である検体を収容する。検体としては、測定対象者の全血、血清、血漿、腹水、尿、唾液等の、測定対象のｍｉＲＮＡを封入するエキソソームを含むあらゆる溶液が挙げられる。

サンプリングアーム１５は、サンプリングプローブ１５ｐを装備している。サンプリングアーム１５は、機構制御部３による制御に従って、上下動及び円周状の回動軌道に沿って回動する。また、サンプリングアーム１５は、機構制御部３による制御に従って、サンプリングプローブ１５ｐにより検体を吸入及び吐出する。サンプリングプローブ１５ｐの回動経路とサンプル管ＣＳの開口部とが交差する位置は、サンプル吸入位置に設定される。サンプリングプローブ１５ｐの回動経路と前処理用テーブル１１とが交差する位置は、サンプル吐出位置に設定される。

磁気ビーズ試薬アーム１７は、磁気ビーズ試薬プローブ１７ｐを装備している。磁気ビーズ試薬アーム１７は、機構制御部３による制御に従って、上下動及び円周状の回動軌道に沿って回動する。また、磁気ビーズ試薬アーム１７は、機構制御部３による制御に従って、磁気ビーズ試薬プローブ１７ｐにより磁気ビーズ試薬を吸入及び吐出する。磁気ビーズ試薬は、磁気ビーズを含む試薬溶液である。磁気ビーズ試薬は、磁気ビーズ試薬容器に収容されている。磁気ビーズ試薬容器は、磁気ビーズ試薬ラック１７ｒに着脱可能に保持されている。磁気ビーズ試薬プローブ１７ｐの回動経路と磁気ビーズ試薬容器の開口部とが交差する位置は、磁気ビーズ試薬吸入位置に設定される。磁気ビーズ試薬プローブ１７ｐの回動経路と前処理用テーブル１１とが交差する位置は、磁気ビーズ試薬吐出位置に設定される。

磁気式攪拌部１９は、ステージ９の内部に設けられている。磁気式攪拌部１９は、前処理用テーブル１１内の第１反応管Ｃ１の回動経路の一部分を挟むように設けられた一対の電磁石を有する。一対の電磁石に挟まれる空間領域は、攪拌位置に設定される。一対の電磁石は、機構制御部３による制御に従って攪拌位置に配置された第１反応管Ｃ１に交互に磁場を印加する。磁場の印加により反応管内の磁気ビーズが振動し、第１反応管Ｃ１内の検体と磁気ビーズ試薬との混合液が攪拌される。後述するように磁気式攪拌部１９による攪拌は、比較的長時間行われる方が良い。従って、複数の第１反応管Ｃ１の停止位置を挟むように複数の対の電磁石が配置されるとよい。

磁気ビーズ洗浄部２１は、前処理用テーブル１１の洗浄位置に隣接してステージ９上に設けられている。洗浄位置は、磁気式攪拌部１９による攪拌位置から第１反応管Ｃ１の移動方向に沿って所定距離だけ離れた位置に位置決めされている。磁気ビーズ洗浄部２１は、磁気ビーズ吸着磁石２９ｍ−１、廃液プローブ２９ｈ−１、洗浄液吐出プローブ２９ｓ−１、及び洗浄用攪拌機構２９ｋ−１を有する。磁気ビーズ吸着磁石２９ｍ−１は、洗浄位置内の吸着位置の近傍に設定される。磁気ビーズ吸着磁石２９ｍ−１は、吸着位置に配置された第１反応管Ｃ１に磁場を印加する。磁気ビーズ吸着磁石２９ｍ−１は、磁場を発生可能であれば、永久磁石や電磁石等の如何なる磁石でもよい。廃液プローブ２９ｈ−１は、吸着位置に隣接してステージ９上に設けられている。廃液プローブ２９ｈ−１は、機構制御部３による制御に従って、吸着位置に配置された第１反応管Ｃ１から溶液を吸入する。洗浄液吐出プローブ２９ｓ−１は、洗浄位置内の洗浄液吐出位置に隣接して設けられる。洗浄液吐出位置は、吸着位置から第１反応管Ｃ１の移動方向に沿って所定距離だけ離れた位置に位置決めされる。洗浄液吐出プローブ２９ｓ−１は、機構制御部３による制御に従って、洗浄液を吐出する。洗浄用攪拌機構２９ｋ−１は、洗浄位置内の攪拌位置に隣接して設けられている。攪拌位置は、洗浄液吐出位置から第１反応管Ｃ１の移動方向に沿って所定距離だけ離れた位置に位置決めされる。洗浄用攪拌機構２９ｋ−１は、物理的な攪拌を行う物理的攪拌部であっても、磁気的な攪拌を行う磁気式攪拌部であってもどちらでもよい。洗浄用攪拌機構２９ｋ−１を具体的に説明するために、以下、洗浄用攪拌機構２９ｋ−１は、物理的攪拌部であるとする。この場合、洗浄用攪拌機構２９ｋ−１は、攪拌アームを有している。攪拌アームは、先端に、樹脂性等の攪拌子を有している。攪拌アームは、機構制御部３による制御に従って、攪拌子を上下動する。攪拌子にはピエゾ素子が結合されている。ピエゾ素子は、機構制御部３による制御に従って振動する。ピエゾ素子の振動に伴って攪拌子が振動し、第１反応管Ｃ１内の溶液が攪拌される。

第１反応管Ｃ１内から不要な成分をできるだけ除去するために、磁気ビーズ洗浄部２１による洗浄は、複数回繰り返されると良い。洗浄を前処理テーブル１１を回動しながら繰り返すため、磁気ビーズ洗浄部２１は、第１反応管Ｃ１の移動方向に沿って複数設けられると良い。図３及び図４においては、具体例を示すため、２つの磁気ビーズ洗浄部２１が設けられているが、３つ以上の磁気ビーズ洗浄部２１が設けられても良い。

エキソソーム溶出部２３は、前処理用テーブル１１上の溶出位置に隣接してステージ９上に設けられている。溶出位置は、洗浄位置から第１反応管Ｃ１の移動方向に沿って所定距離だけ離された位置に位置決めされている。エキソソーム溶出部２３は、磁気ビーズ洗浄部２１と略同一の構成を有している。すなわち、エキソソーム溶出部２３は、第１反応管Ｃ１の移動方向に沿って磁気ビーズ吸着磁石２９ｍ−３、廃液プローブ２９ｈ−３、溶出液吐出プローブ２９ｙ、及び溶出用攪拌機構２９ｋ−３を有する。溶出液吐出プローブ２９ｙは、前処理用テーブル１１上の溶出位置内の溶出液吐出位置上に配置されている。溶出液吐出位置は、磁気ビーズ洗浄部２１に関する洗浄位置から第１反応管Ｃ１の移動方向に沿って所定距離だけ離れた位置に位置決めされる。溶出液吐出プローブ２９ｙは、機構制御部３による制御に従って、溶出液を吐出する。磁気ビーズ吸着磁石２９ｍ−３は磁気ビーズ吸着磁石２９ｍ−１と、廃液プローブ２９ｈ−３は廃液プローブ２９ｈ−１と、溶出用攪拌機構２９ｋ−３は洗浄用攪拌機構２９ｋ−１と略同一の構造を有する。

エキソソーム搬送アーム２５は、エキソソーム搬送プローブ２５ｐを装備している。エキソソーム搬送アーム２５は、機構制御部３による制御に従って、上下動及び円周状の回動軌道に沿って回動する。また、エキソソーム搬送アーム２５は、機構制御部３による制御に従って、エキソソーム搬送プローブ２５ｐによりエキソソームを含む溶出液を吸入及び吐出する。エキソソーム搬送プローブ２５ｐの回動経路と前処理用テーブル１１とが交差する位置は、エキソソーム吸入位置に設定される。また、エキソソーム搬送プローブ２５ｐの回動経路と後述する合成・破砕用テーブル３１とが交差する位置は、エキソソーム吐出位置に設定される。

第１反応管洗浄部２７−１は、前処理用テーブル１１の第１反応管洗浄位置に隣接してステージ９上に設けられている。第１反応管洗浄部２７−１は、例えば、洗浄液吐出プローブ、廃液プローブ、乾燥プローブを有する。洗浄液吐出プローブは、機構制御部３による制御に従って、反応間洗浄位置内の洗浄液吐出位置に配置された第１反応管Ｃ１に洗浄液を吐出する。廃液プローブは、機構制御部３による制御に従って、第１反応間洗浄位置内の廃液位置に配置された第１反応管Ｃ１から溶液を吸入する。乾燥プローブは、機構制御部による制御に従って、第１反応間洗浄位置内の乾燥位置に配置された第１反応管Ｃ１を乾燥する。

合成・破砕部３０は、合成・破砕用テーブル３１、リポソーム試薬アーム３３、攪拌機構２９ｋ、融合用エネルギー印加部３５、促進用エネルギー印加部３７、破砕用エネルギー印加部３９、ｃＤＮＡ溶液搬送アーム４１、及び反応管洗浄部２７を備える。

合成・破砕用テーブル３１は、円周状に配列された複数の第２反応管Ｃ２を保持する。合成・破砕用テーブル３１は、機構制御部３による制御に従って、一定の時間間隔で所定角度だけ回動する。これにより、第２反応管Ｃ２は、回動と停止とを繰り返しながら円周状軌道を周回する。

リポソーム試薬アーム３３は、エキソソームとは異なる脂質膜小胞を含む試薬を吸入及び吐出するためのリポソーム試薬プローブ３３ｐを装備している。脂質膜小胞は、典型的には、リポソームと呼ばれる球形の脂質膜小胞である。以下、この脂質膜小胞はリポソームであるとする。また、リポソームを含む試薬をリポソーム試薬と呼ぶことにする。リポソーム試薬アーム３３は、機構制御部３による制御に従って、上下動及び円周状の回動軌道に沿って回動する。また、リポソーム試薬アーム３３は、機構制御部３による制御に従って、リポソーム試薬プローブ３３ｐによりリポソーム試薬を吸入及び吐出する。リポソーム試薬プローブ３３ｐの回動経路と合成・破砕用テーブル３１とが交差する位置は、リポソーム試薬吐出位置に設定される。リポソーム試薬が収容された試薬容器は、リポソーム試薬ラック３３ｒに着脱可能に保持されている。リポソーム試薬プローブ３３ｐの回動経路上に配置されている。詳細は後述するが、リポソームは、球形の脂質膜を有している。本実施形態に係るリポソームの内側には、エキソソーム内のｍｉＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ（complementary DNA）の合成に必要な物質が人工的に封入されている。

融合用攪拌機構２９ｋ−４は、合成・破砕用テーブル３１上の攪拌位置に隣接してステージ９上に設けられている。この攪拌位置は、溶出液吐出位置から第２反応管Ｃ２の移動方向に沿って所定距離だけ離れた位置に位置決めされる。融合用攪拌機構２９ｋ−４は、洗浄用攪拌機構２９ｋ−１と略同一の構造を有している。

融合用エネルギー印加部３５は、合成・破砕用テーブル３１上の融合位置に隣接してステージ９上に設けられている。融合位置は、融合用攪拌機構２９ｋ−４に関する攪拌位置から第２反応管Ｃ２の移動方向に沿って所定距離だけ離れた位置に位置決めされる。具体的には、融合用エネルギー印加部３５は、機構制御部３による制御に従って、融合位置に配置された第２反応管Ｃ２内においてエキソソームとリポソームとを整列させるために、融合位置に配置された第２反応管Ｃ２にエネルギーを印加する。エネルギーとしては、エキソソームとリポソームとを整列させる効果を有するものであれば手段を限定しないが、交流電場が望ましい。

このように、エキソソームとリポソームとが接近した状態においてエキソソームとリポソームとにエネルギーを印加することで、エキソソームとリポソームとが融合する。エネルギーとしては、電気エネルギーや音響エネルギー等の如何なるエネルギーでも良い。融合後の脂質膜小胞を融合膜小胞と呼ぶことにする。エキソソームとリポソームとが融合されることにより、逆転写酵素によるｍｉＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成反応が開始される。ｃＤＮＡ合成反応により、融合膜小胞内において、ｍｉＲＮＡに相補的なｃＤＮＡが合成される。

促進用エネルギー印加部３７は、合成・破砕用テーブル３１上の促進位置に隣接してステージ３７内に設けられている。促進位置は、融合位置から第２反応管Ｃ２の移動方向に沿って所定距離だけ離れた位置に位置決めされる。具体的には、促進用エネルギー印加部３７は、機構制御部３による制御に従って、促進位置に配置された第２反応管Ｃ２内におけるｃＤＮＡ合成反応を促進するために、促進位置に配置された第２反応管Ｃ２にエネルギーを与える。具体的には、促進用エネルギー印加部３７は、ヒーター等の熱発生装置からなる。この場合、促進用エネルギー印加部３７は、機構制御部３による制御に従って、促進位置に配置された第２反応管Ｃ２内をｃＤＮＡ合成に適した温度に調整するために、促進位置に配置された第２反応管Ｃ２に熱エネルギーを与える。また、促進用エネルギー印加部３７は、ｃＤＮＡ合成反応をさらに促進するために超音波発生装置を含んでいても良い。この場合、超音波発生装置は、合成・破砕用テーブル３１のうちの、促進位置に配置された第２反応管Ｃ２の底面近傍に取り付けられる。この状態において超音波発生装置は、機構制御部３による制御に従って、促進位置に配置された第２反応管Ｃ２に超音波を照射する。なお、ｃＤＮＡ合成反応の促進手段は、超音波発生装置のみに限定されず、電場発生装置であってもよい。

破砕用エネルギー印加部３９は、合成・破砕用テーブル３１上の破砕位置に隣接してステージ９内に設けられている。破砕位置は、促進位置から第２反応管Ｃ２の移動方向に沿って所定距離だけ離れた位置に位置決めされる。具体的には、破砕用エネルギー印加部３９は、機構制御部３による制御に従って、破砕位置に配置された第２反応管Ｃ２内の融合膜小胞を破砕するために、融合位置に配置された第２反応管Ｃ２にエネルギーを印加する。エネルギーとしては、電気エネルギーや音響エネルギー等の如何なるエネルギーでも良い。また、第２反応管Ｃ２に界面活性剤を添加することにより融合膜小胞を破砕しても良い。

融合膜小胞が破砕されることにより、第２反応管Ｃ２内の溶出液に融合膜小胞からｃＤＮＡが流出する。以下、ｃＤＮＡを含む溶出液をｃＤＮＡ溶液と呼ぶことにする。

ｃＤＮＡ溶液搬送アーム４１は、ｃＤＮＡ溶液搬送プローブ４１ｐを装備している。ｃＤＮＡ溶液搬送アーム４１は、機構制御部３による制御に従って、上下動及び円周状の回動軌道に沿って回動する。また、ｃＤＮＡ溶液搬送アーム４１は、機構制御部３による制御に従って、ｃＤＮＡ溶液搬送プローブ４１ｐによりｃＤＮＡ溶液を吸入及び吐出する。ｃＤＮＡ溶液プローブ４１ｐの回動経路と合成・破砕用テーブル３１とが交差する位置は、ｃＤＮＡ溶液吸入位置に設定される。ｃＤＮＡ溶液プローブ４１ｐの回動経路と後述のｃＤＮＡ溶液保持板５１とが交差する位置は、ｃＤＮＡ溶液吐出位置に設定される。

第２反応管洗浄部２７−２は、合成・破砕用テーブル３１の第２反応管洗浄位置に隣接してステージ９上に設けられている。第２反応管洗浄部２７−２は、第１反応管洗浄部２７−１と略同一の構造を有している。従って、第２反応管洗浄部２７−２についての詳細な構成の説明については省略する。

ｃＤＮＡ検出部５０は、ｃＤＮＡを増幅及び検出する。本実施形態においてｃＤＮＡ検出部５０は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応：Polymerase Chain Reaction）法やＩＣＡＮ（isothermal and chimeric primer initiated amplification of nucleic acids）法等によりｃＤＮＡを増幅及び検出する。以下の説明を具体的に行うため、ｃＤＮＡ検出部５０は、ＰＣＲ法、特に定量ＰＣＲ法（リアルタイムＰＣＲ法）によりｃＤＮＡを増幅及び検出するものとする。

定量ＰＣＲ法の実行のため、ｃＤＮＡ検出部５０は、ｃＤＮＡ溶液保持板５１、プレート搬送部５３、ＰＣＲ試薬アーム５５、ＰＣＲ用温度調節部５７、及び蛍光検出部５９を備えている。

ｃＤＮＡ溶液保持板５１は、ｃＤＮＡ溶液を収容可能な複数の収容部ＣＷを有する板状構造物である。具体的には、ｃＤＮＡ溶液保持板５１は、ｃＤＮＡ溶液を収容可能な複数の窪み（以下、ウェルと呼ぶ）ＣＷを有するマルチウェルプレートである。以下、ｃＤＮＡ溶液保持板５１をマルチウェルプレート５１と呼ぶことにする。例えば、マルチウェルプレート５１には、複数のウェルＣＷが２次元状に配列されている。ｃＤＮＡ溶液吐出位置に配置されたウェルＣＷには、ｃＤＮＡ溶液搬送アーム４１によりｃＤＮＡ溶液が吐出される。マルチウェルプレート５１は、既存のものが用いられれば良い。

プレート搬送部５３は、機構制御部３からの制御に従って、マルチウェルプレート５１を直線的に移動し、ＰＣＲ用温度調節部５７の上部に配置する。具体的には、プレート搬送部５３は、プレート搬送機構と駆動装置とからなる。プレート搬送機構は、マルチウェルプレート５１を直線的に往復移動可能に支持している。駆動装置は、機構制御部３からの制御に従って駆動し、マルチウェルプレート５１を直線的な移動経路に沿って移動し、マルチウェルプレート５１をＰＣＲ用温度調節部５７の上部に配置する。

ＰＣＲ試薬アーム５５は、マルチウェルプレート５１のプレート搬送部５３に隣接してステージ９上に設けられる。ＰＣＲ試薬アーム５５は、ＰＣＲ溶液を吸入及び吐出するための複数のＰＣＲ溶液プローブ５５ｐを装備している。複数のＰＣＲ試薬プローブ５５ｐの鉛直下は、ＰＣＲ試薬吐出位置に設定される。ＰＣＲ試薬は、ＰＣＲ反応によりｍｉＲＮＡを増幅するための物質を含む溶液である。ＰＣＲ試薬は、測定対象のｍｉＲＮＡ毎に用意される。ＰＣＲ試薬は、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、緩衝液、及び測定対象のｍｉＲＮＡに応じたプローブ（ＤＮＡ分子）のセットを含んでいる。さらに、ＰＣＲ試薬は、ｃＤＮＡの検出のための蛍光色素を含んでいてもよい。ＰＣＲ試薬アーム５５は、機構制御部３による制御に従って、複数のＰＣＲ試薬プローブ５５ｐにより、ＰＣＲ試薬吐出位置に配置された複数のウェルＣＷにＰＣＲ溶液を吐出する。

ＰＣＲ用温度調節部５７は、マルチウェルプレート５１の移動方向に沿ってプレート搬送部５３に隣接してステージ９の内部に設けられている。ＰＣＲ用温度調節部５７は、機構制御部３による制御に従って熱エネルギーを発生し、ウェルＣＷ内のｃＤＮＡがＰＣＲ反応を起こすようにマルチプレート５１の温度を段階的に変化させる。具体的には、ＰＣＲ用温度調節部５７は、ヒーター装置により実現される。

蛍光検出部５９は、ＰＣＲ用温度調節部５７の近傍に設けられる。蛍光検出部５９は、機構制御部３による制御に従って、ウェルＣＷ内のｃＤＮＡを光学的に検出する。検出結果は、計算部４に転送される。具体的には、蛍光検出部５９は、蛍光励起用の光源と光検出器とを装備している。光源は、励起光を発生する。励起光が照射されるとｃＤＮＡは蛍光を発生する。光検出器は、発生された蛍光を検出する。例えば、光検出器は、蛍光を検出可能な複数の光検出素子を有している。光検出素子としては、蛍光を検出可能なものであれば、光電子増倍管やフォトダイオード、ＣＣＤ（charge coupled device）、ＣＭＯＳ（complementary metal-oxide semiconductor）等の如何なる素子でもよい。また、光検出器は、分光器であってもよい。しかしながら、以下の説明を具体的に行うため、光検出素子はＣＣＤであり、光検出器は複数のＣＣＤを備えるＣＣＤカメラであるとする。ＣＣＤカメラは、ウェルＣＷがＣＣＤカメラの撮像視野に含まれる位置に配置される。ＣＣＤカメラにより発生された画像データは、蛍光検出部５９の検出結果として、計算部４に転送される。

以上で、定量分析機構２の構成についての説明を終了する。

次に、本実施形態に係る定量分析装置１の動作例について説明する。図５は、システム制御部８の制御のもとに行われる自動定量分析処理の大局的な流れを示す図である。システム制御部８は、オペレータにより操作部６を介して開始指示がなされたことを契機として、自動定量分析処理を開始する。まず、システム制御部８は、機構制御部３に前処理工程を実行させる（ステップＳＡ）。前処理工程において機構制御部３は、前処理部１０を制御し、検体から測定対象のｍｉＲＮＡを含むエキソソームを単離する。ステップＳＡが行われるとシステム制御部８は、機構制御部３に融合工程を実行させる（ステップＳＢ）。融合工程において機構制御部３は、単離されたエキソソームとリポソームとを融合し、融合膜小胞を生成する。融合膜小胞が生成されることにより、融合膜小胞内においてｍｉＲＮＡに相補的なｃＤＮＡの合成反応が開始される。ステップＳＢが行われるとシステム制御部８は、機構制御部３に破砕工程を実行させる（ステップＳＣ）。破砕工程において機構制御部３は、ｃＤＮＡを封入する融合膜小胞を破砕し、融合膜小胞からｃＤＮＡを抽出する。ステップＳＣが行われるとシステム制御部８は、機構制御部３に検出工程を実行させる（ステップＳＤ）。検出工程において機構制御部３は、ｃＤＮＡを定量ＰＣＲ反応により増幅及び検出する。ステップＳＤが行われるとシステム制御部８は、計算部４に定量分析工程を実行させる（ステップＳＥ）。定量分析工程において計算部４は、ｃＤＮＡの検出結果に基づいて測定対象のｍｉＲＮＡの定量分析を行う。ステップＳＥが行われるとシステム制御部８は、本実施形態に係る自動定量分析処理を終了する。

次に、ステップＳＡ〜ＳＥまでの各工程について詳細に説明する。

図６と図７とは機構制御部３の制御のもとに実行される前処理工程（ステップＳＡ）の典型的な流れを示す図である。図８は、前処理工程（ステップＳＡ）の典型的な流れを模式的に示す図である。ステップＳＡにおいて機構制御部３は、前処理部１０を制御し、前処理工程を実行する。前処理工程において機構制御部３は、前処理用テーブル１１を所定期間毎に第１反応管ＣＥ一個分ずつ回動させる。例えば、前処理用テーブル１１は、３０秒毎に回動される。

前処理工程において、まず、機構制御部３は、サンプリングアーム１５を制御する（ステップＳＡ１）。ステップＳＡ１においてサンプリングアーム１５は、サンプリングプローブ１５ｐにより検体吸入位置に配置されたサンプル管ＣＷから検体を吸入し、サンプリングプローブ１５ｐを前処理用テーブル１１の検体吐出位置に回動し、検体吐出位置に配置された第１反応管Ｃ１に検体を吐出する。検体には、測定対象のｍｉＲＮＡを含むエキソソームが含まれている。検体は、サンプリングプローブ１５ｐにより適量が分取される。複数の検体を定量分析する場合、サンプリングアーム１５は、前処理用テーブル１１が回動する毎に検体の吸入及び吐出を繰り返す。

ステップＳＡ１が行われると機構制御部３は、引き続き前処理用テーブル１１を制御する（ステップＳＡ２）。ステップＳＡ２において前処理用テーブル１１は、回動と停止とを交互に繰り返しながら、検体が収容された第１反応管Ｃ１を磁気ビーズ試薬吐出位置に配置する。

ステップＳＡ２が行われると機構制御部３は、磁気ビーズ試薬アーム１７を制御する（ステップＳＡ３）。ステップＳＡ３において磁気ビーズ試薬アーム１７は、磁気ビーズ試薬プローブ１７ｐにより磁気ビーズ試薬位置に配置された第１反応管Ｃ１に磁気ビーズ試薬を吐出する。これにより第１反応管Ｃ１内に検体と磁気ビーズ試薬とが収容される。磁気ビーズ試薬は、磁気ビーズが分散されている懸濁液である。図８の（ａ）に示すように、磁気ビーズ２０１の表面には複数の抗体（抗エキソソーム特異的タンパク質抗体）２０３が人工的に固定されている。抗エキソソーム特異的タンパク質抗体２０３は、エキソソーム１０１の表面に提示されたエキソソーム特異的タンパク質１０７に特異的に結合可能なタンパク質である。例えば、エキソソーム１０１が腫瘍由来の場合、エキソソーム１０１の表面にはＥｐＣＡＭ等の腫瘍特異的タンパク質１０７が提示されている。

ステップＳＡ３が行われると機構制御部３は、引き続き前処理用テーブル１１を制御する（ステップＳＡ４）。ステップＳＡ４において前処理用テーブル１１は、回動と停止とを交互に繰り返しながら、磁気ビーズ試薬が収容された第１反応管Ｃ１を攪拌位置に配置する。

ステップＳＡ４が行われると機構制御部３は、磁気式攪拌部（電磁石板）１９を制御する（ステップＳＡ５）。ステップＳＡ５において、攪拌位置を挟む一対の電磁石板１９は、機構制御部３の制御の下に交互に繰り返し磁場を発生する。具体的には、内側の電磁石板１９が磁場を発生し、かつ、外側の電磁石板１９が磁場を発生しないように、あるいは、内側の電磁石板１９が磁場を発生せず、かつ、外側の電磁石板が磁場を発生するように、機構制御部３は一対の電磁石板１９の磁場のＯＮとＯＦＦとを切替える。ＯＮとＯＦＦとの切替えは、１０Ｈｚ程度の周波数で行われるとよい。一対の電磁石板１９から交互に磁場が発生することにより、第１反応管Ｃ１内の磁気ビーズが泳動する。磁気ビーズの泳動により第１反応管Ｃ１内の混合液が攪拌する。混合液の攪拌により、図８の（ｂ）に示すように、磁気ビーズ２０１とエキソソーム１０１とが接近し、エキソソーム１０１が磁気ビーズ２０１に吸着する。より詳細には、エキソソーム１０１の表面に提示されたエキソソーム特異的タンパク質１０７と磁気ビーズ２０１の表面に提示された抗エキソソーム特異的タンパク質抗体２０３とが結合する。多くのエキソソーム１０１を磁気ビーズ２０１に吸着させるために、第１反応管Ｃ１は、例えば、１０分等、比較的長時間かけて攪拌位置を通過するとよい。

ステップＳＡ５が行われると機構制御部３は、引き続き前処理用テーブル１１を制御する（ステップＳＡ６）。ステップＳＡ６において前処理用テーブル１１は、回動と停止とを交互に繰り返しながら第１反応管Ｃ１を洗浄位置に配置する。より詳細には、まず、洗浄位置の吸着位置に反応管が配置される。図８の（ｃ）に示すように、吸着位置における前処理用テーブル１１の壁面には磁気ビーズ吸着磁石２９ｍが設けられている。吸着位置に第１反応管Ｃ１が配置されると、磁気ビーズ吸着磁石２９ｍからの磁場により磁気ビーズ２０１が第１反応管Ｃ１の壁面に引き寄せられる。これにより、第１反応管Ｃ１内の磁気ビーズ２０１とエキソソーム１０１との結合体３０１が他の不用な成分から分離される。不用な成分は、例えば、エキソソーム以外の血清や血漿等である。

ステップＳＡ６が行われると機構制御部３は、磁気ビーズ洗浄部２１を制御する（ステップＳＡ７）。ステップＳＡ７において磁気ビーズ洗浄部２１は、廃液プローブ２９ｈにより、吸着位置に配置された第１反応管Ｃ１内のエキソソーム―磁気ビーズ結合体以外の他の不用な成分を廃棄する。結合体は、磁気ビーズ吸着磁石２９ｍからの磁場により第１反応管Ｃ１の内壁に引き寄せられているので、エキソソーム―磁気ビーズ結合体を誤って廃棄することを防止できる。なお、廃棄後においても、不用な他の成分（残渣成分）がエキソソーム―磁気ビーズ結合体に付着している可能性は十分にある。

ステップＳＡ７が行われると機構制御部３は、引き続き前処理用テーブル１１を制御する（ステップＳＡ８）。ステップＳＡ８において前処理用テーブル１１は、回動と停止とを交互に繰り返しながら第１反応管Ｃ１を洗浄位置内の洗浄液吐出位置に配置する。なお、洗浄液吐出位置は、磁気ビーズ吸着磁石２９ｍからの磁場の影響を受けない位置に設定されている。

ステップＳＡ８が行われると機構制御部３は、磁気ビーズ洗浄部２１を制御する（ステップＳＡ９）。ステップＳＡ９において磁気ビーズ洗浄部２１は、洗浄液吐出プローブ２９ｓにより、洗浄液吐出位置に配置された第１反応管Ｃ１内に洗浄液を吐出する。洗浄液は、エキソソーム―磁気ビーズ結合体から残渣成分を引き離すための液体である。洗浄液は、界面活性剤などエキソソームを破壊する成分を含まず、タンパク質の除去効果を有するものが望ましい。具体的には、中性のリン酸緩衝液などが望ましい。

ステップＳＡ９が行われると機構制御部３、引き続き前処理用テーブル１１を制御する（ステップＳＡ１０）。ステップＳＡ１０において前処理用テーブル１１は、回動と停止とを交互に繰り返しながら第１反応管Ｃ１を洗浄位置内の攪拌位置に配置する。

ステップＳＡ１０が行われると機構制御部３は、磁気ビーズ洗浄部２１を制御する（ステップＳＡ１１）。ステップＳＡ１１において磁気ビーズ洗浄部２１は、攪拌機構２９ｋにより、攪拌位置に配置された第１反応管Ｃ１内の洗浄液を攪拌する。これにより洗浄液内において残渣成分とエキソソーム―磁気ビーズ結合体とが分散される。

第１反応管Ｃ１内から残渣成分をできるだけ除去するために、ステップＳＡ６〜ＳＡ１１の磁気ビーズ洗浄部２１による洗浄工程は、設置されている磁気ビーズ洗浄部２１の数だけ繰り返される。

図７に示すように、ステップＳＡ１１が行われると機構制御部３は、引き続き前処理用テーブル１１を制御する（ステップＳＡ１２）。ステップＳＡ１２において前処理用テーブル１１は、回動と停止とを交互に繰り返しながら第１反応管Ｃ１を溶出位置内の吸着位置に配置する。前述のように、吸着位置における前処理用テーブル１１の壁面には磁気ビーズ吸着磁石２９ｍ−３が設けられている。吸着位置に第１反応管Ｃ１が配置されると、磁気ビーズ吸着磁石２９ｍ−３からの磁場により磁気ビーズが第１反応管Ｃ１の壁面に引き寄せられる。これにより、第１反応管Ｃ１内のエキソソーム―磁気ビーズ結合体が残渣成分から分離される。

ステップＳＡ１２が行われると機構制御部３は、エキソソーム溶出部２３を制御する（ステップＳＡ１３）。ステップＳＡ１３においてエキソソーム溶出部２３は、廃液プローブ２９ｈ−３により、吸着位置に配置された第１反応管Ｃ１内のエキソソーム―磁気ビーズ結合体以外の残渣成分を廃棄する。

ステップＳＡ１３が行われると機構制御部３は、引き続き前処理用テーブル１１を制御する（ステップＳＡ１４）。ステップＳＡ１４において前処理用テーブル１１は、回動と停止とを交互に繰り返しながら第１反応管Ｃ１を溶出位置内の溶出液吐出位置に配置する。なお、溶出液吐出位置は、磁気ビーズ吸着磁石２９ｍからの磁場の影響を受けない位置に設定されている。

ステップＳＡ１４が行われると機構制御部３は、エキソソーム溶出部２３を制御する（ステップＳＡ１５）。ステップＳＡ１５においてエキソソーム溶出部２３は、溶出液プローブ２９ｙにより、溶出液吐出位置に配置された第１反応管Ｃ１内に溶出液を吐出する。溶出液は、磁気ビーズからエキソソームを溶出するための緩衝液である。溶出液は、界面活性剤などエキソソームを破壊する成分を含まず、磁気ビーズに結合された抗体からエキソソームを解離させる効果を有するものが望ましい。例えば、溶出液としては酸性緩衝液などが用いられる。図８の（ｄ）に示すように、緩衝液により第１反応管Ｃ１内の溶液のｐＨが変化し、抗エキソソーム特異的タンパク質抗体２０３とエキソソーム特異的タンパク質１０７との結合力が弱まり、磁気ビーズ２０１とエキソソーム１０１とが分離する。

ステップＳＡ１５が行われると機構制御部３は、引き続き前処理用テーブル１１を制御する（ステップＳＡ１６）。ステップＳＡ１６において前処理用テーブル１１は、回動と停止とを交互に繰り返しながら第１反応管Ｃ１を溶出位置内の攪拌位置に配置する。

ステップＳＡ１６が行われると機構制御部３は、エキソソーム溶出部２３を制御する（ステップＳＡ１７）。ステップＳＡ１７においてエキソソーム溶出部２３は、攪拌機構２９ｋ−３により、攪拌位置に配置された第１反応管Ｃ１内の溶出液を攪拌する。攪拌により磁気ビーズからのエキソソームの溶出が促進される。なお、磁気ビーズ表面の抗体の非特異反応を抑制するため、前処理用テーブル１１において第１反応管Ｃ１が４〜１０℃に調整されていると良い。

ステップＳＡ１７が行われると機構制御部３は、引き続き前処理用テーブル１１を制御する（ステップＳＡ１８）。ステップＳＡ１８において前処理用テーブル１１は、回動と停止とを交互に繰り返しながら第１反応管Ｃ１をエキソソーム吸入位置に配置する。なお、図４に示すように、エキソソーム吸入位置の近傍には、磁石２９ｍ−４が設置されている。磁石２９ｍ−４から発生される磁場によりエキソソーム吸入位置に配置された第１反応管Ｃ１の壁面に磁気ビーズが引き寄せられる。これにより磁気ビーズとエキソソームとが第１反応管Ｃ１内において分離される。

ステップＳＡ１８が行われると機構制御部３は、エキソソーム搬送アーム２５を制御する（ステップＳＡ１９）。ステップＳＡ１９においてエキソソーム搬送アーム２５は、エキソソーム搬送プローブ２５ｐによりエキソソーム吸入位置に配置された第１反応管Ｃ１からエキソソームを含む溶出液（以下、エキソソーム溶液と呼ぶ）を所定量だけ吸入し、エキソソーム搬送プローブ２５ｐを合成・破砕用テーブル３１のエキソソーム吐出位置に回動し、エキソソーム吐出位置に配置された第２反応管Ｃ２にエキソソーム溶液を吐出する。

以上で前処理部１０による前処理工程が終了する。その後、第１反応管Ｃ１は、第１反応管洗浄部２７−１により洗浄され、再び初期位置に戻る。そして再び、サンプリングアーム１５により第１反応管Ｃ１に検体が分注される。

前述のように、本実施形態において前処理部１０は、磁気ビーズと磁石とを利用して検体からのエキソソームを単離するとした。これにより大型の遠心分離器を用いることなくエキソソームを単離することを実現している。しかしながら、エキソソームの単離手段は、単離されたエキソソームが破壊されなければ、磁気ビーズと磁石とを用いる方法に限定されない。例えば、前処理部１０は、限外ろ過膜、クロマトグラフ、遠心分離器等により検体からエキソソームを単離しても良い。

なお、検体からエキソソームを単離する必要がない場合、前処理部１０は不用である。例えば、人為的に検体から単離されたエキソソームを用意し、このエキソソームをエキソソーム搬送アーム２５により第２反応管Ｃ２に分注してもよい。

次に、機構制御部３による制御のもとに合成・破砕部３０により行われる融合工程の詳細について説明する。図９は機構制御部３の制御のもとに実行される融合工程（ステップＳＢ）の典型的な流れを示す図である。図１０は、合成・破砕部３０による融合工程（ステップＳＢ）と破砕工程（ステップＳＣ）との典型的な流れを模式的に示す図である。

なお、以下の説明を具体的に行うため、融合用エネルギー印加部３５と破砕用エネルギー印加部３９とが印加するエネルギーは、電気エネルギーであるとする。この場合、図１０に示すように、各第２反応管Ｃ２の両側面には、一対の電極Ｃ２ｅが取り付けられている。一対の電極Ｃ２ｅは、後述する融合膜小胞の合成や破砕の際に利用される。電極Ｃ２ｅは、各第２反応管Ｃ２の外壁に露出されている。

ステップＳＢにおいて機構制御部３は、合成・破砕部３０を制御し、融合工程を実行する。融合工程において機構制御部３は、合成・破砕用テーブル３１を所定期間毎に第２反応管Ｃ２一個分ずつ回動させる。例えば、合成・破砕用テーブル３１は、３０秒毎に回動される。

融合工程において、まず、機構制御部３は、合成・破砕用テーブル３１を制御する（ステップＳＢ１）。ステップＳＢ１において合成・破砕用テーブル３１は、回動と停止とを交互に繰り返しながら第２反応管Ｃ２をリポソーム試薬吐出位置に配置する。

ステップＳＢ１が行われると機構制御部３は、リポソーム試薬アーム３３を制御する（ステップＳＢ２）。ステップＳＢ２においてリポソーム試薬アーム３３は、図１０の（ａ）に示すように、リポソーム試薬プローブ３３ｐにより、リポソーム試薬吐出位置に配置された第２反応管Ｃ２に、リポソーム４０１を含むリポソーム試薬４０３を吐出する。これにより第２反応管Ｃ２内にエキソソーム溶液１１１とリポソーム試薬４０３との両方が収容される。前述のように、リポソーム試薬４０３は、リポソーム４０１と緩衝液との混合液である。リポソーム試薬４０３は、ｍｉＲＮＡを分解するＲＮａｓｅを含まないように生成される。

図１１は、本実施形態に係るリポソーム４０１の断面を模式的に示す図である。リポソーム４０１の内側には、逆転写酵素４０５、プライマー（ＤＮＡ断片）４０７、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ：deoxyribonucleotide triphosphate）、及び緩衝液が封入されている。典型的には、リポソーム４１０は、リン脂質から人工的に再構成される。逆転写酵素４０５は、ｍｉＲＮＡからｃＤＮＡを合成するための酵素である。プライマー４０７は、ｍｉＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡの合成の開始点となるオリゴヌクレオチドである。本実施形態に係るプライマー４０７としては、如何なる構造のものも適用可能である。しかし、本実施形態においてはプローブ４０７としてステムループ・プライマーが利用されることが望ましい。その理由は後述する。ｄＮＴＰは、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、及びチミンの４種類の塩基のヌクレオチド三リン酸である。緩衝液は、例えば、リポソーム４０１内の逆転写酵素４０５、ステムループ・プライマー４０７、及びｄＮＴＰを保護するためにｐＨを一定に保つために利用される。さらに、リポソーム４０１の内側には、エキソソーム内のｍｉＲＮＡ結合タンパク質を不活性化させるための界面活性剤４０９が内包されてもよい。

図１１に示すように、リポソーム４０１の膜成分は、エキソソームとリポソーム４０１との接近を促進するために、少なくとも外膜が正電荷を帯びていると良い。あるいは、図１２に示すように、リポソーム２０１の表面にエキソソームを特異的に認識する抗エキソソーム特異的タンパク質抗体２０３を結合してもよい。例えば、エキソソームが腫瘍由来の場合、抗エキソソーム特異的タンパク質抗体２０３は抗ＥｐＣＡＭ抗体であると良い。また、エキソソームとの融合の障壁を失くすため、リポソーム４０１の膜構造はシングルラメラ構造（脂質二分子膜）であり、膜厚はエキソソームと略同じ３〜６ｎｍであると良い。理由は後述するが、リポソーム４０１は、エキソソームに比して十分に大きく生成されると良い。

ステップＳＢ２が行われると機構制御部３は、引き続き合成・破砕用テーブル３１を制御する（ステップＳＢ３）。ステップＳＢ３において合成・破砕用テーブル３１は、回動と停止とを交互に繰り返しながら第２反応管Ｃ２を攪拌位置に配置する。

ステップＳＢ３が行われると機構制御部３は、攪拌機構２９ｋ−４を制御する（ステップＳＢ４）。ステップＳＢ４において攪拌機構２９ｋ−４は、攪拌子により、攪拌位置に配置された第２反応管Ｃ２内のエキソソーム溶液とリポソーム試薬溶液とを攪拌する。

ステップＳＢ４が行われると機構制御部３は、引き続き合成・破砕用テーブル３１を制御する（ステップＳＢ５）。ステップＳＢ５において合成・破砕用テーブル３１は、回動と停止とを交互に繰り返しながら第２反応管Ｃ２を融合位置に配置する。

ステップＳＢ５が行われると機構制御部３は、融合用エネルギー印加部３５を制御する（ステップＳＢ６）。ステップＳＢ６において融合用エネルギー印加部３５は、融合位置に配置された第２反応管Ｃ２に交流電場を印加し、第２反応管Ｃ２内においてエキソソームとリポソームとを整列させる。具体的には、融合用エネルギー印加部３５は、図１０の（ｂ）に示すように、一対の電極接点３５ｃと電力発生器３５ｅとを有している。一対の電極接点３５ｃは、融合位置における合成・破砕用テーブル３１の壁面に、第２反応管Ｃ２に設けられた一対の電極板Ｃ２ｅに接触するように取り付けられている。融合位置に第２反応管Ｃ２が配置されると、電極板Ｃ２ｅと電極接点３５ｃとが接触する。一対の電極接点３５ｃは、配線を介して電力発生器３５ｅに接続されている。電力発生器３５ｅは、機構制御部３による制御に従って、電力を発生する。これにより、一対の電極接点３５ｃの間に電場が与えられる。ステップＳＢ６において電力発生器３５ｅは、図１０の（ｂ）に示すように、機構制御部３の制御に従って、一対の電極板Ｃ２ｅの間に交流電場を付加する。エキソソーム１０１とリポソーム４０１とは、電気粘性効果により電場に沿って接近し整列する。

前述のようにエキソソームとリポソームとは異なる大きさを有している。大きさの異なるエキソソームとリポソームとを整列させるため、誘電泳動がおこらないように、電場は空間的に均一である。そのため、電極板Ｃ２ｅは、電極板Ｃ２ｅ間距離に比して十分な面積を有する平行電極板であることが望ましい。例えば、電極板Ｃ２ｅ間に付加される電場の交流周波数は、例えば、５００〜１０００ｋＨｚであり、電場の強さは１０Ｖ／ｍｍ程度に設定されると良い。エキソソームの表面には、負電荷を帯びた脂質ホスファチジルセリンが存在する。従って、前述のように、リポソームの膜成分が正電荷を帯びている場合、エキソソームとリポソームとの接近及び吸着が促進される。また、リポソームの表面に抗エキソソーム特異的タンパク質抗体が結合されている場合も、エキソソームとリポソームとの接近及び吸着が促進される。

ステップＳＢ６が行われると機構制御部３は、融合用エネルギー印加部３５を制御する（ステップＳＢ７）。ステップＳＢ７において融合用エネルギー印加部３５は、電気穿孔法（エレクトロポレーション）により、エキソソームとリポソームとを融合する。具体的には、融合用エネルギー印加部３５の電力発生装置３５ｅは、機構制御部３による制御に従って、図１０の（ｃ）に示すように、一対の電極板Ｃ２ｅ間にパルス状の直流電場を印加する。パルス状の直流電場の印加により、エキソソーム１０１とリポソーム４０１との脂肪膜に孔が形成される。電極板Ｃ２ｅ間に印加される電場は、エキソソーム１０１とリポソーム４０１とに可逆的な孔が形成される程度の強さに設定される。例えば、電場の強さ５０〜１００Ｖ／ｍｍ程度に設定され、パルス幅は５０μｓｅｃに設定されるとよい。

エキソソームとリポソームとが接近した状態においてエキソソームとリポソームとの脂肪膜に孔が形成されると、エキソソームとリポソームとが融合し、融合膜小胞を形成する。融合過程において反応管内の外部溶液が融合膜小胞内に流入する可能性がある。外部溶液の流入を防止するため、例えば、外部溶液（すなわち、エキソソーム溶液及びリポソーム試薬）を融合膜小胞内の溶液（すなわち、エキソソーム内の溶液及びリポソーム内の溶液）よりも浸透圧が高い高張液にすると良い。

ステップＳＢ７が行われると機構制御部３は、合成・破砕用テーブル３１を制御する（ステップＳＢ８）。ステップＳＢ８において合成・破砕用テーブル３１は、引き続き回動と停止とを交互に繰り返しながら第２反応管Ｃ２を合成促進位置に配置する。

ステップＳＢ８が行われると機構制御部３は、促進用エネルギー印加部３７を制御する（ステップＳＢ９）。ステップＳＢ９において促進用エネルギー印加部３７は、合成促進位置に配置された第２反応管Ｃ２にエネルギーを与え融合反応やｃＤＮＡ合成反応を促進させる。具体的には、図１０の（ｄ）に示すように、促進用エネルギー印加部３７として、第２反応管Ｃ２に熱エネルギーを与えるヒーター装置（合成用ヒータ装置）等が利用される。第２反応管Ｃ２内の溶液をｃＤＮＡ合成に適した温度、すなわち、５０℃〜６０℃に上昇させる。また、超音波発生装置により、促進位置の第２反応管Ｃ２の底面から超音波を照射してもよい。超音波の照射により第２反応管Ｃ２内の溶液内の種々の分子のブラウン運動が促進し、融合膜小胞５０１の生成が促進されたり、融合膜小胞５０１内におけるｃＤＮＡ合成反応が促進されたりする。第２反応管Ｃ２は、十分な数のｃＤＮＡを合成するため、少なくとも１０分間に亘って促進位置に曝されると良い。そのため、促進位置は、複数の反応管位置に設置されるとよい。合成・破砕用テーブル３１は、第２反応管Ｃ２が促進位置を少なくとも１０分かけて通り過ぎるよりに、回動と停止とを交互に繰り返す。

ステップＳＢ７〜ＳＢ９において、融合膜小胞が生成されると、融合膜小胞の内部においてｃＤＮＡの合成反応が開始される。図１３は、ｃＤＮＡの合成反応を模式的に示す図である。図１３の（ａ）に示すように、ｃＤＮＡ合成反応の開始前において、融合膜小胞の内部溶液には、ｍｉＲＮＡ１０３、逆転写酵素４０５、ステムループ・プライマー４０７、及び界面活性剤４０９が含まれる。融合膜小胞の内部溶液においてｍｉＲＮＡ１０３は、ｍｉＲＮＡ結合タンパク質１０５に結合された状態で存在する。すなわち、ｍｉＲＮＡ結合タンパク質１０５は、ｃＤＮＡ合成の阻害要因となる。ｍｉＲＮＡ結合タンパク質１０５を不活性化するために、リポソームに界面活性剤４０９が封入される。界面活性剤４０９は、図１３の（ｂ）に示すように、ｍｉＲＮＡ結合タンパク質１０５に結合し、ｍｉＲＮＡ結合タンパク質１０５からｍｉＲＮＡ１０３を引き離す。界面活性剤４０９としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０等が適当である。

エキソソーム内には測定対象のｍｉＲＮＡの他に複数種類のタンパク質やｍＲＮＡ（messenger RNA）が含まれている。融合膜小胞の内部溶液にも、エキソソームに由来するｍＲＮＡが含まれる可能性がある。従って、ｍＲＮＡからｃＤＮＡが合成されることを防止することが望ましい。そのために、プライマーとしてステムループ・プライマー４０７が用いられると良い。ステムループ・プライマー４０７は、図１３の（ａ）に示すように、立体構造を有し、３´末端が突出した構造を有する。この突出した塩基配列部分が相補配列の検出部位となる。すなわち、ステムループ・プライマー４０７には、相補配列が３´末端にあるＲＮＡのみ結合可能である。ｍＲＮＡや未成熟なｍｉＲＮＡは３´末端にポリＡ配列を有している。従って、成熟したｍｉＲＮＡ１０３のみがステムループ・プライマー４０７に結合可能である。なお、リポソームに封入されるステムループ・プライマー４０７は、測定対象のｍｉＲＮＡ１０３に応じた塩基配列を有するものがプライマーライブラリから選択される。

図１３の（ｂ）に示すように、ステムループ・プライマー４０７にｍｉＲＮＡ１０３が結合すると、逆転写酵素４０５によりｃＤＮＡの合成反応が開始される。逆転写酵素４０５は、図１３の（ｃ）に示すように、ｍｉＲＮＡ１０３を鋳型として融合膜小胞内に存在するｄＮＴＰを次々に重合しｃＤＮＡ６０１を合成する。なお、ｍｉＲＮＡ１０３の３´末端とステムループ・プライマー４０７の５´末端とは結合されない。結果的に、ｍｉＲＮＡ１０３の３´末端とｃＤＮＡ６０１の５´末端とも結合されていない。従って、ｍｉＲＮＡ１０３とｃＤＮＡ６０１との結合体に熱を加えることにより比較的容易にｍｉＲＮＡ１０３とｃＤＮＡ６０１とを分離することができる。なお、ｍｉＲＮＡ１０３とｃＤＮＡ６０１との分離は、後述するＰＣＲ反応の第一段階である熱変性工程で実施される。

以上で合成・破砕部３０による融合工程が終了する。

なお、融合工程において、一個の融合膜小胞のもととなるエキソソームの個数とリポソームの個数との比率（以下、融合比率と呼ぶ）はランダムである。従って、融合膜小胞ごとに融合比率がばらついてしまう。融合比率のばらつきにより、融合膜小胞毎の内部溶液に占めるエキソソーム溶液とリポソーム試薬との濃度の比率がばらついてしまう。この濃度のばらつきを無視可能なように、本実施形態に係るリポソームは、エキソソームに比して十分に大きく生成されるとよい。エキソソームの直径は０．１μｍである。従って、例えば、リポソームの直径が０．５μｍの場合、リポソームの容積はエキソソームの容積に比して略１２５倍となる。また、リポソームの直径が２．０μｍの場合、リポソームの容積はエキソソームの容積に比して略８０００倍となる。このように、リポソームをエキソソームに比して十分に大きくなるよう生成することで、融合比率のばらつきに伴う融合膜小胞内のエキソソーム溶液とリポソーム試薬との濃度のばらつきを無視することができる。すなわち、本実施形態に係るリポソームの直径は、０．５μｍ〜２．０μｍ程度が望ましい。

前述のように、本実施形態においては、ｍｉＲＮＡを含むエキソソームと、ｍｉＲＮＡの逆転写に必要な物質を含むリポソームとを融合し、融合膜小胞内でｃＤＮＡ合成反応を行っている。従って本実施形態によれば、ＲＮａｓｅによるｍｉＲＮＡの分解を防止したうえで、ｍｉＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを合成することができる。

次に、機構制御部３による制御のもとに合成・破砕部３０により行われる破砕工程の詳細について説明する。図１４は、機構制御部３の制御のもとに実行される破砕工程（ステップＳＣ）の典型的な流れを示す図である。ステップＳＣにおいて機構制御部３は、合成・破砕部３０を制御し、破砕工程を実行する。破砕工程において機構制御部３は、引き続き合成・破砕用テーブル３１を所定期間毎に第２反応管Ｃ２一個分ずつ回動させる。

破砕工程において、まず、機構制御部３は、合成・破砕用テーブル３１を制御する（ステップＳＣ１）。ステップＳＣ１において合成・破砕用テーブルは、回動と停止とを交互に繰り返しながら第２反応管Ｃ２を破砕位置に配置する。

ステップＳＣ１が行われると機構制御部３は、破砕用エネルギー印加部３９を制御する（ステップＳＣ２）。ステップＳＣ２において破砕用エネルギー印加部３９は、破砕位置に配置された第２反応管Ｃ２に直流電場を印加し、融合膜小胞を破砕し、融合膜小胞からｃＤＮＡを取り出す。具体的には、破砕用エネルギー印加部３９は、図１０の（ｅ）に示すように、融合用エネルギー印加部３５と同様に、一対の電極接点３９ｃと電力発生器３９ｅとを有している。一対の電極接点３９ｃは、破砕位置における合成・破砕用テーブル３１の壁面に、第２反応管Ｃ２に設けられた一対の電極板Ｃ２ｅに接触するように取り付けられている。破砕位置に第２反応管Ｃ２が配置されると、電極板Ｃ２ｅと電極接点３９ｃとが接触する。一対の電極接点３９ｃは、配線を介して電力発生器３９ｅに接続されている。電力発生器３９ｅは、機構制御部３による制御に従って電力を発生する。これにより、一対の電極接点３９ｃの間に電場が与えられる。ステップＳＣ２において電力発生器３５ｅは、図１０の（ｅ）に示すように、機構制御部３の制御に従って、一対の電極板Ｃ２ｅの間に直流電場を付加する。ステップＳＣ２における直流電場は、融合膜小胞５０１の破砕が目的なので、ステップＳＢ７における直流電場よりも強度が高く設定される。このような直流電場の印加により、融合膜小胞５０１には不可逆的な多数の孔が形成され、形成された孔を介して融合膜小胞５０１からｃＤＮＡが漏出される。破砕用エネルギー印加部３９において融合膜小胞を破砕後、さらにエネルギーを印加することで第２反応管Ｃ２内のｃＤＮＡ溶液を攪拌し均質にする。また、物理的攪拌装置など他の攪拌手段を設けても良い。また、破砕用エネルギー印加部３９は、電場エネルギー以外にも音響エネルギーなどを印加する装置であっても良い。

ステップＳＣ２が行われると機構制御部３は、引き続き合成・破砕用テーブル３１を制御する（ステップＳＣ３）。ステップＳＣ３において合成・破砕用テーブル３１は、回動と停止とを交互に繰り返しながら第２反応管Ｃ２をｃＤＮＡ溶液吸入位置に配置する。

ステップＳＣ３が行われると機構制御部３は、ｃＤＮＡ溶液搬送アーム４１を制御する（ステップＳＣ４）。ステップＳＣ４においてｃＤＮＡ溶液搬送アーム４１は、ｃＤＮＡ溶液搬送プローブ４１ｐによりｃＤＮＡ溶液吸入位置に配置された第２反応管Ｃ２からｃＤＮＡ溶液を吸入し、ｃＤＮＡ溶液搬送プローブ４１ｐをｃＤＮＡ溶液吐出位置に回動し、ｃＤＮＡ溶液吐出位置に配置されたマルチウェルプレート５１上のウェルＣＷにｃＤＮＡ溶液を吐出する。この際、ｃＤＮＡ溶液は、測定対象となるｍｉＲＮＡの数に応じて複数のウェルＣＷに等量ずつ吐出される。

以上で合成・破砕部３０による破砕工程が終了する。その後、第２反応管Ｃ２は、第２反応管洗浄部２７−２により洗浄され、再び初期位置に戻る。そして再び、エキソソーム搬送アーム２５により第２反応管Ｃ２にエキソソーム溶液が分注される。

前述のように、本実施形態においては、融合膜小胞においてｍｉＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成し、融合膜小胞を破砕して融合膜小胞からｃＤＮＡを取り出している。ｃＤＮＡは、ｍｉＲＮＡとは異なりＲＮａｓｅにより分解されないので、検出工程におけるＲＮａｓｅ対策が不要となる。従って、ｃＤＮＡを検出する場合、ｍｉＲＮＡを直接的に検出する場合に比して、オペレータによる負担が軽減される。変形例として、融合膜小胞毎に検出工程を行うことも可能である。しかしながら、融合膜小胞の内部溶液の組成比は個別に異なっているため、融合膜小胞毎に検出結果が異なってしまう。一方、本実施形態は、複数の融合膜小胞を破砕してｃＤＮＡを取り出してｃＤＮＡ溶液を生成する。このｃＤＮＡ溶液を利用して検出工程を行う場合、各融合膜小胞の内部溶液の組成比が平均化される。従って、ｃＤＮＡ溶液を利用して検出工程を行う場合、融合膜小胞毎に検出工程を行う場合に比して、検出精度及び定量精度が向上する。

次に、機構制御部３による制御のもとにｃＤＮＡ検出部５０により行われる検出工程の詳細について説明する。図１５は、機構制御部３の制御のもとに実行される検出工程（ステップＳＤ）の典型的な流れを示す図である。ステップＳＤにおいて機構制御部３は、ｃＤＮＡ検出部５０を制御し、検出工程を実行する。より詳細には、ｃＤＮＡ検出部５０は、検出工程として定量ＰＣＲ法を実行する。

図１５に示すように、検出工程において機構制御部３は、まず、プレート搬送部５３を制御する（ステップＳＤ１）。ステップＳＤ１においてプレート搬送部５３は、マルチウェルプレート５１を移動し、ウェルＣＷをＰＣＲ試薬吐出位置に配置する。

ステップＳＤ１が行われると機構制御部３は、ＰＣＲ試薬アーム５５を制御する（ステップＳＤ２）。ステップＳＤ２においてＰＣＲ試薬アーム５５は、複数のＰＣＲ試薬プローブ５５ｐにより、ＰＣＲ試薬吐出位置に配置された複数のウェルＣＷにＰＣＲ試薬を吐出する。

ここで、ウェルＣＷへのｃＤＮＡ溶液とＰＣＲ試薬との分注について、図１６を参照しながら説明する。図１６に示すように、第２反応管Ｃ２内のｃＤＮＡ溶液６０３は、複数のウェルＣＷに等量ずつ分注される。分注数は、測定対象のｍｉＲＮＡの数に応じて変動する。また、一枚のマルチウェルプレート５１の複数のウェルＣＷに、異なる第２反応管Ｃ２に収容された複数の検体に由来する複数のｃＤＮＡ溶液６０３を分注することも可能である。この際、吐出位置と検体との対応関係は、システム制御部８により管理され、混合しないように制御される。また、ＰＣＲ試薬アーム５５により、複数のウェルＣＷにＰＣＲ試薬７０１が分注される。これによりウェル内には、ｃＤＮＡ溶液６０３とＰＣＲ試薬７０１とが収容される。以下、ｃＤＮＡ溶液６０３とＰＣＲ試薬７０１との混合液をＰＣＲ反応溶液と呼ぶことにする。異なるウェルＣＷにおいてＰＣＲ反応溶液の液量が同一になるようにｃＤＮＡ溶液６０３とＰＣＲ試薬７０１とが分注される。ＰＣＲ試薬７０１の吐出後、マルチウェルプレート５１は、乾燥防止のためにシールされると良い。

ステップＳＤ２が行われると機構制御部３は、プレート搬送部５３を制御する（ステップＳＤ３）。ステップＳＤ３においてプレート搬送部５３は、マルチウェルプレート５１を移動し、マルチウェルプレート５１をＰＣＲ用温度調節部５７の上部に配置する。ＰＣＲ用温度調節部５７の上部がＰＣＲ反応位置をなす。

ステップＳＤ３が行われると機構制御部３は、ＰＣＲ用温度調節部５７と蛍光検出部５９とを個別に制御する（ステップＳＤ４）。ステップＳＤ４においてＰＣＲ用温度調節部５７は、ＰＣＲ反応位置に配置されたマルチウェルプレート５１のウェルＣＷ内のＰＣＲ反応溶液の温度を段階的に変化させ、ＰＣＲ反応を実行する。ＰＣＲ反応の１サイクルは、熱変性、アニーリング、及び伸長反応の３つの工程からなる。このサイクルを繰り返すことでｃＤＮＡを増幅する。熱変性工程においては、２本鎖ｃＤＮＡが熱変性により二つの一本鎖ｃＤＮＡに分離する。アニーリング工程においては、各ｃＤＮＡ鎖にプライマーセットが結合する。伸長反応においては、結合されたプライマーからＤＮＡポリメラーゼにより新たなｃＤＮＡ鎖が合成される。これらＰＣＲ反応の工程毎にウェルＣＷ内の溶液の適切な温度が経験的に定められている。例えば、熱変性工程においては略９５℃、アニーリング工程においては略５０℃、伸長反応工程においては略７０℃である。ＰＣＲ用温度調節部５７は、ＰＣＲ反応の工程の各々について工程に応じた時間を割り当てている。例えば、熱変性工程には略１分、アニーリング工程には略２分、伸長反応工程には略３分が割り当てられる。ＰＣＲ用温度調節部５７は、熱変性工程、アニーリング工程、及び伸長反応工程の順番に、各工程に応じた時間に亘って各工程に応じた温度を保つようにウェルＣＷ内の温度を調整する。

定量ＰＣＲ反応中において、蛍光検出部５９は、リアルタイムにｃＤＮＡを光学的に検出する。定量ＰＣＲ法におけるｃＤＮＡの検出手段としては、大別してインターカレーター法と蛍光プローブ法等の蛍光色素を用いた蛍光検出手段がある。本実施形態においては、両者の何れの検出手段を採用しても良い。しかしながら、定量性がより高い蛍光プローブ法によりｃＤＮＡを検出することが望ましい。蛍光プローブ法を利用する場合、ＰＣＲ試薬には、検出対象のｃＤＮＡに特異的な塩基配列を有する蛍光プローブが加えられる。蛍光プローブは、蛍光色素で修飾されたプローブで、蛍光色素は、プローブと結合した状態では蛍光を発しないように設計されている。ＰＣＲ反応の実行中、鋳型のｃＤＮＡの中ほどに蛍光プローブが結合する。蛍光プローブは、伸長反応時に分解され、蛍光色素がプローブから遊離する。蛍光色素のプローブからの遊離時において、蛍光検出部５９の光源からの励起光の曝露により蛍光が発生する。蛍光検出部５９の光検出器（ＣＣＤカメラ）は、発生された蛍光を検出する。ＣＣＤカメラは、マルチウェルプレート５１上の複数のウェル５３を撮影視野に含むように配置されている。ＣＣＤカメラは、ＰＣＲ反応中、機構制御部３による制御のもと一定時間間隔毎にマルチウェルプレート５１を繰り返し撮影し、画像データを繰り返し生成する。生成された画像データは、計算部４に供給される。画像データの画素値は、蛍光強度に応じた値を有している。画像データは、蛍光強度の空間分布を表現する。

既定回数だけサイクルが終了すると機構制御部３は、ＰＣＲ用温度調節部３７と蛍光検出部３９とを停止させる。サイクル数は、操作部６を介してオペレータにより任意に設定可能である。

以上でｃＤＮＡ検出部５０による検出工程が終了する。

前述のように、本実施形態においては、ｍｉＲＮＡの逆転写反応により合成されたｃＤＮＡを検出することにより、測定対象のｍｉＲＮＡを間接的に検出することができる。従って、本実施形態によれば、ＲＮａｓｅ対策を施すことなく、簡便にｍｉＲＮＡを検出することができる。

次に、システム制御部８による制御のもとに計算部４により行われる定量分析工程の詳細について説明する。定量分析工程は、画像データがＣＣＤカメラから供給される毎に実行されてもよいし、検出工程が終了したことを契機として実行されてもよいし、オペレータによる操作部６を介して開始指示がなされたことを契機として実行されてもよい。

定量分析工程において、計算部４は、画像データの画素値分布に基づいてウェルＣＷ毎の蛍光強度を算出する。そして計算部４は、算出された蛍光強度に基づいて、ＰＣＲ反応の開始時点におけるウェルＣＷ内のＰＣＲ反応溶液に含有されるｃＤＮＡ量を算出する。ここで、ＰＣＲ反応の開始時点におけるウェルＣＷ内のＰＣＲ反応溶液に含有されるｃＤＮＡ量を初発のｃＤＮＡ量と呼ぶことにする。ｃＤＮＡの量は、ｍｉＲＮＡの量に相関する。以下に、ｃＤＮＡ量、すなわち、ｍｉＲＮＡ量の算出原理について説明する。なおｃＤＮＡ量（ｍｉＲＮＡ量）とは、ｃＤＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の個数、ｃＤＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の濃度、ｃＤＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が占める体積、及びｃＤＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の重さを包括する表現であるとする。濃度は、重量パーセント濃度や体積パーセント濃度、モル濃度、規定度等の如何なる種類によるものであっても良い。

図１７は、サイクル数に伴うｃＤＮＡ量の増幅曲線を示す図である。計算部４は、サイクル毎に、各ウェルに含まれるＰＣＲ反応溶液内のｃＤＮＡ量を算出する。計算部４は、算出されたｃＤＮＡ量を、サイクル数が横軸に規定され、ｃＤＮＡ量が縦軸に規定された座標系にプロットし、ｃＤＮＡ量の増幅曲線を生成する。一般的に、ｃＤＮＡ量の増幅曲線は、図１７に示すように、シグモイド曲線を描く。ｃＤＮＡ量が指数関数的に増加するまでに必要なサイクル数は、初発のｃＤＮＡ量が多いほど少ない。初発のｃＤＮＡ量の計算には、このようなＰＣＲの増幅原理を利用する。具体的には、計算部４は、ｃＤＮＡ量が閾値Ｔｈに到達するまでのサイクル数（Ｃｔ値）を特定する。ここで、測定対象のｍｉＲＮＡに関するＣｔ値をｔａｒと呼ぶことにする。計算部４は、特定されたサイクル数ｔａｒに基づいて初発のｃＤＮＡ量を算出する。具体的には、計算部４は、予め作成された検量線にサイクル数ｔａｒを当てはめて、ウェル内の反応溶液に含まれるｃＤＮＡ量（初発のｃＤＮＡ量）、すなわち、ｍｉＲＮＡを算出する。

図１８は、初発のｃＤＮＡ量の算出に利用される検量線を示す図である。図１８に示すように、検量線は、Ｃｔ値が横軸に規定され、初発のｃＤＮＡ量［ｌｏｇ値］が縦軸に規定された座標系に描かれた直線である。検量線は、ｃＤＮＡ量が既知のコントロールにより得られたＣｔ値に基づいて生成されている。計算部４は、検量線のデータを予め記憶している。計算部４は、測定対象のｍｉＲＮＡに関するＣｔ値ｔａｒに基づいて、検量線を利用して初発のｃＤＮＡ量、すなわち、測定対象のｍｉＲＮＡに関する初発のｍｉＲＮＡ量を算出する。算出された初発のｍｉＲＮＡ量は、表示部５により表示される。

以上で計算部４による定量分析工程が終了する。

前述のように、初発のｍｉＲＮＡ量は、ＰＣＲ反応の初期段階においてウェルＣＷ内のＰＣＲ反応溶液に含まれるｍｉＲＮＡ量を示す。検体に含まれる総ｍｉＲＮＡ量（すなわち、総エキソソーム量）は検体によって異なる。すなわち、初発のｍｉＲＮＡ量のみでは、測定の結果得られたｍｉＲＮＡ量の基準値に対する増加もしくは減少が判断できない。

そのために、本実施形態に係る定量分析装置１は、測定対象のｍｉＲＮＡの量と同時に、エキソソーム中に含まれる指標分子の量を併せて測定するとよい。指標分子は、エキソソームに含まれる量が不変であるものが好ましい。例えば、指標分子として、ｍｉＲ−１６やＲＮＵ６２等のＲＮＡが指標分子として適当である。

エキソソーム内には、測定対象のｍｉＲＮＡの他にこれら指標分子が包含されている。この場合、指標分子に相補的なｃＤＮＡを生成するため、本実施形態に係るリポソームには、測定対象のｍｉＲＮＡに相補的な塩基配列を有するプライマーの他に、指標分子に相補的な塩基配列を有するプライマーが封入される。これにより、融合膜小胞内において測定対象のｍｉＲＮＡに相補的なｃＤＮＡとともに、指標分子に相補的なｃＤＮＡが合成される。破砕工程においては、融合膜小胞が破砕され、測定対象のｍｉＲＮＡに相補的なｃＤＮＡと指標分子に相補的なｃＤＮＡとが混入されたｃＤＮＡ溶液が生成される。このｃＤＮＡ溶液は、測定項目に応じて複数のウェルＣＷに分注される。検出工程において、各ウェルＣＷに測定項目に応じたＰＣＲ溶液が吐出される。例えば、第１のウェルＣＷには、測定対象のｍｉＲＮＡに相補的なｃＤＮＡに対応するプライマーセットやＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ試薬が吐出される。第２のウェルＣＷには、指標分子に相補的なｃＤＮＡに対応するプライマーセットやＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ試薬が吐出される。これにより、定量ＰＣＲにおいて、測定対象のｍｉＲＮＡに相補的なｃＤＮＡと指標分子に相補的なｃＤＮＡとが異なるウェルＣＷにおいて個別に増幅される。そして、ＣＣＤカメラにより生成された画像データが繰り返し計算部４に転送される。

計算部４は、前述と同様の方法により、初発の測定対象のｍｉＲＮＡ量とともに、初発の指標分子量を算出する。そして計算部４は、初発の測定対象のｍｉＲＮＡ量と初発の指標分子量とに基づいてエキソソームに含まれる測定対象の相対的なｍｉＲＮＡ量を計算する。このようにして、臨床的に有用な、エキソソームに含まれる測定対象のｍｉＲＮＡ量の増減に関する情報が得られる。エキソソームに含まれる測定対象のｍｉＲＮＡ量は、表示部５により表示される。

測定対象とするｍｉＲＮＡ項目数は、必要に応じて任意の数に設定可能である。これらのプロファイルの解析により病変（例えば、腫瘍）の有無、組織の推定が可能になる。

以上で本実施形態に係る自動定量分析処理についての説明を終了する。

前述の通り、本実施形態に係る定量分析装置１は、合成・破砕用テーブル３１、エキソソーム搬送アーム２５、リポソーム試薬アーム３３、融合用エネルギー印加部３５、破砕用エネルギー印加部３７、及びｃＤＮＡ検出部５０を有している。合成・破砕用テーブル３１は、反応管Ｃ２を保持し、反応管Ｃ２を回動する。エキソソーム搬送アーム２５は、合成・破砕用テーブル３１上のエキソソーム溶液吐出位置に配置された反応管Ｃ２に測定対象のマイクロＲＮＡを包含するエキソソームを吐出する。リポソーム試薬アーム３３は、合成・破砕用テーブル３１上のリポソーム試薬吐出位置に配置された反応管Ｃ２に、本実施形態に係るリポソームを吐出する。本実施形態に係るリポソームは、測定対象のマイクロＲＮＡの逆転写のための逆転写酵素、プライマー、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、及び緩衝液を含む溶液を内包する脂質膜小胞である。融合用エネルギー印加部３５は、エキソソームとリポソームとからなる融合膜小胞を生成するために、反応管Ｃ２内のエキソソームと脂質膜小胞とにエネルギーを印加する。破砕用エネルギー印加部３７は、融合膜小胞から測定対象のマイクロＲＮＡの逆転写により合成された測定対象のマイクロＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを取り出すために、反応管Ｃ２内の融合膜小胞にエネルギーを印加する。ｃＤＮＡ検出部５０は、取り出されたｃＤＮＡを検出する。

上記構成により、定量分析装置１は、ＲＮａｓｅにより分解されやすい測定対象のｍｉＲＮＡを抽出せず、ＲＮａｓｅの影響を受けにくい脂質膜小胞中でｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡを検出することにより、ｍｉＲＮＡを間接的に検出している。より詳細には、定量分析装置１は、本実施形態に係るリポソームとｍｉＲＮＡを含むエキソソームとを融合している。本実施形態に係るリポソームは、測定対象のマイクロＲＮＡの逆転写のための逆転写酵素、プライマー、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、及び緩衝液を含み、ＲＮａｓｅｅを含まない溶液を内包している。従って、リポソームとエキソソームとを融合することで、ＲＮａｓｅの存在しない環境下においてｍｉＲＮＡからｃＤＮＡを合成することができる。従って、本実施形態によれば、ＲＮａｓｅによるｍｉＲＮＡの分解の影響を最小にすることができる。これに伴い、ＲＮａｓｅ対策を施す必要がなくなる。さらに、定量分析装置１は、ｃＤＮＡ合成後のＰＣＲ反応においては、融合膜小胞を破砕し、融合膜小胞外の均一溶液を利用することで定量性を担保している。これにより、本実施形態によれば、ＲＮａｓｅの影響を排除しつつ定量性を確保することで操作を簡素化し、定量ＰＣＲ法を一般的な検査室で実行することができる。

かくして、本実施形態によれば、エキソソーム中のｍｉＲＮＡの定量分析におけるオペレータの負担の軽減が実現する。

なお、本実施形態に係る定量分析装置では、特にエキソソーム中のｍｉＲＮＡ定量方法について記述したが、本実施形態に係る定量分析装置はエキソソーム中の様々なＲＮＡ成分の定量に適用可能であり、本実施形態の測定対象はｍｉＲＮＡに限定されるものではない。

本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれるものである。

１…定量分析装置、２…定量分析機構、３…機構制御部、４…計算部、５…表示部、６…操作部、７…記憶部、８…システム制御部、１０…前処理部、１１…前処理用テーブル、１３…サンプルラック、１５…サンプリングアーム、１７…磁気ビーズ試薬アーム、１９…磁気式攪拌部、２１…磁気ビーズ洗浄部、２３…エキソソーム溶出部、２５…エキソソーム搬送アーム、２７…反応管洗浄部、３０…合成・破砕部、３１…合成・破砕用テーブル、３３…リポソーム試薬アーム、３５…融合用エネルギー印加部、３７…促進用エネルギー印加部、３９…破砕用エネルギー印加部３９、４１…ｃＤＮＡ溶液搬送アーム、５０…ｃＤＮＡ検出部、５１…ｃＤＮＡ溶液保持板（マルチウェルプレート）、５３…プレート搬送部、５５…ＰＣＲ試薬アーム、５７…ＰＣＲ用温度調節部、５９…蛍光検出部

Claims (17)

1. 第１の反応管を保持し、前記第１の反応管を回動する合成用テーブルと、
   前記合成用テーブル上の第１の合成用吐出位置に配置された前記第１の反応管に測定対象のＲＮＡを包含するエキソソームを吐出する第１のアームと、
   前記合成用テーブル上の第２の合成用吐出位置に配置された前記第１の反応管に、前記測定対象のＲＮＡの逆転写のための逆転写酵素、プライマー、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、及び緩衝液を内包する脂質膜小胞を吐出する第２のアームと、
   前記エキソソームと前記脂質膜小胞とからなる融合膜小胞を生成するために、前記第１の反応管内の前記エキソソームと前記脂質膜小胞とに第１のエネルギーを印加する第１のエネルギー印加部と、
   前記融合膜小胞から前記測定対象のＲＮＡの逆転写により合成された前記測定対象のＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを取り出すために、前記第１の反応管内の前記融合膜小胞に第２のエネルギーを印加する第２のエネルギー印加部と、
   前記取り出されたｃＤＮＡを検出するｃＤＮＡ検出部と、
   を具備する定量分析装置。
2. 前記ｃＤＮＡ検出部からの出力に基づいて前記エキソソーム内に含まれる前記測定対象のＲＮＡを定量分析する計算部、をさらに備える請求項１記載の定量分析装置。
3. 第２の反応管を保持し、前記第２の反応管を回動する前処理用テーブルと、
   前記前処理用テーブル上の第１の前処理用吐出位置に配置された前記第２の反応管に前記エキソソームを含む検体を吐出する第３のアームと、
   前記検体から前記エキソソームを単離する単離部と、
   前記前処理用テーブル上の前処理用吸入位置に配置された前記第２の反応管から前記単離されたエキソソームを吸入し、前記合成用テーブル上の第３の合成用吐出位置に配置された前記第１の反応管に前記吸入されたエキソソームを吐出する第３のアームと、
   をさらに備える請求項１記載の定量分析装置。
4. 前記前処理用テーブル上の第２の前処理用吐出位置に配置された前記第２の反応管に、前記エキソソームに特異的に結合する磁気ビーズを含む試薬溶液を吐出する第４のアームをさらに備え、
   前記単離部は、前記エキソソームの前記磁気ビーズへの吸着を利用して前記検体から前記エキソソームを単離する、
   請求項３記載の定量分析装置。
5. ＰＣＲ反応のための溶液収容部と、
   前記合成用テーブル上の吸入位置に配置された前記第１の反応管から前記漏出されたｃＤＮＡを吸入し、前記吸入されたｃＤＮＡを前記溶液収容部に吐出する第３のアームと、
   前記漏出されたｃＤＮＡをＰＣＲ反応により増幅するために前記溶液収容部内の温度を段階的に変化させる温度調節部と、をさらに備え、
   前記ｃＤＮＡ検出部は、前記増幅されたｃＤＮＡを検出する、
   請求項１記載の定量分析装置。
6. 前記ｃＤＮＡ検出部は、前記増幅されたｃＤＮＡを検出するためのＣＣＤカメラまたは分光器を有する、請求項５記載の定量分析装置。
7. 前記計算部は、前記エキソソームに含まれる指標分子の存在量と前記検出器からの出力とに基づいて前記エキソソームに含まれる前記測定対象のＲＮＡの存在量を計算する、請求項２記載の定量分析装置。
8. 前記第１のエネルギー印加部は、前記第１のエネルギーとして電気エネルギーを発生する電気発生器を備える、請求項１記載の定量分析装置。
9. 前記第１のエネルギー印加部は、前記第１のエネルギーとして音響エネルギーを発生する超音波発生装置を備える、請求項１記載の定量分析装置。
10. 前記第２のエネルギー印加部は、前記第２のエネルギーとして電気エネルギーを発生する電気発生装置を備える、請求項１記載の定量分析装置。
11. 前記第２のエネルギー印加部は、前記第２のエネルギーとして音響エネルギーを発生する超音波発生装置を備える、請求項１記載の定量分析装置。
12. 検体から測定対象のＲＮＡを含むエキキソームを単離し、
    前記単離されたエキソソームと、前記測定対象のＲＮＡの逆転写のための逆転写酵素、プライマー、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、及び緩衝液を内包する脂質膜小胞とを融合して融合膜小胞を合成し、
    前記融合膜小胞の内部で行われる逆転写により合成された前記測定対象のＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを前記融合膜小胞から取り出すために前記融合膜小胞を破砕する破砕し、
    前記抽出されたｃＤＮＡを検出する、
    ことを具備する定量分析方法。
13. 測定対象のＲＮＡの逆転写のための逆転写酵素、プライマー、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、及び緩衝液を含む溶液を内包する脂質膜小胞。
14. 前記測定対象のＲＮＡを含有するエキソソームの表面に提示されたタンパク質に特異的に結合可能なタンパク質を表面に有する、請求項１３記載の脂質膜小胞。
15. 前記溶液は、前記測定対象のＲＮＡを分解するＲＮａｓｅを含まない、請求項１３記載の脂質膜小胞。
16. 前記測定対象のＲＮＡを含有するエキソソーム内に含まれるタンパク質を不活性化するための界面活性剤をさらに含む、請求項１３記載の脂質膜小胞。
17. 請求項１３から１６の何れか一項に記載の脂質膜小胞と、
    ｐＨを調整するための緩衝液と、
    を具備する試薬。

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