CN112415081A - 一种基于稳定同位素检测的无标记CRISPR-Cas9分析方法 - Google Patents

一种基于稳定同位素检测的无标记CRISPR-Cas9分析方法 Download PDF

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Abstract

CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat)系统是一种细菌获得性免疫系统，近年来广泛应用于基因编辑，药物传递，遗传筛选等领域。研究表明CRISPR‑Cas9系统存在脱靶效应，即切割目标位点邻近的碱基对而非目标位点。为了减少这一现象，预先对CRISPR‑Cas9核酸酶的活性和位点特异性进行检测显得十分必要。本发明分析方法设计了一种基于稳定同位素的无标记检测方法，利用DNA底物特征序列原位合成同纳米粒子进行分析，可以实现高灵敏快速简便的CRISPR‑Cas9分析检测，并可用于核酸位点特异性检测。

Description

一种基于稳定同位素检测的无标记CRISPR-Cas9分析方法
技术领域
本发明属于分析化学的检测领域，涉及对CRISPR-Cas9核酸剪切酶的分析检测，特别涉及一种基于脱氧核糖核酸（DNA）作为模板原位合成铜纳米粒子（CuNPs）产生的稳定同位素通过电感耦合等离子体质谱仪对CRISPR-Cas9核酸酶的检测方法。
背景技术
CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat)系统是一种细菌获得性免疫系统，近年来广泛应用于基因编辑，药物传递，遗传筛选等领域。CRISPR-Cas9系统包括了Cas9核酸剪切酶，sgRNA和DNA底物。在CRISPR-Cas9系统发挥功能的过程中，Cas9核酸剪切酶首先与sgRNA形成复合物，识别并结合DNA底物上与sgRNA互补的序列，随后Cas9核酸酶剪切DNA底物，使双链断裂实现基因编辑。
然而在实际应用中，研究表明CRISPR-Cas9系统存在脱靶效应，即切割目标位点邻近的碱基对而非目标位点。为了减少这一现象，预先对CRISPR-Cas9核酸酶的活性和位点特异性进行检测显得十分必要。
为了解决这一问题，一系列基于化学标记进行CRISPR-Cas9核酸酶分析检测的技术成为近年来的主流。基于放射性同位素标记的凝胶电泳法，荧光/猝灭对标记法，电化学发光标记等，尽管取得了成功，但都必须通过标记过程来制作传感单元。化学标记的存在可能会对Cas9活性造成干扰，额外的操作程序和时间成本也阻碍了标签策略成为理想的先前Cas9测定方法。
为克服这一制约，本发明采用无标记检测法，结合电感耦合等离子体质谱仪（Inductive Coupled Plasma Mass Spectrometry, ICPMS）检出限低（大部分元素都可以达到pg mL-1级别）、基体效应小、线性范围广（高达九个数量级）、稳定性优异的优点，将DNA模板法合成的CuNPs酸消解后进行稳定同位素检测，在保持优秀的检出限性能同时，省去了标记步骤，提高了检测效率，为核CRISPR-Cas9核酸酶检测和体外分析提出了一种更便捷的方法。
发明内容
本发明提供一种基于稳定同位素检测的无标记CRISPR-Cas9核酸酶分析方法，及其在Cas9高灵敏检测和DNA底物位点特异性检测上的应用。
本发明的原理是：根据之前的研究，具有大量重复(AT)碱基序列的核酸双链可以作用DNA模板，原位合成铜纳米粒子（CuNPs）。因此，我们将重复的（AT）序列替换Cas9的DNA底物一侧随机序列，设计功能化的DNA底物。在Cas9的存在下，CRISPR-Cas9系统发挥作用，识别DNA底物互补位点，切割双链，破坏DNA模板，继而无法合成CuNPs。反之，当Cas9不存在时，模板DNA双链序列得以保留，在AA和铜离子作用下可以合成CuNPs。合成的CuNPs通过硝酸消解后形成铜离子，可进行ICPMS定量分析。通过不同浓度的核酸酶产生的铜元素的同位素强度的变化进行线性回归分析，即可对Cas9进行稳定同位素检测。
由于同一位点上不同碱基替换或者突变带来的DNA底物序列不同，导致在相同浓度Cas9下对DNA底物的识别特异性发生变化，进而影响CRISPR-Cas9切割能力，并可以通过铜元素信号的变化来预先判断不同位点对CRIPR-Cas9系统的特异性。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明设计DNA底物的方案是：如附图4所示，对于CRISPR-Cas9系统，DNA底物由三个部分组成：PAM（protospacer adjacent motif）序列用于Cas9核酸酶特异性识别，与sgRNA互补的序列用于sgRNA特异性识别和解旋，以及两侧的随机序列。我们将切割位点另一侧的随机序列替换成由重复的腺嘌呤-胸腺嘧啶碱基对(AT)n组成的DNA模板，同时用生物素修饰在(AT)n序列另一侧合成功能化的DNA底物。重复的(AT)n序列可以做为高效合成CuNPs的模板。
本发明制备CuNPs的原理是：在CRISPR-Cas9体系内，Cas9、sgRNA先形成复合物，复合物再与DNA底物进行反应，发生剪切。剪切后的DNA底物再和链霉亲和素修饰的磁性微球（SA-MBs）一起孵育。由于在(AT)n序列另一侧修饰有生物素，没有被剪切的DNA底物可以完整的被SA-MBs捕获，而被剪切的底物则只有随机序列部分被捕获，(AT)n序列端由于没有生物素修饰，不能被捕获。DNA模板和随后加入的还原剂抗坏血酸（AA）和硫酸铜溶液可快速合成CuNPs。
对合成的CuNPs进行酸消解和稳定同位素检测方法为：磁性分离后，利用一定浓度的硝酸对CuNPs进行消解，形成的铜离子进行ICPMS高灵敏检测。选取63Cu同位素作为检测对象进行高灵敏定量分析。通过不同浓度的核酸酶引起的63Cu同位素强度值进行线性回归分析，即可对待测核酸酶进行定量分析。
其中， DNA底物与AA和硫酸铜的反应缓冲溶液为MOPS(10 mM MOPS, 2mM MgCl2,150mM NaCl, pH=7.6)，温度为20-25℃，时间为3-5min。
本发明有如下有益效果：本发明提供了一种可以对CRISPR-Cas9实现高灵敏无标记检测的分析方法，并且可以实现对于底物位点突变特异性的检测。利用DNA模板法合成CuNPs操作简单，合成快速的特点，本发明具有成本较低，省去繁琐操作步骤、响应快速的优势，同时利用ICPMS对稳定同位素检测的检出限低（大部分元素都可以达到pg mL-1级别）、基体效应小、线性范围广（高达九个数量级）、稳定性优异的优点，在提高对Cas9检测的灵敏度的同时，减少了操作时间和程序，适用于对CRISPR-Cas9的体外预试验。
附图说明
图1 CRISPR-Cas9核酸剪切酶的浓度和63Cu的ICPMS信号线性关系。
图2 sgRNA的结构对本发明分析方法的性能影响。
图3 本发明分析方法对核酸位点突变的检测。
图4 本发明分析方法机理图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下属实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用到的水均为超纯水，经Milli-Q超纯水净化系统处理而成。下述实例中所有样品在使用前均未进行纯化。
本发明按以下具体步骤进行。
a.sgRNA体外转录合成（IVT）。
a1 合成含有T7启动子的DNA双链模板。
a2 利用T7 RNA聚合酶和对应缓冲溶液进行转录，温度为37℃，时间为3-6h。
a3 利用RNA纯化试剂盒进行纯化，纯化后的sgRNA立即使用或存于-80℃冷冻。
b.CRISPR-Cas9剪切。
b1 将sgRNA与Cas9预先孵育，形成两元复合物，sgRNA浓度为30nM，孵育温度为25℃，时间为10-20min。
b2 加入DNA底物，在37摄氏度下反应，时间为1-2h，浓度为3nM；
b3 加热至95℃终止反应，并释放双链DNA，时间为5-10min。
c.无标记分析。
c1 上述反应溶液与SA-MBs混合振荡孵育，缓冲溶液为2X B&W buffer (10 mMTris-HCl, 1 mM EDTA, 2M NaCl, pH 7.5)，时间为20min。
c2 除去上清液，加入160μL MOPS缓冲液和10μL、20μM的抗坏血酸水溶液，在孵育器中振荡1min,25℃。
c3 再加入35μL、1mM的硫酸铜水溶液，在孵育器上轻微振荡5min即完成CuNPs的合成。
c4 磁性分离后去除上清液，加入20% HNO3 200μL，在孵育器中剧烈振荡消解CuNPs，反应温度为37℃，时间为10min。
a.ICPMS测定。
e1 将硝酸消解后的溶液稀释至4mL，并转移至EP管。
e2 在ICPMS中对63Cu、65Cu同位素进行检测，STD模式。
d3 以63Cu为标准，对所测得强度代入线性方程计算浓度。
下面结合说明书附图做进一步的说明，但本发明分析方法并不限于下述实施例。
实施例1、基于稳定同位素检测的无标记分析方法对CRISPR-Cas9核酸剪切酶的检测。
如附图4所示，CRISPR系统中，Cas9核酸剪切酶在sgRNA辅助下可以识别DNA底物的PAM位点，并通过碱基互补配对对目标DNA链进行识别，在PAM序列附近3-5个碱基处进行剪切。另外，(AT)n重复碱基序列可以用作高效合成CuNPs的模板，基于此，我们设计的多重DNA底物可以对CRISPR-Cas9进行基于稳定同位素的无标记检测。
实验中，Cas9的浓度从0.增加至200nM。由附图1a可以看出，在该范围内63Cu信号强度随着Cas9浓度增加而降低。图b可以看出，Cas9浓度的常用对数（X）与63Cu的ICPMS信号（Y）成线性相关关系，线性方程为Y=-5542.7X+16590，相关系数R2=0.98，检出限（LOD，3σ）为0.13 nM。
本实施例证明，本发明以我们设计的DNA底物作为模板可以实现对CRISPR-Cas9剪切酶的高灵敏无标记分析。
实施例2、探究sgRNA的结构对本发明分析方法的性能影响。
sgRNA由三部分组成：20-nt的向导序列，用于和目标DNA链进行碱基互补配对识别；30-nt的重复-反重复双链体区和3个tracrRNA回环用于和Cas9形成复合物。从结构上来说，tracrRNA回环数量越多，对Cas9复合能力就越大，越能引发CRISPR-Cas9剪切反应。
本实施例探究的，是不同数量的tracrRNA回环对CRISPR-Cas9剪切反应的影响。
如附图2所示，首先用过体外转录（IVT）合成了三种sgRNA，分别具有1，2，3个tracrRNA回环，2b显示通过聚丙烯酰胺凝胶电泳成像的结果。条带2-4分别对应了具有1-3个tracrRNA的sgRNA,其中，而条带5显示的是未经热处理的sgRNA，由于具有多聚体而显示出了另一条带，多聚体在热处理之后被除去。图2c可以看出，随着回环结构数量的增多，63Cu的ICPMS信号在减弱，意味着CRISPR-Cas9剪切的效率在增强。
本实施例证明了，sgRNA结构中tracrRNA回环结构的增多可以促进CRIPR-Cas9剪切，并且本发明分析方法可以用于判断sgRNA结构带来的影响。
实施例3、基于稳定同位素检测的无标记CRISPR-Cas9分析方法对位点特异性的检测。
CRISPR-Cas9的机理表明，识别和切割过程高度取决于于两条DNA底物链。非互补链上的PAM序列和核心序列（前5个核苷酸）在Cas9 / sgRNA复合物识别中起关键作用。在识别DNA底物后，sgRNA与互补链杂交，而Cas9的HNH活性位点切割连接互补链的第三和第四核苷酸的磷酸二酯键。在此过程中，共有三条核酸链（两条DNA底物链和sgRNA）参与其中，如附图3a所示。
因此，本实施例中进一步探讨了CRISPR-Cas9活性与DNA底物上不同位点的单个碱基突变的关系。
首先，研究了核心序列和PAM序列的单个碱基变化。如附图3b所示，错配位点包含PAM序列和邻近两个位点。附图3b显示只有PAM序列内的碱基变化导致显著的ICPMS强度降低，而邻近位点的错配的影响很小。它证明了Cas9面对完整的PAM序列时仍保持高亲和力和切割活性。
自发和化学诱导的单碱基突变体是另一个错配的来源。常见的情况包括不匹配的U-G碱基对，大量的的次黄嘌呤（I）和胞嘧啶甲基化，这些都与生物环境有关。因此，本实施例接下来探究了这些DNA突变是否会影响CRISPR-Cas9活性。我们提出了含有五个不同的突变非互补链，含有甲基化胞嘧啶，两个不同的U-G碱基对位点和两个位于PAM序列两侧的I-C碱基对位点，如图3c所示。结果显示设计的突变非互补链对CRISPR-Cas9的活性几乎没有影响，近似于没有突变的控制组。本实施例证明，PAM序列外非互补链的单碱基变化几乎不会影响CRISPR-Cas9系统的作用。
此外，DNA底物的另一条互补链负责与Casy9/sgRNA杂交并被Cas9的HNH位点切割。理论上，切割位点的单碱基变化可能会干扰CRISPR-Cas9活性。为了验证这一点，我们设计了五条具有不同错配位点的互补链。其中，C2的错配位点位于互补链-sgRNA杂合体的第三个核苷酸处。如图3d所示，除C2之外的所有错配序列表现出与控制组几乎相同的切割效率。C2显示相对降低的63Cu ICPMS强度，这可能是因为错配位点位于切割位点处，导致该处的空间扭曲影响Cas9的HNH切割的活性。
最后，本实施例探究了sgRNA中发生单碱基变化时的切割效率。 sgRNA和互补链的杂交是CRISPR-Cas9系统的关键初始阶段。为了验证区分脱靶底物的能力，本实施例引入了三个单碱基改变的sgRNA，如图3e所示。改变的位点分布在互补部分内。与相应的sgRNA相比，切割效率随着不同水平显着降低。错配位点离PAM序列越远，切割效率受影响越小。但与对照组相比，对于脱靶效应仍存在存在非特异性切割。利用不同的脱靶底物设计，本发明分析方法可以检测潜在的切割位点，进一步避免脱靶效应。
序列表
<110> 四川大学
<120> 一种基于稳定同位素检测的无标记CRISPR-Cas9分析方法
<140> 201910781350.9
<141> 2019-08-23
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 123
<212> RNA
<213> 寡核苷酸(Oligonucletides)
<400> 1
uuuuuuucgu ggcugagcca cggugaaaaa guucaacuau ugccugaucg gaauaaaauu 60
gaacgauacg acaaaacaaa gguuuugucg uaucgagauu uugaacacaa cacacacaag 120
agg 123
<210> 2
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<212> DNA
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Cys Ala Cys Ala Ala Thr Gly Gly Ala Ile Thr
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<210> 20
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<213> 寡核苷酸(Oligonucletides)
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cacac 5

Claims (2)

1.一种对CRISPR-Cas9的分析方法，其特征在于：
所述方法包括DNA底物设计和无标记分析稳定同位素检测；
所述分析方法DNA底物序列包括：（1）PAM序列和与sgRNA互补序列；（2）在PAM序列的另一端的胸腺嘧啶和鸟嘌呤大量重复的碱基对（AT）n作为DNA模板；
所述分析方法DNA底物设计中，PAM序列和sgRNA互补序列用于CRISPR-Cas9识别，（AT）n序列可以在抗坏血酸和硫酸铜的作用下快速原位合成铜纳米粒子。
2.根据权利要求1所属的分析方法，其特征在于：
所述分析方法采用电感耦合等离子体质谱仪（ICPMS）稳定同位素分析;
Cas9剪切酶首先与sgRNA孵育形成复合物，再特异性识别设计的DNA底物，并完成剪切;
被剪切的底物分为两部分，包括含有大量重复的碱基对（AT）n的序列和修饰生物素的随机序列，后者与未被剪切的DNA底物可以被链霉亲和素修饰的磁性微球捕获，未被剪切的底物可用作DNA模板，在抗坏血酸和硫酸铜作用下快速原位合成铜纳米粒子，经过磁性分离和硝酸消解后可以进行ICPMS稳定同位素检测;
对不同浓度核酸酶对应的63Cu同位素的ICPMS强度信号采用线性回归分析，即可实现对核酸酶的高灵敏稳定检测；
所述分析方法中DNA底物与Cas9反应时间为1-2小时，浓度为3nM；
所述分析方法中，DNA模板与抗坏血酸和硫酸铜的反应缓冲溶液为MOPS(10 mM MOPS,2mM MgCl2, 150mM NaCl, pH=7.6)，温度为20-25℃，时间为3-5min；
所述分析方法中，磁性微球捕获所用缓冲溶液为2X B&W buffer (10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 2M NaCl, pH 7.5)，时间为20-60min；
所述分析方法对Cas9检测的浓度范围为0至200nM，检出限为0.13nM。
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JIANYU HU ET AL.: "Label-Free CRISPR/Cas9 Assay for Site-Specific Nucleic Acid Detection", 《ANAL. CHEM.》 *

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CN113658634A (zh) * 2021-08-13 2021-11-16 天津擎科生物技术有限公司 碱基耦合效率检测方法及装置
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