JP2024514196A - 改変型タンパク質分子を含む機能化された生体膜、並びにその作成方法及び使用 - Google Patents

改変型タンパク質分子を含む機能化された生体膜、並びにその作成方法及び使用 Download PDF

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Abstract

本明細書では、内因性二重層と、その中に埋め込まれるか又はそれと連結した1つ又は複数の改変型タンパク質分子とを含む、機能化された生体膜について記載される。本明細書ではまた、機能化された生体膜の中に埋め込まれるか又はそれと連結した1つ又は複数の改変型タンパク質分子を含む前記機能化された生体膜を調製する方法、及び前記機能化された生体膜の使用(単数及び複数)の方法についても記載される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2021年4月13日出願の米国仮特許出願第63/201,115号の優先権の利益を主張し、その内容は本明細書において参照によりその全体が組み込まれる。
本開示は、機能化された膜と、特にその中に埋め込まれるか又はそれと連結した改変型タンパク質分子とを有する生体膜、並びにその関連する方法及び使用に関する。
生体膜、バイオ膜又は細胞膜は、細胞を外部環境から分離するか又は細胞内コンパートメントを創出する選択透過膜である。生体膜は、真核細胞膜の形態では、化学物質及びイオンの伝達及び輸送で使用される埋め込まれた内在性及び表在性タンパク質を含むリン脂質二重層からなる。細胞膜内にある脂質のバルクは、タンパク質が回転し、また横方向に拡散して生理的機能を果たすための流体マトリックスを提供する。タンパク質は、膜内在性タンパク質の表面と緊密に結合している脂質分子からなる環状脂質シェルが存在する脂質二重層の高い膜流動性環境に適合している。
赤血球(Red blood cell:RBC)又は赤血球(erythrocyte)は最も豊富に存在する細胞型であり、また身体組織に酸素(O2)を循環系を通じた血流を介して送達する脊椎動物の主要手段である。RBCは、肺で、又は魚類の場合、鰓で酸素を取り込み、そして身体の毛細血管を通じて圧迫されながら通過する際に組織内に放出する。
赤血球の細胞質は、酸素と結合することができ、また細胞及び血液の赤い色に関係している鉄含有生体分子であるヘモグロビンに富む。各ヒト赤血球は、およそ270百万個のこのようなヘモグロビン分子を含有する。細胞膜はタンパク質及び脂質から構成され、またこの構造は、生理学的細胞機能、例えば循環系、特に毛細管網目構造を横断する際の変形性や安定性等にとって必須の特性を提供する。RBCゴーストとは、RBCの内容物が除去されたRBCを指す。薬物送達のためのプラットフォームとしてRBCやRBCゴーストを使用する試みがなされてきた。
生体膜が関係する新規の送達及び投与プラットフォーム並びに方法が望ましい。例えば、コロナウイルス疾患19(COVID-19)の流行という世界的危機は、新規の診断薬、治療薬、及びワクチンに対する差し迫った必要性を顕在化させる[1]。重症急性呼吸器症候群-コロナウイルス-2(SARS-CoV-2)は、主に呼吸器系飛沫を介して伝染する[2、3]。肺内では、SARS-CoV-2並びにその前駆体SARS-CoVの両方が、アンジオテンシン変換酵素2(ACE-2)を通じて繊毛気管上皮細胞及び2型肺細胞に主に感染する[4～6]。これが反応カスケードの契機となってウイルスと宿主細胞との融合を引き起こし、それが複製され、最終的にCOVID-19を引き起こす。
Remington's Pharmaceutical Sciences(2003-第20版) The United States Pharmacopeia:1999年に公表されたThe National Formulary(USP 24 NF19)
一態様は、内因性二重層と、その中に埋め込まれるか又はそれと連結した1つ又は複数の改変型タンパク質分子とを含む、機能化された生体膜を含む。
一実施形態では、1つ又は複数の改変型タンパク質分子は、内因性二重層内に埋め込まれている。
一実施形態では、1つ又は複数の改変型タンパク質分子は、合成により生成される。
一実施形態では、内因性二重層は赤血球二重層である。
一実施形態では、機能化された生体膜は、約0.00001質量%～約80質量%、任意選択で約0.0001%～約70%、約0.01%、又は約50%の1つ又は複数の改変型タンパク質分子を含む。
一実施形態では、膜は、機械的ストレス及び/又は浸透圧ストレスに対して抵抗性である。
一実施形態では、1つ又は複数の改変型タンパク質分子は、膜タンパク質、構造タンパク質、酵素、抗体、抗原、ホルモン、輸送タンパク質、タンパク質受容体、外因性タンパク質、核内因子、そのいずれか1つ若しくは複数の断片、又はそのいずれか2つ以上の組合せを含む。
一実施形態では、膜は1つ又は複数の生体分子又は小分子を更に含む。一実施形態では、1つ又は複数の生体分子は、核酸、糖、脂質、脂肪酸、又はその組合せを含み、任意選択で合成脂質を含む。
一実施形態では、1つ又は複数の改変型タンパク質分子はウイルスの膜タンパク質を含む。一実施形態では、1つ又は複数の改変型タンパク質分子はSARS-CoV-2スパイクタンパク質を含む。
一実施形態では、1つ又は複数の改変型タンパク質分子は抗体を含む。一実施形態では、抗体は、細菌抗原に対して、任意選択で大腸菌(E. coli)抗原に対して特異的な抗体を含む。
一実施形態では、1つ又は複数の改変型タンパク質分子は、血液脳関門内の受容体又はトランスポーターに結合するタンパク質を含む。一実施形態では、血液脳関門内の受容体はトランスフェリン受容体を含み、任意選択でトランスフェリン受容体に結合する1つ又は複数の改変型タンパク質分子はOX-26抗体を含む。
一実施形態では、膜は遊離可能なカーゴを含むか又は封入する。一実施形態では、遊離可能なカーゴは、生体分子又は小分子を含む。一実施形態では、遊離可能なカーゴは、抗生物質を含み、任意選択でポリミキシンB(PmB)を含む。一実施形態では、遊離可能なカーゴは、治療剤を含み、任意選択で脳由来神経栄養因子(BDNF)を含む。
一実施形態では、膜は1つ又は複数の改変型脂質分子を更に含む。
一実施形態では、機能化された生体膜は小胞を形成する。
一態様は、それを必要としている対象において免疫応答を提供するための、又は疾患、障害、若しくは状態を処置するための医薬の製造における、本明細書に記載される機能化された生体膜の使用を含む。
一態様は、治療剤又は予防剤としての、本明細書に記載される機能化された生体膜の使用を含む。
一態様は、ワクチン又は免疫原性組成物としての、本明細書に記載される機能化された生体膜の使用を含む。
一態様は、改変型タンパク質が埋め込まれた機能化された生体膜を調製する方法であって、
a)内因性二重層を提供する工程と、b)1つ又は複数の改変型タンパク質分子の一部分が脂質二重層に組み込まれて機能化された生体膜が生成されるような条件下で、表面活性物質の存在下において、内因性二重層を1つ又は複数の改変型タンパク質分子と接触させる工程と、c)表面活性物質を除去する工程と
を含む方法を含む。
様々な実施形態では、機能化された生体膜を調製する方法は、1つ又は複数の改変型脂質分子を機能化された生体膜中に組み込む工程を、任意選択で工程a)の前又は工程b)の後に更に含む。
一実施形態では、表面活性物質は、その臨界ミセル濃度を上回る濃度を有する。
一実施形態では、表面活性物質は、トリトン(Triton)X-100、ベータオクチルグルコシド、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸カリウム、ラウリル硫酸アンモニウム、ラウレス硫酸マグネシウム、ラウレス硫酸ナトリウム、ドデシルホスホコリン、ドデシルマルトシド、アルキル-PEG、ポリソルベート表面活性物質、CHAPS、CHAPSO、n-ドデシルβ-D-マルトシド、コール酸表面活性物質、又はその組合せを含む。
一実施形態では、表面活性物質を除去する工程は、ポリスチレンビーズを添加すること、任意選択でアンバーライト(Amberlite)XAD-2を添加することを含む。
一実施形態では、表面活性物質を除去する工程は、透析又は濾過を含み、任意選択で粒径排除クロマトグラフィー又はメンブレン濾過を介した濾過を含む。
一実施形態では、方法は、工程c)の後に、任意選択でゲル濾過により、機能化された生体膜を精製する工程を更に含む。
一実施形態では、方法は、脂質二重層適合表面を有する固体基材上で、機能化された生体膜を乾燥させる工程を更に含む。一実施形態では、方法は、ハイブリッド生体膜を再水和する工程を更に含む。
一態様は、1つ又は複数の改変型タンパク質分子が連結された機能化された生体膜を調製する方法であって、a)内因性二重層を提供する工程と、b)内因性二重層を、i)1つ又は複数の改変型タンパク質分子の共有結合に適したリンカー及び官能基、又はii)膜内で1つ又は複数の改変型タンパク質分子を荷電脂質と静電荷を介して会合させるのに適した電荷を含む1つ又は複数の合成脂質分子と、合成脂質分子の一部分が内因性二重層に組み込まれてハイブリッド二重層が生成するような条件下で接触させる工程と、c)ハイブリッド二重層を乾燥させる工程と、d)ハイブリッド二重層を水溶液内で再懸濁する工程と、e)ハイブリッド二重層を、1つ又は複数の改変型タンパク質分子の一部分が、ハイブリッド二重層内で1つ又は複数の合成脂質分子と共有結合し、これにより1つ又は複数の改変型タンパク質分子が連結された機能化された生体膜が生成されるような条件下で、1つ又は複数の改変型タンパク質分子と接触させる工程とを含む方法を含む。
様々な実施形態では、機能化された生体膜を調製する方法は、工程b)の前に、内因性二重層及び/又は1つ又は複数の改変型タンパク質分子を精製する工程を更に含む。
様々な実施形態では、内因性二重層は、赤血球から得られ、任意選択で赤血球ゴーストから得られる。
様々な実施形態では、改変型タンパク質分子は、膜タンパク質、構造タンパク質、酵素、抗体、抗原、ホルモン、輸送タンパク質、タンパク質受容体、外因性タンパク質、核内因子、そのいずれか1つ若しくは複数の断片、又はそのいずれか2つ以上の組合せを含む。一実施形態では、改変型タンパク質分子は、ウイルスの膜タンパク質を含む。一実施形態では、改変型タンパク質分子は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質を含む。
様々な実施形態では、機能化された生体膜を調製する方法は、1つ又は複数の生体分子又は小分子を機能化された生体膜中に組み込む工程を更に含む。一実施形態では、生体分子は、核酸、糖、脂質、脂肪酸、又はその組合せを含む。
様々な実施形態では、機能化された生体膜を調製する方法は、機能化された生体膜中に、遊離可能なカーゴを封入する工程を更に含む。一実施形態では、遊離可能なカーゴは1つ又は複数の生体分子又は小分子を含む。
様々な実施形態では、機能化された生体膜は小胞を形成する。
一態様は、本明細書に記載される方法により調製される機能化された生体膜を含む。
一態様は、本明細書に記載される機能化された生体膜を含む免疫原性組成物を含む。一実施形態では、1つ又は複数の改変型タンパク質分子は抗原を含む。一実施形態では、抗原はSARS-CoV-2スパイクタンパク質である。一実施形態では、機能化された膜又は免疫原性組成物は、対象において免疫応答を提供することにおいて使用される。
一態様は、対象において免疫応答を提供するための、本明細書に記載される機能化された生体膜を含む免疫原性組成物を含む。
一態様は、本明細書に記載される機能化された生体膜を含み、改変型タンパク質分子がSARS-CoV-2スパイクタンパク質を含む医薬組成物を含む。一実施形態では、医薬組成物は、対象におけるCOVID-19の処置で使用される。
一態様は、本明細書に記載される機能化された生体膜を含み、改変型タンパク質分子が対象におけるCOVID-19を処置するためのSARS-CoV-2スパイクタンパク質を含む医薬組成物の使用を含む。
一態様は、本明細書に記載される機能化された生体膜を含む医薬組成物であって、1つ又は複数の改変型タンパク質分子が、細菌抗原に対して、任意選択で大腸菌抗原に対して特異的な抗体を含み、該膜は、抗生物質を含む遊離可能なカーゴを含むか又は封入する、医薬組成物を含む。一実施形態では、抗生物質はポリミキシンBを含む。一実施形態では、医薬組成物は、細菌感染症を処置することにおいて使用される。
一態様は、本明細書に記載される機能化された生体膜を含む医薬組成物の使用を含み、1つ又は複数の改変型タンパク質分子は、細菌抗原に対して、任意選択で大腸菌抗原に対して特異的な抗体を含み、該膜は、細菌感染症を処置するための抗生物質を含む遊離可能なカーゴを含むか又は封入する。
一態様は、本明細書に記載される機能化された生体膜を含む医薬組成物を含み、1つ又は複数の改変型タンパク質分子は、血液脳関門内の受容体又はトランスポーターに結合するタンパク質を含み、任意選択でOX-26抗体を含み、該膜は治療剤を含む遊離可能なカーゴを含むか又は封入する。一実施形態では、治療剤は、抗神経変性剤を含み、任意選択で脳由来神経栄養因子(BDNF)を含む。一実施形態では、医薬組成物は、神経変性の疾患又は状態を処置することにおいて、任意選択で認知症を処置することにおいて使用される。
一態様は、本明細書に記載される機能化された生体膜を含む医薬組成物の使用を含み、1つ又は複数の改変型タンパク質分子は、血液脳関門内の受容体又はトランスポーターに結合するタンパク質を含み、任意選択でOX-26抗体を含み、該膜は、神経変性疾患又は状態を処置するための、任意選択で認知症を処置するための治療剤、任意選択で抗神経変性剤、任意選択でBDNFを含む遊離可能なカーゴを含むか又は封入する。
下記事項も本明細書に提示される。一態様に基づき、1つ又は複数の改変型タンパク質分子でドープされた内因性二重層を含む生体膜が提供される。一実施形態では、改変型タンパク質は、自然に折り畳まれた、別様に折り畳まれた、又は折り畳まれていない配置にある。一実施形態では、改変型タンパク質は、内因性又は非内因性である。一実施形態では、改変型タンパク質は天然又は非天然である。一実施形態では、改変型タンパク質は、合成により生成される。一実施形態では、改変型タンパク質分子は生体膜の機能的特性を変化させる。一実施形態では、内因性二重層は赤血球二重層である。一実施形態では、改変型タンパク質分子は、内因性二重層中で実質的に均一に分布している。一実施形態では、改変型タンパク質分子は、膜の約0.00001質量%～約80質量%、例えば約0.0001%～約70%等、例えば約0.01%又は約50%等を占める。一実施形態では、膜は生体適合性である。一実施形態では、膜は機械的ストレス及び/又は浸透圧ストレスに対して抵抗性である。一実施形態では、改変型タンパク質分子は、構造タンパク質、酵素、抗体、抗原、ホルモン、輸送タンパク質、タンパク質受容体、外因性タンパク質、核内因子、又はその組合せを含む。一実施形態では、改変型タンパク質分子は膜タンパク質を含む。一実施形態では、改変型タンパク質分子は抗原を含む。一実施形態では、改変型タンパク質分子はウイルスの膜タンパク質を含む。一実施形態では、改変型タンパク質分子はSARS-CoV-2スパイクタンパク質を含む。一実施形態では、改変型タンパク質分子は細菌抗体を含む。一実施形態では、改変型タンパク質分子は抗大腸菌抗体を含む。一実施形態では、改変型タンパク質分子は、血液脳関内の受容体及び/又はトランスポーターと結合するタンパク質を含む。一実施形態では、改変型タンパク質分子は抗TfR抗体OX-26を含む。一実施形態では、膜は1つ又は複数の生体分子又は小分子を更に含む。一実施形態では、1つ又は複数の生体分子は、核酸、糖、脂質、脂肪酸、又はその組合せを含む。一実施形態では、膜は、任意選択で遊離可能なカーゴを封入する。一実施形態では、遊離可能なカーゴは生体分子又は小分子を含む。一実施形態では、遊離可能なカーゴは抗生物質的分子を含む。一実施形態では、遊離可能なカーゴは抗生物質的ポリミキシンBを含む。一実施形態では、遊離可能なカーゴは治療剤を含む。一実施形態では、遊離可能なカーゴは脳由来神経栄養因子(BDNF)を含む。一実施形態では、膜は治療剤又は予防剤として使用される。
1つの態様では、本明細書に記載される膜は、医薬の少なくとも一部分、任意選択で免疫原性組成物として使用される。一実施形態では、膜はワクチンの少なくとも一部分として使用される。一実施形態では、膜は抗生物質として使用される。一実施形態では、膜は、治療剤として、任意選択で神経変性治療薬又は神経学的治療薬として使用される。一実施形態では、膜は1つ又は複数の改変型脂質分子を更に含む。一実施形態では、1つ又は複数の改変型タンパク質分子でドープされた内因性二重層は小胞を形成する。
別の態様に基づけば、1つ又は複数の改変型タンパク質分子でドープされた生体膜を調製する方法であって、内因性二重層を1つ又は複数の改変型タンパク質分子でドープする工程を含む方法が提供される。一実施形態では、方法は、ドープの前に内因性二重層を精製する工程を更に含む。一実施形態では、方法は、ドープの前に、内因性二重層から細胞内容物を除去する工程を更に含む。一実施形態では、方法は、ドープの前に1つ又は複数の改変型タンパク質分子を精製する工程を更に含む。一実施形態では、ドープは、内因性二重層を改変型タンパク質分子及び界面活性剤と共に混合する工程を含む。一実施形態では、界面活性剤はその臨界ミセル濃度を上回る濃度を有する。一実施形態では、界面活性剤は表面活性物質として作用する。一実施形態では、界面活性剤は、トリトンX-100、ベータオクチルグルコシド、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸カリウム、ラウリル硫酸アンモニウム、ラウレス硫酸マグネシウム、ラウレス硫酸ナトリウム、ドデシルホスホコリン、ドデシルマルトシド、アルキル-PEG、ポリソルベート表面活性物質、CHAPS、CHAPSO、n-ドデシルβ-D-マルトシド、コール酸表面活性物質、又はその組合せを含む。一実施形態では、方法は界面活性剤を除去する工程を更に含む。一実施形態では、界面活性剤を除去する工程は、ポリスチレンビーズ、任意選択でアンバーライトXAD-2を添加することを含む。一実施形態では、界面活性剤を除去する工程は、透析又は濾過を含み、任意選択で粒径排除クロマトグラフィー又はメンブレン濾過を介した濾過を含む。一実施形態では、方法は、1つ又は複数の改変型タンパク質分子でドープされた内因性二重層を、任意選択でゲル濾過により、任意選択で精製する工程を更に含む。一実施形態では、改変型タンパク質分子は、溶解した状態又は真空凍結乾燥された状態にある。一実施形態では、方法は、1つ又は複数の改変型タンパク質分子でドープする前又は後に、脂質二重層適合表面を有する固体基材上で生体膜を乾燥させる工程を更に含む。一実施形態では、方法は、ハイブリッド生体膜を再水和する工程を更に含む。一実施形態では、内因性二重層は赤血球を含む。一実施形態では、赤血球は赤血球ゴーストを含む。一実施形態では、改変型タンパク質分子は、構造タンパク質、酵素、抗体、抗原、ホルモン、輸送タンパク質、タンパク質受容体、外因性タンパク質、核内因子、又はその組合せを含む。一実施形態では、改変型タンパク質分子は膜タンパク質を含む。一実施形態では、改変型タンパク質分子は抗原を含む。一実施形態では、改変型タンパク質分子は、ウイルスの膜タンパク質を含む。一実施形態では、改変型タンパク質分子は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質を含む。一実施形態では、方法は、1つ又は複数の生体分子又は小分子を、1つ又は複数の改変型タンパク質分子でドープされた生体膜中に組み込む工程を更に含む。一実施形態では、生体分子は、核酸、糖、脂質、脂肪酸、又はその組合せを含む。一実施形態では、方法は、内因性二重層を1つ又は複数の改変型脂質分子でドープする工程を、任意選択で、1つ又は複数の改変型タンパク質分子でドープする前又は後に更に含む。一実施形態では、改変型脂質分子は、タンパク質分子を膜に連結するためのリンカーとしての役目を果たす。一実施形態では、改変型脂質分子は、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[マレイミド(ポリエチレングリコール)-2000](PEG-MAL(2000))である。一実施形態では、方法は、任意選択で1つ又は複数の改変型タンパク質分子でドープする前又は後に、遊離可能なカーゴを生体膜中に封入する工程を更に含む。一実施形態では、遊離可能なカーゴは、1つ又は複数の生体分子又は小分子を含む。
別の態様に基づけば、本明細書に記載される方法により調製される生体膜が提供される。
別の態様に基づけば、本明細書に記載される膜を含み、改変型タンパク質分子が抗原である免疫原性組成物が提供される。
別の態様に基づけば、対象において免疫応答を提供するための方法であって、本明細書に記載される免疫原性組成物を取得する工程と、有効量の該組成物を、それを必要としている対象に投与する工程とを含むが提供される。一実施形態では、対象において免疫応答を提供する工程は、対象の肝臓及び/又は脾臓に対して抗原を提示することを含む。一実施形態では、対象の脾臓に対して抗原を提示する工程は、ファゴサイトーシス、及び脾臓内の抗原提示細胞に対する免疫原性組成物の提示を含む。
別の態様に基づけば、本明細書に記載される膜を含み、改変型タンパク質分子がSARS-CoV-2スパイクタンパク質である、医薬組成物が提供される。
別の態様に基づけば、対象におけるCOVID-19を処置するための方法であって、本明細書に記載される医薬組成物を取得する工程と、有効量の該組成物を、それを必要としている対象に投与する工程とを含む方法が提供される。
本開示のその他の特性は、下記の詳細な説明から明らかとなる。しかしながら、詳細な説明及び具体的な実施例は本開示の実施形態を明示しつつも、単に例証として提示され、また特許請求の範囲はこれら実施形態により限定されるものではなく、むしろ全体としての説明と整合する最も広い解釈を前提とすべきものと理解されるべきである。
ある特定の実施形態が、下記の添付の図面を参照しながら、ここでより詳細に記載される。
本出願の例示的な実施形態における赤血球に基づくウイルス様粒子(Erythro-VLP)の調製プロトコール及び分子シミュレーションを示す図である。A:Erythro-VLPの調製プロトコール:赤血球リポソームをヒトRBCから調製した。14mg/mlの赤血球リポソームを、3μM及び25mMトリトン-X100溶液中でインキュベートした。アンバーライトXAD-2を添加してトリトン-X100を除去し、そして12時間インキュベートした。B:100ps、1μs、2μs、及び3μs後の分子動力学シミュレーションのスナップショット。タンパク質を黒色の鎖として可視化する。赤血球膜に広がる脂質をグレーの球(リン酸基)で表す。表面活性物質(トリトンX-100)をライトグレーのロッドで表記する。C及びD:トリトン-X100を含む/含まない水溶液内Sタンパク質の500ns後の各スナップショット。角度Θはエクトドメイン三量体に対するTMDの傾きを表し、そしてEにプロットした。F:赤血球膜中へのSタンパク質の挿入プロセスから50ns後のMDスナップショット。G:500ns後のスナップショット(Sタンパク質が膜中に完全に埋め込まれている)。両シミュレーションから得られたトリトン-X100密度マップ(y軸に沿って平均化した)をH及びJに示し、z軸に沿って平均化したマップをK及びLに示す。 本出願の例示的実施形態におけるErythro-VLPの特徴付けを示す図である。A:Erythro-VLPのSECクロマトグラム(Erythro-VLP及びトリトン-X100に由来する2つのシグナルを示す)。B:DLSにより決定されたErythro-VLPの粒径分布。赤血球リポソームは102±1nm(多分散性:0.19±0.02)として測定されたが、スパイク担持リポソームについては平均直径222±6nm(多分散性:0.32±0.01)と決定された。C:ヒトACE-2タンパク質に対するErythro-VLPの結合性を、バイオレイヤー干渉法(BLI)により測定した。ACE-2固定化バイオセンサーを、濃度を漸増させたErythro-VLPに曝露すると、大型の粒子が光学バイオセンサーに結合する場合と整合して、用量依存性のBLIシグナルの低下が観察された。D:バイオセンサー上に固定されたヒトACE-2が存在しない場合(ライトグレー)及び存在する場合(ダークグレイ)のErythro-VLPに関する会合及び解離曲線。ダークグレイの曲線を、比較目的でC(8×)から転用した。E:BLIの概略図。ビオチン化ヒトACE-2を、ストレプトアビジンBLIセンサー上に固定化した。次にセンサーをErythro-VLPに曝露し、そして会合及び解離をモニタリングした。 図３。本出願の例示的実施形態における、SARS-CoV-2 Sタンパク質及び巨大Erythro-VLP膜の構造及びラベリングを示す図である。A:SARS-CoV-2 Sタンパク質のタンパク質構造。タンパク質をリボンダイアグラムとして表し、そしてシステインを球として表す。溶媒接触可能表面積(Solvent Accessible Surface Area:SASA)をGetareaソフトウェアにより決定し、そしてBにグラフ化する。C:アガロースゲル上で成長した巨大Erythro-VLPのエピ蛍光顕微鏡画像。膜をTR-DHPEを使用して赤色に染色した; SARS-CoV-2 Sタンパク質はAlexa Fluor 488マレイミドを使用して緑色に染色した。D:アガロースから採取後の巨大リポソームからなるクラスターのCLSM画像。E:CLSMを用いて撮影された1つの単離された巨大Erythro-VLPの拡大像。C～Eの画像は、左から右に、赤色チャネル、緑色チャネル、及び統合した蛍光チャネルをそれぞれ示す。F:赤血球リポソーム及びErythro-VLPのCryo-TEM画像。*100nm及び*230nmのリポソーム粒径はDLSの結果とよく一致する。赤血球膜内に係留されたSタンパク質とそのTMDが観察される。 図３の続き。 本出願の例示的実施形態で行われたErythro-VLP注射に対するin vivoでの応答を示す図である。A:マウス試験のタイムライン。各マウスは、滅菌緩衝生理食塩水に懸濁したErythro-VLPの3回注射を、0、5、及び10日目に受けた。各用量内の小胞濃度はおよそ30nMであった(スパイクタンパク質8μgを含有する)。血液を0(対照)、7、及び14日目に採血した。最終採血は28日後であった。B:酵素結合免疫吸着アッセイ法(ELISA)を抗体検出に使用した。C:ELISAアッセイにおいて全サンプルについて時間の関数として表す光学濃度。D:測定された光学濃度比。バーは全3回の稀釈測定について平均化した平均光学濃度比を表す。比が1を上回れば、SARS-CoV-2抗体ELISAにおいて陽性とみなされる。強い抗体応答が、14日後に両マウスに認められた;対照では応答が認められなかった。 調製プロトコールの概略を示す図である。赤血球リポソームをヒト赤血球から調製し(A～B)、そしてポリミキシンB(PmB)の保持を強化するために、負に荷電したDMPSの添加を通して改変する(C)。抗大腸菌抗体をPEG-MAL(2000)にコンジュゲートして特異性を実現した(D～E)。得られたハイブリッド赤血球リポソームをPmBと混合すればErythro-PmBが生成する(F)。この試験で使用される分子の模式図を右側に示す:1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[マレイミド(ポリエチレングリコール)-2000](PEG-MAL(2000))、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン(DMPS)、及びポリミキシンB(C56H100N16O17S)。 DMPSの割合を変化させた場合のハイブリッド赤血球リポソーム内PmB保持量を示す図であり、PmBの赤血球リポソームに対する比を、大腸菌について増殖曲線を測定することにより最適化した。24時間にわたり、0.32μg/mLのPmB濃度(0.5MIC)において測定した600nmにおける吸収(OD600)を示す。ハイブリッド赤血球リポソームは5mol%のDMPSからなり、リポソームに対するPmBの比を1000とした場合、誘導期が最も短いことから示唆されるように、最高のPmB保持量を引き起した。 Erythro-PmB調製の異なる段階:赤血球リポソーム、ハイブリッド赤血球リポソーム、及びErythro-PmBにおいて、動的光散乱(DLS)を通じて決定されたリポソーム粒径を示す図である。粒径の関数として標準化後の強度をプロットする;データをn=3から得られた平均サイズとして報告する。赤血球リポソームは平均粒径142nm(PDI=0.66)を示した一方、ハイブリッド赤血球リポソームは434nm(PDI=0.03)、及びErythro-PmBは515nm(PDI=0.04)であった。 原子間力顕微鏡(AFM)を用いて画像化した赤血球リポソームを示す図である。70～300nmのリポソームが認められた。b)AFMを用いて画像化したErythro-PmBより、粒径がより大きくなることで表面形態に変形が生ずることが明らかである。c)透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて画像化したErythro-PmBは、外部脂質及び抗体層を伴う粒径約300nmを有するバーストリポソームとして観察される。TEM画像を500,000×の直接拡大法で取得した。 Erythro-PmB中のダンシル-PmB保持量を示す図である。a)ダンシル-PmBをErythro-PmBと共に30分間インキュベートした後、365nmでUV励起した代表的なサンプルドロップレット画像。b)サンプルドロップレットに関する積分ピクセル強度。負荷効率を、Erythro-PmB内に保持されるPmBの、溶液中に含まれる初期の全ダンシル-PmBに対する比として計算した。データはn=3の平均である。 溶血アッセイ(Erythro-PmB濃度の関数として溶血の量を測定する)を示す図である。純粋な赤血球を、陽性対照として種々の濃度の(遊離)PmBを用いて処理した(MIC 0.63μg/mL)。12%トリトンX-100を全溶解対照として使用し、そしてPBSを陰性対照として使用した。 Erythro-PmBがどのように大腸菌を標的とし、それと相互作用するかを示す図である。a)～c)は、蛍光顕微鏡検査を用いて画像化した大腸菌-GFPを示す。緑色チャネルにおいてのみ発光が認められる。d)～f)は、テキサスレッド(TR-DHPE)を用いて標識された膜を有するErythro-PmBと共にインキュベートした大腸菌-GFPを示す。d)及びe)内の緑色チャネル及び赤色チャネルは、それぞれ細菌及びErythro-PmBを示す。f)の統合されたチャネルでは、Erythro-PmB(赤色チャネル)が細菌(緑色チャネル)を取り囲み、それに結合する。1つの細菌を拡大図に示す。g)及びh):Erythro-PmBを大腸菌と共にインキュベートし、酢酸ウラニウムを用いて染色し、そして透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて、25,000×の直接拡大法で画像化した。大腸菌を取り囲み、それに連結したErythro-PmBが見出された。 様々な濃度のa)遊離PmB及びb)Erythro-PmBを用いて処理した大腸菌について、24時間にわたり、600nm(OD600)で測定された細菌増殖曲線を示す図である。遊離PmBの最低阻止濃度(MIC)を0.63μg/mLと決定した。Erythro-PmBの増殖曲線は、全体的に遊離PmBと類似した挙動を示し、Erythro-PmBは、大腸菌増殖阻害において、遊離Pmbと同程度に効果的であることが示唆される。 様々な濃度のa)遊離PmB及びb)Erythro-PmBを用いて処理されたK.アエロゲネス(K. aerogenes)について、24時間にわたり、600nm(OD600)で測定された細菌増殖曲線を示す図である。遊離PmBの最低阻止濃度(MIC)を1.5μg/mLと決定した。大腸菌と同様に、誘導期の長さはPmB濃度の減少と共に単調減少した。Erythro-PmBのMICは6倍超まで有意に増加し、Erythro-PmBは、K.アエロゲネスに対してPmBを効果的に送達しないことが示唆される。 OX26(Erythro-BBB)とコンジュゲートし、シリコン基材上に沈積した赤血球リポソームの原子間力顕微鏡画像を示す図である。300～500nmのリポソームを観測した。 Erythro-BBBのBDNFの負荷効率を示す図である。負に荷電した脂質を膜中に組み込むことにより、負荷効率は30%まで増加しうる。封入を、保持されたBDNFの全BDNFに対する比として計算した。 動的光散乱を通じて決定された赤血球リポソーム及びErythro-BBBの粒径分布を示す図であり、抗体コンジュゲーションの奏功性を証明する。粒径の関数として標準化後の強度をプロットする。データをn=3の平均として報告する。赤血球リポソーム及びErythro-BBBは、324及び508nmの粒径をそれぞれ示す。 サンドイッチELISA実験の結果を示す図である。a)Erythro-BBBを、100,000ng/mLのOX26を含有する反応混合物内で調製した。初期OX26濃度を異なる実験稀釈倍率で希釈し、それに結合したErythro-BBBの濃度を示す。b)Erythro-BBBが関わるサンドイッチELISAの概略。
下記は、本開示を実践する際に当業者の一助となるように提示される詳細な説明である。別途定義されなければ、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本開示が属する当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書の説明において使用される専門用語は、単に具体的な実施形態を記載するためであり、本開示を限定するように意図するものではない。本明細書に記載されるすべての公開資料、特許出願、特許、図面、及びその他の参考資料は、参照によりその全体が明示的に組み込まれる。
本明細書に記載される実施例に示すように、内因性二重層、例えば赤血球膜等は、改変型タンパク質分子、例えばSARS-CoV-2スパイクタンパク質、又は抗体分子、例えば抗大腸菌抗体若しくはOX-26抗体等を組み込み、機能化された生体膜を生成するために改変されうる。前記機能化された生体膜は、遊離可能なカーゴ、例えば抗生物質(例えば、ポリミキシンB(PmB))等、又は治療剤、例えば増殖因子(例えば、脳由来神経栄養因子(BDNF))等を連結するか又は封入することにより更に改変可能であることも、本明細書に記載の実施例に示される。
従って、内因性二重層、及び内因性二重層中に埋め込まれるか又はそれと連結した1つ若しくは複数の改変型タンパク質分子を含み、任意選択で遊離可能なカーゴを更に含む機能化された生体膜が、本明細書に提示される。前記機能化された生体膜を含む組成物、並びに上記したすべてに関する方法及び使用についても本明細書において記載される。前記機能化された生体膜を調製するための方法が更に記載される。
感染性疾患、例えばSARS-CoV-2に由来するCOVID-19等を制御するのに新規治療戦略が必要とされるので、赤血球に基づくプロテオリポソームの膜内にSARS-CoV-2スパイクタンパク質を組み込むためのプロトコールが本明細書に記載される。
一般的に赤血球(red blood cell:RBC)として知られている赤血球(erythrocyte)のin-vitro機能化を、SARS-CoV-2 Sタンパク質をRBCの膜中に直接埋め込むことを通じて行い、それによって内因性担体を使用しながらSタンパク質を投与する代替的アプローチが本明細書に提示される。要するに、タンパク質挿入前に疎水性膜貫通ドメインを安定化させ、RBC膜を可溶化して進入を促進するために、表面活性物質(例えば、トリトン-X100)を使用した。RBCは免疫複合体及び細菌を補足し、そしてそれらを肝臓内クッパー細胞及び脾臓内抗原提示細胞(APC)に提示することがこれまでに報告されている[17、18]。Ukidveらは、この機構は、ナノ粒子を脾臓に送達して、改善した抗体産生、より高いセントラルメモリーT細胞応答、及びより低い調節性T細胞応答をもたらすのに利用可能であることを最近実証した[19]。
例示的な実施形態では、Sタンパク質を含む赤血球に基づくウイルス様粒子「Erythro-VLP」は、十分に定義された粒径分布(222±6nm)及び外膜上タンパク質密度(タンパク質約70個/μm2)を有することが明らかにされている。Sタンパク質の適正な挿入及び機能的確認を、バイオレイヤー干渉アッセイ法において、ACE-2(アンジオテンシン変換酵素2)に対する用量依存性の結合により行った。酵素結合免疫吸着アッセイ法(ELISA)より明らかなように、Erythro-VLPは、静脈内投与したとき、マウストライアルにおいて14日後に顕著な抗体応答を引き起こした。
本明細書に記載される赤血球に基づくウイルス様粒子は、バイオレイヤー干渉アッセイ法において、ACE-2に対する用量依存性の結合、並びにマウストライアル及びELISAにおいて強い抗体応答を示し、重要な低温流通要件を有するmRNAに基づくワクチン、及びアデノウイルスベクター化ワクチンと比較した場合、抗スパイク抗体を創出するための代替案として可能性があることを示している[20]。この赤血球に基づくプラットフォームは、疾患、例えばSARS-CoV-2又はその他のウイルスにより引き起こされた感染性疾患等に対する潜在的治療オプションでありうる。
I.一般的定義
別途表示されない限り、このセクション及びその他のセクションに記載される定義及び態様は、本明細書に記載される本開示のすべての態様に適用されるように意図されており、それらにとってそのような定義及び態様は、当業者により理解されるように適確である。
本開示の範囲を理解する際に、冠詞「1つの(a)」、「1つの(an)」、「その(the)」、及び「前記(said)」は、いくつかの要素のうちの1つ又は複数が存在することを意味するように意図される。それに付加して、用語「～を含むこと(comprising)」及びその派生語は、本明細書で使用される場合、記載された特性、要素、コンポーネント、群、整数、及び/又は工程の存在を特定するが、しかしその他の記載されない特性、要素、コンポーネント、群、整数、及び/又は工程の存在を除外しない非限定的用語であるように意図されている。上記は、類似した意味を有する言葉、例えば用語「～を含むこと(including)」、「～を有すること(having)」、及びその派生語等にも適用される。
用語「対象」、「患者」、「個体」、又は「宿主」とは、本明細書で使用される場合、診断、処置、又は療法が望まれる動物界のいずれかのメンバー(哺乳動物、特にヒトを含む)を指す。従って、本出願の方法及び使用は、ヒト療法及び獣医学用途の両方に適用される。
用語「～を処置すること」、「処置」等とは、本明細書で使用される場合、及び当技術分野において十分に理解されているように、臨床結果を含む有益な又は所望の結果を取得するためのアプローチを指す。有益な又は所望の臨床結果として、検出可能又は検出不能を問わず、1つ又は複数の症状又は状態の軽減又は良化、1つ又は複数の症状又は状態を呈する期間の短縮、疾患発症の阻止、疾患範囲の縮減、疾患状態の安定化(すなわち、無増悪)、疾患拡散の防止(例えば、感染性の減少)、疾患進行の遅延又は低速化、疾患の退化、疾患再発の縮減を含む疾患状態の良化又は緩和、及び寛解(部分的であるか又は全体的であるかを問わない)が挙げられるが、但しこれらに限定されない。「～を処置すること」及び「処置」とは、処置を受けなかった場合の予想される生存と比較して、生存の延長を指す場合もある。「～を処置すること」及び「処置」には、本明細書で使用される場合、予防的処置、例えばリスクの防止、抑制、重症度の低減、又は疾患の発現遅延等も含まれうる。予防的処置は、疾患に罹患しやすい可能性があるが、しかしそれを有するものとなおも診断されていない対象において、疾患又は疾患の症状が生ずることに対する予防を含む(例えば、一次疾患と関連しうるか又はそれにより引き起こされた可能性のある疾患を含む)。従って、効果は、疾患又はその症状を完全又は部分的に防止することに関して予防的でありえ、並びに/或いは疾患及び/又は疾患の症状に対する部分的又は完全な治癒に対する影響に関して治療的でありうる。
用語「～を投与すること」又は「投与」とは、本明細書で使用される場合、組成物を所望の部位(例えば、組織、臓器、又はエリア)に対して少なくとも部分的に送達できるようにする方法又は経路によって、本明細書に開示されるような治療有効量の薬剤、薬物、免疫原性組成物、医薬組成物、及び/又は組合せを、対象内に配置することを指す。本明細書で開示される薬剤及び/又は組成物は、対象内で有効な処置をもたらすいずれかのふさわしい経路により投与可能である。本明細書で開示される医薬品及び組成物の考えうる投与経路として、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経皮、脊髄、及びその他の非経口投与経路、或いは経口、頬側、舌下、鼻腔内、局所的、表皮、粘膜、若しくは直腸の各投与経路、又はその組合せが挙げられるが、但しこれらに限定されない。
用語「有効量」又は「治療有効量」は、本明細書で使用される場合、いずれか1つ又は複数の有益な又は望ましい結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、1回又は2回以上の用量、投与ラウンド、又は処置コースにおいて投与可能である。
ある特定のコンポーネント「を含むこと(comprising)」のように記載されるいずれかの態様は、それ「からなる」か、又はそれ「から実質的になる」(又はその逆も成り立つ)可能性があり、その場合、「～からなる」は、閉鎖的又は限定的な意味合いを有し、「～から実質的になる」とは、特定されたコンポーネントを含むが、しかしその他のコンポーネント(但し、不純物として存在する物質、コンポーネントを提供するのに使用されるプロセスの結果として存在する不可避の物質、及び本明細書に記載される技術的効果を達成する目的以外の目的で添加されるコンポーネントを除く)を除外することを意味するものと理解される。例えば、慣用句「～から実質的になる」を使用して定義される組成物には、いずれかの公知の薬学的に許容される添加剤、賦形剤、稀釈剤、担体等が包含される。一般的に、一連のコンポーネントから実質的になる組成物は、5質量%未満、一般的に3質量%未満、より一般的には1質量%未満の不特定コンポーネントを含む。
本明細書において暗示的に定義されるか又は明示的に定義されるかに関わらず、含まれるものとして本明細書において定義されるいずれかのコンポーネントから、但し書き又は否定的限定によって、例えばいずれかの特定の化合物又は方法ステップ等が明示的に除外されうるものと理解される。
ある範囲の数値が提示される場合、当該範囲の上限及び下限の間の各中間に位置する数値(文脈より別途明確に指示されない限り下限値の単位の10分の1まで)、及びその記載された範囲内のいずれかの記載される又は中間に位置するその他の数値が、その説明内に包含されるものと理解される。いずれかの下限からいずれかの上限の範囲が想定される。このようなより小さい範囲の上限及び下限(より小さい範囲内に独立に含まれうる)もその説明内に包含され、記載される範囲内の特に除外される限界値の制約を受ける。記載される範囲が限界値の一方又は両方を含む場合、これらの含まれる限界値のいずれか又は両方を除外する範囲もその説明に含まれる。用語「及び/又は」は、本明細書で使用される場合、リスト化された事項が、個別に若しくは組み合わされて存在するか又は使用されることを意味する。実際には、この用語は、リスト化された事項「のうちの少なくとも1つ」又は「1つ又は複数」が使用されるか又は存在することを意味する。
略号、「例えば(e.g.)」はラテン語の「exempli gratia」に由来し、本明細書において非限定的な例を示すのに使用される。従って、略号「例えば(e.g.)」は、用語「例えば(for example)」と同義である。言葉「又は」は、文脈が別途明示しない限り、「及び」を含むように意図されている。
最後に、程度の用語、例えば「実質的に」、「約」、及び「およそ」等は、本明細書で使用される場合、修飾された用語の合理的な逸脱量(例えば、最終結果が有意に変わらない量)を意味する。これらの程度の用語は、修飾された用語の少なくとも±5%の逸脱を含む(それが修飾する言葉の意味をこの逸脱が無効にしない限り)ものと解釈すべきである。それに加えて、本明細書に記載するすべての範囲は、明示的に記載されるか又はされないに関わらず、範囲の末端及びいずれかの中間範囲の点も含む。
II.機能化された生体膜、組成物、及び使用
内因性二重層と、その中に埋め込まれるか又はそれと連結した1つ又は複数の改変型タンパク質分子とを含む、機能化された生体膜が本明細書に記載される。
用語「内因性二重層」とは、本明細書で使用される場合、リン脂質二重層、例えば生物学的起源、例えば真核細胞等に由来するか又はそれから得られる細胞膜を含む半透膜を指す。いずれかの内因性二重層が使用可能であるものの、一般的には、内因性二重層は赤血球二重層である。より一般的な実施形態では、内因性二重層は、破裂させるか又は透過処理された赤血球(「赤血球ゴースト」とも呼ばれる)に由来するか又はそれから得られる。いずれかの真核生物膜源(例えば肺、腎臓、肝臓、血液脳関門、又は胎盤に由来するか又はそれから得られる細胞膜等)が、内因性二重層として使用可能であるものと理解される。
用語「タンパク質分子を改変すること」とは、本明細書で使用される場合、膜へのタンパク質分子の組込み又は添加を指し、従ってその天然の状態で膜内にすでに存在するタンパク質は含まれない。しかしながら、内因性二重層に組み込まれるか又は添加されるとき、及びその天然の状態において内因性二重層に見出されるレベルを上回り存在するとき、内因性二重層は、天然に存在するタンパク質を含むものと、そのような天然に存在するタンパク質も改変型タンパク質分子であるとみなされうるものと理解される。用語「ドープ」又は「ドープされた」とは、本明細書で使用される場合、例えば、改変型タンパク質分子を膜中に埋め込むことによるか、又は改変型タンパク質分子を膜と直接的又は間接的に連結することにより、分子、例えばタンパク質分子等を膜に添加することを指すものと理解される。いくつかの実施形態では、改変型タンパク質分子は内因性二重層内には存在しない。
改変型タンパク質分子は、膜中に埋め込まれることにより、リンカーを介して膜と連結することにより、又は静電荷相互作用を介して膜中の脂質と会合することにより、膜中に組み込まれるか又は添加されうる。例えば、内在性膜タンパク質(例えば、1つ又は複数の膜相互作用ドメイン、例えば膜貫通ドメイン等を有するもの)は、膜相互作用ドメインによって膜中に埋め込み可能である。その他のタンパク質、例えば膜相互作用ドメインが欠損しているものは、化学リンカー、例えば脂質アンカー等を使用して膜に連結可能である。本明細書に示す通り、内因性二重層は、リンカー、例えばポリエチレングリコール(PEG)を含む脂質を組み込むように改変され、反応性基、例えばマレイミド(タンパク質分子がそれと共有結合的に連結することができ、これにより改変型タンパク質分子を膜に連結する)等を用いて機能化されうる。改変型タンパク質分子は、その他のリンカー及び当技術分野において公知の反応性基を介して連結可能であると理解される。内因性二重層は、脂質(膜の表面電荷を変化させ、これにより改変型タンパク質分子の特定の特性に応じて改変型タンパク質分子に対する静電荷相互作用を増強する)を組み込むように改変されうることも本明細書に記載される。
いずれかの改変型タンパク質分子が本明細書において使用可能であり、またそれは、例えば自然に折り畳まれた配置(例えば、in vivoで一般的に見出されるコンフォメーションを採る)、別様に折り畳まれた配置(例えば、in vivoで一般的に見出されないコンフォメーションを採る)、又は折り畳まれていない配置の状態にありうるものと理解される。異なるタンパク質及び折り畳み状態からなる様々な混合物を望み通りに併用して、本明細書に記載される望ましい特性を有するように膜を調節することが可能である。
改変型タンパク質分子は、内因性又は非内因性でありえ、すなわち合成により作製されうる。一般的に、得られた膜構造及び機能の生体適合性が改善するものと理解されるように、改変型タンパク質分子は内因性である。更に、タンパク質は、天然に存在するか(例えば、in vivoで見出されるように)、又は天然には存在しない(例えば、in vivoでは一般的に見出されない)場合がある。一般的な実施形態では、タンパク質は、合成により生成されるタンパク質か又は組換えタンパク質、天然に存在するタンパク質のいくつかのバージョンであるが、しかし所望の場合には、天然起源から抽出されうるものと理解される。
例えば、1つ又は複数の改変型タンパク質分子とは、内在性膜タンパク質、表在性膜タンパク質、構造タンパク質、酵素、抗体、抗原、ホルモン、輸送タンパク質、タンパク質受容体、外因性タンパク質、核内因子を含みうるが、但しこれらに限定されない。これらのバリアント及び誘導体(タンパク質複合体、切断型タンパク質、タンパク質断片、タンパク質サブドメイン、タグ化されたタンパク質、及び/又は融合タンパク質を含む)が、その組合せと共に明示的に検討される。
いくつかの実施形態では、改変型タンパク質分子は、細胞膜上又は細胞の表面上に見出されるタンパク質を含む。改変型タンパク質分子は、例えば、膜タンパク質、例えば内在性膜タンパク質又は膜貫通型タンパク質、表在性膜タンパク質、又は脂質係留型膜タンパク質等を含みうる。膜タンパク質は構造タンパク質又は受容体タンパク質でありうる。
いくつかの実施形態では、改変型タンパク質分子は、抗原性タンパク質、例えばウイルス膜タンパク質又はエンベロープタンパク質を含みうる。いくつかの実施形態では、改変型タンパク質分子は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその断片を含む。
いくつかの実施形態では、改変型タンパク質分子は、抗体又はその抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、抗体又はその断片は、膜が身体内の所望の場所を標的とするように使用される。
いくつかの実施形態では、改変型タンパク質分子は抗菌性抗体又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、抗菌性抗体又はその断片は、膜が特定の細菌種を標的とするように使用される。
基本的な抗体構造単位は、ポリペプチド鎖の2つの同一の対から構成される四量体を含み、各対は1本の軽鎖(「L」)(約25kDa)及び1本の重鎖(「H」)(約50～70kDa)を有することが当技術分野において公知である。軽鎖のアミノ末端部分は、軽鎖可変ドメイン(VL)を形成し、重鎖のアミノ末端部分は重鎖可変ドメイン(VH)を形成する。共に、VH及びVLドメインは、抗原認識/結合に主に関与する抗体可変領域(Fv)を形成する。VH及びVLドメインそれぞれの中には、3つの高度可変領域又は相補性決定領域(CDR、一般的にCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、及びCDR-L3と表される)が存在する。重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端部分は、共にエフェクター機能に主に関与する定常領域を形成する。
「相補性決定領域」又は「CDR」とは、本明細書で使用される場合、エピトープとの結合性に寄与するものと一般的に推定される抗体の特定の高度可変領域を指す。CDR配列を特定するためのコンピューターを使用した方法として、Kabat、Chothia、Martin、AHo、及びIMGTが挙げられる。本開示にリスト化されているCDRは、Kabatの定義を使用して特定される。本明細書に含まれる配列に関心を寄せる当業者は、CDR配列をIMGTやChothia等に基づいてもやはり特定することができる。そのような抗体も同様に包含される。
用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化(並びにイヌ化)及びその他のキメラ抗体、並びにその結合断片(例えば、単鎖Fab断片、Fab'2断片、又は単鎖Fv断片を含む)を包含するように意図されている。抗体は、組換え起源に由来する場合があり、及び/又は遺伝子導入動物において産生される場合もある。遺伝子導入動物において、若しくは生化学的技術を使用して産生可能であるか、又はライブラリー、例えばファージディスプレイライブラリー等から単離可能であるヒト抗体も含まれる。抗体骨格は、いずれかの適した可変重鎖又は可変軽鎖配列を含みうる。抗体は、ヒト化及び/又はその他のキメラ抗体を含め、1つ又2つ以上のアイソタイプ、クラス、又は種に由来する配列を含みうる。抗体は、免疫グロブリンのいずれかのクラス(IgG、IgM、IgD、IgA、又はIgEを含む)、及びそのいずれかのアイソタイプ(IgG1、IgG2(例えば、IgG2a、IgG2b)、IgG3、及びIgG4を含む)でありうる。更に、これらの抗体は、抗原結合断片、例えばFab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、及び単一ドメイン抗体断片等として、又は重鎖及び軽鎖がスペーサーにより接続された単鎖抗体として生成可能である。抗体は、ヒト及びイヌを含むいずれかの適した種に由来する配列を含みうる。抗体は、二重特異性又は多重特異性抗体でありうる。また、抗体は、単量体又は多量体の形態でも存在しうる。抗体及びそれをコードする核酸は、例えば、熱安定性エンテロトキシンII由来のシグナルペプチド、又はIL2由来のシグナルペプチドを含むシグナル配列部分も含みうる。その他のシグナルペプチド及びそれをコードする核酸は、当技術分野において公知である。
慣用句「単離された抗体」とは、in vivo又はin vitroで生成される抗体(抗体を生成した起源、例えば、動物、ハイブリドーマ、又はその他の細胞系(例えば、抗体を生成する組換え昆虫、酵母菌、又は細菌細胞等)から取り出された抗体)を指す。単離された抗体は、任意選択で「精製され」、それは少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、又は99%の純度を意味する。
用語「結合断片」とは、本明細書で使用される場合、天然若しくは完全な抗体又は抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基を含む抗体又は抗体鎖の一部又は部分を指し、抗原に結合するか又は天然の抗体と競合する。例示的結合断片には、非限定的にFab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv、ダイマー、ナノボディ、ミニボディ、ダイアボディ、及びその多量体が含まれる。断片は、天然又は完全な抗体又は抗体鎖の化学的又は酵素的処理を介して取得可能である。断片は組換え手段によっても取得可能である。例えば、F(ab')2断片は、ペプシンを用いて抗体を処理することにより生成可能である。得られたF(ab')2断片は、ジスルフィド架橋を還元してFab'断片が生成するように処理することが可能である。パパイン消化は、Fab断片の形成を引き起こしうる。Fab、Fab'、及びF(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv、ダイマー、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片、及びその他の断片は、組換え発現技術によっても構築可能である。
改変型タンパク質分子は膜二重層全体を通じて不均一な「島」内に分布しうるものの、一般的に改変型タンパク質分子は内因性二重層中に実質的に均一に分布している。
改変型タンパク質分子は、いずれかの量で膜中に存在しうる。いくつかの実施形態では、機能化された生体膜は、内因性二重層に対して約0.00001質量%～約80質量%の改変型タンパク質分子を含みうる。一実施形態では、機能化された膜は、該機能化された膜に対して約0.00001質量%～約50質量%の改変型タンパク質分子を含みうる。一実施形態では、改変型タンパク質分子は、内因性二重層に対して、少なくとも約0.00001%、少なくとも約0.0001%、少なくとも約0.001%、少なくとも約0.01%、少なくとも約0.1%、少なくとも約1%、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、又は少なくとも約75質量%を占める。一実施形態では、改変型タンパク質分子は、内因性二重層に対して、最大約0.0001%、最大約0.001%、最大約0.01%、最大約0.1%、最大約1%、最大約5%、最大約10%、最大約15%、最大約20%、最大約25%、最大約30%、最大約40%、最大約50%、最大約60%、最大約70%、又は最大約80%を占めうる。一実施形態では、機能化された膜は、いずれかの適した割合(%)又は割合(%)の範囲、例えば、約0.0001%～約70質量%、任意選択で約0.00001%、約0.0001%、約0.001%、約0.01%、約0.1%、約1%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、又は約75質量%の改変型タンパク質分子を含みうる。実現しうる改変型タンパク質分子の質量%は、改変型タンパク質分子の特定の特性に依存するものと理解される。
いくつかの実施形態では、機能化された生体膜は、約0.0001mol%～約25mol%、又はより多くの改変型タンパク質分子を含みうる。例えば、機能化された膜は、少なくとも約0.0001mol%、少なくとも約0.0001mol%、少なくとも約0.001mol%、少なくとも約0.01mol%、少なくとも約0.1mol%、少なくとも約1mol%、少なくとも約5mol%、少なくとも約10mol%、少なくとも約15mol%、少なくとも約20mol%、又は少なくとも約25mol%の改変型タンパク質分子を含みうる。一実施形態では、機能化された膜は、最大約0.001mol%、最大約0.01mol%、最大約0.1mol%、最大約1mol%、最大約5mol%、最大約10mol%、最大約15mol%、最大約20mol%、又は最大約25mol%の改変型タンパク質分子を含みうる。機能化された膜は、いずれかの適した割合(%)又は割合(%)の範囲、例えば約0.0001mol%～約25mol%、任意選択で約0.0001mol%、約0.001mol%、約0.01mol%、約0.1mol%、約1mol%、約5mol%、約10mol%、約15mol%、約20mol%、又は約25mol%の改変型タンパク質分子を含みうる。任意選択で、機能化された生体膜は約0.0008mol%の改変型タンパク質分子を含みうる。実現可能な改変型タンパク質分子のmol%は、改変型タンパク質分子の特定の特性に依存するものと理解される。
本明細書に記載される機能化された生体膜は、それが投与される対象の身体と適合性を有するという点において一般的に生体適合性である。これは、それがその後投与されうる種と同一の種に一般的に由来する内因性二重層の使用に一般的に起因する。所望の用途に応じて、内因性改変型タンパク質(対象内で有害な免疫反応を引き起こす可能性は低い)も使用可能である。
内因性二重層と、改変型タンパク質分子とを含む機能化された生体膜は、内因性二重層とは異なる特性を有しうる。例えば、一般的に、膜は、機械的ストレス及び/又は浸透圧ストレスに対して抵抗性である。
機能化された生体膜は、1つ又は複数の生体分子又は小分子を含むように更に改変されうる。例えば、機能化された膜は、1つ又は複数の核酸、糖、脂質、脂肪酸、小分子、又はその組合せを更に含みうる。本明細書に示す通り、内因性二重層は、特定の特性を有する1つ又は複数の脂質分子を組み込んで、例えば膜の表面電荷を改変し、これにより遊離可能なカーゴ、例えば所望の生体分子又は小分子等の保持を増強するように改変されうる。例えば、本明細書に示す通り、ポリミキシンB(PmB)の保持は、内因性二重層中に、負に荷電した脂質、例えば1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン(DMPS)等を組み込むことにより強化される。その他の脂質が、生体分子又は小分子の特性、及び所望の膜特性に応じて使用可能である。改変型脂質分子を組み込むための方法は、例えば[49]及び本明細書の実施例に記載されている。
付加的又は代替的実施形態では、機能化された生体膜は、遊離可能なカーゴを封入する。膜は、一般的に生体適合性であり、またコアを取り巻く膜構造を有するので、異なる多くの種類のカーゴにとって好適な送達媒体として機能する。例えば、複数の実施形態における遊離可能なカーゴは、生体分子又は小分子を含む。例として、治療剤、予防剤、診断用薬剤、マーカー剤、予後剤、又はその組合せが挙げられる。例えば、抗生物質、化学療法剤、抗体、蛍光性又はMRI画像形成性分子、又はこれらのいずれかの組合せが、本明細書に記載される膜により封入されうる。
本明細書で使用される場合、用語「遊離可能なカーゴ」とは、例えば、静電荷さもなければ引力を介して膜との緊密な会合を保持しつつ、又は膜のコア内に封入されることにより、本明細書に記載される機能化された膜と可逆的に(例えば、非共有結合的に)会合するコンポーネント(例えば、生体分子、例えばタンパク質又は小分子)を指す。
改変型タンパク質分子と遊離可能なカーゴとの様々な組合せについて、本明細書において特に検討される。例えば、改変型タンパク質分子は、標的エピトープに結合する抗体又はその他のタンパク質でありうるが、また遊離可能なカーゴは、例えば、抗生物質又はその他の治療剤でありうる。例えば、細菌性病原体、例えば大腸菌等に対する抗体は、例えば抗生物質、例えばポリミキシンB(PmB)等を含む遊離可能なカーゴと組み合わせることができる。従って、一実施形態では、抗体は、細菌特異的抗体、例えば大腸菌に対する抗体等であり、遊離可能なカーゴは、抗菌性抗生物質、例えばポリミキシンB(PmB)等を含む。別の事例として、OX-26抗体が、例えば血液脳関門において富化しているトランスフェリン受容体を標的とするのに使用可能であり、また遊離可能なカーゴは、治療剤、例えば増殖因子、例えば脳由来神経栄養因子(BDNF)等を含みうる。従って、一実施形態では、改変型タンパク質分子はOX-26抗体を含み、遊離可能なカーゴはBDNFを含む。改変型タンパク質分子と治療剤とのその他の組合せが、本明細書において特に検討される。例えば、改変型タンパク質分子は、がん関連エピトープに特異的又は選択的に結合することができ、また遊離可能なカーゴは化学療法剤でありうる。
一実施形態では、機能化された生体膜は小胞を形成する。膜が小胞として形成されるとき、改変型タンパク質は、周辺媒体(例えば、小胞外部の媒体)に曝露され、及び/又は小胞コア媒体(例えば、小胞内部の媒体)に曝露される。
本明細書に記載される機能化された生体膜は、例えば、組成物、例えば医薬組成物の調製において使用可能である。従って、本明細書に記載される機能化された生体膜を含む組成物についても本明細書に記載される。
一実施形態では、組成物は稀釈剤を含む。適した稀釈剤として、生理食塩溶液、pH緩衝化溶液、及びグリセロール溶液、或いはポリペプチド及び/又は細胞膜を凍結するのに適したその他の溶液が挙げられるが、但しこれらに限定されない。
一実施形態では、組成物は、本明細書で開示される機能化された生体膜のいずれかを含み、任意選択で薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。薬学的に許容される担体として、例えば、生理学的に適合するあらゆるすべての溶媒、分散媒、等張性吸収遅延剤等が挙げられる。薬学的に許容される担体は水又は緩衝生理食塩水でありえ、防腐剤の有無を問わない。
組成物は、当技術分野において公知の薬学的に許容される剤型を使用しながら、対象への投与を目的として使用又は調製するために製剤化されうる。適した製剤を選択及び調製するための従来手順及び成分は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences(2003-第20版)や、The United States Pharmacopeia:1999年に公表されたThe National Formulary(USP 24 NF19)に記載されている。用語「薬学的に許容される」とは、動物、特にヒトの処置と適合性があることを意味する。
本明細書に記載される組成物は、対象に投与可能である薬学的に許容される組成物を調製するためのそれ自体公知の方法によって、有効量の原薬が混合物内で薬学的に許容される媒体と共に組み合わされるように調製されうる。
医薬組成物として、非限定的に、真空凍結乾燥された粉末、又は水性若しくは非水性の滅菌注射液若しくは懸濁物が挙げられ、これらは、組成物を意図されたレシピエントの組織又は血液に実質的に適合するようにする酸化防止剤、バッファー、静菌薬、及び溶質を更に含有しうる。そのような組成物内に存在しうるその他のコンポーネントとして、例えば、水、表面活性物質(例えばツイーン(Tween)等)、アルコール、ポリオール、グリセリン、及び植物油が挙げられる。即時注射溶液及び懸濁物は、滅菌粉末、顆粒、錠剤、又は濃縮された溶液若しくは懸濁物から調製されうる。組成物は、例えば、患者への投与前に滅菌水又は生理食塩水を用いて再構成される真空凍結乾燥された粉末として供給されうるが、但しそれに限定するものではない。
一実施形態では、組成物は、本明細書に記載される膜を含み、改変型タンパク質分子が抗原である、免疫原性組成物である。一実施形態では、抗原はウイルス抗原である。一実施形態では、ウイルス抗原はSARS-CoV-2スパイクタンパク質である。
一実施形態では、機能化された生体膜又は組成物は、本明細書に記載される前記機能化された生体膜を含み、その場合、改変型タンパク質分子は抗体であり、機能化された膜は、遊離可能なカーゴ、例えば抗生物質又はその他の治療剤を封入する。一実施形態では、抗体は、細菌特異的抗体、例えば大腸菌に対する抗体等であり、また遊離可能なカーゴは、抗菌性の抗生物質、例えばポリミキシンB(PmB)等を含む。
一実施形態では、組成物は、本明細書に記載される機能化された生体膜を含み、その場合、改変型タンパク質分子は、標的細胞上の標的エピトープ又はタンパク質に結合し、また機能化された膜は遊離可能なカーゴ、例えば治療剤を封入する。例えば、OX-26抗体は、例えば、血液脳関門において富化しているトランスフェリン受容体を標的とするのに使用可能であるが、また遊離可能なカーゴは、治療剤、例えば増殖因子、例えば脳由来神経栄養因子(BDNF)等を含みうる。従って、一実施形態では、改変型タンパク質分子はOX-26を含み、そして遊離可能なカーゴはBDNFを含む。
本明細書に記載される機能化された生体膜、及び免疫応答を提供又は誘発することにおいて使用するための、並びに/或いはそれを必要としている対象における疾患、障害、又は状態を処置又は予防するための、前記機能化された生体膜を含む組成物、治療剤、予防剤、医薬組成物、医薬、免疫原性組成物、及びワクチンについても本明細書に提示される。免疫応答を提供又は誘発することにおいて使用するための、並びに/或いはそれを必要としている対象における疾患、障害、又は状態を処置又は予防するための医薬の製造における、本明細書に記載される機能化された生体膜の使用について更に提示される。免疫応答を提供するための、並びに/或いはそれを必要としている対象における疾患、障害、又は状態を処置又は予防するための、本明細書に記載される機能化された生体膜の使用についてなおも更に提示される。免疫応答を提供し、並びに/或いはそれを必要としている対象における疾患、障害、又は状態を処置又は予防する方法であって、本明細書に記載される機能化された生体膜を投与する工程を含む方法について更に提示される。一実施形態では、改変型タンパク質分子はSARS-CoV-2スパイクタンパク質を含み、機能化された生体膜は、SARS-CoV-2に対する免疫応答を提供し、及び/又はSARS-CoV-2感染症を処置若しくは予防することにおいて使用される。一実施形態では、改変型タンパク質分子は抗大腸菌抗体を含み、機能化された膜はPmBを更に含み、そして機能化された生体膜は大腸菌感染症を処置又は予防することにおいて使用される。一実施形態では、改変型タンパク質分子はOX-26抗体を含み、機能化された膜はBDNFを封入し、そして機能化された生体膜は、神経学的疾患又は状態を処置又は予防する、任意選択で認知症を処置又は予防することにおいて使用される。
III.方法
内因性二重層と、その中に埋め込まれた1つ又は複数の改変型タンパク質分子とを含む機能化された生体膜を調製する方法であって、a)内因性二重層を提供する工程と、b)1つ又は複数の改変型タンパク質分子の一部分が二重層中に埋め込まれて機能化された生体膜が生成されるような条件下で、表面活性物質の存在下において、内因性二重層を1つ又は複数の改変型タンパク質分子と接触させる工程と、c)表面活性物質を除去する工程とを含む方法についても本明細書において記載される。
内因性二重層及び/又は改変型タンパク質分子は、工程b)の前に精製されうる。内因性二重層が細胞源に由来するか又はそれから得られる場合、内因性二重層はその細胞内容物を除去するために最初に処理されうる。これは、本明細書の実施例に記載されるような及び/又は当技術分野において公知のような、洗浄及び/又は超音波処理により実現可能である。例えば、内因性二重層が赤血球二重層である(すなわち、赤血球から得られる)場合、赤血球ゴーストが得られるように細胞内容物を除去することができる。赤血球ゴーストを取得する例示的方法は本明細書の実施例に記載されており、またその他の方法は当業者にとって公知である。
上記したように、改変型タンパク質分子は、構造タンパク質、酵素、抗体、抗原、ホルモン、輸送タンパク質、タンパク質受容体、外因性タンパク質、核内因子、又はその組合せを含みうるが、但しこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、改変型タンパク質分子は、膜タンパク質、例えばウイルスの膜タンパク質等、任意選択でSARS-CoV-2スパイクタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、改変型タンパク質分子は、溶解状態又は真空凍結乾燥状態にある。
用語「表面活性物質(surfactant)」は、例えば、疎水性相と親水性相又は水性相との間の表面張力を低下させる表面活性化剤を記載するために本明細書において使用される。ある特定の文脈では、表面活性物質は界面活性剤(detergent)と呼ばれる場合もある。表面活性物質の例として、トリトンX-100、ベータオクチルグルコシド、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸カリウム、ラウリル硫酸アンモニウム、ラウレス硫酸マグネシウム、ラウレス硫酸ナトリウム、ドデシルホスホコリン、ドデシルマルトシド、アルキル-PEGaポリソルベート表面活性物質、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート(CHAPS)、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホネート(CHAPSO)、n-ドデシルβ-D-マルトシド、及びコール酸表面活性物質が挙げられるが、但しこれらに限定されない。表面活性物質の組合せも使用されうる。いずれかの適した濃度の表面活性物質が本明細書に記載される方法で使用されうるが、また当業者により容易に決定可能である。一般的に、表面活性物質は、タンパク質の膜中への組込みをなおも実現しつつ、ミセルを形成するのに十分な濃度で存在する。従って、一実施形態では、表面活性物質は、界面活性剤の臨界ミセル濃度を上回る濃度で、工程b)において存在する。
表面活性物質は、例えば、ポリスチレンビーズ、任意選択でアンバーライトXAD-2を添加することによる、透析による、及び/又は濾過を含み、任意選択で粒径排除クロマトグラフィー若しくはメンブレン濾過を介した濾過による等のいずれかの適した方法を使用しながら、工程c)において除去されうる。一実施形態では、表面活性物質はポリスチレンビーズを使用して除去される。ポリスチレンビーズが表面活性物質を除去するために使用される場合、機能化された生体膜は、任意選択でゲル濾過によって更に精製されうる。
内因性二重層と、それに連結した1つ又は複数の改変型タンパク質分子とを含む機能化された生体膜を調製する方法であって、a)内因性二重層を提供する工程と、b)合成脂質分子の一部分が内因性二重層に組み込まれて、ハイブリッド二重層が生成されるような条件下で、内因性二重層を、改変型タンパク質分子の共有結合にとって好適なリンカー及び官能基を含む1つ又は複数の合成脂質分子と接触させる工程と、c)ハイブリッド二重層を乾燥させる工程と、d)水溶液内ハイブリッド二重層を再懸濁する工程と、e)1つ又は複数の改変型タンパク質分子の一部分が、ハイブリッド二重層内の合成脂質分子と共有結合して機能化された生体膜が生成されるような条件下で、ハイブリッド二重層を1つ又は複数の改変型タンパク質分子と接触させる工程と、を含む方についても本明細書において記載される。
本明細書に示す通り、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[マレイミド(ポリエチレングリコール)-2000](PEG-MAL(2000)が、内因性二重層に組み込まれ、1つ又は複数の改変型タンパク質分子を、マレイミド官能基を介して内因性二重層に連結するのに使用されうる。適したリンカー及び適した官能基を含むいずれかの適した合成脂質分子が、本明細書に記載される方法において使用されうるものと理解される。例えば、適したリンカーとして、非限定的に、ポリエチレングリコール(PEG)、PEG(350)、PEG(550)、PEG(750)、PEG(1000)、PEG(2000)、PEG(3000)、PEG(5000)、ペプチド、ヒドラゾン、ジスルフィドリンカー、及びβ-グルクロニド、アミノ-PEG4-アルキン、及び12-アミノ-4,7,10-トリオキサドデカノエート、及び2-(2-(オクタ-7-イン-1-イルオキシ)エトキシ)酢酸が挙げられる。その他の適した官能基として、非限定的に、NHS-エステル、イソチオシアネート、SNAP-タグ、ビオチン、ストレプトアビジン、アミン、カルボン酸、葉酸、スクシニル、cyanur、PDP、四角形の、ベンジルグアニン、カルボキシNHS、DBCO、アジド、及びHalo-tagが挙げられる。
ハイブリッド二重層は、適した条件下で、例えば脂質二重層適合表面、例えば親水性表面等を有する固体基材を使用するいずれかの適した方法を使用して乾燥されうる。例えば、適した条件は、約0℃～約100℃、例えば約0℃、約10℃、約20℃、約30℃、約40℃、約50℃、約60℃、約70℃、約80℃、又は約90℃から約10℃、約20℃、約30℃、約40℃、約50℃、約60℃、約70℃、約80℃、約90℃、又は約100℃等までの温度を含みうる。付加的又は代替的に、適した条件は、約0%～約100%、例えば約0%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、又は約90%から約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、又は約100%等までの相対湿度を含みうる。
本明細書に記載される方法は、生体膜中に埋め込まれたタンパク質分子に実質的均質性をもたらす。一実施形態では、方法は、小胞の形態の機能化された生体膜を引き起こす。
上記したように、その他の生体分子(例えば、核酸、糖、脂質、及び/又は脂肪酸等)又は小分子は、機能化された生体膜に組み込まれうる。これは、当技術分野において公知のいずれかの適した方法を使用して機能化された生体膜を調製する前、期間中、及び/又は後に実現可能である。
いくつかの実施形態では、方法は、例えば脂質二重層適合表面を有する固体基材上で、内因性二重層又は機能化された生体膜を乾燥させる工程を更に含む。例えば、膜は、適した条件下で、脂質二重層適合表面、例えば親水性表面等を有する固体基材上で、任意選択で乾燥されうる。例えば、適した条件は、約0℃～約100℃、例えば約0℃、約10℃、約20℃、約30℃、約40℃、約50℃、約60℃、約70℃、約80℃、又は約90℃から約10℃、約20℃、約30℃、約40℃、約50℃、約60℃、約70℃、約80℃、約90℃、又は約100℃まで等の温度を含みうる。付加的又は代替的に、適した条件は、約0%～約100%、例えば約0%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、又は約90%から約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、又は約100%まで等の相対湿度を含みうる。複数の実施形態では、方法はハイブリッド生体膜を再水和する工程を更に含みうる。
複数の実施形態では、固体基材上で内因性二重層又は機能化された生体膜を乾燥させる工程は、1つ若しくは複数の改変型脂質分子を内因性二重層若しくは機能化された生体膜中に組み込み、及び/又は膜構造のコア内に遊離可能なカーゴ(例えば、1つ又は複数の生体分子又は小分子等)を封入するのに使用されうる。例えば、本明細書に示す通り、内因性二重層は、負に荷電した脂質、例えば1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン(DMPS)等を組み込み、これにより機能化された生体膜上での抗生物質PmBの保持量が増加するように改変されうる。本明細書で明らかにされるように、機能化された生体膜は乾燥され、そして所望の生体分子又は小分子、例えばBDNFを含む水溶液中で再水和され、これにより所望の生体分子又は小分子を封入しうる。
本明細書に記載される方法により製造される膜についても検討されるものと理解される。
治療剤若しくは予防剤としての、又は医薬組成物としての、医薬としての、本明細書に記載される膜(本明細書に記載される方法により製造された膜を含む)の使用も提示される。複数の実施形態では、治療剤、予防剤、医薬組成物、及び/又は医薬は、免疫原性組成物であり、その場合、改変型タンパク質分子が抗原である。複数の実施形態では、治療剤、予防剤、医薬組成物、医薬、及び/又は免疫原性組成物は、ワクチン又は免疫原性組成物である。複数の実施形態では、改変型タンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質である場合、ワクチン又は免疫原性組成物はCOVID-19である。複数の実施形態では、改変型タンパク質が細菌抗体であり、抗菌剤を担持する場合、治療剤は抗生物質である。複数の実施形態では、改変型タンパク質が血液脳関内の受容体又はトランスポーターを標的とし、そして神経変性疾患を処置するための薬剤を担持する場合、治療剤は抗神経変性薬である。
本開示の別の態様では、対象における免疫応答を提供するための方法であって、本明細書に記載される機能化された生体膜の免疫原性組成物を取得する工程と、有効量の組成物を、それを必要としている対象に投与する工程とを含む方法が本明細書に記載される。複数の実施形態では、疾患、障害、又は状態は、内因性免疫細胞の活性化により影響を受けるか又は処置可能なものである。複数の実施形態では、方法は、抗原を対象の肝臓及び/又は脾臓に対して提示する工程を含む。複数の実施形態では、抗原を対象の肝臓及び/又は脾臓に対して提示する工程は、ファゴサイトーシス並びに肝臓及び/又は脾臓内のクッパー細胞及び/又は抗原提示細胞に対する免疫原性組成物の提示を含む。
障害又は状態は、脾臓内の抗原提示細胞を通じて免疫応答を刺激することにより影響を受けるか又は処置可能なものでありうる。いくつかの実施形態では、対象の脾臓に対して抗原を提示する工程は、ファゴサイトーシス及び脾臓内の抗原提示細胞に対する免疫原性組成物の提示を含む。複数の実施形態では、抗原提示細胞は樹状細胞及び/又はマクロファージである。
別の態様では、対象におけるウイルス感染症を処置するための方法であって、改変型タンパク質がウイルスの膜タンパク質である、本明細書に記載される膜の医薬組成物を取得する工程と、有効量の組成物を、それを必要としている対象に投与する工程とを含む方法が本明細書に提示される。
更なる態様では、対象におけるCOVID-19を処置するための方法であって、改変型タンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質である、本明細書に記載される膜を含む医薬組成物を取得する工程と、有効量の組成物を、それを必要としている対象に投与する工程とを含む方法が本明細書に提示される。いくつかの実施形態では、COVID-19を処置するための本明細書に記載される膜の医薬組成物は、静脈内注射又は輸液を非限定的に含む、いずれかの適した方法により投与される。
免疫応答を提供若しくは誘発するための、及び/又はそれを必要としている対象おける疾患、障害、若しくは状態を処置若しくは予防するための機能化された生体膜、並びに前記機能化された生体膜を含む組成物、治療剤、予防剤、医薬組成物、医薬、免疫原性組成物、及びワクチンの使用についても本明細書に提示される。一実施形態では、改変型タンパク質分子はSARS-CoV-2スパイクタンパク質を含み、使用は、SARS-CoV-2に対する免疫応答を提供又は誘発すること、及び/又はSARS-CoV-2感染症を処置若しくは予防することを含む。一実施形態では、改変型タンパク質分子は抗大腸菌抗体を含み、機能化された膜はPmBを更に含み、使用は大腸菌感染症を処置又は予防することを含む。一実施形態では、改変型タンパク質分子はOX-26抗体を含み、機能化された膜はBDNFを封入し、使用は、神経学的又は神経変性的な疾患又は状態を処置又は予防すること、任意選択で認知症を処置又は予防することを含む。
下記の非限定的な実施例は本開示の例証である。
(実施例1)
Erythro-VLPの調製、特徴付け、及びテスト
SARS-CoV-2は包膜型の一本鎖のプラス鎖RNAウイルスである[4、7]。ウイルスエンベロープ上の3つのタンパク質コンポーネントのうち、スパイク(S-)タンパク質は、ヒトACE-2受容体と高い親和性を有して結合し[7、10]、そしてウイルスと宿主との膜融合を触媒して感染を開始する[10、11]。該タンパク質は、コロナウイルスの特徴的な表面スパイクを形成する高密度にグリコシル化された膜貫通タンパク質である[10]。該タンパク質は、中和抗体及びT細胞応答も誘発し、従ってワクチン開発にとって重要な標的である[12]。SARS-CoV-2 Sタンパク質の基本的構造及びコンフォメーションが明らかにされたが、しかしながら、これはなおもきわめて活発な研究分野である[7、9、11]。SARS-CoV-2に対する診断薬、治療薬、及びワクチンを開発することが、本発明者らの現在のナノメディカル製造能力にとっての課題である。いくつかのSARS-CoV-2ワクチン候補が開発され[13]、それらは、現在、臨床開発段階又は承認段階にある。タンパク質に基づくワクチンは、全不活性化ウイルス、個々のウイルスタンパク質若しくはサブドメイン、又は粒子として集合したウイルスタンパク質[14]を含む。遺伝子に基づくワクチンは、宿主細胞により産生されるタンパク質抗原をコードする遺伝子配列を送達する。mRNAワクチンは高い能力示したが[15]、しかしながら、mRNAは通常の細胞プロセスによって急速に分解されるので、担体、例えばナノ粒子等を必要とする。例えば、候補ワクチンmRNA-1273は、安定化した融合前SARS-CoV-2スパイクタンパク質をコードする[16]。
結果及び考察
Erythro-VLPを、材料及び方法セクションに記載されるように調製した。SARS-CoV-2に対するErythro-VLPを調製するためのプロトコールを図1Aの概略図に示す。要するに、赤血球リポソームをこれまでに公表されたプロトコールに従って調製し[21]、次に3μMのSタンパク質溶液と共にインキュベートした。Sタンパク質の挿入を円滑化するために、トリトン-X100を表面活性物質として使用した(25mMの濃度で)。次に、表面活性物質を、アンバーライトXAD-2ビーズ及び粒径排除クロマトグラフィー(SEC)により除去した。
タンパク質挿入プロセスを図1Bに示し、同図はRBC膜模倣物を使用する分子動力学(MD)シミュレーションのスナップショット(100ps、1μs、2μs、及び3μs後)を表す。タンパク質を膜外部に最初に配置した。MDシミュレーション軌跡の長さ全体にわたり、タンパク質は膜パッチの上部リーフレットに選好的に入没し、そしてそれ自体をその中に挿入する。表面活性物質分子は、このプロセスにおいて重要な役割を演ずる。図1Cは、上部リーフレットについて、二重層パッチ内の横方向の脂質密度及び表面活性物質密度を示す。接触すると、タンパク質は、入口のポイントにおいて、上部リーフレット内脂質分子の局所的な枯渇を誘発する。同時に、表面活性物質密度は、タンパク質周辺で有意に(最大60%)増加する。
Erythro-VLPの粒径排除クロマトグラフィー(SEC)を図2Aに示す。Erythro-VLP及びトリトン-X100に起因する2つのシグナルを認めることができる。合成されたErythro-VLPは溶出ボリューム7ml～12mlの間で検出され、そして更に使用するために分離した。トリトン-X100ミセルは、溶出体積15ml～30mlの間で検出された。これは、アンバーライトXAD-2ビーズはトリトン-X100を完全に取り除くことができず、SECを用いた後続する分離がErythro-VLPの精製に必要とされることを示唆する。
スパイクタンパク質を含む/含まない赤血球リポソームの粒径分布を、動的光散乱法(DLS)により決定し、そして図2Bに示す。赤血球リポソームは、これまでの結果と良く整合して102±1nm(多分散性:0.19±0.02)と測定された[22]一方、Erythro-VLPについて平均直径222±6nm(多分散性:0.320.01)が決定された。粒径の増加は、タンパク質がRBC膜内に埋め込まれた結果(膜の面積増加を引き起こす)であると思われる。
RBC膜の質量の70%が脂質であることが公知であり[21]、700g/molの平均分子質量を有するという仮説を使用して、リポソーム上のタンパク質の濃度を推定することが可能である。リポソームは直径100nmを有し、1脂質当たりの面積0.6nm2と仮定すれば、各小胞は脂質分子約42,000個を含有する。赤血球リポソームの初期濃度14mg/mlは、小胞30nMの濃度に対応する。負荷効率を70～100%と仮定すれば、タンパク質のモル濃度(3μM)を小胞濃度で割り算することにより、小胞1個当たりのタンパク質の数として、タンパク質62～88個/Erythro-VLPと推定することができる。これは、タンパク質495～700個/m2のタンパク質密度に対応する。
ACE-2タンパク質に対する結合性を、バイオレイヤー干渉法(BLI)を通じてモニタリングした[23](図2E)。二重層中に不適正に埋め込まれたとき、スパイクタンパク質はACE-2受容体と相互作用しないと予想される。従って、このアッセイは、膜に埋め込まれた状態のスパイクタンパク質の機能的コンフォメーションが適正であるか評価するのに重要である。ACE-2固定バイオセンサーを、濃度を漸増させたErythro-VLPに曝露したとき、BLIシグナルにおいて用量依存性の低下が観察され、大型粒子が光学バイオセンサーに結合した場合と整合する(図2C)。興味深いことに、より高濃度のErythro-VLP(>4×)を添加すると、早期の時点でより顕著な結合(より小さい負のλ値において飽和する)を引き起した。この観察は、Erythro-VLPの濃度依存性のクラスタリング(センサーチップに結合したとき、更なるErythro-VLPの結合を立体的に妨げる[24])と整合する。特に、バイオセンサーに対するACE-2コンジュゲーションが存在しない場合、結合に起因する波長変化は有意に減少し、Sタンパク質-ACE-2相互作用は、BLIを通じてプローブされる結合の主要源であることが示唆される(図2D)。全体として、これらの知見は、ヒトACE-2を認識するSタンパク質結合エピトープは、RBC膜中に埋め込まれた後でも、溶媒に露出したまま存続することを示唆する(図2E)。
RBC膜内に存在するタンパク質の区分化を視覚化するために、巨大ユニラメラ小胞(GUV)を調製した。エレクトロフォーメーション法がGUVを製作するのに一般的に使用されるが、塩が存在すると電気分解及びガス形成を引き起こすので、この方法は生理学的バッファー内では困難である[25、26]。従って、Erythro-VLPがアガロースゲル上で最初に乾燥されるゲル支援式の膨潤化法を使用して、巨大Erythro-VLPを調製した。次にゲル-リポソームフィルムが水和されるとき、巨大Erythro-VLPが自発的に形成される。リポソーム間で均質なタンパク質分布をもたらし、そして生理学的バッファー内での迅速な調製を可能にする手順は公知である[25]。
RBC膜を、テキサスレッド1,2-ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンでドープした(TR-DHPE、図3C～図3Eの左側パネルに示す)。Sタンパク質をAlexa Fluor 488マレイミド(システインのチオール基と結合する)を使用して染色した(図3C～図3Eの中間パネルに示す)[27]。SARS-CoV-2 Sタンパク質(PDB ID:6VXX [7])を、図3A内に、システイン基をグレーの球として強調しながら、リボンダイアグラムとして表す。システイン残基のそれぞれに対する溶媒接触可能表面積(SASA)を図3Bにグラフ化する。この分析によれば、鎖1つ当たり2つのシステイン残基(136及び166)のみが、Alexa Fluor 488マレイミドを用いた染色に対して直接接触可能である(図3B内でライトグレーのバーにより示す)。従って、各タンパク質は、図3Aにおいて緑色の球としてマークされるように、最大で6個のFluor 488マレイミド分子を担持するものと予想される。
巨大Erythro-VLPを、エピ蛍光剤及び共焦点レーザー走査顕微鏡法(CLSM)を併用して画像化した。得られたエピ蛍光画像を図3Cに示す。画像は、小胞を採取する前にアガロースゲル上で取得した。リポソームは約50μmの粒径を有する球形のオレンジ色の物体のように見える;しかしながら、そのような大型のリポソームは、採取後はもはや観測されなかった。リポソームはピペッティングを通じて収集されたことから、その構造は剪断応力に曝露された。より大型のリポソームは脆弱であり、この手順期間中に破壊すると思われる。図3Dに示すように、採取されたリポソームは約5～10μmの代表的な粒径を示し、それをCLSMを使用して調査した。図3Eは、1つの代表的なリポソームを拡大して示す。緑色(励起:488nm)及び赤色(励起:561nm)チャネルの分離式の画像化により、Sタンパク質はRBC膜内又はその上に位置することが明らかである(顕微鏡の分解能の範囲内)。図3C～図3E内の右側パネルの画像は、赤色色素及び緑色色素の重ね合わせの結果である。画像は、リポソーム内でのSタンパク質の一様分布を示唆する。半径10μmの小胞は1,257μm2の推定表面積を有する。タンパク質495～700個/μm2としてタンパク質密度が計算されることを踏まえれば、各小胞は、およそ622,000～880,000個のタンパク質、及び5.2×106～3.7×106個のAlexa Fluor488マレイミド分子を含有する。
マウス試験を、3月齢のメスマウス3匹について33日間にわたり実施した。すべての注射及び血液収集を含む試験のタイムラインを図4Aに示す。マウスを2群に分けた:2匹のマウスは、試験の0、5、及び10日目に、50Lの滅菌緩衝生理食塩水に懸濁した3用量のErythro-VLPの投与を受けた。各用量内のリポソーム濃度は、およそ30nMであり、8gのSタンパク質を含有した。第3のマウスは、等しい小胞濃度で、スパイクタンパク質を含まない赤血球リポソームの投与を受けた。静脈血を0、7、14、及び28日目に収集し、そして抗体レベルをELISAにより定量化した(図4B)。総スパイクタンパク質に対してマウスを免疫化した;但し、受容体結合ドメイン(RBD)に対する抗体がウイルスの進入及び感染症を防止するのに必要とされることが十分に立証されている。従って、抗RBD IgG抗体をELISAにより測定した。血清を稀釈し(1/20、1/50/、1/00)、そして吸収値を、血清中のワクチン接種後のレベル/ワクチン接種前のレベルの比として図4C及び図4Dに示す。新規の抗体応答が発現するのに一般的に10日を要し、またブースター投与が実施されない場合、その応答は低くまた一過性でありうるので、0及び7日目にはシグナルは観測されなかった。ワクチン接種を受けたマウス(マウス1及び2)は、試験の14日目及び28日目においてこれらの比の増加(それぞれ、最大83及び112倍)を示した。対照(マウス3)は、収集されたサンプル全体を通じて光学濃度の変化を示さなかった。
ナノ担体による薬物送達は、肝臓での取込み及び標的臓器での蓄積制限により、多くの場合限定される。RBC上に吸着されたナノ担体は、広範囲の担体及びウイルスベクターについて送達を改善することが明らかにされている[28、29]。しかしながら、療法への応用、例えば薬物送達[30、31]や免疫学的機能[32、35]等を目的とするその潜在力の開発は、近年開始したばかりである。RBCの生体適合性[36]及びそのバイオアベイラビリティー[37]は、脾臓内でのRBCの食細胞能力と相まって、RBCは、ウイルス性免疫病原体、例えばSARS-CoV-2 Sタンパク質等を、APC及び免疫系に対して提示するための有効な媒体でありうることを示唆する。本明細書では、Sタンパク質を埋め込むために赤血球膜のプロテオミクスを分子レベルで調節するためのプロトコールが開発される。表面活性物質(例えば、トリトン-X100)を、タンパク質の埋め込みを円滑化するのに使用した。MDシミュレーションより明らかなように、表面活性物質は2つの重要な機能を有する:挿入前の疎水性膜貫通ドメインを安定化させて、正しいタンパク質構造を確実にし、そしてRBC膜を可溶化させる(挿入を円滑化する)。膜と接触すると、表面活性分子は進入ポイントに蓄積し、脂質分子がタンパク質に対して自由容積を創出するのを可能にする。
抗体に基づく免疫応答を生成する際のErythro-VLPの有効性において、スパイクタンパク質は、膜に埋め込まれた状態でその機能的コンフォメーションを保持すべきである[14]。従って、ACE-2と結合する証拠が必要とされる。BLIアッセイは、Erythro-VLPとACE-2との濃度依存的相互作用について直接的なエビデンスを提供する。このプロトコールを使用した場合でも一部の分子が不適正に挿入されることを排除することはできないが、結合アッセイから、埋め込まれたSタンパク質の大部分は完全に機能的なまま存続することが示唆される。BLIアッセイで認められた用量依存性の結合は、Erythro-VLPのウイルス様の相互作用も示唆する。細胞がその自然寿命を終える時に脾臓内でファゴサイト化されると、RBCは免疫系に対して免疫病原体を提示することができる[17～19]。これは、ナノ粒子を赤血球[19]及びハイブリッドRBCに基づくナノ媒体[38]と連結することにより、脾臓内のAPCに対して抗原を提示するのに利用されてきた。この機構は、Erythro-VLPを静脈内投与するのが好ましいことを示唆する。注射後14日目にELISAアッセイにおいて光学濃度が増加したが、それは、セロコンバージョンが奏功したことに対する明白なエビデンスである。重要なこととして、完全長スパイクタンパク質を用いてマウスを免疫化したが、RBDサブドメイン(ウイルス進入に必要とされる)に対する抗体を測定した[39、40]。これは、RBDドメインが「隠蔽」又は「改変」されるように、Erythro-VLP内のSタンパク質のコンフォメーションが変化するものではないことを示唆するが、それはしばしば可溶性タンパク質を注射するときに難問となる。更に、タンパク質に基づくワクチンは、アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム等)を通常必要とするが[41]、Erythro-VLPはアジュバントがなくても免疫化することが判明し、忍容性又は安全性、及び公的認知に関して有益でありうる[42]。これらの結果は、COVID-19に対するワクチンとしてのRBCプラットフォームの可能性を実証するが、Erythro-VLPの保持時間、及び脾臓内のその正確な濃度、並びに感染症アッセイにおける有効性の確認について、更なる実験が対処することとなる。
結論
結論として、SARS-CoV-2スパイク(S-)タンパク質は、赤血球に基づくリポソームの膜内に成功裏に埋め込まれ、Erythro-VLPを創出した。この大きさ約200nmのリポソームは、最大88個のSタンパク質をその細胞膜内に担持する(タンパク質約700個/μm2のタンパク質密度に対応する)。Sタンパク質の適正な挿入及び機能性を、ACE-2結合アッセイを通じて明らかにした。顕著な免疫応答を、2回注射した後、14日後にマウスに認めたが、また抗体生成はELISAで確認した。
結果より、Erythro-VLPは、Sタンパク質を免疫系に対して提示し及び抗体産生を誘発するための有効な方法であることが明らかである。多数の類似したウイルスがコウモリ及びラクダの体内に循環していることから[43]、更なる大流行の可能性があり、国際的な公衆の健康に対する重大な脅威を惹起する。本明細書に提示のRBCプラットフォームは、対応する抗原性タンパク質を埋め込むことによって、異なるウイルスに対して容易且つ迅速に適用可能である。
材料及び方法
倫理承認
この研究は、Hamilton Integrated Research Ethics Board(HIREB)より、承認番号1354-Tとして承認された。インフォームドコンセントを、すべての血液ドナーから得た。すべての方法を関連するガイドライン及び規則に基づき実施した。カナダ動物愛護評議会(Canadian Council of Animal Care)のガイドラインに基づき、この試験に関するすべての動物手順が、McMaster University Animal Research Ethics Board(Animal Utilization Protocol 17-05-19及びAmendment #20-111～AUP #17-05-19)によって承認された。
免疫化実験
3匹のメスC57BL/6JマウスをJackson Laboratory(Bar Harbor, ME, Strain 000664)から取得し、同一室内の一つの標準的なマウスケージにおいて、25℃の一定温度、及び明光12時間-暗光12時間のサイクルで維持し、対照標準ダイエット(17%kcal脂肪、29%kcalタンパク質、54%kcal CHO、3kcal/g; Harlan 8640 Teklad 22/5 Rodent Diet)を給餌し、そして適宜水を与えた。免疫化前の血液(200μl)を眼窩後よりヘパリン処理されたチューブ内に収集した。次に遠心分離を通じてRBCを単離し、そして滅菌生理食塩溶液を使用して2回洗浄した。Erythro-VLPを以下に記載するように調製した。承認済みの動物利用プロトコールを順守しながら、赤血球ゴースト調製後に溶解バッファーを滅菌バッファー生理食塩水に置換した。マウスを安静に保ち、そして免疫化の前5日間順応させた。尾静脈内に50μlのErythro-VLPを注射することによりマウスを免疫化し、そして有害反応又は注射部位における炎症反応について毎日モニタリングした。0、7、14、及び28日目に、静脈血(70 l)を尾静脈からヘパリン処理されたチューブ内に収集した。有害反応は認められなかった。
小型赤血球リポソームの調製
詳細なプロトコールが別途記載されている[21]。要するに、ヘパリン処理された血液サンプルを収集した。血液を2回洗浄し、連続した遠心分離によりRBCを単離し、そして上清をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に置換した。ヘマトクリットを5vol%の濃度で溶解バッファー(3%PBSバッファー、pH8)と混合することにより、細胞を浸透圧ストレスに曝露した。溶解バッファーを約4℃に事前冷却し、そして破裂細胞が急速に再閉鎖するのを阻止するために、反応チューブを氷上で速やかに保管した。ヘモグロビン及びその他の細胞コンパートメントは、[21]に示すように、複数の洗浄工程を通じて除去可能である。プロトコールは空の赤血球リポソームを含有する白色ペレットをもたらす。得られた溶液を、各回100Wの電力で、5秒間、20回、チップ超音波処理した。超音波処理期間中、サンプルが過熱するのを防止するために反応チューブを氷上に配置した。その後、チューブを20,000gで15分間遠心分離した。小さなナノメータサイズのリポソームの溶液からなる上清は、以後「血液溶液」と呼ぶこととする。プロトコールは、約14mg/mlの膜濃度を実現する[21]。
Erythro-VLPの調整
Sタンパク質をAcrobiosystems社(SPN-C52H4)から購入した。Superdex200 increase 10/300分析用ゲル濾過カラム(GE Healthcare社)を使用する分析用サイズ排除クロマトグラフィーにより、凍結保護物質、グリセロール、及びトレハロースを、ACE-2及びSタンパク質からそれぞれ除去した。Sタンパク質を、ddH2Oを用いて溶出させ、真空凍結乾燥し、そして50μlの血液溶液を添加することにより再懸濁した。トリトン-X100(9002-93-1、Sigma-Aldrich社)を、表面活性物質の臨界ミセル濃度(CMC)を上回る25mMの濃度を実現するように添加した。サンプルを3時間インキュベートした後、過剰のアンバーライトXAD-2(9003-70-7、Sigma-Aldrich社)を添加した。この非極性ポリスチレンビーズは、表面活性物質、例えばトリトン-X100等を取り除くのに一般的に使用される。サンプルを室温で12時間インキュベートした。過剰に存在する可能性がある(ビーズにより抽出されなかった)トリトン-X100を取り除くために、スパイクタンパク質が埋め込まれたRBC膜(Erythro-VLP)を含有する上清を分析用ゲル濾過カラム内に注入し、そして8倍稀釈したPBSを用いて溶出させた(図2A)。次に、後続するBLI(Octet Red 96、ForteBio社)分析用として、Eppendorf社製Vacufuge plusを使用しながら、精製された分画を500μLのワーキングボリュームまで8倍濃縮した(80μg/mLの総スパイクタンパク質)。得られた溶液を、以後「Erythro-VLP溶液」と呼ぶ。
Erythro-VLPの染色
テキサスレッド1,2-ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(TR-DHPE)(Thermo Fisher社、カタログ番号:T1395MP)を用いて二重層をドープすることによって、RBC膜を蛍光標識した。この膜は、液体無秩序化ld脂質パッチと相互作用することが公知であり、また膜内のドメイン形成を調査するのにこれまでに使用されてきた[44、45]。クロロホルムに溶解した10mg/mlの1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)を、1mol%のTR-DHPEを含めながら調製した。POPCはRBC膜と均質に融合することがこれまでに明らかにされており[22]、また染色された脂質の膜中への組込みを円滑化する。乾燥窒素定常流の下、50μlのこの溶液をガラスバイアル内で乾燥した後、250μl(約3.5mg)の血液溶液を添加した。この溶液は、TR-DHPEの濃度として0.001質量%を有し、これを「蛍光溶液」と呼ぶこととする。SARS-Cov-2 Sタンパク質をACROBiosystems社から購入し(SPN-C52H4)、そしてそれを、トリスバッファー(10%トレハロースを含む50mMトリス(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)、150mM NaCl、pH7.5)中に0.2/mlの濃度で送達した。タンパク質を20μgの一定分量に分離した。解凍後、タンパク質を、100×過剰のTCEP(トリス-(2-カルボキシエチル)-ホスフィン)と共に20分間インキュベートした。これは、ジスルフィド結合を還元し、Alexa Fluor 488マレイミド(SCJ4600016、Sigma-Aldrich社)による染色を目的としてタンパク質を調製する。0.1mlのDMSOに溶解した1molのAlexa Fluor 488マレイミドのストック溶液を調製した。次に1μlをタンパク質溶液に添加し、そして4℃、一晩インキュベートした。遠心分離を20,000gで6時間行うことにより、タンパク質を過剰の色素から分離した。ブラウンパレットが観察され、そして上清を、新鮮なHEPESバッファー(20mM Hepes、150mM NaCl)により置換した。Eppendorf社製Vacufuge plusを使用して蛍光溶液を30mg/mlまで濃縮した。タンパク質溶液を総容積70μlとした。次に、5μlの濃縮蛍光溶液を添加した。トリトン-X100(9002-93-1、Sigma-Aldrich社)を添加して25mMの濃度を実現した。サンプルを3時間インキュベートした後、過剰のアンバーライトXAD-2(9003-70-7、Sigma-Aldrich社)を添加し、そして更に12時間室温でインキュベートした。
巨大Erythro-VLPの調製
巨大Erythro-VLPを、ゲル支援式膨潤法を使用して調製した[25]。要するに、顕微鏡カバースリップを、アガロースゲルの薄層でコーティングした。次に、Erythro-VLP溶液のドロップレット12x1μlをゲル上に適用し、そして窒素雰囲気下、約10分間放置して完全に乾燥させた。ガラススライドを次にペトリ皿内に配置し、1mlの増殖バッファー(20mM Hepes、150mM NaCl、200mMスクロース)で覆い、そして室温で30分間インキュベートした。これは、リポソームがアガロースゲルの表面上で成長できるようにする。一般的に知られているGUVのエレクトロフォーメーション法と比較して、本方法はそれより不均質な小胞を生成するが、しかしながら、成長期間中に生理食塩水に基づくバッファーを使用するという利点を有する。しかしながら、無欠陥のGUVを単離するという点で、同方法はより低い収率を有することが報告された[25]。アガロースの表面近傍から20Lを静かにピペッティングし、そしてそれを1:1の比でイメージングバッファー(20mM Hepes、150mM NaCl、200mMグルコース)と混合することにより巨大Erythro-VLPを採取した。
エピ蛍光顕微鏡検査
エピ蛍光顕微鏡検査を、Nikon Eclipse LV100 ND顕微鏡を使用して実施した。本装置は、0.3及び0.5の開口数をそれぞれ有するPlan Fluor BD 10×及び20×対物レンズを備える。画像を、4908×3264ピクセルの分解能、及び7.3×7.3μmのピクセルサイズを有するNikon DS-Ri2カメラを使用して記録した。カメラは、2.5×テレスコープを介して顕微鏡に取り付ける。すべての画像を、ハロゲンランプを使用しながら落射照明モード(episcopic illumination mode)で記録した。画像を、Nikon制御ソフトウェア(NIS Elements社、バージョン4.60.0)を使用して記録した。
共焦点レーザースキャニング顕微鏡検査
リポソームを、Nikon A1plusカメラを備えるNikon A1 Confocal Eclipse Ti顕微鏡上で画像化した。顕微鏡は、Plan Apo 40/0.9 NA対物レンズを装備した。2048×2048ピクセルの分解能を使用して画像を記録し、またチャネル毎にシグナル対ノイズ比の最適化を確実にするために記録スピードをそれぞれ調整した。2つの励起モード:561nm(TR-DHPE)及び488nm(Alexa Fluor 488マレイミド)を使用し、膜及びSタンパク質の同定をそれぞれ可能にした。装置をNikon NIS Elementsソフトウェアにより制御した。
動的光散乱
Malvern Panalytical社製のZetasizer Nano ZSを、リポソームのサイズ分布を決定するのに使用した。本装置は、4mW He-Neレーザー(波長:633nm)及び非侵襲的な後方散乱光学系を装備する。リポソームの拡散定数Dは、動的光散乱(DLS)スペクトルを測定することにより決定される。これは、ストークス・アインシュタインの関係式:D=kBT/6πηr(式中、ηは溶液の動的粘度であり、kBはボルツマン定数であり、Tはサンプル温度であり、そしてrは球状粒子の半径である)を介して粒子サイズと関連付けられる。すべての測定を、約0.5mg/mlの膜材料を含有する1mlのサンプルにおいて25℃で実施した。
バイオレイヤー干渉法(BLI)
ビオチン化ヒトACE-2をAcrobiosystems社から購入した(AC2-H82F9)。Superdex 200 increase 10/300分析用ゲル濾過カラム(GE Healthcare社)を使用する分析用サイズ排除クロマトグラフィーにより、凍結保護物質、グリセロール、及びトレハロースをACE-2タンパク質からそれぞれ除去した。ACE-2タンパク質をpH7.4のBSを用いて溶出させ、そして使用するまで4℃で保管した。すべてのセンサーチップについて、1nmの波長変化閾値に到するまで、ビオチン化ヒトACE-2タンパク質(11μg/mL)をストレプトアビジン(SA)バイオセンサー(ForteBio社)に固定した。センサーをpH7.4のPBS中に120秒間浸漬することにより、過剰の非固定化ACE-2を洗浄した。その後、1～16の範囲の異なる用量のRBC-スパイクの溶液中にSAバイオセンサーを900秒間浸漬して会合させた。バイオセンサーをpH7.4のPBS中に900秒間浸漬することにより、解離をモニタリングした。
SARS COV-2スパイクタンパク質の溶媒接触可能表面積(SASA)
Walls及び共同研究者らにより報告されたPDB ID:6VXXスパイクタンパク質構造に基づき、スパイクタンパク質のSASAを、Getareaソフトウェア(http://curie.utmb.edu/getarea.html)を通じてコンピューター計算した[7]。総合的な(骨格及び側鎖)SASAを、3つのプロトマーすべてについてコンピューター計算し、そしてこれら3測定の平均及び標準偏差を残基毎に報告する。
SARS-CoV-2 ELISA
COVID-19患者内のSARS-CoV-2抗体を同定するためのハイスループット血清学アッセイ法がこれまでに開発されている[46]。要するに、384ウェルプレート(Nunc Maxisorp社、Rochester、NY、米国)を、50mMの炭酸-重炭酸バッファー(pH9.6)中に懸濁した25L/ウェルのRBD(2g/mL)を用いて、4℃、一晩コーティングした。プレートを、次に0.05%ツイーン20を含むPBS内で調製した3%スキムミルクを100μl/ウェルで用いながら、室温で2時間ブロックした。ブロッキング溶液を除去し、そして稀釈したマウス血清サンプル(PBS/0.05%ツイーン20に溶解した1%スキムミルクにおいて1/100稀釈調製した)を、室温で1時間プレートに添加した。PBS/0.05%ツイーン20を用いてプレートを2回及びPBSを用いて3回洗浄した。結合したマウス抗体(IgG、IgA、又はIgM)を、PBS/0.05%ツイーン20内で調製したアルカリホスファターゼコンジュゲートヤギ抗マウスIgG(側鎖特異的、1/2000、Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc社、Westgrove、PA、米国)、ヤギ抗マウスIgA(側鎖特異的; 1/500、Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc社、Westgrove、PA、米国)抗体、又はヤギ抗マウスIgM(側鎖特異的; 1/1000、Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc社、Westgrove、PA、米国)抗体を用いて検出した。プレートを前回と同様に洗浄し、それに後続して50μLの基質(ジエタノールアミンに溶解した4-ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物; MilliporeSigma社、St. Loui、MO、米国)を添加した。405nm及び490nm(参照として)における光学濃度を、BioTek 800TSマイクロプレートリーダー(BioTek社、Winooski、VT、米国)を使用して測定した。数値を、1840秒後の観測された光学濃度の、0日目に決定された光学濃度に対する比として提示する。この数値を「光学濃度比」と呼ぶこととする。1の比を上回る数値は、SARS-CoV-2抗体ELISAにおいて陽性とみなされる。
分子動力学シミュレーション
MDシミュレーションを、MacSim(GROMACSバージョン5.1.4を使用するGPU加速型コンピューターワークステーション)上で実施した。デバイスは、40コア中央処理装置(CPU、Intel(R)Xeon(R)CPU E5-2630 v4、2.20GHzで)、130GBランダムアクセスメモリー(RAM)、及び3つのグラフィック処理ユニット(GPU、2×NVIDIA 1080 TDI+1×GeForce GT 730)を装備する[22]。2つの膜-Sタンパク質複合体を、膜に挿入されたタンパク質及び二重層と接触したタンパク質という2つの配置でシミュレーションした。各系は1つのSARS-CoV-2スパイクタンパク質を含有しており、また膜はCHARMM-GUI membrane-builder(http://charmm-gui.org/)を使用して設計した[47]。これまでに明らかにされたようなRBC膜の脂質濃度に一致するように、二重層組成物を選択した[22]。トリトン-X100を、25mMolの濃度でシミュレーションボックスに添加した。両分子は非生理学的非イオン性表面活性物質であるが、脂質膜に対して類似した効果を示す。系の電荷を、Na+及びCl-対イオンを添加することにより中和した。NPTアンサンブルを使用して5ns間平衡化した後、シミュレーションを2fsの時間ステップで500ns間実施した(一定の圧力及び温度)。1.1nmの短距離ファンデルワールス(van der Waal)カットオフ、及びpotential-shift-verlet coulomb modifierを使用し、そして周期的境界条件を3つの寸法すべてに適用した。近接リストを20ステップ間隔で更新した。温度を、Parrinello-Rahman半等方性の弱いカップリングを使用しながら、1barの一定圧力で、速度スケーリングサーモスタット(v-rescale thermostat)を通じてカップリングした(τ=12ps;圧縮率β=3 10-4bar-1)。図1Bは、タンパク質の初期配置の両方に対する膜-タンパク質複合体の3次元表現を示す。
(実施例2)
Erythro-PmBの調製、特徴付け、及びテスト
抗生物質耐性危機が世界規模で増大している結果、細菌による耐性機構の発現に起因して、多くの既存抗生物質が無効となった。微生物の増殖抑制において奏功性である強力な抗生物質、例えばポリミキシンB(PmB)等が限定数存在する;しかしながら、その毒性に起因して、これらは多くの場合最後の手段とみなされる。ハイブリッド赤血球リポソームを抗菌性抗体とコンジュゲートさせて、高負荷効率を誘導式の送達と組み合わせることにより、PmB送達システムを構築した。PmBの保持は、負に荷電した脂質を赤血球の細胞質膜(RBCcm)中に組み込むことにより強化される。DSPE-PEGマレイミドリンカーを組み込むことにより、抗大腸菌抗体をこれらのハイブリッド赤血球リポソームに連結させる。Erythro-PmBは、約90%の負荷効率を有し、PmBの大腸菌への送達において有効である(最低阻止濃度(MIC)において遊離PmBに匹敵する数値を有する)ことが明らかにされている。クレブシエラ・アエロゲネス(Klebsiella aerogenes)に対するMIC値は、耐性ブレークポイントを十分上回り有意に増加し、抗大腸菌抗体を組み込むことで、Erythro-PmBは抗生物質を特定の標的に対してきわめて選択的に送達できることが示唆される。この汎用性プラットフォームは、異なる種類の抗生物質及び細菌標的に対して使用可能である。
方法
クロロホルム中に1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[マレイミド(ポリエチレングリコール)-2000](PEG-MAL(2000)、Avanti社)を溶解し、クロロホルム及び2,2,2-トリフルオロエタノール(TFE)(1:1)中に1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン(DMP、Avanti社)を溶解することにより、合成脂質の個々のストック溶液を調製した。ハイブリッドRBC膜を生成するために、脂質を別個のガラスバイアルに添加して、0.4mol%のPEG-MAL(2000)及び5mol%のDMPからなる総合的な脂質組成物を実現した。弱めの窒素流によりクロロホルムをガラスバイアル内で約20分間除去した後、実施例1に記載するように調製した赤血球リポソーム溶液内で合成脂質を再懸濁した。混合物を次にボルッテックス処理し、そしてすべての合成脂質がガラスバイアルの底部表面から取り出されることを確実にするために、30分間インキュベートした。次に、ハイブリッド膜混合物を、20%の強度で、5秒間パルス及び55秒間休止を用いながら、氷冷バケット内で20分間超音波処理した。Vacufugeを使用してサンプルを完全に乾燥し、そして37℃、97%の相対湿度(RH)で1時間インキュベートした。このステップは、これまでに明らかにされたように、脂質がアニーリングし、そして均質な膜を形成するのを可能にする。インキュベーション後、稀釈PBSを添加して全体的なモル濃度として約30nMを実現した。これを「ハイブリッド膜溶液」と呼ぶこととする。0.1%アジ化ソーダの溶液に溶解した、4.0mg/mLのIgG濃度を有するウサギ抗大腸菌抗体を、BioRad社から購入した(製品コード:4329-4906)。抗体溶液を、それぞれ1mgの抗体を含有する4本のチューブ内に一定量分取し、そして-20℃で保管した。アジ化ソーダは細菌に対して有毒であるので、RBCコンジュゲーション前にPBSを用いてバッファー交換を実施した。250μlの抗体溶液を、10kDaの分子量カットオフを有する0.5mL Amicon Ultra Centrifugal Filter Unit(製品コード:UFC501008)内で、12,000×gにて15分間遠心分離した。濾液を除去し、そして残留物を初期容積のPBSに対して再懸濁した。すべてのアジ化ソーダの完全除去を確実にするために、このステップを3回反復した。すべての洗浄が完了したら、フィルターチューブを上下逆さまにして清浄な収集チューブ内に挿入し、12,000×gで5分間遠心分離し、そして初期容積のPBSに対して再懸濁した。洗浄前後の濃度を260nmにおいてNanoSpectrophotometer上で測定し、90%超のタンパク質回収率を確認した。次に、抗体溶液を、100×過剰のTCEP内で、室温にて20分間インキュベートした。このステップは、抗体のジスルフィド結合を還元し、PEG-MAL(2000)とコンジュゲーションさせるためにそれを調製する。次に、抗体溶液をハイブリッド膜溶液に添加し、室温で1時間、及び4℃、一晩インキュベートした。インキュベーションの後、12,000×gで2時間遠心分離することを通じて未結合の抗体を除去した。次に、PmBを得られた溶液中に1000:1の比で導入した。混合物を4℃で30分間インキュベートした後、20,000×gで4時間遠心分離した。遊離PmBを含有する上清を除去し、そしてPBSと置換して最終的なErythro-PmBを生成した。
結果
抗生物質の保持量は、ハイブリッド赤血球の組成を最適化することにより最大化する。
図5に図示するように、赤血球リポソームはヒトRBCから調製される。最初に、ハイブリッド赤血球リポソーム内PmBの保持量を、負に荷電したDMPSのRBCcm脂質に対する割合を変化させ、PmBのハイブリッド赤血球リポソームに対する比を変化させることにより最適化した。DMPSの組入れは、静電相互作用は抗生物質とリポソームとの間の相互作用において役割を演じているという仮説、及びカチオン性のPmBの保持量は負電荷を赤血球リポソームに付加することにより増加しうるという仮説に基づいた。図6に示すように、大腸菌の増殖曲線を、下記の処方物:(1)5mol%のDMPS及び赤血球リポソーム1個当たり1000個のPmB、(2)5mol%のDMPS及び赤血球リポソーム1個当たり10000個のPmB、(3)10mol%のDMPS及び赤血球リポソーム1個当たり1000個のPmB、及び(4)10mol%のDMPS及び赤血球リポソーム1個当たり10000個のPmBについて測定した。効率を、誘導期の相対的な期間により数値化した:誘導期が短い(曲線が無干渉増殖曲線(undisturbed growth curve)に密接に近似する)ほど、赤血球リポソーム内のPmBの保持量は高くなる。保持量を定量する方法は、下記で更に示すように、対応する抗菌性抗体を欠いている赤血球リポソームは細菌と相互作用せず、従ってPmBを送達するはずはないという前提に基づいた。5mol%のDMPSからなり、そしてリポソーム1個当たり1000個のPmBが負荷されたハイブリッド赤血球リポソームは最高の保持量を示し、従って更なる調査のために選択した。
ハイブリッド赤血球リポソームに対する抗体のコンジュゲーション
調製の異なる段階(赤血球リポソーム、RBC-DMPSハイブリッド赤血球リポソーム、及びRBC-DMPS-(PEG-MAL(2000)))(Erythro-PmB)におけるリポソームの粒径分布を、動的光散乱法(DLS)を使用して決定し、図7に示す。赤血球リポソームは142nmの平均粒径を示し、多分散指数(PDI)により0.66と確認されたように、幅広い粒径分布(粒径約40～900nmに対応する)を有した。負に荷電したDMPSを組み込んだ場合、434nmまで粒径の有意な増加が観測され、PDIは0.03に低下した。PEG-MAL(2000)の組込み及びマレイミド基に対する抗体のコンジュゲーション(Erythro-PmB)により、粒径は515nmまで増加した(PDI 0.04)。赤血球リポソームからErythro-PmBに向かって粒径が大幅に増加するが、それは抗体がPEG-MAL(2000)と成功裏にコンジュゲーションしたことを示唆する。赤血球リポソームは、図8a)の原子間力顕微鏡(AFM)画像において約70～300nmの粒径を示し、DLSの結果と整合する。図8b)のErythro-PmBは約800nmの粒径を有し、DLSで決定されたサイズ(515nm)よりも大きいが、おそらくはシリコン基材上でのリポソームの平坦化に起因する。タンパク質はこの分解能では観測することはできないが、表面特性の差異、例えば大きさにばらつきを伴う表面変形等は、膜の表面上に抗体が存在することを示唆しうる。Erythro-PmBは、図8c)において透過型電子顕微鏡を用いて画像化したとき、約300nmのサイズを有するバーストリポソームのように見える。Erythro-PmB周辺の暗い層がリポソーム表面上のタンパク質の存在に帰属可能となりうるように、酢酸ウラニルを使用して抗大腸菌抗体を陰性染色した。
PmBはErythro-PmB内に保持される
Erythro-PmB内のPmBの保持量を、沈降アッセイにおいてダンシル標識PmBを使用しながら数値化した。図9a)は、純粋なダンシル-PmB、及び純粋なハイブリッド赤血球リポソーム(対照として)、非保持型ダンシル-PmB(上清)、及びErythro-PmB(ペレット)の1μlドロップレット(直径約1mm)のUV画像を示す。図9b)にプロットするように、積分蛍光強度は、異なるサンプル内のダンシル-PmBの量に直接比例する。上清内の強度(非保持型ダンシル-PmB)は、ペレット(Erythro-PmB内に保持されたPmBの量)と比較して有意に低下した。純粋なダンシル-PmB参照物質と比較したとき、ペレットは全蛍光シグナルの78%を占めた一方、非保持型ダンシル-PmBは13%寄与した(純粋なハイブリッド赤血球リポソームの蛍光強度は4%)。これらの数値から保持量を(87±3)%と算出した。
Erythro-PmBは溶血活性を示さない
Erythro-PmBの溶血活性を図10に示す。溶血量をUV吸収により測定されるヘモグロビン放出量から決定した。データは、0MIC～MICの異なるPmB濃度における遊離PmB及びErythro-PmBについて示す。0.03%というオーダーの数値は、2%のベンチマーク溶血率(米国臨床病理学会(American Society of Clinical Pathology)により特定された)よりも十分低いことが確認され、非溶血性とみなされた。遊離PmBの濃度を変化させても(MIC、0.5MIC、0.25MIC)、溶血活性において統計的有意差は観測されなかった。Erythro-PmBの溶血活性は、遊離PmBの溶血活性よりも低く、0.01%未満であり、またPmB濃度とは無関係であった(実験誤差内)。
Erythro-PmBは大腸菌を標的とする
図11a)～図11c)に示すように、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する大腸菌をアガロースパッド上に固定し、そして落射蛍光顕微法を用いて画像化した。細菌はロッド状に見え、そして約2μmの平均直径及び約10μmの長さを示し、緑色チャネルにおいてのみ高強度の蛍光が放射されるのが認められた。図11d)～図11f)に示すように、大腸菌-GFPを、次にErythro-PmB(その膜はテキサスレッド(TR-DHPE)で標識された)と共にインキュベートした。細菌及びErythro-PmBは、緑色及び赤色チャネルによりそれぞれ観測される。統合したチャネルf)では、Erythro-PmBが大腸菌-GFPを取り巻き、そしてそれと相互作用する。赤色及び緑色チャネルのオーバーラップする部分は、Erythro-PmBの同時局在を示唆する。大腸菌を、Erythro-PmBと共に、37℃で1時間インキュベートし、コントラストを増加させるために酢酸ウラニウムを用いて染色し、そして図11g)及び図11h)に示すようにTEMを用いて画像化した。Erythro-PmBは大腸菌周辺に濃縮しており、そして細菌表面に対する連結を形成することが見出された。いくつかのErythro-PmBは、細菌と接触したものと思われる。
Erythro-PmBは効率的にPmBを大腸菌に送達する
異なる濃度の(遊離)PmB(MIC、0.5MIC、0.25MIC、及び0MIC)について、大腸菌の細菌増殖曲線を図12a)に示す。これらの実験に基づき、MICを0.63μg/mLと決定した。600nmにおける吸収(OD 600)を24時間測定した。抗生物質の非存在下(0MIC)では、細菌は単調増殖し、そして(1)細菌はグルコース代謝を伴いつつ増殖を開始し、そして(2)約14時間後にラクトース利用に切り替わる、2つの指数関数的増殖サイクルを有する特徴的なジオーキシー増殖曲線を示す。0.25MICを用いて処置された細菌も同様の挙動を示した。0.5MICの中間濃度を添加した後、最初の指数関数的サイクルの前に誘導期が観測され、指数関数的増殖は約9時間遅延した。MICのPmBでは増殖は観察されなかった。MIC、0.5MIC、0.25MIC、及び0MICのPmBを含有する、種々の濃度のErythro-PmBを用いて処置された大腸菌の増殖曲線を図12b)に示す。大腸菌は、0MIC及び0.25MICでは、遊離PmBと比較して、Erythro-PmBについて類似した初期指数関数的増殖を示したが、初期の誘導期は、約0.5MICのErythro-PmBにおいて約5時間長期化した。MICでは増殖は観察されなかった。
Erythro-PmBはきわめて選択的である
異なる濃度の(遊離)PmB(MIC、0.5MIC、0.25MIC、及び0MIC)における、K.アエロゲネスの細菌増殖曲線を図13a)に示す。K.アエロゲネスのMICを1.5μg/mLと決定した。大腸菌と同様に、K.アエロゲネスは0MICにおいてジオーキシー増殖曲線を示し、第2の指数関数的増殖相は約14時間において生ずる。ジオーキシー増殖は、遊離PmB:0.25MIC～MICの存在下ではそれほど明白ではなかった。中間濃度のMICを用いて処置されたK.アエロゲネスは、誘導期の長期化を示した:0.25MIC(6時間)及び0.5MIC(9時間)。抗大腸菌抗体を含有するErythro-PmBを用いて処置されたK.アエロゲネスの細菌増殖曲線を図13b)に示す。遊離PmBの場合、MICにおいて増殖は観察されなかったが、Erythro-PmBの存在下では、K.アエロゲネスは約7時間の増殖遅延を示した。増殖遅延(最長約16時間のラグタイムを伴う)は、2MIC、3MIC、4MICの濃度、最大6MICまで継続して観測され、従ってMICは>9μg/mLとして定義された。大腸菌についてMICの変化は観測されなかったが、Erythro-PmBを用いて処置されたK.アエロゲネスの場合、MICが6倍超増加した。
結論
抗体コンジュゲートハイブリッド赤血球リポソームは、PmBを細菌標的に対して選択的に送達するための有効なプラットフォームであることは明らかである。カチオン性のPmBの保持量を最大化するために、負に荷電したDMPSを組み込むことを通じて、ハイブリッド赤血球リポソームを形成した。DSPE-PEGマレイミドリンカーを組み込むことにより、抗大腸菌抗体をコンジュゲートした。このようなErythro-PmBは、同一のMIC値を有しつつ、遊離PmBと同じくらい有効にPmBを大腸菌に送達する。しかしながら、これは、K.アエロゲネスに対するMICが6倍増加した(耐性ブレークポイントを十分上回る)ことから、きわめて選択的である。約90%という高負荷効率と組み合わせることで、このようなErythro-PmBはPmBを細菌標的に送達するためのきわめて選択的なプラットフォームを代表する。
(実施例3)
Erythro-BDNFの調製、特徴付け、及びテスト
神経変性疾患を処置する際に直面する最大の難問は、血液脳関門(BBB)が存在するために、有望な薬物候補の脳へのアクセスが制限されることである。BBBは、血液と脳との間の分子の通過を制御する物理的障壁として作用する。過去25年にわたり、神経学的障害の有病率は世界的に増加しており、有効な処置法及びリハビリテーション法の開発に対する要求を惹起する。脳由来神経栄養因子(BDNF)は、可塑性及びニューロンの発達を制御する重要な分子であり、そのレベルは、神経変性状態、例えばアルツハイマー病等において低下することが明らかにされている。BDNFレベルを増加させることで、このような状態が改善することが明らかにされている;しかしながら、そのアクセスはBBBにより制限を受ける。赤血球(RBC)が、その高い生体適合性(循環内の薬物の寿命を延長することができる)に起因して、薬物送達のための有望な候補として浮上してきた。膜を操作し、またタンパク質を膜表面に連結することによって、RBCを機能化することができる。本発明者らは、BDNFを封入するRBC(Erythro-BDNF)をBBBを横断して送達するための、BBB輸送システムを標的とするRBCに基づくプラットフォームを開発した。RBC膜は、標的タンパク質(例えば、OX26等)の連結及びBDNFの封入を可能にするために操作される。標的タンパク質は、BBB内の受容体又はトランスポーターに結合し、またBBBを横断して脳内に負荷物を送達することが可能である。
方法
Erythro-BBBの調製
クロロホルム中に1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[マレイミド(ポリエチレングリコール)-2000](PEG-MAL(2000))を溶解し、クロロホルム及び2,2,2-トリフルオロエタノール(TFE)(1:1)中に1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン(DMPS)を溶解することにより、合成脂質の個々のストック溶液を調製した。ハイブリッドRBC膜を生成するために、脂質を別個のガラスバイアルに添加して、0.4mol%のPEG-MAL(2000)及び5mol%のDMPSからなる総合的な脂質組成物を実現した。弱めの窒素流によりクロロホルムをガラスバイアル内で約20分間除去した後、エリスロリポソーム溶液内で合成脂質を再懸濁した。混合物を次にボルッテックス処理し、そしてすべての合成脂質がガラスバイアルの底部表面から取り出されることを確実にするために、30分間インキュベートした。次に、ハイブリッド膜混合物を、20%の強度で、5秒間パルス及び55秒間休止を用いながら、氷冷バケット内で20分間超音波処理した。サンプルを、水及びメタノールで予めリンスしたガラスウェル内で乾燥した。ガラスウェルを、プラズマ洗浄装置を用いながら、1mbar、80:20窒素において5分間更に洗浄した。このステップは表面を親水性状態に保ち、リポソームの接着を可能にする。サンプルを親水性ガラスウェル上で乾燥し、そしてオービタルシェーカー内の37℃のホットプレート上、一晩乾燥した。サンプルを、次に37℃、98%RHでインキュベートし、RBCと合成脂質膜ドメインとの間の均質な混合を可能にした。BDNFを封入するために、乾燥した膜を、リポソーム1個に対してBDNFが2500:1となるような比で、希釈BDNF溶液中に再懸濁した。未封入BDNFを、20,000×gで4時間遠心分離することにより除去した。
抗トランスフェリン受容体抗体(OX26)を、Abcam社(ab6331)から購入し、そして0.1mg/mLの濃度となるようにPBS中に一定量分取した。Erythro-BBBを調製するために、最初に、OX26を、40×過剰の2-イムノチオラン(トラウツ試薬)を用いながら、室温で1時間チオール化した。このステップは、抗体上にスルフヒドリル基(DSPE-PEG-MAL(2000)上のマレイミド残基と反応することができる)の付加を引き起こす。チオール化されたOX26を、次にハイブリッド膜溶液と共に、室温で1時間、及び4℃、一晩インキュベートした。インキュベーション後、20,000×gで4時間遠心分離し、合計4回洗浄を反復することで、未結合の抗体を除去した。
結果
Erythro-BBBを、原子間力顕微鏡を使用して特徴付けた。図14は、シリコンウェファー上に沈積したErythro-BBBの画像を示す。リポソームは300～500nmの粒径分布を示す。Erythro-BBBは中央部に特徴的な凹部を示す。図15では、膜の最適化を実施して、BDNFの保持量が最高のErythro-BBBを生成した。Erythro-BBBを、5mol%の中性脂質POPC又は5mol%の負に荷電した脂質DMPSのいずれかでドープした。350～600nmの吸収スペクトルを測定し、そして全混合物、非保持型BDNFを含有する上清、及び保持型BDNFを含有するペレットについて積分した。封入効率を、中性Erythro-BBBについて約20%、及び負に荷電したErythro-BBBについて約30%と算出した。図16では、ハイブリッド赤血球リポソーム及びErythro-BBBの粒径分布を、動的光散乱を使用して測定した。ハイブリッド赤血球リポソームは324nmの粒径を示す。抗体がコンジュゲートすると、粒径は508nmまで増加する。図17では、Erythro-BBB OX26の結合性を、サンドイッチELISAを用いて確認した。これより、OX26抗体は成功裏に組み込まれたこと、及びコンジュゲーション後でもなおも機能的状態にあることが確認される。
本出願は実施例を参照しながら記載されているが、特許請求の範囲は実施例に記載される実施形態により限定されるものではなく、むしろ全体としての説明と整合する最も広い解釈を前提とすべきであると理解される。
個々の公開資料、特許、又は特許出願それぞれが、参照によりその全体が組み込まれるものと具体的且つ個別に明示されるかのように、それと同程度まで、すべての公開資料、特許、及び特許出願は、本明細書において参照によりその全体が組み込まれる。本出願における用語が、本明細書において参照により組み込まれている文書内で相違する定義がなされていることが判明した場合、本明細書に提示される定義が該用語に対する定義の役目を果たす。
［参考文献］
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Claims (60)

  1. 内因性二重層と、その中に埋め込まれるか又はそれと連結した1つ又は複数の改変型タンパク質分子とを含む、機能化された生体膜。
  2. 1つ又は複数の改変型タンパク質分子が、内因性二重層内に埋め込まれている、請求項1に記載の膜。
  3. 1つ又は複数の改変型タンパク質分子が、合成により生成される、請求項1又は2に記載の膜。
  4. 内因性二重層が、赤血球二重層である、請求項1から3のいずれか一項に記載の膜。
  5. 機能化された生体膜が、約0.00001質量%～約80質量%、任意選択で約0.0001%～約70%、約0.01%、又は約50%の1つ又は複数の改変型タンパク質分子を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の膜。
  6. 機械的ストレス及び/又は浸透圧ストレスに対して抵抗性である、請求項1から5のいずれか一項に記載の膜。
  7. 1つ又は複数の改変型タンパク質分子が、膜タンパク質、構造タンパク質、酵素、抗体、抗原、ホルモン、輸送タンパク質、タンパク質受容体、外因性タンパク質、核内因子、そのいずれか1つ若しくは複数の断片、又はそのいずれか2つ以上の組合せを含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の膜。
  8. 1つ又は複数の生体分子又は小分子を更に含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の膜。
  9. 1つ又は複数の生体分子が、核酸、糖、脂質、脂肪酸、又はその組合せ、任意選択で合成脂質を含む、請求項8に記載の膜。
  10. 1つ又は複数の改変型タンパク質分子が、ウイルスの膜タンパク質を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の膜。
  11. 1つ又は複数の改変型タンパク質分子が、SARS-CoV-2スパイクタンパク質を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の膜。
  12. 1つ又は複数の改変型タンパク質分子が、抗体を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の膜。
  13. 抗体が、細菌抗原、任意選択で大腸菌(E. coli)抗原に対して特異的な抗体を含む、請求項12に記載の膜。
  14. 1つ又は複数の改変型タンパク質分子が、血液脳関門内の受容体又はトランスポーターに結合するタンパク質を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の膜。
  15. 血液脳関門内の受容体が、トランスフェリン受容体を含み、任意選択でトランスフェリン受容体に結合する改変型タンパク質分子が、OX-26抗体を含む、請求項14に記載の膜。
  16. 遊離可能なカーゴを含むか又は封入する、請求項1から15のいずれか一項に記載の膜。
  17. 遊離可能なカーゴが、生体分子又は小分子を含む、請求項16に記載の膜。
  18. 遊離可能なカーゴが、抗生物質を含み、任意選択でポリミキシンB(PmB)を含む、請求項17に記載の膜。
  19. 遊離可能なカーゴが、治療剤を含み、任意選択で脳由来神経栄養因子(BDNF)を含む、請求項17に記載の膜。
  20. 1つ又は複数の改変型脂質分子を更に含む、請求項1から19のいずれか一項に記載の膜。
  21. 機能化された生体膜が、小胞を形成する、請求項1から20のいずれか一項に記載の膜。
  22. それを必要としている対象において免疫応答を提供するための、又は疾患、障害、若しくは状態を処置するための医薬の製造における、請求項1から21のいずれか一項に記載の膜の使用。
  23. 治療剤又は予防剤としての、請求項1から21のいずれか一項に記載の膜の使用。
  24. ワクチン又は免疫原性組成物としての、請求項1から21のいずれか一項に記載の膜の使用。
  25. 改変型タンパク質が埋め込まれた機能化された生体膜を調製する方法であって、
    a)内因性二重層を提供する工程と、
    b)1つ又は複数の改変型タンパク質の一部分が脂質二重層に組み込まれて機能化された生体膜が生成されるような条件下で、表面活性物質の存在下において、内因性二重層を、1つ又は複数の改変型タンパク質分子と接触させる工程と、
    c)表面活性物質を除去する工程と
    を含む方法。
  26. 1つ又は複数の改変型脂質分子を、機能化された生体膜中に組み込む工程を、任意選択で工程a)の前又は工程b)の後に更に含む、請求項25に記載の方法。
  27. 表面活性物質が、その臨界ミセル濃度を上回る濃度を有する、請求項25又は26に記載の方法。
  28. 表面活性物質が、トリトンX-100、ベータオクチルグルコシド、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸カリウム、ラウリル硫酸アンモニウム、ラウレス硫酸マグネシウム、ラウレス硫酸ナトリウム、ドデシルホスホコリン、ドデシルマルトシド、アルキル-PEG、ポリソルベート表面活性物質、CHAPS、CHAPSO、n-ドデシルβ-D-マルトシド、コール酸表面活性物質、又はその組合せを含む、請求項25から27のいずれか一項に記載の方法。
  29. 表面活性物質を除去する工程が、ポリスチレンビーズ、任意選択でアンバーライトXAD-2を添加する工程を含む、請求項25から28のいずれか一項に記載の方法。
  30. 表面活性物質を除去する工程が、透析又は濾過を含み、任意選択で粒径排除クロマトグラフィー又はメンブレン濾過を介した濾過を含む、請求項25から29のいずれか一項に記載の方法。
  31. 工程c)の後に、任意選択でゲル濾過により、機能化された生体膜を精製する工程を更に含む、請求項25から30のいずれか一項に記載の方法。
  32. 脂質二重層適合表面を有する固体基材上で、機能化された生体膜を乾燥させる工程を更に含む、請求項25から31のいずれか一項に記載の方法。
  33. ハイブリッド生体膜を再水和する工程を更に含む、請求項32に記載の方法。
  34. 1つ又は複数の改変型タンパク質分子が連結された機能化された生体膜を調製する方法であって、
    a)内因性二重層を提供する工程と、
    b)1つ又は複数の合成脂質分子の一部分が内因性二重層に組み込まれてハイブリッド二重層が生成されるような条件下で、内因性二重層を、
    i)改変型タンパク質分子の共有結合に適したリンカー及び官能基、又は
    ii)膜内で1つ又は複数の改変型タンパク質分子を荷電脂質と静電荷を介して会合させるのに適した電荷
    を含む1つ又は複数の合成脂質分子と接触させる工程と、
    c)ハイブリッド二重層を乾燥させる工程と、
    d)ハイブリッド二重層を水溶液内で再懸濁する工程と、
    e)1つ又は複数の改変型タンパク質分子の一部分が、ハイブリッド二重層内で合成脂質分子と共有結合し、これにより1つ又は複数の改変型タンパク質分子が連結された機能化された生体膜が生成されるような条件下で、ハイブリッド二重層を、1つ又は複数の改変型タンパク質分子と接触させる工程と
    を含む方法。
  35. 工程b)の前に、内因性二重層及び/又は1つ又は複数の改変型タンパク質分子を精製する工程を更に含む、請求項25から34に記載の方法。
  36. 内因性二重層が、赤血球から、任意選択で赤血球ゴーストから得られる、請求項25から35のいずれか一項に記載の方法。
  37. 1つ又は複数の改変型タンパク質分子が、膜タンパク質、構造タンパク質、酵素、抗体、抗原、ホルモン、輸送タンパク質、タンパク質受容体、外因性タンパク質、核内因子、そのいずれか1つ若しくは複数の断片、又はそのいずれか2つ以上の組合せを含む、請求項25から36のいずれか一項に記載の方法。
  38. 1つ又は複数の改変型タンパク質分子が、ウイルスの膜タンパク質を含む、請求項25から37のいずれか一項に記載の方法。
  39. 1つ又は複数の改変型タンパク質分子が、SARS-CoV-2スパイクタンパク質を含む、請求項38に記載の方法。
  40. 1つ又は複数の生体分子又は小分子を、機能化された生体膜中に組み込む工程を更に含む、請求項25から39のいずれか一項に記載の方法。
  41. 生体分子が、核酸、糖、脂質、脂肪酸、又はその組合せを含む、請求項40に記載の方法。
  42. 機能化された生体膜中に、遊離可能なカーゴを封入する工程を更に含む、請求項25から41のいずれか一項に記載の方法。
  43. 遊離可能なカーゴが、1つ又は複数の生体分子又は小分子を含む、請求項42に記載の方法。
  44. 機能化された生体膜が、小胞を形成する、請求項25から43のいずれか一項に記載の方法。
  45. 請求項25から44のいずれか一項に記載の方法により調製される機能化された生体膜。
  46. 請求項1から21のいずれか一項に記載の膜を含み、1つ又は複数の改変型タンパク質分子が抗原を含む、免疫原性組成物。
  47. 抗原がSARS-CoV-2スパイクタンパク質である、請求項46に記載の免疫原性組成物。
  48. 対象において免疫応答を提供することにおいて使用される、請求項46又は47に記載の免疫原性組成物。
  49. 対象において免疫応答を提供するための、請求項46又は47に記載の組成物の使用。
  50. 請求項1から21のいずれか一項に記載の膜を含み、1つ又は複数の改変型タンパク質分子が、SARS-CoV-2スパイクタンパク質を含む医薬組成物。
  51. 対象におけるCOVID-19の処置で使用される、請求項50に記載の医薬組成物。
  52. 対象におけるCOVID-19を処置するための、請求項50に記載の組成物の使用。
  53. 請求項1から21のいずれか一項に記載の膜を含む医薬組成物であって、1つ又は複数の改変型タンパク質分子が、細菌抗原、任意選択で大腸菌抗原に対して特異的な抗体を含み、膜が、抗生物質を含む遊離可能なカーゴを含むか又は封入する、医薬組成物。
  54. 抗生物質が、ポリミキシンBを含む、請求項53に記載の医薬組成物。
  55. 細菌性感染症を処置することにおいて使用される、請求項53又は54に記載の医薬組成物。
  56. 細菌性感染症を処置するための、請求項53又は54に記載の医薬組成物の使用。
  57. 請求項1から21のいずれか一項に記載の膜を含む医薬組成物であって、1つ又は複数の改変型タンパク質分子が、血液脳関門内の受容体又はトランスポーターに結合するタンパク質を含み、任意選択でOX-26抗体を含み、膜が、治療剤を含む遊離可能なカーゴを含むか又は封入する、医薬組成物。
  58. 治療剤が、抗神経変性剤、任意選択で脳由来神経栄養因子(BDNF)を含む、請求項57に記載の医薬組成物。
  59. 神経変性疾患又は状態を処置することにおいて、任意選択で認知症を処置することにおいて使用される、請求項57又は58に記載の医薬組成物。
  60. 神経変性疾患又は状態を処置するための、任意選択で認知症を処置するための、請求項57又は58に記載の医薬組成物の使用。
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