KR101842768B1 - 세포-유래 나노베지클을 이용한 유전자 전달체 및 이의 제조방법 - Google Patents

세포-유래 나노베지클을 이용한 유전자 전달체 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포-유래 나노베지클을 이용한 유전자 전달체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에서, 세포막 (Plasma membrane)으로부터 인위적으로 분출된 나노베지클에 유전자를 삽입함으로써, 이를 통해 제조된 유전자 전달체는, 표적 장기 및 세포로의 전달 효율이 우수하고, 장시간 유전자의 발현 조절을 유도할 수 있을 뿐만 아니라, 제조과정이 간이하여 대량생산이 용이한바, 유전자 또는 세포 치료제 분야의 핵심기술로 이용될 수 있을 것이다.

Description

세포-유래 나노베지클을 이용한 유전자 전달체 및 이의 제조방법 {Gene delivery carrier using cell-derived nanovesicles and method for producing the same}
본 발명은 세포-유래 나노베지클을 이용한 유전자 전달체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
유전자 치료 (Gene therapy)는 치료 유전자를 체내의 원하는 장기로 전달하여 세포 내에서 새로운 단백질이 발현되도록 하여 질병을 치료하는 것으로, 최근, 유전자 치료에 의한 바이러스성 질환, 암 등 다양한 질병의 유효한 치료 효과가 다수 보고되고 있다. 최초의 유전자 치료제가 유럽에서 시판되어 상용화됨에 따라, 국내에서도 이에 대한 활발한 연구가 진행되고 있으며, 실제로, 몇몇의 유전자 치료제는 임상 연구에서 우수한 치료 효과를 보여주고 있는바, 국내뿐만 아니라, 전 세계적으로 유전자 치료제 개발에 대한 기대가 높은 상황이다. 그러나 이러한 주목을 받고 있음에도 불구하고, 유전자 치료제는, 초기 임상 시험에서 뛰어난 효능을 보여주지 못해 실제로 상업화까지 진행되는 경우는 극히 드문 실정으로서, 이의 주요한 요인으로 유전자 치료제의 안전성 및 표적 세포로의 낮은 유전자 전달 효율을 꼽고 있다. 따라서, 효과적인 유전자 치료를 위해서는 치료 유전자를 원하는 표적세포로 안전하게 전달하여 높은 발현 효율의 달성을 가능케 하는 유전자 전달체 (Gene carrier)를 개발하는 것이 필수적이다.
현재, 높은 전달 효율을 가지고 있는 바이러스성 유전자 전달체가 가장 많이 활용되고 있으나, 레트로바이러스 (retrovirus), 아데노바이러스 (adenovirus), 아데노 연관 바이러스 (adeno-associated virus)와 같은 바이러스성 벡터는 제조과정이 복잡할 뿐만 아니라, 면역원성, 감염 가능성, 염증 유발, 비특이적 DNA의 삽입 등의 안전성 문제와 수용할 수 있는 핵산의 크기가 한정되어 있다는 문제로 인해 인체에 적용하기엔 한계가 많다. 이에 현재는 비바이러스성 유전자 전달체가 바이러스성 유전자 전달체의 대용으로 각광을 받고 있다 (한국 공개 특허 2014-0118458). 비바이러스성 유전자 전달체는 최소한의 면역반응으로 반복 투여할 수 있고, 특정 세포로의 특이적 전달이 가능하며, 안전성 및 저장 안정성이 우수하고, 대량 생산이 용이하다는 장점을 가지고 있으며, 이러한 예로는 양이온성 리포좀 (liposome) 계열로서 N-[1-(2,3-다이올레일옥시)프로필]-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA), 알킬암모늄 (alkylammonium), 양이온성 콜레스테롤 유도체 (cationic cholesterol derivatives), 그라미시딘 (gramicidin) 등이 있다. 그러나, 이 역시도 혈액 안정성이 낮고, 유전자 전달 효율 및 가격 경쟁력이 낮다는 단점이 있다.
이러한 배경 하에서, 기존의 바이러스성 유전자 전달체의 장점은 그대로 유지하면서, 우수한 전달 효율을 나타내는 유전자 전달체의 개발이 절실히 요구되고 있으나, 아직은 미비한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은, 세포막 (Plasma membrane)으로부터 인위적으로 분출된 나노베지클을 이용한 유전자 전달체를 통해 표적세포 내로 유전자를 효율적으로 도입할 수 있음을 확인하고, 이에 기초하여, 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은, 세포-유래 나노베지클을 기반으로 하는 유전자 전달체 및 이의 제조방법을 제공하는데 있다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, (a) 세포로부터 분출된 베지클을 함유하는 현탁액을 압출하여 나노베지클을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 제조된 나노베지클 내로 뉴클레오티드를 삽입하는 단계를 포함하는, 유전자 전달체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, (a) 세포로부터 분출된 베지클을 함유하는 현탁액을 원심분리하여 마이크로베지클을 제조하는 단계; (b) 상기 마이크로베지클에 계면활성제 및 뉴클레오티드를 처리하여 마이크로베지클 내로 뉴클레오티드를 삽입하는 단계; 및 (c) 상기 뉴클레오티드가 삽입된 마이크로베지클을 함유하는 현탁액을 압출하여 나노베지클을 제조하는 단계를 포함하는, 유전자 전달체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 세포-유래 나노베지클을 기반으로 하는 유전자 전달체를 제공한다.
또한, 본 발명은 유전자 치료제, 세포 치료제의 일 구성성분으로 적용될 수 있는 상기 유전자 전달체의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 유전자 전달체의 제조방법은, 세포막 (Plasma membrane)으로부터 인위적으로 분출된 나노베지클에 유전자를 삽입하는 단계를 포함하며, 이를 통해 제조된 유전자 전달체는, 표적 장기 및 세포로의 전달 효율이 우수하고, 장시간 유전자의 발현 조절을 유도할 수 있을 뿐만 아니라, 제조과정이 간이하여 대량생산이 용이한바, 유전자 또는 세포 치료제 분야의 핵심기술로 이용될 수 있을 것이다. 이 뿐만 아니라, 본 발명의 방법을 이용하여 환자의 세포로 환자에게 최적화된 유전자 전달체를 제조할 수 있으므로 개인 맞춤형 유전자 치료에 활용될 수 있을 것이다.
도 1은, RNA 전달을 위한 유전자 전달체의 제조 과정을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 2는, DNA 전달을 위한 유전자 전달체의 제조 과정을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 3은, (a) 본 발명의 나노베지클을 투과 전자 현미경으로 관찰한 결과, 및 (b) Dynamic light scattering을 통해 크기 분포를 나타낸 결과이다.
도 4는, 본 발명의 제조방법에 따른 (a) 단일 세포당 나노베지클 생산량, (b) 단위 시간당 단일 세포의 생산량을 나타낸 결과이다.
도 5는, 본 발명의 나노베지클을 이용하여 Cy5 형광이 표지된 siRNA를 세포에 전달한 후, (a) 세포 내 이입여부를 형광을 통해 확인한 결과, (b) 세포 내 이입률을 Ribogreen assay를 통해 정량화한 결과이다.
도 6은, 본 발명의 제조방법에서, PFA (Paraformaldehyde) 또는 DTT (Dithiothreitol) 처리 농도의 차이에 따른 나노베지클의 수득량을 비교한 결과이다.
도 7은, 본 발명의 제조방법에서, 버퍼 용액 (HEPES, PBS, HBSS)의 차이에 따른 유전자 전달 효율을 비교한 결과이다.
도 8은, HeLa 세포주에서, 본 발명의 유전자 전달체를 이용하여 EGFP siRNA를 전달한 후, EGFP의 발현을 (a) 형광현미경, (b) 유세포 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 9는, HeLa 세포주에서, 본 발명의 유전자 전달체를 이용하여 EGFP siRNA를 전달한 후, (a) EGFP의 발현을 정량화한 결과, 및 (b) 세포 독성 평가를 실시한 결과이다.
도 10은, 인간 지방유래 줄기세포 (hADSC)에서, 본 발명의 유전자 전달체를 이용하여 GAPDH siRNA를 전달한 후, (a) GAPDH의 발현을 정량화한 결과, 및 (b) 세포 독성 평가를 실시한 결과이다.
도 11은, 인간 태아유래 신경줄기세포 (hfNSC)에서, 본 발명의 유전자 전달체를 이용하여 GAPDH siRNA를 전달한 후, (a) GAPDH의 발현을 정량화한 결과, 및 (b) 세포 독성 평가를 실시한 결과이다.
도 12는, 인간 지방유래 줄기세포 (hADSC)에서, 본 발명의 유전자 전달체를 이용하여 GNAS siRNA를 전달한 후, GNAS의 발현을 정량화한 결과이다.
도 13은, 인간 지방유래 줄기세포 (hADSC)에서, 본 발명의 유전자 전달체를 이용하여 GNAS siRNA를 전달한 후, COL1A2, 및 OPN의 발현을 (a) 시간의 경과에 따라 정량화한 결과, 및 (b) 형광 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 14는, 인간 지방유래 줄기세포 (hADSC)에서, 본 발명의 유전자 전달체를 이용하여 GNAS siRNA를 전달한 후, 칼슘의 침착 정도를 Alizarin S 염색으로 확인한 결과이다.
도 15는, 인간 태아유래 줄기세포 (hfNSC)에서, 본 발명의 유전자 전달체를 이용하여 REST siRNA를 전달한 후, REST의 발현을 정량화한 결과이다.
도 16은, 인간 태아유래 줄기세포 (hfNSC)에서, 본 발명의 유전자 전달체를 이용하여 REST siRNA를 전달한 후, (a) Nestin, (b) GFAP, (c) olig2, (d) Tuj1, 및 (e) MAP2의 발현을 정량화한 결과이다.
도 17은, 인간 태아유래 줄기세포 (hfNSC)에서, 본 발명의 유전자 전달체를 이용하여 REST siRNA를 전달한 후, 신경돌기의 길이를 (a) 형광현미경으로 관찰한 결과, 및 (b) 정량화한 결과이다.
도 18은, 인간 지방유래 줄기세포 (hADSC)에서, 인간 지방유래 줄기세포로부터 유래한 나노베지클을 이용하여, GAPDH siRNA를 전달한 후, GAPDH의 발현을 정량화한 결과, 및 (b) 세포 독성 평가를 실시한 결과이다.
도 19는, E-cadherin이 도입된 본 발명의 유전자 전달체에서, (a) E-cadherin의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과, (b) 인간 만능유도줄기세포 (hiPSC) 내로의 유입을 형광현미경으로 확인한 결과이다.
도 20은, (a) 인간 만능유도줄기세포 (hiPSC) 또는 (b) 인간 지방줄기세포 (hADSC)에서, GAPDH siRNA를 E-cadherin이 도입된 본 발명의 유전자 전달체를 이용하여 전달한 후, GAPDH의 발현을 정량화한 결과이다.
도 21은, K+ depletion된 세포에 Dil dye로 염색된 본 발명의 유전자 전달체를 처리한 후, 세포 내 유입을 (a) 형광현미경으로 관찰한 결과, 및 (b) 정량화한 결과이다.
도 22는, CHC siRNA 처리된 세포에 Dil dye로 염색된 본 발명의 유전자 전달체를 처리한 후, 세포 내 유입을 (a) 형광현미경으로 관찰한 결과, 및 (b) 정량화한 결과이다.
도 23은, EIPA 또는 LY294002 화합물이 처리된 세포에 Dil dye로 염색된 본 발명의 유전자 전달체를 처리한 후, 세포 내 유입을 (a) 형광현미경으로 관찰한 결과, 및 (b) 정량화한 결과이다.
도 24는, 마우스 동물모델에서, 본 발명의 유전자 전달체를 이용하여 APOB siRNA를 전달한 후, (a) 실시간 이미징 분석 결과, (b) 형광 강도의 측정 결과, (c) 장기별 형광 이미징 분석 결과, 및 (d) 장기별 형광 강도의 측정 결과를 나타낸 결과이다.
도 25는, 마우스 동물모델에서, 본 발명의 유전자 전달체를 이용하여 APOB siRNA를 전달한 후, 간 조직 내 APOB 발현을 정량화한 결과이다.
도 26은, 마우스 동물모델에서, 본 발명의 유전자 전달체를 이용하여 APOB siRNA를 전달한 후, 혈중 (a) AST 및 (b) ALT 농도를 측정한 결과이다.
도 27은, (a) HeLa 세포주 또는 (b) 인간 지방유래 줄기세포 (hADSC)에서, 본 발명의 유전자 전달체를 이용하여 EGFP 플라스미드를 전달한 후, EGFP의 발현을 형광현미경으로 관찰한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.
본 발명은, a) 세포로부터 분출된 베지클이 함유된 현탁액을 압출하여 나노베지클을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 제조된 나노베지클 내로 뉴클레오티드를 삽입하는 단계를 포함하며, 상기 뉴클레오티드는 mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, 및 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는, 유전자 전달체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, (a) 세포로부터 분출된 베지클이 함유된 현탁액을 원심분리하여 마이크로베지클을 제조하는 단계; (b) 상기 마이크로베지클에 계면활성제 및 뉴클레오티드를 처리하여 마이크로베지클 내로 뉴클레오티드를 삽입하는 단계; 및 (c) 상기 뉴클레오티드가 삽입된 마이크로베지클이 함유된 현탁액을 압출하여 나노베지클을 제조하는 단계를 포함하며, 상기 뉴클레오티드는 gDNA, pDNA, 및 cDNA로 이루어진 군으로부터 선택되는, 유전자 전달체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 베지클은 효율적인 유전자 전달을 위하여 바람직하게 나노 단위의 직경을 갖도록 제조될 수 있으며, 바람직하게 100 내지 200nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 압출, 초음파 분해, 세포 용해, 균질화, 냉동-해동, 전기천공, 기계적 분해, 및 화학 물질 처리로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 이상의 방법을 사용하여 나노베지클을 제조할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게 PFA (Paraformaldehyde) 및 DTT (Dithiothreitol)가 첨가된 버퍼 용액에 배양시켜 세포부터 분출시키고, 이를 포함하는 현탁액을 압출하여 제조할 수 있다. 이때, PFA의 농도는 바람직하게 25 mM이상, 보다 바람직하게 25mM 내지 50mM, 가장 바람직하게 25mM일 수 있으며, DTT의 농도는 바람직하게 1mM 이상, 보다 바람직하게 1mM 내지 2mM, 가장 바람직하게 1mM일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 종래의 세포-유래 유전자 전달체로서, 세포간 신호 전달 목적으로 분비되는 엑소좀 (Exosome)이 널리 이용되어 왔으나, 상기 엑소좀은, 세포 자체의 RNA, 단백질 등의 유전 물질을 내포하고 있으며, 이들의 내재조성을 조절함은 무리가 있었다. 다만, 상기의 방법에 의해 제조된 나노베지클 또는 유전자 전달체는, 한 구체 예로서, HEPES buffer에서 세포-유래 베지클을 분출 (Outbudding)시킬 경우, 상기 HEPES buffer를 주요 성분으로 하는 베지클을 제조할 수 있었다. 즉, 세포에 처리되는 buffer의 종류에 따라 나노베지클의 내재 조성을 용이하게 조절할 수 있는바, 이를 통해 세포 자체의 유전 물질에 의한 영향을 최소화할 수 있다. 이때, 버퍼 용액은 바람직하게 HEPES buffer, PBS buffer, HBSS buffer 등일 수 있으며, 나노베지클의 내재 조성을 변화시킬 수 있는 버퍼 용액이라면 제한없이 사용될 수 있다.
또한, 상기 (a) 단계 이전에, 타겟팅 리간드 (Targeting ligand)를 세포에 형질전환, 즉, 과발현시키는 단계를 실시함으로써, 특정 세포에 대한 유전자 전달체의 전달 효율을 증진시킬 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, 형질전환은 본래의 세포가 가지고 있던 것과 다른 종류의 외래 유전자가 있는 DNA 사슬 조각 또는 플라스미드 등이 세포 내로 침투되어 원래 세포에 존재하던 DNA와 결합함으로써 세포의 유전형질을 변화시키는 분자생물학적 기술로서, 본 발명에서는 타겟 세포로의 전달 효율을 증진시키기 위하여 세포막에 타겟팅 리간드를 과발현시키는 것을 의미한다. 한 구체예로서, 타겟팅 리간드로 E-cadherin을 이용하여, 만능유도줄기세포 (hiPSC) 및 인간 지방줄기세포 (hADSC)로의 전달 효율을 증진시킬 수 있었으며, 특정 세포와 결합할 수 있는 리간드라면 제한없이 포함될 수 있다.
다만, 유전자 전달체에 봉입되는 뉴클레오티드가 RNA에 비해 상대적으로 크기가 큰 gDNA, pDNA, 및 cDNA와 같은 DNA인 경우, 우선, 마이크로베지클에 계면활성제 및 뉴클레오티드를 처리하여 뉴클레오티드를 삽입한 후, 이를 압출하여 나노 단위의 유전자 전달체를 제조할 수 있다. 상기 계면 활성제는 상기 마이크로베지클의 표면장력을 감소시켜 DNA를 내부로 삽입하기 위해 처리되는 물질로서, 바람직하게 트리톤 X-100 (Triton X-100)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실험예에서는, 본 발명의 방법을 통해 제조된 나노베지클은 엑소좀과 유사한 물리적 특성을 가지는 바, 유전자 전달체로 활용할 수 있으며, 나아가, 엑소좀에 비해 대량 생산 및 유전자 전달이 용이하고, 버퍼 용액의 차이에 의해서도 유전자의 세포 내 이입 효율이 일정하게 유지됨을 확인하였다 (실험예 1 및 2 참조). 또한, 본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 나노베지클을 기반으로 하는 유전자 전달체를 이용함으로써, 다양한 세포, 특히 줄기세포 내 분화 관련 유전자의 발현을 효과적으로 조절할 수 있음을 in vitro 및 in vivo에서 각각 확인하였고 (실험예 3 및 5 참조), 타겟 리간드를 도입하여 유전자 전달체의 전달 효율을 증진시킬 수 있으며, 상기 유전자 전달체는 RNA 뿐만 아니라 DNA를 삽입한 경우에도 우수한 전달 효율을 나타냄을 실험적으로 확인하였다 (실험예 4 및 6 참조).
이에, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된, 세포-유래 나노베지클 및 상기 나노베지클에 봉입된 뉴클레오티드를 포함하는, 유전자 전달체를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "나노베지클" 또는 "마이크로베지클"은 세포, 보다 구체적으로, 세포막에서 인위적으로 분출시켜 제조된 베지클로서, 뉴클레오티드를 표적세포 내로 전달하는 역할을 한다. 자연적으로 분비되는 "쉐딩 마이크로베지클"과 구별되며, 본 발명의 베지클은 세포막 성분으로 이루어진 지질 이중막에 의해 내부와 외부가 구분된다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 제조방법에 의해 제조된, 세포-유래 나노베지클 및 상기 나노베지클에 봉입된 뉴클레오티드를 포함하는, 줄기세포 분화 촉진용 유전자 전달체를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, 줄기세포는 자기 복제 능력을 가지면서 새로운 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 의미하며, 분화능에 따라 만능 줄기세포 (Totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포 (Pluripotent stem cells), 다분화능 줄기세포 (Multipotent stem cells)로 분류할 수 있고, 줄기세포의 유래조직에 따라 성체줄기세포, 배아줄기세포 및 역분화줄기세포로 분류할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 본 발명에서 제공하는 유전자 전달체에 의해 분화가 촉진되는 세포로서, 바람직하게 골수, 지방조직, 치아, 치아조직, 혈액, 제대혈, 간장, 피부, 위장관, 태반, 자궁, 태아로부터 유래한 줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다른 양태로서, 유전자 치료제, 세포 치료제의 일 구성 성분으로 적용될 수 있는 상기 유전자 전달체의 용도를 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 제조예 ]
제조예 1. 세포-유래 나노베지클 기반의 유전자 전달체의 제조
1-1. RNA 전달을 위한 유전자 전달체의 제조
25mM의 PFA (Parformaldehyde) 및 2mM의 DTT (Dithiothreitol)가 첨가된 HEPES buffer (10mM HEPES, 150mM NaCl, 2mM CaCl2, pH 7.4)에서, HEK-293 세포주를 37℃, 3-4 시간 동안 인큐베이션시켜 상기 세포로부터 인위적으로 베지클을 분출시켰으며, 보다 높은 수율의 베지클을 수득하기 위하여 30분마다 culture dish를 흔들어 주었다. 이후, 상기 베지클을 함유하는 현탁액을 순차적으로 원심분리 (Centrifugation), 초음파 분해 (Sonication), 및 압출 (Extrusion)하여 균일한 크기의 세포-유래 나노베지클을 제조하였다. 이후, 전기천공법을 이용하여 상기 나노베지클의 내부에 RNA로 이루어진 핵산분자를 도입함으로써, RNA 전달을 위한 유전자 전달체를 제조하였다.
1-2. DNA 전달을 위한 유전자 전달체의 제조
상기 제조예 1-1과 동일한 방법으로, HEK-293 세포주를 인큐베이션시켜 인위적으로 베지클을 분출시키고, 이를 원심분리 (20,000g, 60분)하여 세포-유래 마이크로베지클을 수득하였다. 이후, 10mM의 Triton X-100과 DNA를 함께 처리하여 상기 마이크로베지클의 내부에 DNA로 이루어진 핵산분자를 도입하고, bio-bead resin과 함께 4℃에서 인큐베이션시켜 잔존하는 Triton X-100을 제거하였다. 이후, DNA가 삽입되어 있는 세포-유래 마이크로베지클을 나노 단위의 베지클로 압출함으로써, DNA 전달을 위한 유전자 전달체를 제조하였다.
이하, 본 실험예에서는 상기 제조예 1-1 및 1-2의 방법에 따라 세포로부터 분출시켜 제조한 '세포-유래 나노베지클'을 '나노베지클'로 명명하였다.
[ 실험예 ]
실험예 1. 나노베지클의 물리적 특성 분석
엑소좀 (Exosome)은 세포 유래의 천연물질로서, 최근 보고에 따르면, 유전자 전달체로 적용이 가능하다고 알려져 있다. 이에, 본 실험예에서는, 상기 제조예 1-1에서 제조된 나노베지클 (Plasma membrane-derived nanovesicle; PMNV)의 물리적 특성을 엑소좀과 비교하여 분석하였다.
구체적으로, 나노베지클의 구조를 투과 전자 현미경 (TEM)으로 관찰하였으며, Dynamic light scattering (DLS), 및 Nanoparticle tracking analysis (NTA) 분석을 통해 나노베지클과 제타전위 (Zeta-potential)를 측정하였고, 단일 세포당 생산량 및 단위 시간당 단일 세포에서의 생산량을 측정하여 이들의 생산 효율을 비교하였다. 또한, Cy5 형광으로 표지된 siRNA를 단순 혼합하여 전달한 경우, 및 상기 siRNA를 삽입하여 전달한 경우에서의 형광세기를 측정하여, 나노베지클 또는 엑소좀을 이용한 유전자 전달체의 세포 내 이입 여부를 확인하였고, 전기천공법을 통해 나노베지클 또는 엑소좀 내로 삽입된 siRNA의 양을 Ribogreen assay를 통해 정량화함으로써, 이들간 세포 내 이입률을 비교하였다.
그 결과, 도 3 및 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 나노베지클 (PMNV)은 엑소좀의 구조와 유사하게 외측이 막으로 둘러싸여 있었으며 (도 3a 참조), 나노베지클의 직경은 100-200nm의 범위에서 주로 관찰되었고 (도 3b 참조), 평균 지름 및 제타전위는 각각 139.21±1.91nm, 및 -11,59±1.41ζ로, 엑소좀과 유사한 물질적 성질을 가지고 있는바, 유전자 전달체로 적합함을 확인할 수 있었다.
[표 1]
Figure 112016039330391-pat00001
또한, 도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 나노베지클 (PMNV)은 엑소좀에 비해 단일 세포당 생산량 (도 4a) 또는 단위 시간당 단일 세포의 생산량 (도 4b)이 현저하게 증가하였는바, 이는 대량 생산에 이점이 있음을 나타낸다 (도 4 참조). 이 뿐만 아니라, 세포 내 이입 여부를 확인한 결과, 단순 혼합하여 전달한 경우, 세포 내 형광이 측정되지 않은 반면, 나노베지클 또는 엑소좀 내로 siRNA를 삽입하여 전달한 경우에는 강한 형광이 관찰되었으며 (도 5a 참조), 이들간 siRNA 이입률을 비교한 결과, 엑소좀을 이용한 유전자 전달체는 25.3%인 반면, 나노베지클을 이용한 경우 31.6%로, 세포 내 이입률이 유의적으로 증진됨을 확인할 수 있었다 (도 5b 참조). 상기 결과로부터, 본 발명의 나노베지클은 종래 보고된 엑소좀과 마찬가지로, 유전자 전달체로 활용될 수 있으며, 이러한 나노베지클 기반의 유전자 전달체를 이용함으로써, 유전자의 세포 내 이입률이 보다 증진됨을 알 수 있었다.
실험예 2. 처리 조건에 따른 나노베지클 수득량 및 유전자 전달 효율 비교
2-1. PFA 및 DTT 처리 농도에 따른 나노베지클 수득량 비교
상기 제조예 1의 유전자 전달체 제조에서는, PFA (paraformaldehyde) 및 DTT (Dithiothreitol)가 첨가된 버퍼 용액 (HEPES buffer)에 세포를 배양시킴으로써, 세포로부터 인위적으로 다량의 베지클을 분출시킬 수 있었다. 본 실험예에서는, 나노베지클의 생산 수율을 보다 증진시키기 위한 최적의 조건을 도출하고자 다양한 농도의 PFA (5mM, 25mM, 50mM) 및 DTT (0.25mM, 1mM, 2mM)를 버퍼 용액에 첨가하였으며, PFA의 농도 변화시, DTT의 농도는 1mM로, DTT의 농도 변화시, PFA의 농도는 25mM로 일정하게 유지하면서, 상기 제조예 1-1과 동일한 방법으로 나노베지클을 제조하였다. 이후, 처리 농도별 나노베지클의 수득량을 정량적으로 비교하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 버퍼 용액에 첨가된 PFA의 농도가 25mM, DDT의 농도가 1mM 이상일 때부터 나노베지클의 수득량이 현격하게 증가함을 확인할 수 있었다.
2-2. 버퍼에 따른 유전자 전달 효율 비교
현재, 유전자 전달체로 이용되고 있는 엑소좀은, 세포 자체의 RNA, 단백질 등의 유전 물질을 내포하고 있어 전달 효율을 저하시키는 요인으로 작용될 우려가 있었던 반면, 상기 제조예 1의 유전자 전달체에서는 배양에 사용된 버퍼 용액이 주요성분인 베지클을 제조함으로써, 베지클 내 내재 조성을 필요에 따라 조절할 수 있다. 본 실험예에서는, 이러한 버퍼 용액의 변화에도 불구하고 본래의 유전자 전달 효율이 유지될 수 있는지 여부를 확인하고자 다양한 버퍼 용액 (HEPES, PBS, HBSS)을 사용하여 상기 제조예 1-1과 동일한 방법으로 EGFP siRNA (siEGFP)가 도입된 유전자 전달체를 제조하고 이들 각각을 세포 내로 전달하였으며, 이후, 이들의 형광세기를 측정하여 유전자 전달 효율을 비교하였다. 한편, 대조군으로 siRNA를 전달하지 않은 군 (NT), Scrambled siRNA (siSCR)가 삽입된 군을 이용하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 버퍼 용액의 조성을 변화 (HEPES, PBS, HBSS, pH7.4) 시킨 경우에도, 이들간 유의적인 형광의 차이가 관찰되지 않았는바, 일정하게 유전자 전달 효율이 유지됨을 확인할 수 있었다.
실험예 3. 본 발명의 유전자 전달체에 의한 세포 내 siRNA 전달
3-1. 세포 내 siRNA 전달 효율 분석
본 실험예에서는, EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) siRNA를 제조예 1-1의 나노베지클에 삽입하여 유전자 전달체를 제조한 뒤, 이를 HeLa 세포주에 전달하였고, 이에 따른 EGFP의 발현 감소 효율을 형광 현미경 및 유세포 분석 (FACS)을 통해 정량화하였으며, MTT 실험으로 세포 독성을 평가하였다. 또한, 항존 유전자인 GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)의 siRNA를 본 발명의 나노베지클에 삽입하여 유전자 전달체를 제조한 뒤, 이를 인간 지방유래 줄기세포 (hADSC), 및 인간 태아유래 신경줄기세포 (hfNSC)에 전달하고, 이들 각각에 대한 발현 감소 및 세포 독성을 평가하였으며, GAPDH의 발현은 ACTB 유전자에 대한 상대적인 발현 비율로 측정하였다. 한편, 대조군으로 siRNA를 전달하지 않은 군 (NT), 비교군으로 현재 상용화 중인 Lipofectamine 2000 (LF 2000)과 엑소좀 (Exo)을 이용하였다. 구체적으로, 상기 LF 2000을 이용한 전달체는 (LF 2000), 20pmol의 siRNA당 1μg의 LF 2000을 혼합하고, 10분간 인큐베이션시켜 siRNA와 LF 2000이 섞여있는 유전자 전달체를 제조하였다. 또한, 엑소좀을 이용한 전달체는 (Exo), 우선, 세포를 36-48시간 동안 Exosome-free media에서 배양시키고, 상기로부터 수득한 배양액을 2회 초원심분리 (Ultracentrifugation)한 뒤, 세척 과정을 거친 엑소좀을 1:1 wt/wt ratio로 siRNA와 함께 전기천공 (Electroporation)시켜 siRNA가 엑소좀 내 봉입되어 있는 유전자 전달체를 제조하였다.
그 결과, 도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이, HeLa 세포주에서, LF 2000 및 엑소좀을 이용한 군의 발현 감소율은 각각 73.9% 및 72.9%에 불과하였던 반면, 본 발명의 유전자 전달체 (PMNV)를 이용한 경우, 81.5%로 유의적인 감소 효율 증가를 나타냈으며, 비교군과 마찬가지로 낮은 세포 독성을 보였다. 상기 결과와 마찬가지로, 도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이, hADSC 및 hfNSC 세포에서도 본 발명의 유전자 전달체를 이용함으로써, GAPDH의 발현이 보다 감소되었으며, 낮은 세포 독성을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, 본 발명의 전달 기술을 통하여 세포 독성과 같은 부작용 없이, 유전 물질을 다양한 세포에 높은 효율로 전달이 가능함을 알 수 있었다.
3-2. GNAS siRNA 전달에 따른 골세포 분화 효율 증진
본 실험예에서는, 본 발명의 유전자 전달체를 통해 골 분화 저해 단백질인 GNAS siRNA를 인간 지방유래 줄기세포 (hADSC)에 전달한 뒤, 이에 따른 GNAS mRNA의 발현 감소를 GAPADH 유전자에 대한 상대적인 발현 비율로 측정하였고, 골세포 마커인 COL1A2, 및 OPN의 발현 증가를 qRT-PCR 및 면역염색 분석을 통하여 확인하였으며, GNAS 발현 감소에 따른 칼슘 침착 여부를 Alizarin S 염색법을 이용하여 평가하였다. 한편, 대조군으로 siRNA를 전달하지 않은 군 (NT), 비교군으로 현재 상용화 중인 Lipofectamine 2000 (LF 2000)과 엑소좀을 이용하였다.
그 결과, 도 12 및 도 13에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 유전자 전달체 (PMNV)를 이용함으로써, 비교군에 비해 GNAS의 발현을 더욱 감소시킬 수 있었으며 (도 12 참조), 대조군에 비해 골 세포 마커인 COL1A2, 및 OPN의 발현이 현저하게 증가됨을 확인할 수 있었다 (도 13 참조). 또한, hADSC 세포의 칼슘 침착 정도를 평가한 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 유전자 전달체를 이용한 경우, 가장 높은 수준의 칼슘 침착이 검출됨을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, 본 발명의 기술을 적용하여 인간 지방유래 줄기세포로부터 골세포로의 분화를 촉진시킬 수 있음을 알 수 있었다.
3-3. REST siRNA 전달에 따른 신경 분화 효율 증진
본 실험예에서는, 본 발명의 유전자 전달체를 통해 신경 분화 저해 단백질인 REST (RE1-silencing transcription factor)의 siRNA를 인간 태아유래 줄기세포 (hfNSC)에 전달한 뒤, REST siRNA 전달 2일 후, REST mRNA 발현 감소를 GAPADH 유전자에 대한 상대적인 발현 비율로 측정하였고, 이와 마찬가지로 REST siRNA 전달 5일 및 9일 후, 초기 신경 마커인 Nestin, GFAP, 후기 신경 마커인 olig2, Tuj1, MAP2의 발현을 측정하였으며, REST 발현 감소에 따른 신경돌기의 길이 변화를 면역염색을 이용하여 관찰하였다. 한편, 대조군으로 siRNA를 전달하지 않은 군 (NT), 비교군으로 현재 상용화 중인 Lipofectamine 2000 (LF 2000)을 이용하였다.
그 결과, 도 15 및 도 16에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 유전자 전달체 (PMNV)를 이용함으로써, 대조군에 비해 REST 발현을 현격히 감소시켰고, LF 2000를 이용한 군과 유사한 수준의 REST 발현을 확인할 수 있었으며 (도 15 참조), Nestin, GFAP의 발현 감소 및 olig2, Tuj1, MAP2의 발현 증가를 확인함으로써, REST의 발현 억제에 의한 hfNSC 세포의 신경분화능 향상 효과를 확인할 수 있었다 (도 16 참조). 또한, hfNSC 세포의 신경돌기의 길이 변화를 측정한 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 유전자 전달체를 이용한 경우, 대조군 및 Lipofectamine 2000을 이용한 군에 비해 신경돌기의 길이가 현저하게 증가됨을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, 본 발명의 기술을 적용하여 인간 신경 줄기세포로부터 신경 세포로의 분화를 촉진시킬 수 있음을 알 수 있었다.
3-4. 인간 지방유래 줄기세포를 이용한 유전자 전달체의 siRNA 전달 효율 분석
본 실험예에서는, HEK-293 세포주 대신 인간 지방유래 줄기세포 (hADSC)를 이용하여 실시예 1-1과 동일한 방법으로 균일한 크기의 나노베지클을 제조하였다. 이후, GAPDH siRNA를 상기 나노베지클에 삽입하여 유전자 전달체를 제조한 뒤, 이를 인간 지방유래 줄기세포 (hADSC)에 전달하고, GAPDH의 발현 감소 및 세포 독성을 평가하였으며, GAPDH의 발현은 ACTB 유전자에 대한 상대적인 발현 비율로 측정하였다. 한편, 대조군으로 siRNA를 전달하지 않은 군 (NT), 비교군으로 현재 엑소좀 (Exo)을 이용한 군, HEK-293 세포주 유래 나노베지클을 이용한 군 (HEK293-derived)을 이용하였다.
그 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이, 인간 지방유래 줄기세포를 이용한 경우에도, HEK-293 세포주의 경우와 마찬가지로, 엑소좀을 이용한 군에 비해 GAPDH의 발현을 보다 감소시킬 수 있었으며, 낮은 세포 독성을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, 본 발명의 유전자 전달체는 HEK-293 세포주뿐만 아니라 다양한 세포를 이용하여 제조될 수 있음을 알 수 있었다.
실험예 4. 타겟 리간드의 도입에 따른 전달 효율 증진
본 발명자들은, 인간 만능유도줄기세포 (hiPSC)나 인간 배아줄기세포 (hESC)와 같은 전분화능 줄기세포의 경우, E-cadherin이 높은 수준으로 발현되어 있으며, E-cadherin-E-cadherin 상호작용은 상기 세포 내로의 유입을 보다 증진시킬 수 있을 것이라는 전제 하, HEK-293 세포에 E-cadherin을 과발현시킨 후, 상기 제조예 1-1과 동일한 방법으로 타겟 리간드인 E-cadherin이 표면에 발현된 유전자 전달체를 제조하였다.
우선, 본 발명의 유전자 전달체 (PMNC-Ecad)에서, E-cadherin의 발현여부를 western blot을 통해 확인하였고, Cy5 형광으로 표지된 siRNA를 상기 유전자 전달체를 통해 hiPSC 내로 전달한 후, 이들의 세포 내 형광 강도를 측정하였다. 또한, hiPSC 및 hADSC 세포에서, GAPDH siRNA의 전달에 따른 GAPDH 발현 감소를 ACTB 유전자에 대한 상대적인 발현 비율로 측정하였으며, 상기 유전자 전달체 (PMNC-Ecad)가 세포 내로 이입되는 메카니즘을 규명하고자, Dil dye로 염색된 유전자 전달체를 K+ depletion 또는 CHC (clathrin heavy chain) siRNA 처리에 의해 clathrin-mediated endocytosis가 억제된 세포, EIPA (ethyl isopropyl amiloride), LY294002 화합물 처리에 의해 macropinocytosis가 억제된 세포 각각에 처리한 뒤, 세포 내 유입여부를 평가하였다. 한편, 대조군으로 siRNA를 전달하지 않은 군 (NT), 비교군으로 E-cadherin이 발현되지 않은 나노베지클 (PMNV) 또는 Lipofectamine 2000 (LF 2000)을 이용하였다.
그 결과, 도 19에 나타낸 바와 같이, E-cadherin이 과발현된 HEK-293 세포를 이용하여 유전자 전달체의 표면에 타겟 리간드인 E-cadherin을 손쉽게 도입할 수 있음을 알 수 있었으며 (도 19a 참조), 이를 통해 다량의 siRNA를 hiPSC 세포 안으로 전달할 수 있음을 확인할 수 있었다 (도 19b 참조). 또한 hiPSC 및 hADSC 세포로 GAPDH siRNA를 전달한 후, GAPDH 발현 감소를 정량적으로 평가한 결과, 도 20에 나타낸 바와 같이, 두 세포 모두에서 본 발명의 유전자 전달체를 이용한 경우, 대조군, 및 PMNV, 또는 LF 2000을 이용한 군에 비해 GAPDH 발현 감소율이 현저하게 증가됨을 확인할 수 있었다. 아울러, 도 21 내지 도 23에 나타낸 바와 같이, 특정 기전이 차단된 세 종류 세포 모두에서 나노베지클의 유입이 현저하게 감소됨을 확인하였는바, 이를 통하여 본 발명의 유전자 전달체가 세포 내로 유입되는 과정에서, clathrin-mediated endocytosis 및 macropinocytosis가 주요한 기전으로 작용함을 알 수 있었다.
실험예 5. In vivo에서의 siRNA 전달 효율 분석
고콜레스테롤혈증 (Hypercholesterolemia)은 아테롬성 동맥 경화증 (Atherosclerosis) 및 관상심장질환 (Coronary Heart Disease, CHD) 등 주요 심장 혈관 질환을 유발시키며, 간 조직에 다량 존재하는 APOB의 높은 발현이 주요한 발병 원인이다. 본 실험예에서는, 마우스 동물모델에 APOB siRNA가 삽입된 본 발명의 유전자 전달체를 투여하고 이에 따른 생체 변화를 관찰하였다.
5-1. 유전자 전달체의 실시간 이미징 및 분포
본 발명의 유전자 전달체를 이용하여 마우스 동물모델에 형광물질이 표지된 APOB siRNA를 마우스의 미정맥을 통해 투여한 후, 시간의 경과 (15분, 150분)에 따른 live 이미징 및 전신의 형광세기를 측정하였으며, 상기 마우스로부터 주요 장기 (심장, 폐, 간, 신장, 비장)를 적출하여 장기별 siRNA의 분포를 평가하였다. 한편, 대조군으로 siRNA를 전달하지 않은 군 (NT)을 이용하였다.
그 결과, 도 24에 나타낸 바와 같이, 유전자 전달체 투여로부터 15분이 경과한 때, 전신으로 넓게 분포하는 경향을 보인 반면, 150분이 경과한 때에는 대부분이 간에 축적되어 있었고 (도 24a 참조), 시간이 경과함에도 불구하고 높은 수준의 형광 강도가 유지됨을 확인할 수 있었다 (도 24b 참조). 또한, 적출한 장기 내 존재하는 siRNA량을 측정한 결과, 간과 신장에서 높은 강도의 형광이 측정되었다 (도 24c 및 도 24d 참조).
5-2. 유전자 전달체에 의한 발현 감소
상기 실험예 4-1과 동일한 방법으로, 본 발명의 유전자 전달체를 이용하여 APOB siRNA를 마우스 동물모델 내로 투여한 후, 상기 투여에 의한 간 조직 내 APOB의 발현 감소를 GAPDH 유전자에 대한 상대적인 발현 비율로 측정하였다. 대조군으로는 PBS 버퍼를 주입한 군 (PBS), 비교군으로는 Scrambled siRNA (siSCR)가 삽입된 군을 이용하였다.
그 결과, 도 25에 나타낸 바와 같이, 대조군 및 Scrambled siRNA가 삽입된 군은 간 조직 내 APOB의 발현 변화가 관찰되지 않은 반면, 본 발명의 유전자 전달체 (PMNV)를 이용한 경우, APOB의 발현이 현저하게 감소됨을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 본 발명의 유전자 전달체는 생체 내에서도 유효하게 그 기능이 발휘됨을 알 수 있었다.
5-3. 유전자 전달체의 체내 독성 평가
마우스 유래 피부 세포로부터 추출한 나노베지클에 Scrambled siRNA를 삽입한 유전자 전달체를 마우스에 투여하고, 시간의 경과 (투여 12시간 전, 투여 12시간, 또는 24시간 후)에 따른 AST (Aspartate aminotransferase) 및 ALT (Alanine transaminase)의 혈중 농도 변화를 측정함으로써, 체내 독성 유발 여부를 평가하였다. 대조군으로는 PBS 버퍼를 주입한 군 (PBS)을 이용하였다.
그 결과, 도 26에 나타낸 바와 같이, 유전자 전달체 (PMNV/siRNA)의 투여 전후로 AST 및 ALT의 유의적인 농도변화가 관찰되지 않았을 뿐만 아니라, 대조군과도 큰 차이를 보이지 않았는바, 본 발명의 유전자 전달체 자체의 체내 독성이 관찰되지 않았다.
실험예 6. 본 발명의 유전자 전달체에 의한 세포 내 DNA 전달
본 실험예에서는, EGFP 플라스미드를 상기 제조예 1-2에서 제조된 나노베지클에 삽입한 뒤, 이를 HeLa 세포주 및 hADSC 세포에 전달하였으며, 이에 따른 EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein)의 발현 증가를 형광 현미경을 통해 관찰하였다. HeLa 세포주에 대한 대조군으로, Lipofectamine 2000 (LF 2000-EGFP) 및 Luciferase가 삽입된 군 (PMNV-Luc)을, hADSC 세포에 대한 대조군으로, 형질전환되지 않은 군 (NT) 및 Luciferase가 삽입된 군 (PMNV-Luc)을 이용하였다.
그 결과, 도 27에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 유전자 전달체를 이용한 경우, HeLa 세포주 및 hADSC 세포 모두에서 EGFP의 발현이 증가됨을 확인하였으며, 상기 결과로부터 본 발명의 유전자 전달체는 DNA의 전달에도 적용 가능함을 알 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (11)

  1. (a) PFA (Paraformaldehyde) 및 DTT (Dithiothreitol)가 첨가된 버퍼 용액에 배양된, 세포로부터 분출된 베지클을 함유하는 현탁액을 압출하여 나노베지클을 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 제조된 나노베지클 내로 뉴클레오티드를 삽입하는 단계를 포함하며,
    상기 뉴클레오티드는 mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, 및 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는, 줄기세포 분화 촉진용 유전자 전달체의 제조방법.
  2. (a) PFA (Paraformaldehyde) 및 DTT (Dithiothreitol)가 첨가된 버퍼 용액에 배양된, 세포로부터 분출된 베지클을 함유하는 현탁액을 원심분리하여 마이크로베지클을 제조하는 단계;
    (b) 상기 마이크로베지클에 계면활성제 및 뉴클레오티드를 처리하여 마이크로베지클 내로 뉴클레오티드를 삽입하는 단계; 및
    (c) 상기 뉴클레오티드가 삽입된 마이크로베지클을 함유하는 현탁액을 압출하여 나노베지클을 제조하는 단계를 포함하며,
    상기 뉴클레오티드는 gDNA, pDNA, 및 cDNA로 이루어진 군으로부터 선택되는, 줄기세포 분화 촉진용 유전자 전달체의 제조방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 (a) 단계 이전에, 타겟팅 리간드 (targeting ligand)를 세포에 과발현시키는 단계를 포함하는, 줄기세포 분화 촉진용 유전자 전달체의 제조방법.
  4. 삭제
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 세포는 인간 배아 신장-293 (Human embryonic kidney-293, HEK-293) 세포, 인간 지방유래 줄기세포, 골수 줄기세포, 피부 세포, 및 혈액 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 분화 촉진용 유전자 전달체의 제조방법.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 계면활성제는 트리톤 X-100 (Triton X-100)인 것을 특징으로 하는, 줄기세포 분화 촉진용 유전자 전달체의 제조방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110037996B (zh) * 2019-04-30 2022-01-18 郑州大学 内源性高表达miRNA的大肠杆菌内膜囊泡的制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用
CN110585168A (zh) * 2019-09-12 2019-12-20 南昌大学 一种利用细胞表面囊泡作为药物载体的用途
CN113304111B (zh) * 2021-05-14 2022-05-31 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种将脂肪组织制备成纳米囊泡的方法及该纳米囊泡的应用
CN113786390A (zh) * 2021-08-20 2021-12-14 广州医科大学 负载siRNA的仿生化ZIF-8纳米传递系统，及其制备方法和应用
WO2024014907A1 (ko) * 2022-07-13 2024-01-18 주식회사 엠디뮨 앵커단백질로 엔지니어링된 세포 유래 베지클 및 이의 용도
CN115948475A (zh) * 2022-11-25 2023-04-11 中国科学院深圳先进技术研究院 一种用于rna递送的转染复合物及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Lamichhane, TN. et al., Molecular Pharmaceutics, 16 September 2015, vol.12, no.10, pp.3650-3657
Yoon, J. et al., Biomaterials, 15 May 2015, vol.59, pp.12-20

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200050294A (ko) 2018-11-01 2020-05-11 경북대학교 산학협력단 적혈구 유래 엑소좀 유사체를 포함하는 물질 전달용 조성물 및 그의 용도
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