KR20200050294A - 적혈구 유래 엑소좀 유사체를 포함하는 물질 전달용 조성물 및 그의 용도 - Google Patents
적혈구 유래 엑소좀 유사체를 포함하는 물질 전달용 조성물 및 그의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 적혈구 유래 엑소좀 유사체를 포함하는 물질 전달용 조성물 및 그의 용도에 관한 것으로서, 본 발명의 일 구체예에 따른 물질 전달용 조성물은 약물, 방사성 물질 또는 형광 물질을 탑재할 수 있는 적혈구 유래 엑소좀 유사체를 포함하므로 약물 전달 용도, 세포 표지 용도 또는 조영제 등으로 유용하게 활용될 수 있고 본 발명의 일 구체예에 따른 물질 전달용 조성물을 사용하면 치료와 진단을 동시에 수행할 수 있다.
Description
본 발명은 적혈구 유래 엑소좀 유사체를 포함하는 물질 전달용 조성물 및 그의 용도에 관한 것으로서, 구체적으로 본 발명의 일 구체예에 따른 물질 전달용 조성물은 약물, 방사성 물질 및 형광 물질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 탑재할 수 있는 적혈구 유래 엑소좀 유사체에 관한 것이다.
엑소좀은 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭(대략 30-100 nm의 직경)으로서, 다낭체(multivesicular bodies, MVBs)라고 불리는 세포 내 특정 구획에서 기원하며 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나 세포 밖으로 방출, 분비되며 지질, 단백질, mRNA, miRNA 및 DNA의 구성을 풍부하게 포함한다. 이러한 엑소좀은 특정 조직을 표적할 수 있고 크기가 작아 세포막을 투과할 수 있어 최근에는 엑소좀을 약물 전달체로 이용하여 여러 질병의 치료에 사용하는 연구가 진행되고 있으나, 엑소좀의 대량 생산 및 정제를 위해 많은 시간과 비용이 필요하다는 단점이 있다. 그러나 엑소좀 유사체(exosome mimetics; EM)는 엑소좀의 장점을 그대로 가지고 있으면서도 엑소좀 보다 용이하게 대량 생산이 가능하여 새로운 약물 전달체로서 각광받고 있다.
원하는 치료 효과를 달성하고 부작용없이 질병을 통제하기 위해서는 신체의 특정 조직을 표적화하는 안전한 약물 전달 시스템을 이용하는 것이 중요하다. 다양한 세포에서 생산된 엑소좀은 생체 내에서 완전히 다른 분포를 가질 수 있으므로 생체 내 에서 엑소좀의 시각화 및 추적은 특정 기관이나 질병을 대상으로하는 약물 전달체로서의 개발에 중요하다.
한편, 인류의 평균수명이 연장되고 건강한 삶에 대한 관심이 증가함에 따라 환자와 환자 가족의 삶의 질을 향상시킬 수 있는 핵심 의료기술의 하나로써 진단과 치료를 동시에 수행하는 신개념 치료기술인 테라노시스(Theranosis= Therapy+Diagnosis)가 각광받고 있다. 질병의 진단과 치료를 동시에 가능하게 하는 테라노시스 기술은 질병의 치료 효과를 실시간으로 추적함으로써 치료제의 선정 및 치료제 투여 종료시점의 결정 등 양질의 질병치료 기회를 제공한다. 이러한 기술이 빠른 시일 내에 실용화되기 위해서는 생체적합성 나노재료의 개발, 보다 효율적이고 안전한 표적지향화 기술의 확보 및 효율적인 약물전달 시스템의 연구와 고감도의 진단 영상장비 개발 등 다양한 분야에서의 융합 연구가 필요하다.
이에 본 출원의 발명자들은 다양한 물질을 탑재할 수 있는 적혈구 유래 엑소좀 유사체를 제조하여 이를 이용하면 약물 전달체로 사용할 수 있음과 동시에 세포를 표지 용도 및 영상화 용도로서 용이하게 활용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 목적 물질이 탑재된 적혈구 유래 엑소좀 유사체를 포함하는 물질 전달용 조성물 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 물질 전달용 조성물을 포함하는 조영제를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 목적 물질이 탑재된 적혈구 유래 엑소좀 유사체를 포함하는 물질 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "적혈구 유래 엑소좀 유사체"는 적혈구를 필터로 압출시켜 인위적으로 제조된 베지클로서, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나 세포 밖으로 자연적으로 분비되는 엑소좀과 구별된다. 본 발명의 일 구체예에 따르면 "적혈구 유래 엑소좀 유사체"는 자연적으로 분비되는 엑소좀과 크기 및 형태학적 특성이 유사하면서도 대량생산이 가능하다.
본 발명에서 "탑재"란 예를 들면, 목적 물질이 적혈구 유래 엑소좀 유사체의 내부에 포함되어 있거나 적혈구 유래 엑소좀 유사체의 멤브레인과 결합된 것을 의미하나 적혈구 유래 엑소좀 유사체와 함께 이동될 수 있는 형태라면 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에 따른 물질 전달용 조성물은 대량 생산이 가능하고, 크기가 작아 조직 침투에 용이하며 면역 시스템에 의해 분해될 가능성 및 세포 독성이 낮은 적혈구 유래 엑소좀 유사체를 포함함으로써 물질 전달용 조성물로서 활용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 적혈구 유래 엑소좀 유사체는 30nm 내지 400nm의 직경을 갖는 것일 수 있다. 더욱 구체적으로, 적혈구 유래 엑소좀 유사체는 40nm 내지 380nm, 50nm 내지 370nm, 55nm 내지 360nm, 60nm 내지 350nm, 65nm 내지 340nm, 70nm 내지 330nm, 75nm 내지 320nm, 80nm 내지 310nm, 90 nm 내지 300nm, 또는 95nm 내지 300nm의 직경을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 적혈구 유래 엑소좀 유사체는 100nm 내지 300nm의 직경을 갖는 것일 수 있다.
본 발명에서 "목적 물질"은 적혈구 유래 엑소좀 유사체에 탑재되어 목적하는 곳으로 이동되거나 목적하는 곳에 잔류할 수 있는 물질을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 목적 물질은 약물, 방사성 물질 및 형광 물질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명에서 "약물"이란, 상기 적혈구 유래 엑소좀 유사체에 탑재되어 세포 또는 조직으로 전달될 수 있어, 질병에 대한 치료학적 효과를 갖는 물질을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 약물은 질환의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 화합물, 펩타이드, 단백질 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 핵산은 RNA, DNA, siRNA(short interfering RNA), 앱타머, 안티센스 ODN(antisense oligodeoxynucleotide), 안티센스 RNA(antisense RNA), 리보자임(ribozyme), 디엔에이자임(DNAzyme) 및 microRNA으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 방사성 물질은 진단용 방사성 핵종 또는 치료용 방사성 핵종인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 진단용 방사성 핵종은 질병의 진단을 위해 사용되는 것으로서 99mTc, 131I, 123I, 및 111In로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 진단용 방사성 핵종은 99mTc(technetium-99m)일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 99mTc(technetium-99m)은 적혈구 유래 엑소좀 유사체 내부의 헤모글로빈과 결합된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 치료용 방사성 핵종은 베타선 방출 방사성 핵종을 비롯하여 인체에 치료 목적으로 사용될 수 있는 핵종이면 모두 가능하다. 방사선 방출 핵종에는 순수한 베타선 방출 핵종 이외에 감마선 방출 핵종, 베타선과 감마선을 동시에 방출하는 핵종이 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 치료용 방사성 핵종은 131I, 186Re, 188Re, 153Sm 및 32P로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 형광 물질은 형광 단백질(fluorescent protein), 발광 단백질(photoprotein), 루시퍼라제(luciferase) 및 형광염료(fluorescent dye)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 형광 물질은 포르피린(porphyrin) 또는 DiD(1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine Perchlorate)일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 물질 전달용 조성물은 간 질환의 치료를 위해 사용되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 물질 전달용 조성물을 정맥에 주입하였을 때 빠르게 간 세포에 집중적으로 누적될 수 있으므로, 상기 물질 전달용 조성물은 간 질환의 치료를 위해 사용될 수 있다.
본 발명에서 간 질환은 비알콜성 지방간, 알코올성 지방간, 비알콜성 간염 및 알코올성 간염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 간섬유화(Liver fibrosis) 또는 간 경화(Liver cirrhosis)일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 물질 전달용 조성물은 관절염의 치료를 위해 사용되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 물질 전달용 조성물을 관절강 내에 주입하였을 때 다른 장기로 이동하지 않고 관절강 내에서 잔류할 수 있다. 종래의 관절염 치료방법으로서 단순히 약물 용액을 관절강 내 투여할 경우 약물이 빠르게 관절 활액으로부터 혈액으로 유출되어 약물의 효과가 오래 지속되지 않으나, 본 발명의 일 구체예에 따른 물질 전달용 조성물은 관절강 내에 3일, 6일, 8일, 10일 또는 15일 이상 잔류할 수 있어 관절염 치료를 위해 용이하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 "관절염(arthritis)"은 여러 가지 원인에 의해 관절에 염증이 생긴 질환으로서 예를 들면 관절염은 골관절염, 류마티스 관절염, 퇴행성 관절염, 통풍성 관절염, 감염성 관절염 또는 루푸스(Lupus) 관절염일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 물질 전달용 조성물은 종양 치료를 위해 사용되는 것일 수 있다.
본 출원의 발명자들은 본 발명의 일 구체예에 따른 물질 전달용 조성물을 종양에 주입하였을 때 다른 장기로 이동하지 않고 종양에 잔류하는 것을 확인하였으며, 예를 들면 3일, 6일, 8일, 10일, 12일 또는 15일 이상 종양 내에 잔류하므로 본 발명의 일 구체예에 따른 물질 전달용 조성물은 종양, 바람직하게는 악성 종양인 암 치료를 위해 용이하게 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 물질 전달용 조성물은 세포를 표지하기 위해 사용되는 것일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따른 물질 전달용 조성물은 방사성 물질 및/또는 형광 물질을 탑재한 적혈구 유래 엑소좀 유사체를 포함하고 있고 적혈구 유래 엑소좀 유사체는 세포에 의해 흡수될 수 있어 물질 전달용 조성물을 매개로 하여 세포를 방사성 물질 및/또는 형광 물질로 표지할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 물질 전달용 조성물에 의해 표지될 수 있는 세포는 백혈구 또는 암세포일 수 있다.
본 발명의 물질 전달용 조성물은 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화할 수 있다.
본 발명의 물질 전달용 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들면 정맥 내, 피하, 복강내 또는 국소 적용)할 수 있으나 이에 제한되지 않는다
본 발명의 일 구체예에 따르면, 물질 전달용 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 담체, 부형제 및 희석제는 예를 들면, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 또는 광물유일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 본 발명에서 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 일 구체예에 따르면, 물질 전달용 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 약 0.0001㎎/㎏ 내지 약 100㎎/㎏, 또는 약 0.001㎎/㎏ 내지 약 200㎎/㎏의 양을 일일 1회 내지 24회, 2일 내지 1주에 1 내지 7회, 또는 1개월 내지 12개월에 1 내지 24회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 질환의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 상기 조성물에서 목적 물질이 탑재된 적혈구 유래 엑소좀 유사체는 전체 조성물 총 중량에 대하여 약 0.0001 중량% 내지 약 10 중량%, 또는 약 0.001 중량% 내지 약 1 중량%로 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 양상은,
(a) 적혈구로부터 적혈구 유래 엑소좀 유사체를 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 수득된 적혈구 유래 엑소좀 유사체와 목적 물질을 혼합한 혼합물을 인큐베이션하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 인큐베이션한 혼합물을 초원심분리하여 펠렛을 수득하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계에서 수득된 펠렛을 세척하고 밀도 구배를 이용하여 목적 물질을 탑재한 적혈구 유래 엑소좀 유사체를 분리하는 단계를 포함하는 물질 전달용 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, (a) 단계에서 적혈구 유래 엑소좀 유사체를 수득하는 것은 필터에 의해 여과되어 수행될 수 있고, 필터에 1회 내지 4회 여과되어 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 초원심분리는 100,000g 이상, 구체적으로 100,000g 내지 200,000g, 또는 100,000g 내지 150,000g, 또는 150,000g 내지 200,000g에서 수행하는 것일 수 있다.
(c) 단계에서 밀도 구배는 밀도가 다른 물질을 구분할 때 가장 많이 사용되는 방법으로서 본 발명의 일 구체예에 따르면 밀도 구배는 피콜(ficoll), 글리세롤(glycerol), 수크로즈(sucrose), 염화세슘(cesium chloride) 또는 이오딕사놀(iodixanol) 등의 밀도 기울기 분리 재료를 이용하여 실시할 수 있고, 밀도 구배는 초원심분리 등과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 목적 물질은 약물, 방사성 물질 및 형광 물질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인 물질 전달용 조성물을 제조하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 (d) 단계 이후에,
(e) 상기 (d) 단계에서 분리된 적혈구 유래 엑소좀 유사체 및 염화 주석(Ⅱ)(Tin(Ⅱ)chloride)을 혼합한 혼합물을 인큐베이션하는 단계; 및
(f) 상기 (e) 단계에서 인큐베이션된 혼합물에 99mTc(technetium-99m)를 첨가하여 인큐베이션하는 단계를 더 포함하는 물질 전달용 조성물을 제조하는 방법을 제공할 수 있다.
상기 (d) 단계에서 99mTc는 염화 주석(II)에 의해 적혈구 내의 헤모글로빈에 단단히 결합되는 낮은 산화 상태로 환원될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 (e) 단계 후에 초원심분리를 수행하여 유리 99mTc을 제거하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 물질 전달용 조성물을 제조하는 방법에 의하면 적혈구 유래 엑소좀 유사체에 99mTc가 탑재되어 적혈구 유래 엑소좀 유사체가 99mTc로 표지되는 비율을 의미하는 방사 화학적 순도는 80%, 85%, 90%, 95% 이상 또는 100%일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 물질 전달용 조성물이 포함하는 99mTc가 탑재된 적혈구 유래 엑소좀 유사체는 99mTc가 탑재되지 않은 적혈구 유래 엑소좀 유사체와 크기 및 형태가 동일 또는 유사하다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 물질 전달용 조성물을 포함하는 조영제를 제공한다.
본 발명에서 "조영제(Contrast Medium)"는 위, 장관, 혈관, 뇌척수강, 관절강 등에 주입되어 방사선 검사시에 조직이나 혈관을 구분하기 용이하도록 해주는 기능성 약품을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 조영제는 약물, 방사성 물질 및 형광 물질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 탑재한 적혈구 유래 엑소좀 유사체를 포함하므로 영상제로 사용됨과 동시에 치료 효과도 가질 수 있어 치료영상제로서 사용될 수 있다. 본 발명에서 "치료 영상제"란 치료 약제에 영상 기능을 부여하여 질환의 치료와 영상 촬영을 동시에 할 수 있는 시각화가 가능한 치료용 탐사물질(imageable therapeutic probe)을 의미하고 치료(therapy)와 진단(diagnosis)이 한번에 가능한 치료진단제(theragnosis)를 의미한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 조영제는 상기 물질 전달용 조성물을 이용하여 표지한 세포를 포함할 수 있고, 상기 세포는 백혈구로서 조영제를 이용하여 염증 추적에 용이하게 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 조영제는 핵의학 영상 촬영에 적용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 핵의학 영상 촬영은 양전자 방출 단층 촬영(positron emission tomography; PET) 또는 단광자 방출 컴퓨터 단층 촬영(single-photon emission computed tomography; SPECT) 또는 감마 카메라 촬영일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 조영제는 비경구 방식으로 투여될 수 있다. 비경구 투여를 하는 경우, 정맥내 주입, 근육내 주입, 관절내(intra-articular) 주입, 활액내(intra-synovial) 주입, 수망강내 주입, 간내(intrahepatic) 주입, 병변내(intralesional) 주입 또는 두개강내(intracranial) 주입 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 조영제의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 조영제는 조직을 영상화하여 그로부터 질병을 진단하는 데 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 99mTc으로 백혈구를 표지할 수 있어 99mTc로 표지된 백혈구를 포함하는 조영제 조성물은 염증 추적에 용이하게 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 물질 전달용 조성물은 약물, 방사성 물질 및 형광 물질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 탑재할 수 있는 적혈구 유래 엑소좀 유사체를 포함하므로, 약물 전달체, 세포 표지법, 조영제 등으로 유용하게 활용될 수 있고, 본 발명의 일 구체예에 따른 물질 전달용 조성물을 사용하여 치료와 진단을 동시에 수행할 수 있다.
또한 본 발명의 일 구체예에 따른 물질 조성물이 포함하는 적혈구 유래 엑소좀 유사체는 생체 내에서 간에 축적되고, 관절강 또는 종양에 주입시 관절강 내 또는 종양 내에 잔류하므로, 본 발명의 일 구체예에 따른 물질 조성물은 간 질환, 관절염, 종양의 치료를 위해 사용될 수 있다.
도 1은 동일한 수의 적혈구로부터 제조된 적혈구 유래 엑소좀(Exosome; RBC-Exo) 및 적혈구 유래 엑소좀 유사체(Exosome-mimetics; RBC-EM)의 시각적인 이미지를 나타낸다.
도 2의 A는 동일한 수의 적혈구로부터 제조된 RBC-Exo 및 RBC-EM의 농도(제조된 개수/㎖)를 나타내고, B는 동일한 수의 적혈구로부터 제조된 RBC-Exo와 RBC-EM의 총 단백질 함량을 나타낸다.
도 3은 RBC-EM을 99mTc로 표지하는 과정을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 4는 시간에 따른 99mTc으로 표지된 적혈구 유래 엑소좀 유사체(99mTc-RBC-EM)의 방사 화학적 순도를 나타낸다.
도 5는 시간에 따른 99mTc-RBC-EM의 안정성을 나타낸다.
도 6의 A는 RBC-Exo, RBC-EM 및 99mTc-RBC-EM의 크기 분포를 나타내고 B는 RBC-Exo, RBC-EM 및 99mTc-RBC-EM의 평균 크기를 나타낸다.
도 7은 전계방사형 투과 전자 현미경(FE-TEM)으로 RBC-EM 및 99mTc-RBC-EM을 관찰한 이미지를 나타낸다.
도 8는 고각 산란 환상 암시야 주사 투과 전자 현미경(HAADF-STEM)에 의해 RBC-EM 및 99mTc-RBC-EM를 관찰한 이미지를 나타낸다.
도 9의 A는 유리 99mTc 및 99mTc-RBC-EM에 대한 생체 내 감마 카메라 이미지를 나타내고 B는 측정된 방사선의 정량값을 나타낸다.
도 10은 유리 99mTc 및 99mTc-RBC-EM을 정맥 주사를 통해 마우스에게 투여한 후 99mTc 및 99mTc-RBC-EM의 생체 분포를 측정한 결과를 나타낸다. 도 10에서 상부의 그래프는 상이한 기관에서 측정된 방사선량을 나타내고, 구체적으로 하부의 왼쪽 패널과 오른쪽 패널로 구분하여 측정된 방사선량을 상세하게 나타낸다.
도 11a 및 도 11b는 RBC-EMDiD에 대해 형광 이미징을 수행한 결과를 나타낸다. 구체적으로 도 11a는 생체 내에서 RBC-EMDiD에 대한 형광 이미지를 나타낸다. 도 11b는 마우스로부터 수집된 간 및 비장에서 RBC-EMDiD에 대한 형광 이미지(좌측 이미지) 및 이를 정량한 결과(우측 그래프)를 나타낸다.
도 12a 및 도 12b는 간 조직의 섹션(section)에서 RBC-EMDiD에 대하여 면역형광 분석을 수행한 결과를 나타낸다. 구체적으로 도 12a는 간 조직의 섹션(section)에서 RBC-EMDiD에 대한 면역형광 분석 이미지를 나타내고 도 12b는 CD68+(좌측 그래프) 및 DiD(우측 그래프)에 대한 면역형광 분석에서 관찰된 형광 수치를 나타낸다.
도 13은 덱사메타손 및 커큐민이 적혈구 유래 엑소좀 유사체(RBC-EM)에 성공적으로 탑재된 결과를 나타낸다.
도 14의 A는 배양 시간 및 99mTc-RBC-EM의 용량(dose)에 따라 8505C 세포에서 측정된 방사선 양을 나타낸다. 도 14의 B는 배양된 시간에 따른 동일한 용량(4μCi)의 99mTc-RBC-EM 및 유리 99mTc가 세포에 흡수된 양을 나타낸다.
도 15는 급성 염증 마우스에 대한 18F-FDG PET/CT 이미지를 나타낸다.
도 16a 내지 도 16d는 급성 염증 마우스 모델에서 99mTc로 표지된 백혈구가 염증 추적에 효과적으로 사용될 수 있음을 보여준다. 구체적으로 도 16a는 꼬리 정맥을 통해 99mTc-WBC를 주입한 급성 염증 마우스 모델에서 감마 카메라 이미지를 나타낸다. 도 16b는 99mTc-WBC를 주입한 급성 염증 마우스 모델의 왼발과 오른발에서 측정한 방사성 양을 나타낸다. 도 16c는 99mTc-WBC의 생체 분포를 나타낸다. 도 16d는 왼발과 오른발의 99mTc-WBC 섭취량를 나타낸다.
도 17a 및 도 17b는 99mTc-DiD-RBC-EM를 류마티스 관절염 동물 모델의 관절강 내에 주입후 감마 카메라 이미징을 수행한 결과를 나타낸다. 구체적으로 도 17a는 류마티스 관절염 마우스에 대한 감마 카메라 이미지를 나타내고 도 17b는 측정된 방사선양을 정량적으로 나타낸다. 도 17b의 왼쪽 그래프는 관절염 병변에 주사한 부분에서 측정한 방사선량(Count/Background)의 절대치이며, 우측 그래프는 같은 자료에서 방사선 붕괴 보정(decay correction) 후 주사한 병변에 남아있는 방사선량(retention rate)을 나타낸다.
도 18a 및 도 18b는 99mTc-DiD-RBC-EM를 류마티스 관절염 동물 모델의 관절강 내에 주입후 형광 이미징을 수행한 결과로서, 구체적으로 도 18a는 시간에 따른 형광 이미지를 나타내고, 도 18b는 측정된 형광 물질의 양을 정량적으로 나타낸다.
도 19는 RBC-EM-porphyrin을 종양에 주입시 시간에 따른 형광 이미지를 나타낸다.
도 20은 RBC-EM-porphyrin을 피하 및 종양에 주입시 피하(A) 및 종양(B)에서 측정된 포르피린(porphyrin)의 양을 나타낸다.
도 21은 다양한 기관에 대한 생체 외(ex-vivo) 형광 이미지 및 측정된 포르피린의 정량적인 값을 나타낸다.
도 2의 A는 동일한 수의 적혈구로부터 제조된 RBC-Exo 및 RBC-EM의 농도(제조된 개수/㎖)를 나타내고, B는 동일한 수의 적혈구로부터 제조된 RBC-Exo와 RBC-EM의 총 단백질 함량을 나타낸다.
도 3은 RBC-EM을 99mTc로 표지하는 과정을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 4는 시간에 따른 99mTc으로 표지된 적혈구 유래 엑소좀 유사체(99mTc-RBC-EM)의 방사 화학적 순도를 나타낸다.
도 5는 시간에 따른 99mTc-RBC-EM의 안정성을 나타낸다.
도 6의 A는 RBC-Exo, RBC-EM 및 99mTc-RBC-EM의 크기 분포를 나타내고 B는 RBC-Exo, RBC-EM 및 99mTc-RBC-EM의 평균 크기를 나타낸다.
도 7은 전계방사형 투과 전자 현미경(FE-TEM)으로 RBC-EM 및 99mTc-RBC-EM을 관찰한 이미지를 나타낸다.
도 8는 고각 산란 환상 암시야 주사 투과 전자 현미경(HAADF-STEM)에 의해 RBC-EM 및 99mTc-RBC-EM를 관찰한 이미지를 나타낸다.
도 9의 A는 유리 99mTc 및 99mTc-RBC-EM에 대한 생체 내 감마 카메라 이미지를 나타내고 B는 측정된 방사선의 정량값을 나타낸다.
도 10은 유리 99mTc 및 99mTc-RBC-EM을 정맥 주사를 통해 마우스에게 투여한 후 99mTc 및 99mTc-RBC-EM의 생체 분포를 측정한 결과를 나타낸다. 도 10에서 상부의 그래프는 상이한 기관에서 측정된 방사선량을 나타내고, 구체적으로 하부의 왼쪽 패널과 오른쪽 패널로 구분하여 측정된 방사선량을 상세하게 나타낸다.
도 11a 및 도 11b는 RBC-EMDiD에 대해 형광 이미징을 수행한 결과를 나타낸다. 구체적으로 도 11a는 생체 내에서 RBC-EMDiD에 대한 형광 이미지를 나타낸다. 도 11b는 마우스로부터 수집된 간 및 비장에서 RBC-EMDiD에 대한 형광 이미지(좌측 이미지) 및 이를 정량한 결과(우측 그래프)를 나타낸다.
도 12a 및 도 12b는 간 조직의 섹션(section)에서 RBC-EMDiD에 대하여 면역형광 분석을 수행한 결과를 나타낸다. 구체적으로 도 12a는 간 조직의 섹션(section)에서 RBC-EMDiD에 대한 면역형광 분석 이미지를 나타내고 도 12b는 CD68+(좌측 그래프) 및 DiD(우측 그래프)에 대한 면역형광 분석에서 관찰된 형광 수치를 나타낸다.
도 13은 덱사메타손 및 커큐민이 적혈구 유래 엑소좀 유사체(RBC-EM)에 성공적으로 탑재된 결과를 나타낸다.
도 14의 A는 배양 시간 및 99mTc-RBC-EM의 용량(dose)에 따라 8505C 세포에서 측정된 방사선 양을 나타낸다. 도 14의 B는 배양된 시간에 따른 동일한 용량(4μCi)의 99mTc-RBC-EM 및 유리 99mTc가 세포에 흡수된 양을 나타낸다.
도 15는 급성 염증 마우스에 대한 18F-FDG PET/CT 이미지를 나타낸다.
도 16a 내지 도 16d는 급성 염증 마우스 모델에서 99mTc로 표지된 백혈구가 염증 추적에 효과적으로 사용될 수 있음을 보여준다. 구체적으로 도 16a는 꼬리 정맥을 통해 99mTc-WBC를 주입한 급성 염증 마우스 모델에서 감마 카메라 이미지를 나타낸다. 도 16b는 99mTc-WBC를 주입한 급성 염증 마우스 모델의 왼발과 오른발에서 측정한 방사성 양을 나타낸다. 도 16c는 99mTc-WBC의 생체 분포를 나타낸다. 도 16d는 왼발과 오른발의 99mTc-WBC 섭취량를 나타낸다.
도 17a 및 도 17b는 99mTc-DiD-RBC-EM를 류마티스 관절염 동물 모델의 관절강 내에 주입후 감마 카메라 이미징을 수행한 결과를 나타낸다. 구체적으로 도 17a는 류마티스 관절염 마우스에 대한 감마 카메라 이미지를 나타내고 도 17b는 측정된 방사선양을 정량적으로 나타낸다. 도 17b의 왼쪽 그래프는 관절염 병변에 주사한 부분에서 측정한 방사선량(Count/Background)의 절대치이며, 우측 그래프는 같은 자료에서 방사선 붕괴 보정(decay correction) 후 주사한 병변에 남아있는 방사선량(retention rate)을 나타낸다.
도 18a 및 도 18b는 99mTc-DiD-RBC-EM를 류마티스 관절염 동물 모델의 관절강 내에 주입후 형광 이미징을 수행한 결과로서, 구체적으로 도 18a는 시간에 따른 형광 이미지를 나타내고, 도 18b는 측정된 형광 물질의 양을 정량적으로 나타낸다.
도 19는 RBC-EM-porphyrin을 종양에 주입시 시간에 따른 형광 이미지를 나타낸다.
도 20은 RBC-EM-porphyrin을 피하 및 종양에 주입시 피하(A) 및 종양(B)에서 측정된 포르피린(porphyrin)의 양을 나타낸다.
도 21은 다양한 기관에 대한 생체 외(ex-vivo) 형광 이미지 및 측정된 포르피린의 정량적인 값을 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 적혈구 유래 엑소좀 유사체(Exosmoe mimetics derived from Red Blood Cell)의 제조
1-1. 적혈구 유래 엑소좀(RBC-Exo) 및 적혈구 유래 엑소좀 유사체(RBC-EM) 제조
혈액 응고 방지제(anticoagulant)로서 시트레이트-덱스트로스 용액(citrate-dextrose solution; Sigma-Aldrich, USA)의 존재 하에서 Sprague Dawley 랫트(150g; 6주령; 하나상사, Korea)로부터 혈액 시료를 채취하였다.
채취된 혈액을 18 내지 22℃에서 15분 내지 20분 동안 200g에서 원심분리하였다. 농축 적혈구(packed RBCs)의 상층부(top)로부터 혈액 상층액의 연층(buffy coat)을 수득하고, 이를 백혈구의 분리를 위해 사용하였다. 이어서 농축된 적혈구를 수집하였다. 적혈구(Red Blood cell; RBC)는 4℃에서 20분 동안 1,500g의 조건에서 한 번의 원심분리 단계에 의해 수득되었다.
이전에 공지된 방법(Varga et al.,Cancer Biother. Radiopharm. 31, 168-173, 2016)으로 적혈구로부터 엑소좀을 수득하였고, 적혈구로부터 유래된 엑소좀을 RBC-Exo로 명명하였다.
적혈구(RBC)에 PBS(RBC:PBS = 1:9 부피비)를 첨가하여 희석하고 이것을 미니 압출기(mini-extruder; vanti Polar Lipids, Birmingham, AL, USA)를 이용하여 1㎛ 크기의 폴리카보네이트 멤브레인 필터(polycarbonate membrane filter; Nuclepore, Whatman, Inc., Clifton, NJ, USA)를 통해 1회 내지 4회 압출(extruded)시켰다. 압출된 시료는 20배의 PBS을 첨가하여 희석하고 RBC, 크기가 큰 베지클(vesicle) 및 잔해(debris)를 제거하기 위해서 10분 동안 3,000g에서 원심분리 하였다. 원심분리된 시료는 0.22㎛의 주사기 필터(syringe filter)로 여과하고 1시간 동안 4℃, 100,000g에서 초원심분리(ultracentrifuged; Beckman Coulter, CA, USA) 하였다. 초원심분리 후에, 이오딕사놀(OptiPrep? Density Gradient Medium, Sigma-Aldrich, USA)을 사용하여 4℃에서 2단계 밀도 초원심분리(two-step density gradient ultracentrifugation)를 수행하였다. 적혈구 유래 엑소좀 유사체는 60% 와 20%의 이오딕사놀(iodixanol) 층의 교차점에서 얻어졌고, 추가적인 처리 없이 즉시 사용되었다. 수득된 적혈구 유래 엑소좀 유사체를 RBC-EM(RBC-exosome mimetics)으로 명명하였다.
도 1은 동일한 수의 적혈구로부터 제조된 RBC-Exo 및 RBC-EM의 시각적인 이미지를 나타낸다. 도 1의 점선은 RBC-Exo 및 RBC-EM의 위치를 나타낸다. 도 1에 나타난 바와 같이 자연적으로 유래된 RBC-Exo 보다 RBC-EM의 수가 많은 것을 확인할 수 있다.
1-2. RBC-Exo 및 RBC-EM의 개수 및 단백질 양 분석
초원심분리 및 추출법으로 5Х106개의 적혈구(RBC)로부터 생성된 RBC-Exo 및 RBC-EM의 수를 측정했다. 도 2의 A는 동일한 수의 적혈구로부터 제조된 RBC-Exo 및 RBC-EM의 농도(제조된 개수/㎖)를 나타낸다. 도 2의 A에 나타난 바와 같이 동일한 수의 적혈구에서 제조된 RBC-EM의 수는 RBC-Exo보다 130배 정도 높다(P <0.001).
RBC-Exo와 RBC-EM의 단백질 양은 이전에 공지된 방법(Gangadaran et al., Oncotarget 8, 109894-109914, 2017)으로 측정하였다. 도 2의 B는 동일한 수의 적혈구로부터 제조된 RBC-Exo와 RBC-EM의 총 단백질 함량을 나타낸다. 도 2의 B에서 나타난 바와 같이, 동일한 수의 적혈구로부터 제조된 RBC-EM은 RBC-Exo에는 유의하게 보다 높은 단백질 농도(약 65 배)를 보였다(P <0.001).
상기 결과로부터 RBC-EM은 자연적으로 만들어지는 RBC-Exo 보다 효율적으로 대량 생산이 가능한 것을 알 수 있다.
실시예 2. 적혈구 유래 엑소좀 유사체(RBC-EM)에 대한
99m
Tc 표지 및 표지 순도
2-1. 적혈구 유래 엑소좀 유사체(RBC-EM)에 대한
99m
Tc 표지
낮은 산화 상태로 환원된 99mTc만이 헤모글로빈, 특히 헤모글로빈의 베타-사슬에 단단히 결합하기 때문에 99mTc의 환원을 위해 RBC-EM을 염화 주석(II)과 함께 인큐베이션하였다. 실시예 1-1에서 수득된 RBC-EM을 동량의 0.01 % 염화 주석(Ⅱ) (Tin(Ⅱ)chloride; Sigma, USA)을 37℃ 진탕기(shaker)에서 5분간 인큐베이션하고, 99mTc(technetium-99m)를 RBC-EM에 첨가(RBC-EM(100㎍):99mTc(111MBq)하고 37 ℃ 진탕기에서 20분 동안 인큐베이션하여 적혈구 유래 엑소좀 유사체를 방사성 물질(99mTc)로 표지하고 이를 99mTc-RBC-EM로 명명하였다. 방사 화학 순도가 95% 미만인 경우 99mTc-RBC-EM의 정제를 위해 4℃, 100,000g에서 1시간 동안 초원심분리를 수행하였다.
도 3은 RBC-EM을 99mTc로 표지하는 과정을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
2-2.
99m
Tc 표지 순도(labeling purity)
RBC-EM에 대한 99mTc의 표지 순도(labeling purity)는 각 칼럼 용리액으로 0.9% NaCl 용액을 사용하는 즉석 박층 크로마토그래피(thin-layer chromatography)(TLC)를 사용하여 측정하고, 방사능-TLC 이미지 스캐너(radio-TLC imaging scanner; AR-2000, Bioscan, Poway, CA, United States)를 사용하여 컬럼의 방사능을 계수하였다. 유리 99mTc(free 99mTc)를 대조군으로 하여 방사 화학적 순도를 분석하였다.
도 4는 99mTc-RBC-EM의 시간에 따른 방사 화학적 순도를 나타낸다. 도 4에 나타난 바와 같이 초원심분리로 정제한 직후(0 시간) 방사 화학적 순도는 100 % 였다. RBC-EM에 99mTc이 표지된 비율은 99.57%(3 시간), 97.07%(6 시간), 96.34 %(12 시간), 94.98 %(24 시간)이었다.
이와 같은 결과를 통하여 방사성 물질인 99mTc으로 표지된(99mTc가 탑재된) 적혈구 유래 엑소좀 유사체(99mTc-RBC-EM)가 안정한 것을 알 수 있다.
2-3. serum stability 측정
37℃ CO2 배양기에서 99mTc-RBC-EM을 20% FBS를 포함하는 PBS 용액에서 배양하였다. 99mTc-RBC-EM의 안정성은 방사능-TLC 이미지 스캐너(radio-TLC imaging scanner; AR-2000, Bioscan, Poway, CA, United States)를 사용하여 배양 후 0, 1, 3 및 24시간에 측정하였다. 안정성은 시간 경과에 따른 99mTc-RBC-EM의 방사 화학적 순도(radiochemical purity)의 변화율에 의해 결정되었다.
도 5는 시간에 따른 99mTc-RBC-EM의 안정성을 나타낸다. 도 5에 나타난 바와 같이 24시간까지 99mTc-RBC-EM이 안정한 것을 알 수 있다.
실시예 3. RBC-EM 및
99m
Tc-RBC-EM의 특성 분석
3-1. 나노입자 추적 분석(Nanoparticle Tracking Analysis; NTA)
실시예 1-1의 방법으로 제조된 RBC-Exo, RBC-EM 및 실시예 2-1의 방법으로 제조된 99mTc-RBC-EM의 입자 크기는 제공된 프로토콜에 따라 Nano Sight LM 10(Malver)를 사용하여 분석하였다. 각 시료는 밀리-Q 물로 1000배 희석하고 멸균주사기를 이용하여 챔버로 주입하고, 이전에 공지된 방법과 같이(Gangadaran et al., J. Control. Release 264, 112-126, 2017) 측정을 수행하였다.
3-2. 전계방사형 투과 전자 현미경(Field emission transmission electron microscopy; FE-TEM) 및 주사 투과 전자 현미경(scanning transmission electron microscopy; STEM)
RBC-Exo, RBC-EM 및 99mTc-RBC-EM 시료의 펠렛을 2%의 파라포름알데히드 100㎕에 재현탁시켰다. 5㎕의 각 시료를 Formvar/Carbon 코팅된 EM 그리드 (Electron Microscopy Sciences, USA)에 부착(drop)시키고, 개방된 공간에서 20분 동안 건조시켰다. 세척을 위해, 50㎕의 PBS를 파라필름 시트에 첨가하고 그리드를 멸균된 포셉을 사용하여 PBS 방울 위에 거꾸로 띄웠다. 그리드를 1% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde) 50㎕로 이동시키고 5 분 동안 인큐베이션하고, 증류수로 2 분 동안 세척하였다. 그리드 상의 RBC-EM 및 99mTc-RBC-EM을 2% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate) 10㎕로 염색한 다음, 그리드를 다시 PBS로 7회 세척하였다. 그 후 그리드를 완전히 건조시켰다. 모든 과정은 실온(room temperature)에서 수행되었다.
RBC-Exo, RBC-EM 및 99mTc-RBC-EM의 크기를 관찰하고 구성요소 분석(element analysis)을 수행하기 위하여 시료는 Cs Probe(FEI company, Netherlands)가 있는 Titan G2 ChemiSTEM(FEI Company)에서 관찰하였다. RBC-Exo, RBC-EM 및 99mTc-RBC-EM 의 크기를 측정하기 위해, HT 7700 transmission electron microscope(Hitachi, Tokyo, Japan)를 사용하였다.
3-3. RBC-EM 및
99m
Tc-RBC-EM의 특성
상기 실시예 3-1의 방법으로 RBC-Exo, RBC-EM 및 99mTc-RBC-EM의 크기 분포를 측정하였다. 도 6의 A는 RBC-Exo, RBC-EM 및 99mTc-RBC-EM의 크기 분포를 나타내고 B는 RBC-Exo, RBC-EM 및 99mTc-RBC-EM의 평균 크기를 나타낸다. 도 6에 나타난 바와 같이 NTA 분석 결과, RBC-Exo의 크기는 30 내지 450nm 범위내였고, 평균 크기는 209.1 ± 19.8nm 이었다. 또한 표지되지 않은 RBC-EM의 평균 직경은 201.3 ± 16nm이고 99mTc로 표지된 99mTc-RBC-EM의 평균 직경은 195.0 ± 11.1㎚ 이다. RBC-Exo, RBC-EM 및 99mTc-RBC-EM 크기가 서로 유의미한 차이를 나타내지 않았다(P 값이 모두 0.05 이상).
이로부터 적혈구 유래 엑소좀 유사체는 적혈구 엑소좀과 크기가 비슷하고, 또한 99mTc 방사성 표지에 의해 크기 변화가 나타나지 않은 것을 알 수 있다.
방사성 표지가 RBC-EM의 모양과 형태를 변화시키는지를 확인하고 99mTc가 내부 또는 막에 존재하는지 분석하기 위해 상기 실시예 3-2의 방법으로 FE-TEM을 수행하였다. 도 7은 전계방사형 투과 전자 현미경(FE-TEM)으로 RBC-EM 및 99mTc-RBC-EM을 관찰한 이미지를 나타낸다. 도 7에 나타난 바와 같이 표지되지 않은 RBC-EM 및 99mTc-RBC-EM는 모두 유사한 원형의 모양을 유지하므로 99mTc 표지에 의한 형태학적 변화가 없는 것을 확인하였다.
상기와 같은 결과는 99mTc의 방사성 표지가 RBC-EM의 크기와 모양을 변화시키지 않는다는 것을 나타낸다.
도 8는 고각 산란 환상 암시야 주사 투과 전자 현미경(High-Angle Annular Dark Field Scanning Transmission Electron Microscopy; HAADF-STEM)에 의해 RBC-EM 및 99mTc-RBC-EM를 관찰한 이미지를 나타낸다. 표 1은 도 8의 STEM 이미지를 이용하여 RBC-EM 및 99mTc-RBC-EM의 세포질(cytosol)에서 존재하는 철 및 테크네슘 양을 수치화한 결과를 나타낸다. 표 1 및 도 8의 결과와 같이 99mTc-RBC-EM의 세포질에서 유의하게 99mTc가 많이 존재하므로 99mTc가 RBC-EM의 내부(cytosol)에 성공적으로 포함되어 있음을 알 수 있다.
| RBC-EM | 99mTc-RBC-EM | |||
| Weight(wt). % | Error in wt. % | Weight(wt). % | Error in wt. % | |
| 철(iron) | 90.07 | 21.94 | 40.80 | 18.89 |
| 테크네슘(technetium) | 9.93 | 9.53 | 59.20 | 34.59 |
4.
99m
Tc-RBC-EM의 생체 내 분포
4-1. 생체 내(in vivo) 감마 카메라 이미징(gamma camera imaging)
생체 내 감마 카메라 이미징을 5주령 수컷 C57BL/6 마우스(Hamamatsu, Shizuoka)에서 수행하였다. 감마 카메라 이미지는 2mm 핀홀 콜리메이터(pinhole collimator; Infinia Ⅱ, GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA)를 사용하여 10분 동안 캡처하여 촬영하였다. 200㎕ 부피의 37MBq 99mTC-RBC-EM을 마우스의 꼬리 정맥으로 주입하였다. 대조군은 동량의 유리 99mTc(free 99mTc)을 주입하였다. 이미징 동안, 마우스를 2.5% 이소플루란(isoflurane; Merial, Lyon, France)을 사용하여 지속적으로 마취하였다다. 감마 카메라 이미지는 99mTc-RBC-EM 및 유리 99mTc 주입 후 1 시간 및 3 시간 후에 촬영하여 얻어졌다.
유리 99mTc가 주입된 마우스에서 관심영역(Region of interests; ROIs)은 갑상선 및 위이고 99mTc-RBC-EM 주입된 마우스에서 관심영역(ROI)은 갑상선 및 간/비장이다. 오른쪽 허벅지 부분은 ROI의 대조군으로 사용되었다. ROI의 평균 픽셀당 카운트는 동일 마우스에서 대조군 ROI로 나누어 계산하였다.
99mTc 및 99mTc-RBC-EM를 마우스의 정맥 내 주사 후, 생체 내 감마 카메라 이미지를 얻었다. 도 9의 A는 유리 99mTc 및 99mTc-RBC-EM에 대한 생체 내 감마 카메라 이미지를 나타내고 B는 측정된 방사선의 정량값을 나타낸다. 도 9에 나타난 바와 같이 생체 내 감마 카메라 이미지는 살아있는 마우스에서 99mTc-RBC-EM이 명확하게 검출될 수 있음을 보여준다. 유리 99mTc를 주사한 후 1 시간 후에 획득한 이미지는 갑상선, 위 및 방광에서 유리 99mTc의 강한 섭취를 나타낸다(도 9의 A, 왼쪽 상부 패널). 동시에, 99mTc-RBC-EM을 주사 한 후 1 시간 후에 99mTc-RBC-EM의 섭취가 간, 비장 및 방광에서 관찰되었다(도 9의 A, 오른쪽 상부 패널). 유리 99mTc와는 달리, 마우스의 갑상선 또는 위에서 99mTc-RBC-EM의 흡수는 관찰되지 않았다. 또한, 주입 후 3 시간에 감마 카메라 이미지는 주입 후 1시간 후에 촬영한 이미지와 비슷한 패턴을 보였다(도 9의 A, 오른쪽 하부 및 왼쪽 하부 패널). 그러나 유리 99mTc는 1 시간 후와 비교하여 3 시간 후에서 갑상선 및 위에서 흡수가 유의하게 (P <0.001) 증가한 반면(도 9B의 왼쪽 그래프) 99mTc-RBC-EM은 1 시간과 비교하여 3 시간 동안 갑상선과 간장 및 비장 섭취가 유의하게 증가하지 않았다(P> 0.05)(도 9B의 오른쪽 그래프).
유리 99mTc는 각각 다른 기전으로 99mTc의 화학적 특성으로 인하여 갑상선과 위에 용이하게 섭취된다. 99mTc-RBC-EM은 99mTc이 RBC-EM의 세포질에 있는 헤모글로빈(Hb)에 결합되어 있으므로 99mTc에 의해 방사선을 검출할 수 있으나 생체 내에서 99mTc-RBC-EM은 RBC-EM의 특성대로 행동한다. 따라서 RBC-EM은 간이나 비장과 같은 세망내피계(reticuloendothelial system)에 섭취된다. 도 9의 B에서 나타난 바오 같이 99mTc-RBC-EM에서 3시간째에서도 1시간째와 마찬가지로 갑상선의 섭취가 증가하지 않았으므로 3시간째까지 99mTc-RBC-EM에서 유리되어서 나온 유리 99mTc이 거의 존재하지 않는다는 것을 의미하며 이를 통해 99mTc과 RBC-EM의 결합이 안정하다는 것을 알 수 있다.
4-2.
99m
Tc-RBC-EM 생체 분포(biodistribution)
99mTC-RBC-EM 또는 유리 99mTC를 마우스에 정맥 주사로 주입하였다. 한 시간 후 혈액 시료를 수집하고, 마우스는 희생시켰다. 섭취량(uptake value)은 폐, 심장, 간, 위, 비장, 장, 신장, 근육 및 갑상선 등의 기관에서 감마카운터를 사용하여 측정하였다. 결과값은 조직의 그람당 주입된 양의 퍼센트(%ID/g)로 표현하였다.
도 10은 유리 99mTc 및 99mTc-RBC-EM을 정맥 주사를 통해 마우스에게 투여한 후 99mTc 및 99mTc-RBC-EM의 생체 분포를 측정한 결과를 나타낸다. 도 10에서 상부의 그래프는 상이한 기관에서 측정된 방사선량을 나타내고, 구체적으로 하부의 왼쪽 패널과 오른쪽 패널로 구분하여 측정된 방사선량을 상세하게 나타낸다. 도 10에서 나타난 바와 같이 갑상선에서 99mTc-RBC-EM의 흡수는 유리 99mTc에 비해 유의하게(P <0.01) 낮았다. 비슷한 섭취 경향이 위에서도 관찰되었다(P <0.05). 99mTc-RBC-EM의 간(P <0.001), 비장(P <0.01) 및 신장(P <0.05)]에서의 흡수는 이들 기관에서 유리 99mTc의 섭취와 비교하여 20 내지 40 배 더 높았다. 또한 도 10에 나타난 바와 같이 뇌(P <0.05), 혈액(P <0.05), 폐(P <0.05), 근육(P <0.05), 골(P <0.05)에서의 흡수도 유리 99mTc보다 99mTc-RBC-EM이 높다. 이러한 결과는 방사성 물질로 표지된 적혈구 유래 엑소좀 유사체(99mTc-RBC-EM)가 살아있는 동물에서 용이하게 시각화될 수 있음을 나타낸다.
4-3. 생체 내 및 생체 외 RBC-EM
DiD
의 형광 이미징(fluorescent imaging)
실온에서 20분 동안 RBC-EM과 DiD(1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine Perchlorate; Thermo Fisher Scientific)와 함께 배양한 후, PBS로 세척하고, 실시예 1-1의 방법과 같이 2 단계 Opti-Prep 밀도 구배 초원심분리(Opti-Prep density gradient ultracentrifugation)를 수행하여 DiD로 표지된 RBC를 분리하고 RBC-EMDiD로 명명하였다. C57BL/6 마우스를 이소플루란으로 마취하고 RBC-EMDiD 또는 PBS를 꼬리 정맥을 통하여 정맥주사로 주입하였다. 주입 후 1분 및 1시간 후에 생체내 이미징 시스템(IVIS Lumina III instrument, PerkinElmer) [wavelengths: Excitation-644nm 및 emission-665nm; imaging parameters: binning-4, smoothing-3Х3, Field of subject(stage-D): 12.5 cm, height of subject image: 1.5 cm]을 사용하여 형광 이미징을 수행하였다. 이미징 후에 간 및 비장을 수집하여 생체 외 형광 이미징이 수행되고 IVIS 소프트웨어(Living Image Software, PerkinElmer)를 사용하여 정량분석을 수행하였다.
RBC-EM의 생체 분포를 조사하기 위해, 상기의 방법으로 RBC-EM을 DiD로 표지한 다음, 마우스에 정맥 내 투여하였다. 도 11a 및 도 11b는 RBC-EMDiD에 대해 형광 이미징을 수행한 결과를 나타낸다. 구체적으로 도 11a는 생체 내에서 RBC-EMDiD에 대한 형광 이미지를 나타낸다. 도 11b는 마우스로부터 수집된 간 및 비장에서 RBC-EMDiD에 대한 형광 이미지 및 이를 정량한 결과를 나타낸다. 도면에 나타난 바와 같이 투여 직후(0 시간)에 간에서 강한 형광 신호를 보였으며, 투여 후 1시간 후에는 간과 비장의 영역에서 더 강한 신호를 보였다. 반면, 도 11a에 나타난 바와 같이 대조군(PBS 투여) 마우스는 어떠한 신호도 나타내지 않았다. 도 11b에 나타난 바와 같이 생체 내 및 생체 외 형광 이미징을 통해 RBC-EMDiD가 간 및 비장에 유의하게 분포되어 있는 것을 알 수 있다.
4-4. 면역형광 분석(Immunofluorescent Assay)
RBC-EM의 위치를 더 상세히 분석하기 위해 간 조직을 크리오-섹션(cryo-section)하여 면역형광 분석(immunofluorescence(IF) assay)을 수행하였다. RBC-EM DiD 또는 PBS가 주입된 마우스의 간 섹션을 항-래빗 CD68(Abcam)으로 염색한 후 염소 항-래빗 FITC(Abcam)로 염색하였다. 간 조직을 VECTASHIELD mounting medium(Vector Laboratories, Burlingame, CA, United States)을 사용하여 마운트하였다. 면역형광(IF)-염색된 섹션을 컨포칼 현미경(LSM 5 Exciter, Zeiss, Oberkochen, Germany) 하에서 관찰하였다. 관찰자가 6개의 필드를 계수하였다. CD68 양성(CD68 +; green) 세포의 수는 RBC-EMDiD 또는 PBS-주입된 마우스 간 섹션으로부터 계수되었다. 그 후 CD68 + 또는 CD68 - 세포에서 DiD 양성이 계수되었다.
도 12a 및 도 12b는 간 조직의 섹션(section)에서 RBC-EMDiD에 대하여 면역형광 분석을 수행한 결과를 나타낸다. 구체적으로 도 12a는 간 조직의 섹션(section)에서 RBC-EMDiD에 대한 면역형광 분석 이미지를 나타내고, 도 12b는 CD68+ 및 DiD에 대한 면역형광 결과를 수치로 나타낸다. 도면에 나타난 바와 같이 간 섹션에 CD68 양성 세포(쿠퍼 세포, 간 상주 대식세포)의 유의한(P=0.1856) 변화가 없음을 확인하였다. 또한 면역 형광 분석 결과, RBC-EMDiD의 상당수가 쿠퍼 세포와 공존하는 것을 알 수 있다. 도면에 나타난 바와 같이 RBC-EmDiD의 약 75%가 쿠퍼 세포에 국한되어 있있다. 대조군 마우스의 CD68 + 세포는 DiD 신호를 나타내지 않았다.
상기 결과에 의해 RBC-EM은 간에서 주로 분포하고 쿠퍼(Kupffer) 세포(대식세포)에 내재되어 있음을 알 수 있다.
실시예 5. 약물이 탑재(loading)된 적혈구 유래 엑소좀 유사체의 제조
Sprague Dawley 랫트(150g; 6주령; 하나상사, Korea)로부터 안와후방(retroorbital) 혈액 시료를 수집하였다. 섭씨 4℃, 200g에서 15 내지 20분간 원심분리를 수행하여 혈청을 분리하고 PBS와 항응고제로서 ACD(acid citrate dextrose)의 혼합물(PBS:ACD = 9:1의 부피비)을 혈액과 4:1의 비율로 혼합하였다.
미니 압출기(mini-extruder; vanti Polar Lipids, Birmingham, AL, USA)를 이용하여 1㎛ 크기의 폴리카보네이트 멤브레인 필터(polycarbonate membrane filter; Nuclepore, Whatman, Inc., Clifton, NJ, USA)를 통해 압출(extruded)시켰다. 압출된 시료는 20배의 PBS을 첨가하여 희석하고 RBC, 크기가 큰 베지클(vesicle) 및 잔해(debris)를 제거하기 위해서 10분 동안 4,000g에서 원심분리 하였다. 원심분리된 시료는 0.22㎛의 주사기 필터(syringe filter)로 여과하고 1시간 동안 4℃, 100,000g에서 초원심분리하였다. 초원심분리 후에, 수득된 펠렛을 이오딕사놀(OptiPrep? Density Gradient Medium, Sigma-Aldrich, USA)을 사용하여 4℃에서 2단계 밀도 초원심분리(two-step density gradient ultracentrifugation)를 수행하였다. 적혈구 유래 엑소좀 유사체(RBC-EM)는 60% 와 20%의 이오딕사놀(iodixanol) 층의 교차점에서 얻어졌고, BCA 분석법에 의하여 RBC-EM의 단백질을 정량하였다 .
10 내지 20uM/㎖의 농도의 약물과 RBC-EM을 혼합하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 약물로는 덱사메타손(dexamethasone) 및 커큐민(curcumin)을 사용하였다. 그 후에 1시간 동안 100,000g에서 초원심분리하여 수득된 펠렛을 PBS로 세척하고 이오딕사놀을 사용하여 4℃에서 2단계 밀도 초원심분리(two-step density gradient ultracentrifugation)를 수행하였다. UV 분광계(UV spectrometry)를 이용하여 약물의 적재 효율(loading efficiency)을 계산하였다. 약물의 적재효율은 약 2% 였다.
도 13은 덱사메타손 또는 커큐민이 RBC-EM에 성공적으로 탑재된 결과를 나타낸다. 도 13에 나타난 바와 같이 첨가되는 약물의 농도가 증가할수록 약물이 탑재된 RBC-EM의 수가 증가하는 것을 육안으로 관찰할 수 있다. 상기 결과를 바탕으로 적혈구 유래 엑소좀 유사체에 성공적으로 약물을 탑재할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 6.
99m
Tc-RBC-EM를 이용한 세포 표지
6-1.
99m
Tc-RBC-EM를 이용한 종양 세포에 대한
99m
Tc 표지
인간 비정형 갑상선 암종(Human atypical thyroid carcinoma) 8505C 세포주(DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen))를 10% 소태아혈청(FBS), 10U/㎖ 페니실린 및 10㎍/㎖ 스트렙토마이신(Invitrogen)으로 보충된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, Invitrogen, Grand Island, NY, USA)에서 37℃ 및 5% CO2 조건의 습윤한 환경(humidified atmosphere)에서 배양하였다. 8505C 세포를 다양한 용량의(0, 1, 2 및 4μCi) 99mTc-RBC-EM와 함께 배양하였다. 24 시간 후, PBS를 사용하여 세포에 흡수되지 않은 유리(free) 99mTc-RBC-EM을 세척하였다. 그 후, 8505C 세포를 37℃ CO2 배양기에서 20% FBS 용액으로 1, 6, 12 및 18시간 동안 배양하였다. 흡수 값(uptake values)은 모든 시점에서 감마 카운터(gamma-counter; Cobra II, 1 Hewlett Packard, USA)로 측정하고 측정된 방사선 양을 cpm(count per minute) 단위로 나타냈다. 99mTc-RBC-EM(4μCi)의 결과와 비교하기 위해 유리 99mTc(4μCi)를 사용하여 99mTc-RBC-EM에 의해 종양 세포가 99mTc으로 표지되었는지 여부를 측정하였다.
도 14의 A는 배양 시간 및 99mTc-RBC-EM의 용량(dose)에 따른 8505C 세포의 방사선 양을 나타낸다. 도 14의 A에 나타난 결과와 같이 방사선 양은 99mTc-RBC-EM의 용량(dose) 및 시간에 따라 점진적으로 증가했다. 세포에 흡수된 유리 99mTc이 대조군으로 분석되었다. 도 14의 B는 배양 시간에 따른 동일한 용량(4μCi)의 99mTc-RBC-EM 및 유리 99mTc가 세포에 흡수된 양을 나타낸다. 도 14의 B에 나타난 바와 같이 세포는 유리 99mTc를 거의 흡수하지 않았으며 시간이 증가함에 따라서 유리 99mTc 흡수가 증가하지 않았다.
이러한 결과는 99mTc-RBC-EM이 99mTc를 세포에 전달하는 능력을 가지고 있어 99mTc-RBC-EM를 사용하여 세포를 방사능 물질로 표지할 수 있음을 보여준다.
6-2.
99m
Tc-RBC-EM을 이용한 백혈구(WBC)에 대한
99m
Tc 표지
상기 실시예 1-1 과 같은 방법으로 수집된 혈액 시료의 연막(buffy coat) 에서 백혈구(White blood cell; WBC)를 분리하였다. 분리된 시료를 10분 동안 250g에서 원심분리했다. 그 후 RBC 오염을 제거하기 위해 세포 펠렛을 용해 완충액 (0.83% (w/v) NH4Cl, 10 mM HEPES-NaOH, pH 7.0) 3 ㎖에 재현탁 하고, 37℃에서 7분간 인큐베이션 하였다. 그 후에 실온에서 10분 동안 250g로 원심분리를 수행하여 WBC를 수득하여 추후 실험에 사용하였다.
99mTc-RBC-EM를 사용하여 99mTc를 WBC에 표지하기 위해, 분리된 WBC를 99mTc-RBC-EM과 함께 37℃, CO2 배양기에서 6시간 동안 배양하였다. WBC의 짧은 반감기를 고려하여 6시간의 배양 시간 동안 동일한 방식으로 99mTc를 WBC에 표지했다.
배양 후, 10분 동안 250g에서 원심 분리하여 유리 99mTc-RBC-EM을 제거하고 수집된 펠렛을 PBS로 용해시켜 방사성 물질 표지된 백혈구를 제조하고 이를 99mTc-WBC로 명명하였다. 99mTc-RBC-EM를 사용하여 백혈구에 99mTc를 표지한 99mTc-WBC는 추가적으로 생체 내(in vivo) 급성 염증 추적 실험(acute inflammation tracking experiment)에 사용하였다.
실시예 7. 급성 염증 동물 모델을 이용한 종양 추적
7-1. 급성 염증 마우스 모델의 확립 및 확인
6주된 암컷 BALB/c 누드 마우스는 Hamamatsu (Shizuoka, Japan)에서 구입했다. 급성 염증 마우스 모델을 확립하기 위해 1% 카라기난(carrageenan) 100㎕를 BALB/c 누드 마우스(n = 15)의 왼발에 피하 주사(subcutaneous injection) 하였다. 주사 6시간 후 왼발이 붓고 붉은색으로 변하는 급성 염증의 특징이 관찰되었다.
급성 염증의 확립을 확인하기 위해 18F-FDG PET/CT 이미징을 수행하였다. 주사 및 이미징 중 100% O2에서 1% 내지 2% 이소플루란으로 전신 마취(general anesthesia)하에 마우스에 18F-FDG 11.1MBq(300μCi)를 정맥 주사(intravenous injection)한 후에 18F-FDG PET/CT를 수행하였다. 이미지는 2 차원 OSEM(2-dimensional ordered-subsets expectation maximization algorithm)으로 재구성되었다. 감쇠(attenuation) 또는 산란(scattering)을 위한 보정은 수행되지 않았다.
도 15는 급성 염증 마우스에 대한 18F-FDG PET/CT 이미지를 나타낸다. 도 15에 나타난 바와 같이 왼쪽발의 포도당 대사가 강하게 증가했으며 사타구니 부위의 림프절에서 포도당 대사가 증가하는 것을 확인하여 마우스에 급성 염증이 확립되었음을 확인하였다.
7-2. 생체 내(in vivo) 감마 카메라 이미징(gamma camera imaging)
실시예 7-1에서 제작한 급성 염증 마우스 모델의 꼬리 정맥에 200㎕ 의 3.7MBq 99mTc-WBC를 주입하였다. 10분 동안 2㎜ 핀홀 콜리메이터(pinhole collimator; Infinia II, GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA)를 사용하여 감마 카메라 이미지를 얻었다. 이미징 동안, 마우스를 2.5% 이소플루란을 사용하여 지속적으로 마취하였다. 99mTc-WBC 투여 후 5분, 3시간, 6시간, 12시간 및 24시간에 촬영하여 감마 카메라 이미지를 얻었다.
7-3. 급성 염증 마우스 모델에서
99m
Tc-WBC의 생체 분포(biodistribution) 분석
실시예 7-2의 감마 카메라 이미징 직후에 마우스를 희생시켰다. 뇌, 갑상선, 폐, 심장, 간, 비장, 위, 장, 양측 신장(bilateral kidneys), 뼈, 근육, 왼발 및 오른발 등의 기관에서 감마 카운터(Cobra II, 1 Hewlett Packard, USA)로 99mTc-WBC의 섭취량을 측정하였다. 결과값은 조직의 그람당 주입된 양의 퍼센트(%ID/g)로 표현하였다.
7-4.
99m
Tc-WBC 을 이용한 염증 추적
도 16a 내지 도 16d는 급성 염증 마우스 모델에서 99mTc로 표지된 백혈구가 염증 추적에 효과적으로 사용될 수 있음을 보여준다. 구체적으로 도 16a는 꼬리 정맥을 통해 99mTc-WBC를 주입한 급성 염증 마우스 모델에서 감마 카메라 이미지를 나타낸다. 도 16b는 99mTc-WBC를 주입한 급성 염증 마우스 모델의 왼발과 오른발에서 측정한 방사성 양을 나타낸다. 도 16c는 99mTc-WBC의 생체 분포를 나타낸다. 도 16d는 왼발과 오른발의 99mTc-WBC 섭취량를 나타낸다.
도 16a에 나타난 바와 같이 99mTc-WBC 주사 후 5분 이내에 획득한 이미지는 간, 비장 및 방광에서 99mTc-WBC가 강하게 섭취되었음을 나타낸다. 도 16b에 나타난 결과와 같이 주사후 3시간 후에 왼쪽 다리에 유의하게 축적되었고 cpm 값은 오른발에 비해 통계적으로 왼쪽 발에서 더 높았다. 주사 후 24시간의 cpm도 왼쪽 발에서 더 높은 것을 알수 있었다. 도 16c에 나타난 바와 같이 생체 외 연구에서 간과 신장의 활동은 왼발보다 유의하게 높았으며 뇌, 심장, 장, 근육 및 갑상선의 활동은 왼발보다 유의하게 낮았지만 간 및 신장의 활동은 주사 후 3시간에 급격히 감소하였다. 도 16d에 나타난 바와 같이 왼발에서의 99mTc-WBC의 섭취량은 모든 시점에서 오른발보다 높았다. 주사 후 24시간에 왼쪽발의 방사선 양이 다른 기관들보다 가장 높았고 오른발보다 약 20배 더 높았다.
이와 같은 결과는 RBC-EM을 이용하여 WBC에 대해 성공적으로 99mTc로 표지할 수 있고, 99mTc로 표지된 WBC(99mTc-WBC)를 사용하여 급성 염증이 있는 동물에서 성공적으로 염증의 위치가 시각화될 수 있음을 나타낸다.
실시예 8. 류마티스 관절염 동물 모델에서 적혈구 유래 엑소좀의 위치 분석
8-1. 방사성 물질(
99m
Tc) 및 형광 물질(DiD)로 표지된 적혈구 유래 엑소좀 유사체의 제작
실온에서 20분 동안 실시예 1-1에서 수득한 RBC-EM과 DiD(1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine Perchlorate; Thermo Fisher Scientific)와 함께 배양한 후, PBS로 세척하고, 실시예 1-1의 방법과 같이 2 단계 Opti-Prep 밀도 구배 초원심분리를 수행하여 DiD가 탑재된 적혈구 유래 엑소좀 유사체(DiD-RBC-EM)를 분리하였다
낮은 산화 상태로 환원된 99mTc만이 헤모글로빈, 특히 헤모글로빈의 베타-사슬에 단단히 결합하기 때문에 99mTc의 환원을 위해 DiD-RBC-EM을 염화 주석(II)과 함께 인큐베이션하였다. DiD-RBC-EM을 동량의 0.01% 염화 주석(Ⅱ) (Tin(Ⅱ)chloride; Sigma, USA)을 37℃ 진탕기(shaker)에서 5분간 인큐베이션하고, 99mTc(technetium-99m)를 DiD-RBC-EM에 첨가(DiD-RBC-EM(100㎍):99mTc(111MBq)하고 37℃ 진탕기에서 20분 동안 인큐베이션하여 방사성 물질(99mTc) 및 형광 물질(DiD)이 탑재된 적혈구 유래 엑소좀 유사체의 제작하고 이를 99mTc-DiD-RBC-EM로 명명하였다. 방사 화학 순도가 95% 미만인 경우 99mTc-DiD-RBC-EM의 정제를 위해 4℃, 100,000g에서 1시간 동안 초원심분리를 수행하였다.
8-2. 관절염 동물 모델 제작
쥐 콜라겐 유도 관절염 모델은 이전에 보고된 대로(Journal of Controlled Release 252 (2017): 62-72; PloS one 12.4 (2017))수행하였다. 제 2형 콜라겐(bovine type-II collagen, CII; Chondrex, Redmond, WA, USA)을 10 mM 아세트산에서 2mg/㎖의 농도로 용해시켰다. 1차 접종(immunization)을 위해, 동량의 완전 프로인트 보강제(complete Freund's adjuvant)로 유화된 CⅡ(100㎍)를 6 내지 8주령의 DBA/1J 수컷 마우스(Japan SLC, Inc., Hamamatsu, Japan)의 꼬리 기저부에 피부내로 주사하였다. 불완전 프로인트 보강제(complete Freund's adjuvant)에서 CⅡ(100㎍)를 1차 접종 후 21일 차에 추가 접종(booster injection) 하였다. 마우스를 22일차부터 관절염의 임상적 특성을 매일 관찰하였다. 2명의 독립 관찰자가 관절염의 임상적 특성을 1차 접종 후 22일차부터 주당 3회 관찰하였다. 관절염의 임상적 중증도는 이전에 보고된 대로(Arthritis & Rheumatism 65.7 (2013)) 0에서 4까지의 등급에 따라 기록하였다. 관절염이 발생하면 마우스를 무작위로 선택하여 추후 실험에 사용하였다.
8-3. 감마 카메라 이미징 및 형광 이미징
감마 카메라 이미지는 2mm 핀홀 콜리메이터(pinhole collimator; Infinia Ⅱ, GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA)를 사용하여 10분 동안 캡처하여 촬영하였다. 200㎕의 99mTc-DiD-RBC-EM을 마우스의 꼬리 정맥으로 주입하였다. 대조군은 동량의 유리 99mTc(free 99mTc)을 주입하였다. 이미징 동안, 마우스는 2.5% 이소플루란을 사용하여 지속적으로 마취되었다. 감마 카메라 이미지는 99mTc-DiD-RBC-EM 및 유리 99mTc 주입 후 1, 3, 12 또는 24시간 후에 촬영되었다.
C57BL/6 마우스를 이소플루란으로 마취하고 99mTc-DiD-RBC-EM 또는 PBS를 꼬리 정맥을 통하여 정맥주사로 주입하였다. 주입 후 1시간, 3시간, 12시간, 1일, 2일, 3일, 6일. 8일, 10일 및 15일에 생체내 이미징 시스템(IVIS Lumina III instrument, PerkinElmer) [wavelengths: Excitation-644nm 및 emission-665nm; imaging parameters: binning-4, smoothing-3Х3, Field of subject(stage-D): 12.5 cm, height of subject image: 1.5 cm]을 사용하여 형광 이미징을 수행하였다.
8-4.
99m
Tc-DiD-RBC-EM의 위치 분석
도 17a 및 도 17b는 99mTc-DiD-RBC-EM를 류마티스 관절염 동물 모델의 관절강 내에 주입후 감마 카메라 이미징을 수행한 결과를 나타낸다. 구체적으로 도 17a는 류마티스 관절염 마우스에 대한 감마 카메라 이미지를 나타내고 도 17b는 측정된 방사선양을 정량적으로 나타낸다. 도 17b의 왼쪽 그래프는 관절염 병변에 주사한 부분에서 측정한 방사선량(count/background)의 절대치이며, 우측 그래프는 같은 자료에서 방사선 붕괴 보정(decay correction) 후 주사한 병변에 남아있는 방사선량(retention rate)을 나타낸다. 즉 1시간 후의 방사선량을 100%(그래프에서 1.0에 해당됨)로 보았을 때 어느 정도의 방사선이 주사한 병변에 남아 있는가를 나타낸다.
도 17a 및 도 17b에 나타난 바와 같이 주입 후 24시간까지 99mTc-DiD-RBC-EM이 다른 장기로 유의하게 이동하지 않고 관절강 내에 잔류하고 있는 것을 확인할 수 있었다.
99mTc-DiD-RBC-EM를 류마티스 관절염 동물 모델의 관절강 내에 주입후 형광 이미징을 수행한 결과로서, 도 18a는 시간에 따른 형광 이미지를 나타내고, 도 18b는 측정된 형광 물질의 양을 정량적으로 나타낸다. 2번 마우스는 2일째에 사망하였으나 1번 마우스의 IVIS 영상에서 15일째까지 관절강 내에서 99mTc-DiD-RBC-EM이 잔류하고 있음을 알 수 있다. 1번 마우스의 IVIS 영상에서 12시간째, 3일, 6일, 8일, 10일 및 15일차에 관절강 외에 형광이 관찰되는 것은 자발형광(autofluorescence)으로 판단된다. 도 18a 및 도 18b에 나타난 바와 같이 감마 카메라 이미징 결과와 동일하게 99mTc-DiD-RBC-EM은 다른 장기로 유의하게 이동하지 않고 관절강내에 잔류하고 있다,
실시예 9. 종양 동물 모델에서 적혈구 유래 엑소좀의 위치 분석
9-1. 종양 동물 모델 제작
우측 하부 영역에 Cal62/effluc(5Х106cells)를 피하로 이식한 누드 마우스를 6주 동안 성장시켰다. 마우스를 2.5% 이소플루란으로 마취시키고, 생체 발광 이미지를 100㎕의 D-루시페린(3㎎/마우스; Caliper)을 복강 내 주사한 후 IVIS Lumina III 영상 시스템을 사용하여 생물 발광 이미징(bioluminescence imaging, 이하 BLI)을 수행하였다. 이어서 6주까지 BLI를 관찰하고 마우스를 추가 실험에 사용했다.
9-2. 형광 물질(porphyrin)로 표지된 적혈구 유래 엑소좀 유사체의 제작
적혈구를 실시예 1-1에 기재된 방법으로 수득하고, 적혈구에 PBS를 첨가(RBC:PBS = 1:9의 부피비)하여 희석하고 0.1% 농도가 되도록 포르피린(porphyrin)을 추가하였다. 이것을 미니 압출기(mini-extruder; vanti Polar Lipids, Birmingham, AL, USA)를 이용하여 1㎛ 크기의 폴리카보네이트 멤브레인 필터(polycarbonate membrane filter; Nuclepore, Whatman, Inc., Clifton, NJ, USA)를 통해 1회 내지 4회 압출(extruded)시켰다.
포르피린으로 표지된 표지 적혈구 유래 엑소좀 유사체는 60% 와 20%의 이오딕사놀(iodixanol) 층의 교차점에서 얻어졌고, 추가적인 처리 없이 즉시 사용되었다. 수득된 포르피린이 탑재된(포르피린으로 표지된) 적혈구 유래 엑소좀 유사체를 porphyrin-RBC-EM(porphyrin-RBC-exosome mimetics)으로 명명하였다.
9-3. 형광 이미징
C57BL/6 마우스를 이소플루란으로 마취하고 porphyrin-RBC-EM 또는 유리 포르피린(free porphyrin)을 종양 동물 모델의 종양 내와 건측의 피하에 주입하였다. 주입 후 1~288시간 후에 생체 내 이미징 시스템(IVIS Lumina III instrument, PerkinElmer) [wavelengths: Excitation-644nm 및 emission-665nm; imaging parameters: binning-4, smoothing-3Х3, Field of subject(stage-D): 12.5cm, height of subject image: 1.5cm]을 사용하여 형광 이미징을 수행하였다. 이미징 후에 피하조직, 간, 비장, 심장, 폐, 신장, 종양을 수집하여 생체 외 형광 이미징이 수행되고 IVIS 소프트웨어(Living Image Software, PerkinElmer)를 사용하여 정량분석을 수행하였다.
9-4. porphyrin-RBC-EM의 위치
RBC-EM에 porphyrin을 탑재시킨 후에 피하 및 종양에 주사하였다. 도 19는 RBC-EM-porphyrin을 종양에 주입시 시간에 따른 형광 이미징을 나타낸다. 도 19에 기재된 HRS는 시간을 의미한다. 도 20은 RBC-EM-porphyrin을 피하 및 종양에 주입시 피하 및 종양에서 측정된 포르피린의 양을 나타낸다. 도 19 및 20에 나타난 바와 같이 RBC-EM-porphyrin이 12일째까지 종양내에 잔류하고 있는 것을 생체 내 IVIS 이미징에서 확인할 수 있다.
12일차에 마우스를 희생시키고 피하조직, 간, 비장, 심장, 폐, 신장 및 종양 조직을 수집하여 형광 이미징을 수행하였다. 도 21은 다양한 기관에 대한 생체 외(ex-vivo) 형광 이미징 및 정량적으로 측정된 포르피린의 양을 나타낸다. 도 21에 나타난 바와 같이 피하 및 종양에서 포르피린의 양이 현저히 높으므로 상기 결과와 동일하게 RBC-EM-porphyrin이 다른 장기로 유의하게 이동하지 않고 종양 내에 잔류하고 있음을 알 수 있다.
통계 분석
실험 결과값은 평균±표준편차(SD)로 나타내었다. GraphPad Prism5 소프트웨어 버전 7.04(GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)에 의해 통계적 유의성이 결정(student t-test)되었다. 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의하다고 간주되었다.
Claims (19)
- 목적 물질이 탑재된 적혈구 유래 엑소좀 유사체를 포함하는 물질 전달용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 적혈구 유래 엑소좀 유사체는 100nm 내지 300nm의 직경을 갖는 것인 물질 전달용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 목적 물질은 약물, 방사성 물질 및 형광 물질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인 물질 전달용 조성물.
- 청구항 3에 있어서, 상기 약물은 화합물, 펩타이드, 단백질 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인 물질 전달용 조성물.
- 청구항 3에 있어서, 상기 방사성 물질은 진단용 방사성 핵종 또는 치료용 방사성 핵종인 것인 물질 전달용 조성물.
- 청구항 5에 있어서, 상기 진단용 방사성 핵종은 99mTc(technetium-99m)인 것인 물질 전달용 조성물.
- 청구항 6에 있어서, 상기 99mTc(technetium-99m)은 적혈구 유래 엑소좀 유사체 내부의 헤모글로빈과 결합된 것인 물질 전달용 조성물.
- 청구항 5에 있어서, 상기 치료용 방사성 핵종은 131I, 186Re, 188Re, 153Sm 및 32P로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인 물질 전달용 조성물.
- 청구항 3에 있어서, 상기 형광 물질은 형광 단백질(fluorescent protein), 발광 단백질(photoprotein), 루시퍼라제(luciferase) 및 형광염료(fluorescent dye)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인 물질 전달용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 물질 전달용 조성물은 간 질환의 치료를 위해 사용되는 것인 물질 전달용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 물질 전달용 조성물은 관절염의 치료를 위해 사용되는 것인 물질 전달용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 물질 전달용 조성물은 종양 치료를 위해 사용되는 것인 물질 전달용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 물질 전달용 조성물은 세포를 표지하기 위해 사용되는 것인 물질 전달용 조성물.
- (a) 적혈구로부터 적혈구 유래 엑소좀 유사체를 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 수득된 적혈구 유래 엑소좀 유사체와 목적 물질을 혼합한 혼합물을 인큐베이션하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 인큐베이션한 혼합물을 초원심분리하여 펠렛을 수득하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계에서 수득된 펠렛을 세척하고 밀도 구배를 이용하여 목적 물질을 탑재한 적혈구 유래 엑소좀 유사체를 분리하는 단계를 포함하는 청구항 1의 물질 전달용 조성물을 제조하는 방법.
- 청구항 14에 있어서, 상기 목적 물질은 약물, 방사성 물질 및 형광 물질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인 물질 전달용 조성물을 제조하는 방법.
- 청구항 14에 있어서,
(e) 상기 (d) 단계에서 분리된 적혈구 유래 엑소좀 유사체 및 염화 주석(Ⅱ)(Tin(Ⅱ)chloride)을 혼합한 혼합물을 인큐베이션하는 단계; 및
(f) 상기 (e) 단계에서 인큐베이션된 혼합물에 99mTc(techetium-99m)을 첨가하여 인큐베이션하는 단계를 더 포함하는 것인 물질 전달용 조성물을 제조하는 방법.
- 청구항 1의 물질 전달용 조성물을 포함하는 조영제.
- 청구항 17에 있어서, 상기 조영제는 핵의학 영상 촬영에 적용되는 것인 조영제.
- 청구항 18에 있어서, 상기 핵의학 영상 촬영은 양전자 방출 단층 촬영 (positron emission tomography; PET), 단광자 방출 컴퓨터 단층 촬영(single-photon emission computed tomography; SPECT) 또는 감마 카메라 촬영인 것인 조영제.
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