CN115531369A - 用于缓解肾脏疾病与器官纤维化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于缓解肾脏疾病与器官纤维化的方法。本发明揭示一种用于缓解在个体中的肾脏疾病或者器官的纤维化的方法,其包括对该个体投药以含有氨基酸亚铁螯合物的组合物,该氨基酸亚铁螯合物包括亚铁离子与氨基酸。
Description
技术领域
本发明是有关于一种用于缓解肾脏疾病的方法以及一种用于缓解器官的纤维化的方法,特别是有关于使用氨基酸亚铁螯合物来缓解肾脏疾病的方法以及缓解器官的纤维化的方法。
背景技术
纤维化疾病(fibrotic disorders)是常见的,具有多种形式,并且可能会危及生命。不存在有比伴随着所有慢性和/或急性肾脏疾病的渐进性纤维化(progressivefibrosis)更好的纤维化疾病例子。肾脏纤维化是受伤后肾脏的有限再生能力的直接结果。肾脏结瘢(renal scarring)导致肾脏功能的渐进性丧失,最终招致末期肾衰竭(end-stagerenal failure)以及对于透析或肾脏移植的需求。因此,存在有迫切的需要去发展出用于缓解肾脏纤维化以及与此有关的肾脏疾病的药剂与方法。
发明内容
本发明提供一种用于缓解在个体中的肾脏疾病的方法,其包含对该个体投药以含有氨基酸亚铁螯合物的组合物,该氨基酸亚铁螯合物包括亚铁离子与氨基酸。
较佳地,该氨基酸亚铁螯合物是甘氨酸亚铁螯合物。
较佳地,在该氨基酸亚铁螯合物中该亚铁离子与该氨基酸的螯合比例落在1:1至1:4的范围内。
较佳地,该组合物被口服投药。
较佳地,该肾脏疾病是急性肾脏疾病。
本发明也提供一种用于缓解在个体中的器官的纤维化的方法,其包含对该个体投药以含有氨基酸亚铁螯合物的组合物,该氨基酸亚铁螯合物包括亚铁离子与氨基酸。
较佳地,该氨基酸亚铁螯合物是甘氨酸亚铁螯合物。
较佳地,在该氨基酸亚铁螯合物中该亚铁离子与该氨基酸的螯合比例落在1:1至1:4的范围内。
较佳地,该组合物被口服投药。
较佳地,该器官选自于由下列所构成的群组:肾脏、肺脏、肝脏、睪丸,以及它们的组合。
较佳地,该器官是肾脏。
附图说明
本公开内容的其他的特征以及优点将在下列参照随文检附的图式的具体例的详细说明中变得明显,其中:
图1显示在下面实施例1的各组中,小鼠血液样品中肝脏酶(liver enzymes)、尿素氮(urea nitrogen)与肌酸酐(creatinine)的水平,以及小鼠尿液样品中尿素氮与肌酸酐的水平,其中符号“**”表示与假手术组(sham-operated group,SOG)作比较,p<0.01,以及符号“#”表示与病理对照组(pathological control group,PCG)作比较,p<0.05;
图2显示在下面实施例1的各组中小鼠的肾脏形态学;
图3显示在下面实施例1的各组中所选定的小鼠的肾脏组织切片的组织学分析;
图4显示在下面实施例1的各组中,肾脏组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscle actin)、胶原纤维(collagen fibers)以及中间丝蛋白(vimentin)的蛋白质表达水平,其中GAPDH供作为加载对照;
图5显示在下面实施例2的各组中HK-2细胞的可活性百分比;以及
图6显示在下面实施例3的各组中HK-2细胞的迁移。
具体实施方式
要被了解的是:若有任何一件前案刊物在此被引述,该前案刊物不构成一个下述承认:在中国或任何其他国家中,该前案刊物形成本领域中的常见一般知识的一部分。
为了这本说明书的目的,将被清楚地了解的是:文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限于”,以及文字“包括(comprises)”具有对应的意义。
除非另外有所定义,在本文中所使用的所有技术性与科学术语具有本领域技术人员所共同了解的意义。
本领域技术人员会认知到许多与那些被描述于本文中者相似或等效的方法和材料,它们可被用于实施本发明。当然,本发明决不受到所描述的方法和材料的限制。
由于申请人意外地发现:氨基酸亚铁螯合物在缓解肾脏肿胀与肾脏纤维化上是有效的,因此本发明提供了一种用于缓解在个体中的肾脏疾病的方法,其包含对该个体投药以含有氨基酸亚铁螯合物的组合物,该氨基酸亚铁螯合物包括亚铁离子和氨基酸。
另外,由于氨基酸亚铁螯合物对缓解肾纤维化上是有效的,申请人推测这种氨基酸亚铁螯合物可用于缓解器官中的纤维化。因此,本发明提供了一种用于缓解在个体中的器官的纤维化的方法,其包含对该个体投药以上述含有氨基酸亚铁螯合物的组合物。
在某些实施例中,该器官选自于由下列所构成的群组:肾脏、肺脏、肝脏、睪丸,以及它们的组合。在一个示范性具体例中,该器官是肾脏。
如本文中所使用的,术语“肾脏疾病(kidney disease)”意指肾功能在数天、数月或数年的一段时间内的渐进性丧失(progressive loss)。肾脏疾病具有其在本领域中的通常含意,并且用于归类数种对影响肾脏、肾脏器质性(renal parenchyma)的破坏以及功能性肾元(nephrons)或肾小球(glomeruli)的丧失的疾病。应特别注意的是,肾脏疾病可能由不同的因素所导致,但最终途径仍然是肾脏纤维化。肾脏疾病病因的例子包括,但不限于:心血管疾病、高血压、糖尿病、肾丝球肾炎(glomerulonephritis)、多囊性肾病(polycystickidney diseases),以及肾脏移植排斥。
术语“纤维化(fibrosis)”意指纤维组织的异常进程,或者类纤维瘤(fibroid)或纤维变性(fibrous degeneration)。纤维化可由各种不同急性或慢性的损伤或疾病所引起,以及经常可能由与各种不同器官的移植有关的移植排斥反应所引起。纤维化通常涉及细胞外基质成分(extracellular matrix components)的异常产生、累积或沉积,包括例如胶原蛋白与纤维接合素(fibronectin)的过度产生与沈积增加。如本文中所使用的,术语“肾脏纤维化(kidney fibrosis)”、“肾纤维化(renal fibrosis)和“肾脏的纤维化(fibrosis of the kidney)”意指与细胞外基质组分(特别是胶原蛋白)的过量产生或异常沉积相关的疾病(diseases)或障碍(disorders),其导致肾功能的退化或损害。
如本文中所使用的术语“缓解(alleviating)”意指降低(lessening)、诱发停滞(inducing stasis)或者延后(postponing)或减少(reducing)疾病或病况(condition)的进展(progression)、发展(development)、发作(onset)或严重性(severity),或者与本文中所描述的疾病或障碍或病况相关的一或多个症状(symptoms)的严重性,或者改善(ameliorating)现有的不受控制或非所欲的症状、预防额外的症状,或者缓解或预防(prevent)症状的潜在代谢因素。因此,这些术语表示有益的结果已被赋予给带有疾病或症状或具有发展出此类疾病或症状的可能性的个体。当该个体经历疾病、病况或病症(illness)的一种或多种病征(signs)或症状的部分或全部的缓解或减少时,反应被实现。
如本文中所使用的,术语“个体”意指任何感兴趣的动物,诸如人(humans)、猴子(monkeys)、牛(cows)、绵羊(sheeps)、马(horses)、猪(pigs)、山羊(goats)、狗(dogs)、猫(cats)、小鼠(mice)以及大鼠(rats)。在某些具体例中,该个体可为人类。
依据本发明,该氨基酸亚铁螯合物中该亚铁离子与该氨基酸的螯合比例落在1:1至1:4的范围内。在某些具体例中,该氨基酸亚铁螯合物中该亚铁离子与该氨基酸的螯合比例落在1:1.5至1:2.5的范围内。
用于制备该氨基酸亚铁螯合物的方法已被揭示在,例如,US2017/0224727A1中,并且包括在加热下使亚铁化合物与氨基酸混合的步骤。在某些具体例中,该混合步骤可在范围落在60℃至90℃的温度下被进行。在某些具体例中,该混合步骤可被进行历时8小时至48小时。
依据本发明,在该制备方法中所使用的亚铁化合物与氨基酸的重量比例介于1:1.2与1:1.5之间。在本发明的具体例中,该亚铁化合物与该氨基酸的重量比例为1:1.3。
在某些具体例中,该亚铁化合物可为硫酸亚铁(ferrous sulfate)、氯化亚铁(ferrous chloride)、焦磷酸亚铁(ferrous pyrophosphate),或者它们的组合。
在某些具体例中,该氨基酸可为甘氨酸(glycine)。也就是,该氨基酸亚铁螯合物可为甘氨酸亚铁螯合物(ferrous glycinate chelate)。
依据本发明,该组合物可被制备成药学组合物(pharmaceutical composition)或食物组合物(food composition)的形式。
若该组合物被制备成药学组合物的形式,该组合物可进一步包含药学上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier),并且利用本领域技术人员所详知的技术而被制造成适合于口服投药(oral administration)的剂型(dosage form)。该剂型的实例包括,但不限于:溶液(solution)、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、粉末(powder)、锭剂(tablet)、丸剂(pill)、糖浆(syrup)、口含锭(lozenge)、片剂(troche)、口嚼胶(chewing gum)、胶囊(capsule)、浓浆(slurry)以及类似物。
适用于本发明的药学上可接受的载剂的实例可包括,但不限于:溶剂(solvent)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agents)、分解剂(decomposers)、黏结剂(binding agents)、赋形剂(excipients)、稳定剂(stabilizing agents)、螯合剂(chelating agents)、稀释剂(diluents)、胶凝剂(gelling agents)、防腐剂(preservatives)、润滑剂(lubricants)、吸收延迟剂(absorption delaying agents)、脂质体(liposomes),以及它们的组合。
依据本发明,该组合物可呈食品添加物(food additive)的形式(食品组合物的示范性实例),其可以被添加至可食性材料(edible material)中以制备供人类或动物食用的食品产品。依据本发明,该食物产品的实例可包括,但不限于:流体乳品(fluid milkproducts),例如,牛奶(milk)以及浓缩牛奶(concentrated milk);发酵乳品(fermentedmilk),例如,酸奶(yogurt)、酸乳(sour milk)以及冷冻优格(frozen yogurt);奶粉(milkpowder);冰淇淋(ice cream);奶酪(cream cheeses);干酪(dry cheeses);豆奶(soybeanmilk);发酵豆奶(fermented soybean milk);蔬果汁(vegetable-fruit juices);果汁(fruit juices);运动饮料(sports drinks);甜点(confectionery);果冻(jelly);糖果(candies);健康食品(health foods);动物饲料(animal feeds);以及膳食补充品(dietary supplements)。
依据本发明,该组合物的投药剂量与频率可视下列因素而变化:要被治疗的疾病的严重性,以及要被治疗的个体的体重、年龄、身体状况以及反应。举例来说,依据本发明,该组合物的每日剂量可以是每kg体重12至36mg,并且可以单一剂量或数个剂量而被投药。
本发明将通过下列的实施例而被进一步说明。然而,应了解的是:下列的实施例仅是意欲供例示说明用,而不应被解释为本发明于实施上的限制。
<实施例>
一般实验材料:
1.氨基酸亚铁螯合物的制备:
氨基酸亚铁螯合物是根据在例如US 2017/0224727 A1中所描述的操作过程而被制备。具体而言,硫酸亚铁与甘氨酸(高于98%的纯度)以为1:1.3的重量比例而被混合,继而自60℃加热至90℃历时8小时至48小时,借此而得到氨基酸亚铁螯合物。在所得到的氨基酸亚铁螯合物中亚铁离子与氨基酸的螯合比例介于1:1与1:4之间。
2.实验小鼠
购自于NLAC实验动物中心(台北,中国台湾)的雄性C57BL/6J小鼠(具有约为25公克的体重)被饲养在下列实验条件下的动物房中:约24℃的温度以及12小时光照/12小时黑暗的周期。饲料与水分被任意采食地(ad libitum)提供给所有的实验动物。
3.人类肾脏上皮细胞系(HK-2)的来源与培养
在下列实验中所使用的人类肾脏近端小管表皮细胞系(human kidney proximaltubular epithelial cell line)HK-2[来自正常成年人类肾皮质(renal cortex)]得自于食品工业发展研究所(Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)的生物资源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center,BCRC)(300新竹市食品路331号,中国台湾)。
HK-2细胞被培养在10-cm培养皿(petri dish)中,各个培养皿含有补充以HyCloneTM 1%(v/v)青霉素-链霉素(penicillin-streptomycin)(制造商:Cytiva;货号:SC30010)的杜贝可氏改良的依格氏培养基/Ham氏营养混合物F-12(Dulbecco’s modifiedEagle’s medium/Ham’s Nutrient Mixture F-12,DMEM/F12)(制造商:Thermo FisherScientific,WA,USA;货号:12500062)。之后,在一个培养条件设为37℃与5%CO2的培养箱中进行培养。每隔2天更换培养基。当细胞密度达到约85%汇合度(confluence)时,所培养的细胞被进行继代培养(sub-culturing)。
一般实验方法:
1.单侧输尿管阻塞(Unilaterial ureter obstruction,UUO)手术
UUO手术是依据实验动物的照护与使用准则(Guidelines for Care and Use ofLaboratory Animals)来进行。具体而言,在UUO手术期间,各小鼠通过以大约每kg体重60mg的剂量的戊巴比妥(pentobarbital)(制造商:Merck KGaA,达姆施塔特,德国;货号:P3761)的腹膜内注射(intraperitoneal injection)被麻醉。在腹中线(abdominal midline)的左侧的皮肤组织与皮下肌肉层(subcutaneous muscle layer)被切开,而使得左肾被露出,并且左侧的输尿管被辨识与分离。左输尿管在距肾门(renal hilum)约1cm的上游位置和距肾门约1cm下游位置使用剪刀而被剖开并且使用丝质手术缝合线(尺寸:4-0)来结扎。确认无出血与无漏尿发生后,所切开的皮下肌肉层与皮肤组织被缝合。
2.统计学分析(statistical Analysis)
在下面所述的所有实验均被进行三重复。所有测试组别的实验数据是以平均值(mean)±标准误差(standard deviation,SD)来表示,并且是使用GraphPad Prism 4软件(开发商:GraphPad Sofware,Inc.,圣地亚哥,CA)与SPSS 12.0(International BusinessMachine Corporation)而以非成对双尾史徒登氏t-试验(unpaired two-tailed Student’s t-test)来作分析,以评估各组间的差异性。统计学显著性(statistical significance)是以p<0.05来表示的。
实施例1.氨基酸亚铁螯合物在缓解肾脏纤维化上的效用评估
A.血液与尿液样品的生化分析
实验方法:
将“一般实验材料”的第2项中所述的雄性C57BL/6J小鼠随机分为5组,也就是,一个假手术组(sham-operated group,SOG)、一个病理对照组(pathological controlgroups,PCG)以及三个实验组[也就是,实验组1(experimental group 1,EG1)、实验组2(experimental group 2,EG2)与实验组3(experimental group 3,EG3)](每组n=3)。在动物房饲养历时一周后,对PCG以及EG1至EG3的小鼠进行如在“一般实验方法”的第1项中所述的UUO手术。对SOG的小鼠进行了类似的手术操作,除了SOG中的小鼠的输尿管没有被阻塞,也就是左输尿管没有被剖开与结扎。手术后,在整个历时7天的实验过程中,所有的小鼠都被置于铁笼中。
EG1至EG3的小鼠分别经由口服胃管灌食法(oral gavage)而被投药以呈5mg/kg体重、125mg/kg体重以及250mg/kg体重的剂量的“一般实验材料”的第1项中所述的氨基酸亚铁螯合物,每天一次(在早上),历时7天。在第7天结束时,从EG1至EG3的每只小鼠取得血液样本和尿液样本,每个样本的体积为0.2mL。SOG的小鼠与PCG的小鼠没有接受任何处理(也就是0mg/kg的亚铁氨基酸螯合物),而在第7天结束时,从每只小鼠取得血液样本和尿液样本,每个样本的体积为0.2mL。
对各小鼠的血液样本进行丙氨酸转氨酶(alanine transaminase,ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate transaminase,AST)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和肌酸酐(creatinine)的水平测量,以评估肾脏健康。对各小鼠的尿液样品进行尿素氮(ureanitrogen)与肌酐酸的水平定量,以评估肾脏健康。对于上述参数中的各者,根据如在“一般实验方法”的第2项中所述的方法来分析各组间的差异。
结果:
图1显示了UUO手术后7天各组小鼠血液样品中的ALT、AST、尿素氮和肌酐酸的水平(上区),以及尿液样品中的尿素氮和肌酐酸的水平(下区)。如图1的上区所示,PCG的血液尿素氮水平显著地高于SOG所具者,表示:UUO手术负面地影响了小鼠的肾功能。此外,与PCG所具者相较下,在EG1至EG3中的各者所测得的血液尿素氮水平有显著地减低,甚至近似于SOG所具者。而且,在EG1至EG3间的血液尿素氮水平没有观察到显著的差异。再者,对于血液样本中ALT、AST与肌酐酸水平的各者,在SOG、PCG以及EG1至EG3间没有观察到显著的差异。
如图1的下区所示,PCG的尿液肌酐酸水平和尿素氮水平显著地高于SOG所具者,表示:UUO手术负面地影响了小鼠的肾功能。此外,与PCG所具者相较下,EG2与EG3所测得的尿液肌酐酸水平有显著地减低,而在PCG、EG1、EG2以及EG3的尿液尿素氮水平间没有观察到显著的差异。
这些结果显示:本发明的氨基酸亚铁螯合物在缓解UUO手术所引起的肾脏纤维化和改善肾功能上是有效的。
B.肾脏形态学的观察
实验方法:
收集血液与尿液样品后,牺牲本实施例第A项中所述的各组小鼠。收集各小鼠的左肾与右肾。将PCG以及EG1至EG3的阻塞左肾与SOG所具者进行关于肾脏形态学观察的视觉比较。
结果:
图2显示UUO手术后7天各组小鼠的肾脏形态学。如图2所示,在UUO手术后7天,与SOG的小鼠所具者相较下,PCG的小鼠的阻塞左肾展现出更高程度肉眼上的形态学变异[例如肥大(hypertrophy)、水肾(hydronephrosis)、肾小管扩张(tubular dilation)以及间质性扩张(interstitial expansion)],表示:肾脏纤维化已通过UUO手术而被诱发。
C.肾脏组织的组织学分析
实验方法:
从各组中所选定的一只小鼠的阻塞左肾来分离出肾脏组织。使用10%福尔马林(formalin)进行固定,并且使用一系列梯度的酒精(从低至高浓度)和二甲苯(xylene)进行脱水,然后包埋在石蜡中。得到4mm的组织切片并且置于载玻片上,然后在37℃的烘箱中加热过夜以熔化石蜡(paraffin)。使用二甲苯来去除熔化的石蜡,并且使用梯度的酒精(从高至低浓度)来进行复水(rehydration)。使用1%H2O2来去除内生性过氧化酶(endogenousperoxidase),然后使用磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate-buffered saline,PBS)洗涤,借此提升渗透性。将组织切片与胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)培育以防止一些非特异性抗原(non-specific antigens)结合后,通过负压来去除水分。
为了α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,SMA)的染色,在室温下对组织切片添加抗α-平滑肌肌动蛋白(SMA)(α-SMA)的一次抗体(primary antibody)(制造商:Abcam PLC;货号:ab5694)以1:400的稀释比例,并且使反应在室温下进行2小时。此后,使用PBS洗涤两次以去除未结合的一次抗体。加入聚合物-HRP二次抗体(Polymer-HRPsecondary antibody)(制造商:Golden Bridge International Inc.,USA)。反应一小时后,使用PBS进行洗涤两次。加入卵白素-生物素复合物(avidin-biotin complex,ABC)溶液,并且使反应在室温下进行历时45分钟,然后使用PBS洗涤两次。α-平滑肌肌动蛋白(SMA)是基于经染色的组织切片中的棕色分布来进行识别的。
核染色(nuclear staining)是通过将组织切片浸入底物缓冲液中历时10分钟来进行的。在反应被抑止(quenched)后,加入Hematoxylin Gill II溶液(制造商:Leica Biosystems Inc.;货号:3801522)和Eosin Y溶液(制造商:LeicaBiosystems Inc.;货号:3801602),接着施用ddH2O来清洗多余的染色溶液。使用酒精来进行脱水(dehydration),然后将封固剂(mounting medium)逐滴添加至载玻片上并使用盖玻片来覆盖该载玻片。细胞核是基于经染色的组织切片中的蓝色分布来进行识别。
间质胶原纤维(interstitial collagen fibers)和肌肉纤维(muscle fibers)的染色是使用三色染色试剂盒(Trichrome Stain Kit)[改良的马森氏(Modified Masson's)](制造商:ScyTek Laboratories,Inc.;货号:TRM-2-IFU)并根据制造商的指南来对组织切片进行。胶原纤维和肌肉纤维是基于经染色的组织切片中的蓝色与红色分布分别来进行识别的。
针对可供作细胞在病理情况(特别是经历纤维化)下的标记--中间丝蛋白(vimentin)染色,在Rapid Science Co.Ltd.(中国台湾)的人员所提供的帮助下对组织切片进行免疫组织化学分析(immunohistochemical analysis)。具体而言,在室温下以1:50的稀释比例来添加抗中间丝蛋白的一次抗体(制造商:Cell Signaling Technology,Inc.;货号:#5741),且使反应在室温下进行历时2小时。此后,使用PBS进行洗涤两次以去除未结合的一次抗体。加入聚合物-HRP山羊抗-兔子IgG H&L二次抗体(polymer-HRP goat anti-rabbit IgG H&L secondary antibody)(制造商:Abcam PLC,剑桥,UK;货号:ab214880)。反应一小时后,使用PBS进行洗涤两次。中间丝蛋白是基于染色组织切片中的棕色分布来进行识别的。
各个经染色的组织切片是使用荧光显微镜[制造商:Carl Zeiss Microscopy,LLC,USA;型号:Axio Imager.A2(490022-0009-000)]在100X的倍率下来进行成像(imaging)和摄影的。
结果:
图3显示了UUO手术后7天各组所选定的小鼠的肾脏组织切片的组织学分析。如图3所示,UUO手术后7天,与所选定的SOG小鼠所具者相较下,所选定的PCG小鼠的阻塞左肾的组织展现出更高程度的肾小管扩张[如苏木素和伊红(H&E)染色所示],增多的胶原纤维与肌肉纤维间质沉积(interstitial deposition)(如马森氏三色染色所示),增加的肌动蛋白纤维量(如α-SMA染色所示)以及增加的经历纤维化的细胞数量(如中间丝蛋白染色所示),这证实:肾小管间质纤维化已通过UUO手术而被诱发。此外,与PCG所具者相较下,在EG1至EG3中的各者肾小管扩张、胶原纤维和肌肉纤维的间质沉积、肌动蛋白纤维量以及经历纤维化的细胞数量皆显著地减少,而与EG1所具者相比,EG2和EG3在肾小管扩张以及胶原纤维和肌肉纤维的间质沉积上的减少程度更多。这些结果显示:本发明的氨基酸亚铁螯合物能够缓解肾纤脏维化。
D.肾脏组织的蛋白质表达分析
实验方法:
从各组中所选定的一只小鼠的阻塞左肾分离出肾脏组织,然后在冰上使用NETN溶解缓冲液(NETN lysis buffer)(20mM Tris、150mM氯化钠、1mM EDTA与0.5%NP-40)来予以溶解。将所形成的细胞溶解物离心,并且收集上清液以供作为总蛋白样品。
将由布拉福分析法(Bradford assay)所测定的呈等量(也就是20μg)的蛋白质样品在8%或10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide,SDS-PAGE)凝胶中来进行解析,然后进行免疫墨点分析(immunoblot analysis)。具体而言,将经分离的蛋白质转移至-P聚二氟亚乙烯膜(polyvinylidenedifluoride membranes,PVDF membranes)(制造商:Merck Millipore,NJ,USA)。将由此而获得的经印渍的PVDF膜在室温下使用Tris缓冲生理盐水(Tris-buffered saline,TBS)与含有5%脱脂奶粉的0.1%(vol/vol)聚山梨醇酯20(polysorbate 20)(也被称为Tween 20)来进行封组历时1小时,继而使用TBST来洗涤3次,每次历时10分钟,然后使用指定的一次抗体来进行探测(probing)过夜。将经探测的膜使用TBST缓冲液(TBS与聚山梨醇酯20的混合物)来洗涤3次,每次历时5分钟,接着在室温下与二次抗体[诸如辣根过氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)-缀合的抗-小鼠抗体或HRP-缀合的抗-兔子抗体]进行培育历时60分钟。HRP是使用ECL检测试剂(Merck Millipore,达姆施塔特,德国)来进行侦测的,而条带强度(band intensity)是通过ImageQuantTM LAS-4000冷光影像分析仪(luminescence image analyzer)(GE Healthcare)来进行测定的。
用于侦测各个蛋白质的一次抗体和二次抗体被显示于表1中。抗-甘油醛3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)被用作为加载对照。
表1
结果:
图4显示UUO手术7天后各组肾脏组织中纤维蛋白(也就是α-SMA、胶原蛋白I型以及中间丝蛋白)的西方墨点法(Western blot)结果。如图4所示,与SOG相较下,PCG的中间丝蛋白、α-SMA和胶原白I型的表达有增加,表示:UUO手术后肾脏纤维化发生。此外,与PCG所具者相较下,中间丝蛋白的表达水平从EG1至EG3依次地降低,并且与PCG所具者相较下,EG2与EG3在表达水平上展现出显著的降低。此外,与PCG所具者相较下,EG3的α-SMA与胶原蛋白I型的表达显著地降低,而在EG1、EG2与PCG之间没有观察到显著差异。这些结果显示:本发明的氨基酸亚铁螯合物当以250mg/kg的剂量来投药时能够降低肾脏中纤维蛋白的表达。
总而言之,这些结果表示:本发明的氨基酸亚铁螯合物在缓解肾脏纤维化上是有效的。
实施例2.氨基酸亚铁螯合物的细胞毒性分析
实验方法:
首先,将一般实验材料的第3项中所描述的HK-2细胞以每孔2×104个细胞的浓度接种到6-孔培养板的孔中,各孔均含有补充有1%(v/v)青霉素-链霉素的DMEM/F-12,然后分为7组,也就是一个对照组(CG)与6个实验组[也就是实验组1至6(EG1至EG6)],继而在培养箱中以设置在37℃与5%CO2的培养条件下来进行培养历时24小时。接着,对EG1至EG6中的各个细胞培养物处理以具有50、100、250、500、750以及1000μg/mL的浓度中的一对应者的亚铁氨基酸螯合物,而CG的细胞培养物没有接受任何处理。培养24小时后,移除各组培养基,并使用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)来洗涤细胞二次,接着使用浓度为0.5mg/mL的MTT试剂来进行培育历时4小时。之后,移除MTT试剂,并且在室温下将细胞培育以1mL的异丙醇历时5分钟。接着,收集各组的培养基并使用分光亮度计在570nm(OD570)的波长下来进行吸亮度测量。
各组的细胞可活性比率(%)是使用下面的公式(I)而被计算的:
A=(B/C)×100 (I)
其中A=细胞可活性比率(%)
B=各组的OD570值
C=对照组的OD570值
根据一般实验方法的第2项中所述的方法来对各组间的差异进行统计分析。
结果:
图5显示了各组HK-2细胞在处理以氨基酸亚铁螯合物后的细胞可活性比率。如图5所示,EG1至EG6中各组HK-2细胞的可活性相较于CG所具者没有显著地影响,表示:使用本发明的氨基酸亚铁螯合物来处理肾小管上皮细胞后没有诱发细胞毒性。
实施例3.氨基酸亚铁螯合物在缓解TGF-β1所诱发的肾脏纤维化上的效用评估
实验方法:
首先,将一般实验材料的第3项中所述的HK-2细胞以每孔4x104个细胞的浓度接种到6-孔培养板的孔中,各孔含有补充有1%(v/v)的青霉素-链霉素的DMEM,然后分成4组,也就是一个对照组、一个比较组1、一个比较组2与一个实验组,继而培养至90%汇合度。接着,通过使用200μL的量吸管尖管(pipette tip)沿相应孔的直径刮除各组的细胞培养物,以产生约50μm的无细胞伤口区域(cell-free wound area)。然后,移除培养基,并且将新鲜培养基(也就是无血清DMEM)与2μg/mL的丝裂霉素c(mitomycin c)(供作为细胞增生抑制剂)添加至各组的细胞中。之后,对比较组1的细胞处理以50ng/mL的转化生长因子β-1(transforming growth factor beta-1,TGF-β1)(来源:购自于R&D systems,Inc.的重组型人类TGF-β1蛋白质;货号:240-B),对比较组2的细胞处理以100μg/mL的氨基酸亚铁螯合物,以及对实验组的细胞处理以50ng/mL的TGF-β1与100μg/mL的氨基酸亚铁螯合物。对照组的细胞没有接受任何处理。细胞迁移是在第0小时与第24小时使用倒立式光学显微镜来进行评估的。
结果:
图6是显示各组HK-2细胞的迁移的光学显微镜影像。如图6所示,在24小时,与对照组相较下,比较组1的HK-2细胞得到了经提升的进入无细胞伤口区域的迁移行为(也就是远离其上皮细胞群落移动),证实:HK-2细胞已通过TGF-β1而被诱发去经历上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程。相对地,与比较组1所具者相较下,实验组的HK-2细胞显示出经减低的迁移到无细胞伤口区域的能力,表示:本发明的氨基酸亚铁螯合物能够抑制由TGF-β1所诱发的EMT过程。由于EMT在诸如纤维化的病理情况下被重现,此结果暗示:本发明的氨基酸亚铁螯合物能够缓解肾脏纤维化。
综上所述,这些结果证明了本发明的氨基酸亚铁螯合物对肾脏纤维化的治疗效果。因此,本发明的氨基酸亚铁螯合物被预期可用于缓解肾脏疾病(例如,急性肾脏疾病)与器官(诸如肾脏)的纤维化。
于本申请说明书内所引述的所有专利案与文献数据以及其中所描述的参考数据是以它们的整体在此被并入以作为参考数据。若有所冲突时,本申请详细说明(包含界定在内)将占上风。
虽然本发明已参照被认为是示范性的具体例而被描述,应被了解的是:本公开内容不限于所揭示的具体例,而意欲涵盖被包括在最广泛的解释的精神与范畴中的各种不同的配置,以包含所有这类的修改以及等效的配置。
Claims (11)
1.一种用于缓解在个体中的肾脏疾病的方法,其包含对该个体投药以含有氨基酸亚铁螯合物的组合物,该氨基酸亚铁螯合物包括亚铁离子与氨基酸。
2.如权利要求1的方法,其特征在于:该氨基酸亚铁螯合物是甘氨酸亚铁螯合物。
3.如权利要求1的方法,其特征在于:在该氨基酸亚铁螯合物中该亚铁离子与该氨基酸的螯合比例落在1:1至1:4的范围内。
4.如权利要求1的方法,其特征在于:该组合物被口服投药。
5.如权利要求1的方法,其特征在于:该肾脏疾病是急性肾脏疾病。
6.一种用于缓解在个体中的器官的纤维化的方法,其包含对该个体投药以含有氨基酸亚铁螯合物的组合物,该氨基酸亚铁螯合物包括亚铁离子与氨基酸。
7.如权利要求6的方法,其特征在于:该氨基酸亚铁螯合物是甘氨酸亚铁螯合物。
8.如权利要求6的方法,其特征在于:在该氨基酸亚铁螯合物中该亚铁离子与该氨基酸的螯合比例落在1:1至1:4的范围内。
9.如权利要求6的方法,其特征在于:该组合物被口服投药。
10.如权利要求6的方法,其特征在于:该器官选自于由下列所构成的群组:肾脏、肺脏、肝脏、睪丸,以及它们的组合。
11.如权利要求10的方法,其特征在于:该器官是肾脏。
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