CN108498805B - 一种利用生物细胞膜提高阳离子共轭聚合物生物相容性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用生物细胞膜提高阳离子共轭聚合物生物相容性的方法。本发明要求保护一种细胞膜在制备降低阳离子共轭聚合物诱导红细胞和/或血小板聚集的产品中的应用。本发明提供的降低阳离子共轭聚合物诱导红细胞聚集的产品，为由细胞膜和阳离子共轭聚合物复合而得。本发明有效提高了阳离子共轭聚合物在血液中的生物相容性，为共轭聚合物在生物领域的应用提供了更多的保障。引进的生物细胞膜来源于生物体系，具备生物相容性的保障，且其自带的生物特性(如抗原性)也可拓宽共轭聚合物的应用。
Description
技术领域
本发明属于化学领域，涉及一种利用生物细胞膜提高阳离子共轭聚合物生物相容性的方法。
背景技术
心血管疾病已然成为人类生命与健康的最大威胁之一，包括冠状动脉粥样硬化，心力衰竭，心律失常，高血压等，而在这形式多样的心血管疾病中，血栓是常见且不容忽视的病症之一。血栓主要由不溶性的纤维蛋白，沉积的血小板，积聚的白细胞和陷入的红细胞组成。其中红细胞作为血液中含量最多的血细胞，承担着运输氧气和二氧化碳的重要功能，所以它们在血液中的正常稳定的流通是身体正常运转的重要保证。一般情况下，红细胞表面的负电荷同性排斥从而维持了细胞较好的悬浮稳定性，而当血浆中带正电荷的蛋白质增加，被红细胞吸附后，表面电荷减少，红细胞聚集，血液黏度增加，促进血栓的形成。
阳离子聚电解质以其良好的光电性质及生物相容性等在生物传感和成像，病原菌的检测与杀伤，肿瘤的抑制等领域得到了广泛的关注和应用。但是，当这些阳离子聚电解质进入血液中时，会引发红细胞的聚集，造成血液黏度增加，促进血栓的形成，为了避免这种情况的发生，对聚合物的性质进行进一步的改进和完善具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用生物细胞膜提高阳离子共轭聚合物生物相容性的方法。
本发明要求保护一种细胞膜在制备降低阳离子共轭聚合物诱导红细胞和/或血小板聚集的产品中的应用。
本发明还要求保护细胞膜在制备抑制红细胞和/或血小板聚集的产品中的应用。
本发明提供了一种降低阳离子共轭聚合物诱导红细胞聚集的产品，该产品为由细胞膜和阳离子共轭聚合物复合而得。
具体的，所述阳离子共轭聚合物可为式I-式III任一所述聚合物；
所述式I-式III中，n为5-50；具体为10-20；m为5-50；具体为10-20。
式I简称为PFP，式Ⅱ简称为PPV，式Ⅲ简称为PMNT；
所述细胞膜与阳离子共轭聚合物的用量比为80μg：10-100μmol；
各种生物细胞膜均适用于本发明。
更具体的，所述细胞膜可来源于革兰氏阴性菌、正常细胞、癌细胞或血小板。
再具体的，所述细胞膜为所述革兰氏阴性菌的外膜囊泡；
所述革兰氏阴性菌具体为铜绿假单胞杆菌或大肠杆菌。
所述细胞膜均可按照各种常规方法提取而得。
如对于铜绿假单胞杆菌的外膜囊泡，可参照文献Jagath L.Kadurugamuwa andTerry J.Beveridge.Virulence Factors Are Released from Pseudomonas aeruginosain Association with Membrane Vesicles during Normal Growth and Exposure toGentamicin:a Novel Mechanism of Enzyme Secretion Journal of Bacteriology1995,177(14),3998-4008.对铜绿假单胞杆菌的外膜囊泡进行提取。提取得到的外膜囊泡的浓度通过BCA试剂盒确定。
所述抑制红细胞和/或血小板聚集的产品中还包括水；
所述细胞膜在水中的浓度为50-150μg/mL；具体为80μg/mL。
本发明提供的制备所述抑制红细胞和/或血小板聚集的产品的方法，包括如下步骤：
将所述细胞膜与所述阳离子共轭聚合物进行接触而得。
经过如上接触，即可通过扫描电镜、透射电镜和激光共聚焦荧光显微镜证实复合物的形成。
上述方法中，所述接触在水中进行；
所述细胞膜与所述阳离子共轭聚合物的用量比为80μg：10-100μmol；
所述细胞膜在水中的浓度为50-150μg/mL；具体为80μg/mL。
所述接触步骤中，温度为室温；时间为30min-24h；具体为4h。
另外，本发明还要求保护上述本发明提供的降低阳离子共轭聚合物诱导红细胞聚集的产品在制备降低阳离子共轭聚合物诱导红细胞和/或血小板聚集的产品或在制备抑制红细胞和/或血小板聚集的产品中的应用。
本发明利用细胞膜与阳离子共轭聚合物形成复合物，可以使得原本会引起红细胞聚集的阳离子共轭聚合物，不再诱导红细胞聚集，从而降低阳离子共轭聚合物诱导血栓形成的可能性。这一点通过激光共聚焦荧光显微镜得到了证明。本发明有效提高了阳离子共轭聚合物在血液中的生物相容性，为共轭聚合物在生物领域的应用提供了更多的保障。引进的生物细胞膜来源于生物体系，具备生物相容性的保障，且其自带的生物特性(如抗原性)也可拓宽共轭聚合物的应用。
附图说明
图1为铜绿假单胞杆菌的外膜囊泡与三种阳离子共轭聚合物形成的复合物的扫描电镜结果。
图2为铜绿假单胞杆菌的外膜囊泡与三种阳离子共轭聚合物形成的复合物的透射电镜结果。
图3为不同浓度的三种共轭聚合物在与外膜囊泡形成复合物前后分别与红细胞作用的激光共聚焦荧光显微镜下观察的结果。
图4为100μM的三种共轭聚合物与外膜囊泡形成复合物前后的ζ电势变化，以及共轭聚合物与红细胞作用前后，共轭聚合物与外膜囊泡形成的复合物与红细胞作用前后的ζ电势变化。
图5为式Ⅱ所示共轭聚合物与外膜囊泡及红细胞作用过程中的等温量热滴定结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
下述实施例中铜绿假单胞杆菌的外膜囊泡的提取按照如下步骤进行：
在200mL LB培养基中加入100μL铜绿假单胞杆菌的液体菌种，在37℃摇床中过夜孵育。在上述细菌培养液中加入硫酸庆大霉素，使其终浓度为8μg/mL，继续在37℃下孵育1h，细菌悬浮液在6000g下离心10min，收集上清，沉下来的菌体弃去。收集的上清依次用0.45μm和0.22μm孔径大小的滤器过滤，以进一步除去细菌菌体，滤液在贝克曼超高速离心机下离心，120000g，30min,沉淀用50mM HEPES buffer(pH＝6.8)洗涤一次，再次离心(120000g X 30min)，沉淀即为OMV，重悬于超纯水中。
红细胞的提取按照如下步骤：100μL新鲜小鼠血液(肝素钠抗凝)在800g X 5min下离心5min，沉下来的细胞用预冷的生理盐水洗涤3次，重悬于100μL生理盐水中，置于碎冰上，备用。
实施例1、铜绿假单胞杆菌外膜囊泡与聚合物的复合物制备
向蛋白浓度为80μg/mL的OMV水溶液中加入式I至式III中任一阳离子共轭聚合物(n为10-20；m为1-20)至终浓度分别为10μM、100μM，混匀，室温下作用4h即可得到CP-OMV复合物。
实施例2、实施例1所用阳离子共轭聚合物与红细胞作用的荧光成像实验
在25L制备好的不同浓度的(10μM，100μM)聚合物溶液中，分别加入5μL上述红细胞悬浮液，混匀，取3L滴在载玻片上，再加上盖玻片，于LSCM下观察。其中式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ所示共轭聚合物的激发光波长分别为405nm,488nm和405nm。
实施例3、实施例1所得阳离子共轭共轭聚合物与外膜囊泡形成的复合物与红细胞作用的荧光成像实验
在25μL制备好的不同浓度的(10μM，100μM)聚合物与外膜囊泡的复合物悬浮液中，分别加入5μL上述红细胞悬浮液，混匀，取3μL滴在载玻片上，再加上盖玻片，于LSCM下观察。其中式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ所示共轭聚合物的激发光波长分别为405nm,488nm和405nm。
实施例4、共轭聚合物与外膜囊泡形成复合物前后的电势变化
向蛋白浓度为80μg/mL的外膜囊泡水溶液中加入共轭聚合物至终浓度为100μM，混匀，室温下作用4h得到共轭聚合物与外膜囊泡的复合物后，在zeta电位仪上测量其ζ电势大小。
实施例5、共轭聚合物与外膜囊泡形成复合物及共轭聚合物与红细胞作用前后的电势变化
在100μM的共轭聚合物水溶液中加入上述处理好的红细胞悬浮液，混匀后在zeta电位仪上测量其电势。同样，在100μM的聚合物与外膜囊泡的复合物中加入上述红细胞，混匀后测其电势。
实施例6、式Ⅱ所示共轭聚合物与铜绿假单胞杆菌的外膜囊泡作用过程中的等温量热滴定测试
配制240μM的式Ⅱ水溶液，将其储存在注射器中，约需330μL；制备的80μg/mL的外膜囊泡的水溶液，取600μL置于样品池中，以10μL每滴的速度滴定，通过一根金属螺旋桨以90r/min的速度搅拌样品池中的体系。
实施例7、式Ⅱ所示共轭聚合物及其与外膜囊泡形成的复合物和红细胞作用过程中的等温量热滴定测试
240μM的式Ⅱ的生理盐水溶液或式Ⅱ与外膜囊泡复合物溶液约330μL储存在注射器中，在样品池中装入约600μL上述处理过的红细胞悬浮液，以10μL每滴的速度滴定，通过一根金属螺旋桨以60r/min的速度搅拌样品池中的体系。
从扫描电镜和透射电镜结果可知，纳米级别的共轭聚合物可与提取的纳米级的铜绿假单胞杆菌的外膜囊泡形成微米级的复合物。
上述实施例2-7所得结果见图1至图5。由图可知，式Ⅰ所示共轭聚合物在10μM时可诱导红细胞的聚集，在100μM时却不会，但在与外膜囊泡形成复合物之后，10μM的复合物不再引起红细胞聚集，而100μM的复合物却能够引起细胞聚集，说明式Ⅰ所示共轭聚合物在低浓度下时，与膜形成的复合物可以降低红细胞的聚集，而在高浓度时反而会因为增加了聚合物在水中的分散性而促进其与红细胞的作用而引发聚集效果。式Ⅱ所示共轭聚合物在10μM和100μM时均可诱导红细胞的聚集，且随着浓度的增加，聚集效果更明显，而当其与膜形成复合物后，都可以避免红细胞聚集体的产生，说明式Ⅱ所示共轭聚合物在与膜形成复合物后具有很好的抑制红细胞聚集的效果。式Ⅲ所示共轭聚合物在10μM时不会引起红细胞的聚集，100μM时可以，而在与膜形成复合物后，都没有红细胞聚集体形成，说明膜的加入也阻碍了其与红细胞的作用，从而抑制了红细胞的聚集。
通过ζ电势的测量和等温量热滴定结果，进一步了解了共轭聚合物与外膜囊泡及红细胞的作用过程，推测共轭聚合物与外膜囊泡主要是在静电作用下形成了复合物，而共轭聚合物与红细胞的作用则主要依靠疏水相互作用驱动，当共轭聚合物与外膜囊泡形成复合物之后，在一定程度上减弱了共轭聚合物与红细胞作用的强度，从而避免了红细胞的聚集。
Claims (8)
1.细胞膜在制备降低阳离子共轭聚合物诱导红细胞聚集的产品中的应用；
所述阳离子共轭聚合物为式I-式III任一所述聚合物；
所述降低阳离子共轭聚合物诱导红细胞聚集的产品为由所述细胞膜和阳离子共轭聚合物复合而得；
式I
式II
式III
所述式I-式III中，n为5-50； m为5-50；
所述细胞膜与阳离子共轭聚合物的用量比为80μg：10-100μmol。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述式I-式III中，n为10-20；m为10-20。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述细胞膜为生物细胞膜。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述细胞膜来源于革兰氏阴性菌、正常细胞、癌细胞或血小板。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述细胞膜为所述革兰氏阴性菌的外膜囊泡。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述革兰氏阴性菌为铜绿假单胞杆菌或大肠杆菌。
7.根据权利要求1-6中任一所述的应用，其特征在于：所述产品中还包括水；
所述细胞膜在水中的浓度为50-150 μg /mL。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述细胞膜在水中的浓度为80 μg/mL。
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