CN107434814B - 改性共轭聚合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医学领域，公开了改性共轭聚合物及其制备方法和应用。本发明提供一种改性共轭聚合物，包括式(I)或式(II)所示的化合物，其中，R1为具有共轭结构单元的基团，R2为C2‑C25的直链烷基，R3为亲水基团。本发明的改性共轭聚合物既有磷脂的生物相容性，又有共轭聚合物的荧光性质。通过与天然磷脂之间的强疏水作用嵌插在细胞的膜结构上，共轭聚合物的荧光性质能够实现对细胞内膜结构的成像；此外，在光照条件下产生的活性氧能够有效地氧化临近的不饱和磷脂，实现了药物的控制释放。本发明的改性共轭聚合物在自组装、细胞成像、细胞膜通透性调节和药物控制释放等方面具有应用价值。

Description

改性共轭聚合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体涉及改性共轭聚合物及其制备方法和应用。
背景技术
细胞膜在维持细胞内稳态、调节和选择物质进出细胞、细胞代谢等方面发挥着极其重要的作用。通过细胞膜工程化的方法在细胞膜上引入各种各样的抗体、配体、探针以及其他功能性分子极大地促进了生命科学的发展，在细胞成像、检测、肿瘤治疗等方面有着重要的意义。调控和可视化细胞膜参与的活动是细胞膜工程化的一个重要目的，在基础生物医学领域以及临床诊断中受到广泛的关注。目前广泛应用于细胞成像的荧光材料主要是量子点和小分子荧光染料，但小分子染料面临着光漂白问题，而量子点则存在由重金属泄漏带来的细胞毒性问题，所以发展一种新型的荧光材料很有必要。共轭聚合物是一类高度共轭的高分子体系，因为其自身结构的特点使其具有强的光捕获能力、高的荧光量子产率，作为一类新型的荧光材料被应运而生。同时，共轭聚合物还具有敏化为氧气产生的活性氧(ROS)的能力，在肿瘤杀伤、杀菌中都有着优异的效果。
为了使共轭聚合物能够与细胞相互作用进而实现生物功能，很多方法被用于修饰共轭聚合物，包括：引入带正电荷的侧链、在侧链上修饰细胞穿透肽、生物素、抗体、药物等。
虽然这些方法能够比较有效地应由于细胞生物学领域中，然而通过强的静电作用将共轭聚合物修饰到细胞膜上，容易造成细胞膜的破裂和细胞的死亡；通过靶向分子将共轭聚合物修饰到细胞膜上，由于细胞膜的代谢，共轭聚合物很快就被内吞进细胞，不能稳定地存在于细胞膜上。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的共轭聚合物生物相容性差、不能稳定地与细胞膜结构结合的问题，提供改性共轭聚合物及其制备方法和应用，制备的改性共轭聚合物既有磷脂的生物相容性，又有共轭聚合物的荧光性质和产生活性氧的能力。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种改性共轭聚合物，包括式(I)或式(II)所示的化合物，
其中，R1为具有共轭结构单元的基团，R2为C2-C25的直链烷基，R3为亲水基团。
本发明第二方面提供上述的改性共轭聚合物的制备方法，该方法包括：在溶剂和催化剂存在的条件下，将共轭聚合物与式(III)或式(IV)所示的化合物进行点击化学合成反应，
其中，R4为C2-C20的直链炔烃基。
本发明第三方面提供上述的改性共轭聚合物在自组装、细胞成像、细胞膜通透性调节和控制释放药物中的应用。
本发明通过使用生物活性分子磷脂将共轭聚合物进行改性，集两种分子的优势于一身，既有磷脂的生物相容性，又有共轭聚合物的荧光性质和产生活性氧的能力。磷脂结构可以促使其通过疏水作用紧密地嵌入细胞膜中，并且其代谢方式与细胞膜上的天然磷脂的途径基本类似，从而能够长时间、稳定地与细胞膜结合，不会造成细胞膜的破裂或死亡，如图3所示。此外，改性共轭聚合物具有较高的荧光量子产率，可以通过共聚焦激光显微镜对细胞膜进行成像。
本发明的改性共轭聚合物，在白光照射下产生活性氧并氧化模型脂质体上的不饱和磷脂，磷脂被氧化引起脂质体膜上产生小孔，脂质体腔内的荧光分子逐渐释放。如图9和10所示，说明通过本发明制备的改性共轭聚合物具有较好的光稳定性，长时间光照后依然能够引发模型染料分子的释放。
由此，通过本发明制备的改性共轭聚合物在细胞膜成像、细胞膜通透性调节和控制药物控制释放等方面具有应用价值。
附图说明
图1是本发明的不同浓度的改性共轭聚合物的电镜扫描图；
图2是本发明的改性共轭聚合物在不同浓度的极性溶剂中的紫外吸收光谱和荧光发射光谱图；
图3是不同时间下本发明的改性共轭聚合物在MCF-7细胞上的荧光显微镜染色图；
图4是本发明的改性共轭聚合物与MCF-7细胞的溶酶体染料的共定位荧光显微镜图；
图5是本发明的改性共轭聚合物与MCF-7细胞的细胞膜染料的共定位荧光显微镜图；
图6是本发明的改性共轭聚合物与MCF-7细胞的高尔基体染料的共定位荧光显微镜图；
图7是本发明的改性共轭聚合物与MCF-7细胞的线粒体染料的共定位荧光显微镜图；
图8是本发明的改性共轭聚合物与MCF-7细胞的内质网染料的共定位荧光显微镜图；
图9是在光照条件下空白组、具有改性共轭聚合物的脂质体及改性共轭聚合物的荧光强度图；
图10是在光照条件下引发模型分子钙黄绿素从脂质体内释放的速率图；
图11是在光照条件下本发明的改性共轭聚合物引发药物释放的机理示意图。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明第一方面提供一种改性共轭聚合物，包括式(I)或式(II)所示的化合物，
其中，R1为具有共轭结构单元的基团，R2为C2-C25的直链烷基，R3为亲水基团。
在本发明中，所述R1为共轭聚合物失去一个原子所形成的，所述共轭聚合物为本领域常规的共轭聚合物。
在本发明中，所述共轭结构单元可以为但不限于：取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基。在本发明具体的实施方式中，所述共轭结构单元可以为但不限于：苯基、对苯乙烯撑基、芴基、苯乙炔基、苯并噻唑基和噻吩基中的一种或多种。
在本发明中，所述共轭结构单元的内部以及共轭结构单元之间的键合方式选自单键、双键和三键中的至少一种。
在本发明中，所述共轭结构单元的个数以能够具有共轭聚合物的特性为目的，在本发明优选的情况下，所述共轭结构单元的个数为2-30个，优选为3-20个。
在本发明具体的实施方式中，所述R2可以为但不限于：壬烷基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十五烷基、十七烷基、8-十三烷基、8-十五烷基、8-十七烷基、8-二十一烯基和8,11,14-十七三烯基中的一种。
在本发明具体的实施方式中，所述R3可以为但不限于：胆碱基、丝氨酸基、乙醇胺基、肌醇基或甘油基。
本发明第二方面提供上述的改性共轭聚合物的制备方法，该方法包括：在溶剂和催化剂存在的条件下，将共轭聚合物与式(III)或式(IV)所示的化合物进行点击化学合成反应，
其中，R4为C2-C20的直链炔烃基。
在本发明具体的实施方式中，所述R4可以为但不限于：丙炔烃基、丁炔基或戊炔基。在优选的情况下，所述R4为丁炔基。
在本发明一种具体的实施方式中，在溶剂和催化剂存在的条件下，将共轭聚合物与式(III)所示的化合物进行点击化学合成反应，制备式(I)所示的改性共轭聚合物。
在本发明另一种具体的实施方式中，在溶剂和催化剂存在的条件下，将共轭聚合物与式(IV)所示的化合物进行点击化学合成反应，制备式(II)所示的改性共轭聚合物。
在本发明中，共轭聚合物、式(III)或式(IV)所示的化合物，以及催化剂的摩尔比以能够实现点击化学合成反应为目的，并无特别限定。在优选的情况下，共轭聚合物、式(III)或式(IV)所示的化合物，以及催化剂的摩尔比为(100-1000):(100-5000):(1-10)，优选为(100-1000):(100-2000):(1-10)。
在本发明中，所述催化剂可以为本领域常规的点击化学合成催化剂。在本发明优选的情况下，催化剂为CuI。
在本发明中，所述反应的条件以能够实现合成反应为目的。在优选的情况下，反应温度为20-60℃，优选为25-40℃；反应时间为2-48h，优选为10-12h。
在本发明中，式(III)或式(IV)所示的化合物的制备方法，包括：在溶剂存在的条件下，将式(V)所示的化合物或式(VI)所示的化合物、直链炔基羧酸、催化剂和缩合剂进行酯化缩合反应，或者进行酰胺缩合反应，
其中，R5为羟基或胺基。
在本发明一种具体的实施方式中，在溶剂存在的条件下，将式(V)所示的化合物、直链炔基羧酸、催化剂和缩合剂进行酯化缩合反应，得到式(III)所示的化合物。
在本发明一种具体的实施方式中，在溶剂存在的条件下，将式(V)所示的化合物、直链炔基羧酸、催化剂和缩合剂进行酰胺缩合反应，得到式(III)所示的化合物。
在本发明一种具体的实施方式中，在溶剂存在的条件下，将式(VI)所示的化合物、直链炔基羧酸、催化剂和缩合剂进行酯化缩合反应，得到式(IV)所示的化合物。
在本发明另一种具体的实施方式中，在溶剂存在的条件下，将式(VI)所示的化合物、直链炔基羧酸、催化剂和缩合剂进行酰胺缩合反应，得到式(IV)所示的化合物。
在本发明中，所述式(V)或式(VI)所示的化合物可以通过商购获得。
在本发明中，所述直链炔基羧酸可以为但不限于：3-丁炔酸，4-戊炔酸，5-己炔酸，优选为4-戊炔酸。
在本发明中，所述溶剂以能够实现酯化缩合反应或酰胺缩合反应为目的，在优选的情况下，所述溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、甲醇或二甲基亚砜。
在本发明中，所述催化剂可以为但不限于：4-二甲氨基吡啶。
在本发明中，所述缩合剂可以为但不限于：碳二亚胺缩合剂。
在本发明中，所述碳二亚胺缩合剂可以为但不限于：二异丙基碳二亚胺。
根据本发明的方法，所述催化剂、缩合剂、式(V)所示的化合物或式(VI)所示的化合物，以及直链炔基羧酸的摩尔比以能够实现酯化缩合反应或酰胺缩合反应为目的，可以为但不限于：(1-10):(10-200):(1-100):(10-500)。
根据本发明的方法，所述反应的条件以能够实现缩合反应或酰胺缩合反应为目的，并无特别限定。在优选的情况下，反应温度为20-60℃，优选为25-40℃，时间为3-24h，更优选为10-12h。
本发明第三方面提供上述的改性共轭聚合物的应用，可以为但不限于：在自组装、细胞成像、细胞膜通透性调节和控制释放药物中的应用。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
透射电子显微镜购自日立公司，型号为HT7700；
紫外吸收光谱购自赛默飞公司，型号为Evolusion-201；
荧光发射光谱购自日立公司，型号为F-4500；
酶标仪购自BioTec公司，型号为Synergy HT。
实施例1
(1)制备共轭聚合物
(1a)(E)-1-溴-4-(4-溴乙基苯乙烯基)苯的合成
将4-溴苄基膦酸二乙酯(购自百灵威公司，批号为377896)(2.0g，6.5mmol)，叔丁醇钠(NaOtBu)(0.69g，7.2mmol)和40mL无水四氢呋喃(THF)依次加入到100mL舒伦克烧瓶中，经过交替冷冻，抽空和解冻脱气3次之后，逐滴滴加含有4-(溴甲基)苯甲醛(1.29g，6.5mmol)的10mL脱气干燥THF溶液，将上述混合物在0℃下保持搅拌30分钟。除去冰浴后，将反应混合物在室温下搅拌24小时。将反应用水淬灭并用二氯甲烷萃取。随后，将有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥并旋干有机相。粗产物通过柱色谱(石油醚/二氯甲烷1:1)纯化，得到白色固体M，(质量为0.85g，收率为37％)。
M的氢谱数据为：1H NMR(300MHz,CDCl3,δ):7.49(d,2H,J＝2.1Hz),7.46(d,2H,J＝1.8Hz),7.39(d,2H,J＝3.0Hz),7.36(d,2H,J＝3.6Hz),7.05(d,2H,J＝2.1Hz),4.51(s,2H)。
表征数据表明：得到了(E)1-溴-4-(4-溴乙基苯乙烯基)苯。
由4-溴苄基膦酸二乙酯和4-(溴甲基)苯甲醛为原料，进行反应，得到(E)1-溴-4-(4-溴乙基苯乙烯基)苯的方程式如下：
(1b)(E)-4-(4-溴苯乙烯基)苄基膦酸二乙酯的合成
将(E)1-溴-4-(4-溴乙基苯乙烯基)苯(0.85g，2.4mM)溶解在20毫升的亚磷酸三乙酯(P(OEt)3)中，160℃回流过夜。待反应混合液冷却至室温后，减压蒸馏除去多余的亚磷酸三乙酯，得到的粗产物通过柱色谱(石油醚/二氯甲烷5:1)纯化，得到白色固体N，(质量为0.61g，收率为63％)。
N的氢谱数据为：1H NMR(300MHz,CDCl3，δ):7.45(m,4H),7.36(d,2H,J＝8.4Hz),7.29(m,2H),7.03(m,2H),4.02(p,4H,J＝7.5Hz),3.15(d,2H,J＝21.6Hz),1.25(t,6H,J＝6.9Hz)。
N的碳谱数据为：13C NMR(400MHz,CDCl3,δ):136.28,135.67,135.63,131.79,131.45,131.36,130.20,130.13,129.02,127.94,127.31,126.72,126.69,121.31,62.19,62.12,34.36,32.99,16.41,16.35。
N的质谱数据为：HRMS(HR-MALDI-TOF)m/z:[M+Na]+。
N的模拟计算值(calcd)为：C19H22BrO3P,431.038214。
N的实验值(found)为：431.038469。
表征数据表明：得到了(E)-4-(4-溴苯乙烯基)苄基膦酸二乙酯。
由(E)1-溴-4-(4-溴乙基苯乙烯基)苯和亚磷酸三乙酯为原料，进行反应，得到(E)-4-(4-溴苯乙烯基)苄基膦酸二乙酯的方程式如下：
(1c)4-((E)-4-(E)-4-溴苯乙烯基)苯乙烯基)-N,N-二丁基苯胺的合成
将(E)-4-(4-溴苯乙烯基)苄基膦酸二乙酯(610mg，1.5mmol)，NaOtBu(158mg，1.65mmol)和10mL无水THF依次加入到50mL舒伦克烧瓶中，经过交替冷冻，抽空和解冻脱气3次之后，逐滴滴加含有4-(二丁基氨基)苯甲醛(348mg，1.5mmol)的10mL脱气的无水THF溶液，将上述混合物在0℃下保持搅拌30分钟。除去冰浴后，将反应混合物在室温下搅拌24小时。将反应用水淬灭并用二氯甲烷萃取。随后，将有机层用盐水洗涤，用NaCl干燥并旋干有机相。粗产物通过柱色谱(石油醚/二氯甲烷2:1)纯化，得到白色固体P，(质量为282mg，收率为37％)。
P的氢谱数据为：1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):7.47(m,6H),7.37(m,4H),7.07(m,3H),6.86(d,2H,J＝24Hz),6.62(d,2H,J＝12Hz),3.29(t,4H,J＝8Hz),1.58(m,4H),1.37(m,4H),0.96(t,6H,J＝8Hz)。
P的碳谱数据为：13C NMR(400MHz,CDCl3,δ):148.01,138.27,136.61,135.22,131.87,129.35,129.23,127.99,126.96,126.59,126.34,124.47,123.16,119.66,116.48,111.72,68.09,58.60,50.89,29.81,29.59,20.46,18.55,14.12。
P的质谱数据为：HRMS(HR-MALDI-TOF)m/z:[M]+。
P的模拟计算值(calcd)为：C30H34BrN,487.186914。
P的实验值(found)为：487.187397。
表征数据表明：得到了4-((E)-4-(E)-4-溴苯乙烯基)苯乙烯基)-N,N-二丁基苯胺。
由(E)-4-(4-溴苯乙烯基)苄基膦酸二乙酯和4-(二丁基氨基)苯甲醛为原料，进行反应，得到4-((E)-4-(E)-4-溴苯乙烯基)苯乙烯基)-N,N-二丁基苯胺的方程式如下：
(1d)4-((E)-4-((E)-4-叠氮基苯乙烯基)苯乙烯基)-N,N-二丁基苯胺的合成
向100mL舒伦克烧瓶中加入4-((E)-4-(E)-4-溴苯乙烯基)苯乙烯基)-N,N-二丁基苯胺(150mg，0.3mmol)和15mL无水THF。将烧瓶抽真空之后，烧瓶中的溶液被冷却至-78℃，逐滴滴加正丁基锂(n-BuLi)(200μL，0.45mmol，正己烷中2.2M)。将混合物在-78℃下保持1小时，然后缓慢滴加含有4-甲基苯磺酰基叠氮化物(89mg，0.45mmol)的4mL无水THF。反应1小时后，将混合物缓慢升温至室温并再搅拌24小时。加入饱和NH4Cl溶液20mL以终止反应。旋转蒸发除掉THF后，加入氯仿萃取产物3次。有机层用饱和盐水洗涤，然后用MgSO4干燥。过滤后旋干溶剂得到固体粗产物Q，粗产物不经进一步纯化直接用于下一步骤合成。
Q的质谱数据为：HRMS(MALDI-TOF)m/z:[M+H]+。
Q的模拟计算值(calcd)为：C30H34N4,451.3。
Q的实验值(found)为：409.2。
表征数据表明：得到了4-((E)-4-((E)-4-叠氮基苯乙烯基)苯乙烯基)-N,N-二丁基苯胺。
由4-((E)-4-(E)-4-溴苯乙烯基)苯乙烯基)-N,N-二丁基苯胺和4-甲基苯磺酰基叠氮化物为原料，进行反应，得到4-((E)-4-((E)-4-叠氮基苯乙烯基)苯乙烯基)-N,N-二丁基苯胺的方程式如下：
(2)制备式(III)所示的化合物
在140mL二氯甲烷溶液中，将2mmol式(V)所示的1-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(购自西格玛公司，批次为214-097-4，其中R2为十五烷基(-C15H31)，R3为胆碱基，R5为羟基)、10mmol的4-戊炔酸、15.7mmol二异丙基碳二亚胺和2.9mmol的4-二甲氨基吡啶，在25℃下进行酯化缩合反应12h，得到式(III)所示的1-棕榈酰-2-[戊-4-炔酰基]-sn-甘油-3-磷酸胆碱(其中R2为-C15H31，R3为胆碱基，R4为丁炔基)。
(3)制备改性共轭聚合物
将步骤(1)得到的4-((E)-4-((E)-4-叠氮基苯乙烯基)苯乙烯基)-N,N-二丁基苯胺共轭聚合物(150mg，0.3mmol)与步骤(2)得到的式(III)所示的1-棕榈酰-2-[戊-4-炔酰基]-sn-甘油-3-磷酸胆碱(192mg，0.3mmol)，溶于20mL二氯甲烷中，并向溶液中鼓入30分钟氩气。加入3×10-4mmol的CuI后，将混合物在25℃下搅拌12小时。过滤后旋干溶剂得到固体粗产物，通过柱色谱法(二氯甲烷/甲醇/水5:1:0.1)分离粗产物，得到亮黄色粉末R，(质量为：23.6mg，收率为32％)。
R的氢谱数据为：1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):7.95(s,1H),7.66(m,6H),7.42(m,4H),7.09(m,3H),6.89(d,1H,J＝24Hz),6.64(d,2H,J＝12Hz),5.26(m,1H),4.39(m,3H),4.16(m,1H),4.08(m,2H),3.92(m,2H),3.38(s,9H),3.29(t,4H),3.10(t,2H),2.83(t,2H),2.52(m,2H),2.24(t,2H),2.05(m,6H),1.56(m,2H),1.24(m,24H),0.96(t,6H,J＝8Hz),0.87(m,3H)。
R的碳谱数据为：13C NMR(400MHz,CDCl3,δ):172.57,171.10,142.17,137.30,136.92,134.75,133.91,128.93,128.72,128.22,127.76,126.85,126.50,125.96,125.25,125.04,124.76,122.00,119.45,110.62,81.48,70.11,69.55,68.53,65.35,61.62,58.49,53.54,49.79,33.06,33.00,32.43,32.28,31.74,30.91,30.42,28.70,28.66,28.55,28.46,28.41,28.35,28.16,26.07,25.38,24.60,23.83,21.68,19.90,19.33。
R的质谱数据为：HRMS(HR-MALDI-TOF)m/z:[M+Na]+。
R的模拟计算值(calcd)为：C59H88N5O8P,1048.626272。
R的实验值(found)为：1048.626302。
表征数据表明：得到了如下的改性共轭聚合物，也即包括式(I)所示的化合物，
由4-((E)-4-((E)-4-叠氮基苯乙烯基)苯乙烯基)-N,N-二丁基苯胺共轭聚合物和式(III)所示的1-棕榈酰-2-[戊-4-炔酰基]-sn-甘油-3-磷酸胆碱为原料，进行反应，得到包括式(I)所示的化合物的改性共轭聚合物的方程式如下：
(4)改性共轭聚合物在水溶液中形成聚集体的表征
将10mM步骤(3)得到的改性共轭聚合物分别在水中一次稀释到5μM，20μM，300μM，600μM。混合均匀后滴加到透射电子显微镜(TEM)的铜网上，待水挥发干，在TEM上进行表征，如图1所示。
从图1可以看出，在浓度为5μM-20μM之间，改性共轭聚合物形成纳米颗粒，增大浓度至300μM，棒状的形貌出现，继续增大浓度至600μM，纤维状的聚集体出现了。表明改性共轭聚合物在水中能够形成不同形状的聚集体形貌，保留了天然磷脂的两亲特性。
(5)改性共轭聚合物在不同浓度极性溶剂中的紫外吸收光谱和荧光发射光谱表征
改性共轭聚合物的浓度为100μM，调整四氢呋喃(THF)和水(H2O)的体积比(v/v)从0:100逐渐升高到100:0，结果如图2所示。
在纯水中，改性共轭聚合物的亲水的头部(即式(1)所示化合物的R1)朝向外，疏水的尾部(即式(1)所示化合物的R2和R3)，由于疏水作用和π-π堆积朝内团聚起来形成聚集体，随着THF比例的增大，改性共轭聚合物的疏水尾链聚集态逐渐解开，如图2所示，具体表现为吸光度、荧光强度逐渐增强，当THF在水中的比例为80％时，改性共轭聚合物处于完全舒展的结构，在图2中，其吸光度、荧光强度也达到最大值。继续增加THF的比例，一种新的聚集体出现：亲水的头部朝向内部，疏水的尾链朝外，在图2中，表现为吸光度和荧光强度逐渐降低。以上结果表明，改性共轭聚合物具有一般两亲性分子的性质。随着浓度、溶剂极性的变化，会形成不同形态的聚集体。
(6)改性共轭聚合物在细胞成像中的应用
(6a)细胞复苏和培养
将乳腺癌细胞MCF-7冻存管从液氮中取出，置37℃恒温水浴中快速融化。转入细胞培养瓶，加入含10％新生牛血清的DMEM培养液10mL(即1ml新生牛血清，9ml的DMEM培养液)，放置于CO2培养箱(5％的CO2，95％的过滤空气，37℃恒温)中培养。
(6b)细胞给药
将状态良好的乳腺癌细胞MCF-7消化之后，按8×104个/mL的细胞密度传代接种到35mm培养皿中，在培养箱放置24h后，吸去培养基，用1×PBS洗涤一次细胞，加入1mL含10％血清的DMEM培养基，加入20μM的改性共轭聚合物，继续培养6h，12h，24h，36h后用荧光显微镜观察染色结果，如图3所示。从图3的彩色图(未显示)能够看出，本发明的改性共轭聚合物一部分从6h到36h一直稳定存在于细胞膜上，同时有一部分改性共轭聚合物通过内吞进入细胞内，分布于细胞内各个细胞器的膜结构上，细胞膜没有出现破裂或死亡的现象，说明能够长时间、稳定的与细胞膜结合。
将乳腺癌细胞MCF-7与改性共轭聚合物共培养24h，洗去培养基后，分别加入商业购买的细胞器染料，包括溶酶体染料、细胞膜染料、高尔基体染料、线粒体染料和内质网染料对细胞进行染色，从而确定改性共轭聚合物在细胞内的具体位置。用激光共聚焦显微镜进行扫描，分别收集改性共轭聚合物的荧光、商业染料的荧光以及两者共定位的融合图片。从图4和图5的彩色图(未显示)中能够看出，改性共轭聚合物具有较高的荧光量子产率，而且改性共轭聚合物与溶酶体染料和细胞膜染料有很好的重叠，说明其主要集中在细胞的细胞膜部位和溶酶体部位，同时，改性共轭聚合物与高尔基体染料、线粒体染料和内质网染料，如图6、7和8的彩色图所示(未显示)，也有不同程度的重叠，表明上述细胞器上也分散有一部分改性共轭聚合物。以上结果表明，改性共轭聚合物可以稳定地嵌入细胞膜以及细胞内细胞器的膜结构上，实现了对细胞内膜结构的长时间、稳定的成像。
(7)白光引发的药物释放的应用
(7a)自组装具有改性共轭聚合物的包封钙黄绿素的脂质体
将实验中使用的POPC、DOTAP、胆固醇分别溶解在氯仿中，制备浓度为10mg/mL的溶液待进一步使用。将改性共轭聚合物(67μL)，POPC(850μL)，DOTAP(18μL)和胆固醇(35μL)以摩尔比为5:85:3:7混合在50mL茄形烧瓶中，通过旋转蒸发除去溶剂后，得到浅绿色的脂质薄膜。然后在40℃下用含有浓度为100mM的钙黄绿素的1×PBS缓冲液(5mL，PH＝7.2)摇动水化，得到的乳浊液用孔径为200nm的聚碳酸酯膜挤出10次。最后，用葡聚糖凝胶G-75除去未包封的钙黄绿素。将收集的脂质体进行浓缩，使得最终磷脂浓度为0.4mg/mL。新鲜制备的脂质体立即用于药物控制释放的研究，以防止钙黄绿素泄漏。
(7b)白光照射下改性共轭聚合物产生活性氧能力的检测
还原态的二氯荧光素DCFH本身没有荧光，当被氧化成为氧化态生物二氯荧光素(DCF)之后在525nm处表现出很强的荧光，被广泛应用于活性氧水平的检测。
配制还原态的二氯荧光素(DCFH，40μM)的PBS溶液，置于冰上待用。取1μL具有改性共轭聚合物的脂质体溶液(3.3mg/mL)加入1mL的DCFH的PBS溶液中混匀，将溶液曝露在光密度为10mW/cm2的白光下，在荧光仪上分别检测光照0、1、2、3、4和5min后，检测525nm处的DCF荧光强度(激发波长Ex＝488nm)，结果如图9所示。
(7c)白光引发的药物控制释放
钙黄绿素是一种在高浓度下荧光自淬灭的水溶性荧光素。将大浓度的钙黄绿素包封到脂质体的腔内，当钙黄绿素从脂质体内释放到周围环境中被稀释之后，该化合物在523nm处表现出强的荧光发射。将钙黄绿素被作为模型药物分子，通过检测荧光信号的增强即研究光控的脂质体内药物释放过程。
将包封钙黄绿素脂质体置于96孔板(200μL/孔)中，磷脂的总浓度为0.4mg/mL。将脂质体在黑暗环境下保持1小时，然后用强度为10mW/cm2的白光照射1小时，每15分钟收集数据，这样黑暗和光照交替一次作为一个循环，整个光控药物释放过程中执行三个循环，时间一共为6小时。用酶标仪检测钙黄绿素在523nm处的荧光强度，激发波长为488nm，结果如图10所示。
实施例2
(1)制备共轭聚合物
(1a)9,9-二(6′-溴己基)-2,7-二溴芴
将1,6-二溴己烷(97.6g，400mmol)加入100ml的50％的氢氧化钾溶液中，加入1.28g相转移催化剂四丁基溴化铵(TBAB)，反应液温度升至75℃，然后加入2,7-二溴芴(12.96g，40mmol)搅拌15min。反应停止并冷却至室温后，二氯甲烷萃取(100ml，进行3次)，合并有机相，并分别用1M盐酸溶液和蒸馏水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩。粗产物硅胶柱层析分离纯化，展开剂为二氯甲烷/石油醚(v/v＝1/9)，得白色固体产物V(质量为21.4g，产率为82％)。
V的氢谱数据为：1H-NMR:(300MHz,CDCl3,ppm)δ:0.58(m,4H),1.08(m,4H),1.21(m,4H),1.66(m,4H),1.91(m,4H),3.29(m,4H),7.43(s,4H),7.53(s,2H)。
V的碳谱数据为：13C-NMR:(100MHz,CDCl3,ppm)δ:23.53,27.80,29.00,32.67,33.92,40.06,55.06,121.30,126.17,130.38,139.09,152.23。
V的质谱数据为：EI(m/z):650(100％)[M+]。
V的模拟计算值(Anal.Calcd)：C25H30Br4(650.15):C,46.14,H,4.614。
V的实验值(Found)：C,45.95,H,4.61。
表征数据表明：得到了9,9-二(6′-溴己基)-2,7-二溴芴。
(1b)制备PFP共轭聚合物
氮气保护下，将9,9-二(6′-溴己基)-2,7-二溴芴(260mg，0.4mmol)与2′,2′-二甲基-1′,3′-丙二醇-1,4-苯二硼酸酯(120mg，0.4mmol)加入到6.4mL的THF中，溶解后加入1.6mL碳酸钾溶液(2M)与催化量的钯催化剂PdCl2(dppf)(20mg)，混合液升温至80℃反应2d。反应液冷却至室温后，将四氢呋喃(THF)减压除去，加入氯仿，洗涤两次，将有机相浓缩，滴加到甲醇中沉淀，离心、干燥后得固体产物W(质量为115mg，产率为52％)。
W的氢谱数据为：1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.83(m,6H),7.74-7.62(m,4H),3.30(m,4H),2.10(b,4H),1.81(m,4H),1.39-1.13(m,8H),0.79(b,4H)。
(1c)制备PFP-N3共轭聚合物
将固体产物W(100mg，0.18mmol)溶解在20mL的N,N’二甲基甲酰胺溶液中，加入叠氮化钠(117mg，1.8mmol)，80℃反应12h。反应停止并冷却至室温后，三氯甲烷萃取(100ml，进行3次)，合并有机相，并分别用1M盐酸溶液和蒸馏水洗涤，无水硫酸镁干燥。减压除去有机溶剂，得到固体产物X(质量为76mg，产率为88％)。
X的氢谱数据为：1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.83(m,6H),7.74-7.62(m,4H),3.30(m,4H),2.10(b,4H),1.81(m,4H),1.39-1.13(m,8H),0.79(b,4H)。
表征数据表明：(参见参考文献：Shape-Adaptable Water-Soluble ConjugatedPolymers.JACS.125,13306–13307(2003)，Liu,B.,Wang,S.,Bazan,G.C.&Mikhailovsky)，得到了如式(VII)所示的PFP-N3共轭聚合物，
(2)制备式(IV)所述的化合物
在10mL四氢呋喃溶液中，将式(VI)所示的0.14mmol的(2S,3R,4E)-2-氨基-1,3-十七碳-4-烯二醇-1-磷酸胆碱(购自Avanti polar lipids公司，批次为110752，其中R2为-C12H25，R3为胆碱基，R5为胺基)、0.71mmol的4-戊炔酸、0.51mmol二异丙基碳二亚胺和0.057mmol的4-二甲氨基吡啶，在40℃下进行酰胺缩合反应10h，得到式(IV)所示的(2S,3R,4E)-2-[戊-4-炔酰基]-1,3-十七碳-4-烯二醇-1-磷酸胆碱(其中R2为-C12H25，R3为胆碱基，R4为丁炔基)。
(3)制备改性共轭聚合物
将步骤(1)得到的PFP-N3共轭聚合物(60mg，0.11mmol)与步骤(2)得到的式(IV)所示的(2S,3R,4E)-2-[戊-4-炔酰基]-1,3-十七碳-4-烯二醇-1-磷酸胆碱(其中R2为-C12H25，R3为胆碱基，R4为丁炔基)(169mg，0.28mmol)，溶于60mL二氯甲烷中，并向溶液中鼓入30分钟氩气。加入1×10-3mmol的CuI后，将混合物在40℃下搅拌12小时。过滤后旋干溶剂得到固体粗产物，甲醇沉淀法分离粗产物，得到固体产物Y，(质量为：60mg，收率为46％)。
Y的氢谱数据为：1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.83(m,6H),7.74-7.62(m,4H),7.59(s,1H),5.26(s,1H),4.39(m,3H),4.16(m,1H),4.08(m,2H),3.92(m,2H),3.38(s,9H),3.30(m,4H),2.83(t,2H),2.52(m,2H),2.24(t,2H),2.10-0.79(m,40H)。
表征数据表明：得到了如下的改性共轭聚合物，也即包括式(II)所示的化合物，
按照实施例1的方法进行步骤(4)至步骤(5)，改性共轭聚合物同样保留了天然磷脂的两亲特性，能够随着浓度、溶剂极性的变化，会形成不同形态的聚集体。
按照实施例1的方法进行步骤(6)，改性共轭聚合物可以稳定地嵌入细胞膜以及细胞内细胞器的膜结构上，能够对细胞内膜结构的长时间、稳定的成像。
按照实施例1的方法进行步骤(7)，改性共轭聚合物保留了一般共轭聚合物光照产生活性氧的能力，能够应用于药物的控制释放和细胞膜通透性的调节。
对比例1
按照实施例1的方法进行步骤(7b)，不同的是，取1mL的DCFH的PBS溶液作为空白组，将溶液曝露在光密度为10mW/cm2的白光下，在荧光仪上分别检测光照0、1、2、3、4和5min后，检测525nm处的DCF荧光强度(激发波长Ex＝488nm)，结果如图9所示。
对比例2
按照实施例1的方法制备改性共轭聚合物。
按照实施例1的方法进行步骤(7b)，不同的是，取1μL改性共轭聚合物(10mM)加入1mL的DCFH的PBS溶液中混匀，将溶液曝露在光密度为10mW/cm2的白光下，在荧光仪上分别检测光照0、1、2、3、4和5min后，检测525nm处的DCF荧光强度(激发波长Ex＝488nm)，结果如图9所示。
对比例3
按照实施例1的方法制备改性共轭聚合物。
按照实施例1的方法进行步骤(7c)，不同的是，将包封钙黄绿素以及改性共轭聚合物的脂质体一直保持在黑暗环境中6h，结果如图10所示。
对比例4
按照实施例1的方法进行步骤(7c)，不同的是，仅使用包封钙黄绿素(没有改性共轭聚合物)的空白脂质体，在黑暗环境下保持1小时，然后用强度为10mW/cm2的白光照射1小时，每15分钟收集数据，这样黑暗和光照交替一次作为一个循环，整个光控药物释放过程中执行三个循环，时间一共为6小时，结果如图10所示。
对比例5
按照实施例1的方法，不同的是，共轭聚合物不与式(III)所示的化合物进行合成反应，也即仅使用共轭聚合物，4-((E)-4-((E)-4-叠氮基苯乙烯基)苯乙烯基)-N,N-二丁基苯胺。
按照实施例1的方法进行步骤(6)在细胞成像中的应用，由于共轭聚合物不溶于水，共轭聚合物无法与细胞相互作用。
按照实施例1的方法进行步骤(7)白光引发的药物释放的应用，结果是共轭聚合物不具有与磷脂膜相互作用的能力，无法控制释放。
对比例6
通过强的静电作用将共轭聚合物修饰到细胞膜上。
按照实施例1的方法进行步骤(6)在细胞成像中的应用，结果是共轭聚合物与细胞膜的强静电作用使得细胞膜破裂、死亡，不能有效地成像。
按照实施例1的方法进行步骤(7)白光引发的药物释放的应用，结果是共轭聚合物会干扰脂质体的形成，无法用于药物控制释放。
对比例7
通过靶向将共轭聚合物修饰到细胞膜上。
按照实施例1的方法进行步骤(6)在细胞成像中的应用，结果是共轭聚合物在3小时被细胞内吞进细胞，无法进行长时间的细胞膜成像。
按照实施例1的方法进行步骤(7)白光引发的药物释放的应用，结果是共轭聚合物没有嵌插在脂质体膜内，产生的活性氧不能够扩散到脂质体表面，不能有效地氧化磷脂，无法释放药物分子。
从图9可以看出，在含有改性共轭聚合物的水溶液中，光照DCF在525nm处的发射随着光照时间的增加显著增强，说明光照条件下改性共轭聚合物可以高效地产生活性氧。
从图10的结果可以看出，包封钙黄绿素以及本发明的改性共轭聚合物的脂质体(实施例1的步骤7c)在光照后，钙黄绿素的荧光强度快速增强，停止光照其荧光强度也停止增长，直到下一次光照后才会继续增长。如图11所示，由于脂质体可以作为一个简单的细胞膜模型，改性共轭聚合物嵌插在脂质体的膜上。光照后脂质体腔内的模型分子钙黄绿素逐渐释放，表明脂质体的膜上形成了缺陷。这是因为改性共轭聚合物在光照下产生的活性氧氧化了脂质体膜上的不饱和磷脂。磷脂的氧化导致脂质体上形成小孔，从而引起模型分子的释放。而对比例3的在黑暗条件下进行的包封钙黄绿素以及本发明的改性共轭聚合物的脂质体实验几乎没有钙黄绿素释放，在对比例4的包封钙黄绿素的空白脂质体的实验中只有少量的钙黄绿素释。以上结果表明，改性共轭聚合物保留了一般共轭聚合物光照产生活性氧的能力，能够应用于药物的控制释放和细胞膜通透性的调节。采用本发明改性共轭聚合物是良好的光敏剂，光照产生的活性氧氧化了脂质体膜上的不饱和磷脂，在脂质体膜上形成临时的小孔，使得脂质体腔内的钙黄绿素逐渐释放。停止光照后，脂质体上的小缺陷又慢慢恢复，钙黄绿素无法继续释放。由此，改性共轭聚合物可以作为新型光敏剂在自组装、细胞膜通透性调节和药物控制释放中应用。
通过实施例和对比例的结果可以看出，采用本发明改性共轭聚合物克服了现有技术存在的共轭聚合物生物相容性差、不能稳定地与细胞膜结构结合的问题，磷脂结构可以促使其通过疏水作用紧密地嵌入细胞膜中，并且其代谢方式与细胞膜上的天然磷脂的途径基本类似，从而能够长时间、稳定地与细胞膜结合，不会造成细胞膜的破裂。此外，改性共轭聚合物具有较高的荧光量子产率，可以通过共聚焦激光显微镜对细胞膜进行成像。
以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (20)

1.一种改性共轭聚合物，包括式(I)或式(II)所示的化合物，
其中，R1为具有共轭结构单元的基团，所述共轭结构单元选自苯基、对苯乙烯撑基、芴基、苯乙炔基、苯并噻唑基和噻吩基中的一种或多种，所述共轭结构单元的个数为3-20个；
所述R2为壬烷基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十五烷基、十七烷基、8-十三烷基、8-十五烷基、8-十七烷基、8-二十一烯基和8,11,14-十七三烯基中的一种；
所述R3为胆碱基、丝氨酸基、乙醇胺基、肌醇基或甘油基。
2.权利要求1所述的改性共轭聚合物的制备方法，该方法包括：在溶剂和催化剂存在的条件下，将共轭聚合物与式(III)或式(IV)所示的化合物进行点击化学合成反应，
其中，R4为C2-C20的直链炔烃基。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述R4为丙炔烃基、丁炔基或戊炔基。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述R4为丁炔基。
5.根据权利要求2所述的方法，其中，共轭聚合物、式(III)或式(IV)所示的化合物，以及催化剂的摩尔比为(100-1000):(100-5000):(1-10)。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，共轭聚合物、式(III)或式(IV)所示的化合物，以及催化剂的摩尔比为(100-1000):(100-2000):(1-10)。
7.根据权利要求2所述的方法，其中，所述催化剂为CuI。
8.根据权利要求2所述的方法，其中，所述反应的条件包括：温度为20-60℃；时间为2-48h。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述反应的条件包括：温度为25-40℃；时间为10-12h。
10.根据权利要求2所述的方法，其中，式(III)或式(IV)所示的化合物的制备方法，包括：在溶剂存在的条件下，将式(V)所示的化合物或式(VI)所示的化合物、直链炔基羧酸、催化剂和缩合剂进行酯化缩合反应，或者进行酰胺缩合反应，
其中，R5为羟基或胺基。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述直链炔基羧酸为3-丁炔酸，4-戊炔酸，5-己炔酸。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述直链炔基羧酸为4-戊炔酸。
13.根据权利要求10所述的方法，其中，所述溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、甲醇或二甲基亚砜。
14.根据权利要求10所述的方法，其中，所述催化剂为4-二甲氨基吡啶。
15.根据权利要求10所述的方法，其中，所述缩合剂为碳二亚胺缩合剂。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述碳二亚胺缩合剂为二异丙基碳二亚胺。
17.根据权利要求10所述的方法，其中，所述催化剂、缩合剂、式(V)所示的化合物或式(VI)所示的化合物，以及直链炔基羧酸的摩尔比为：(1-10):(10-200):(1-100):(10-500)。
18.根据权利要求10所述的方法，其中，反应的条件包括：温度为20-60℃；时间为3-24h。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，反应的条件包括：温度为25-40℃；时间为10-12h。
20.权利要求1所述的改性共轭聚合物在自组装、细胞成像和制备控制释放药物中的应用。
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