JPS63232841A - 再構成重合化小胞体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、再構成重合化小胞体の製造方法に係り、特
には、内包物質の変性を抑制できる重合化小胞体の製造
方法に関する。

［従来の技術および問題点］ リン脂質は細胞膜の主成分であり、生体内におけるｉｌ
ｉ性も極めて低いため、薬物投与用マイクロカプセル材
料として期待されている。しかしながら、リン脂質で構
成される小胞体（リポソーム）を生体内に投与すると、
多くの場合短時間のうちにＩＩ器による吸収、分解が起
こり、系から消失してしまう。

そこで、リン脂質小胞体の安定性をｉ！に善する目的で
１重合性リン脂質が開発され、その重合に関する研究が
多く報告されている。すなわち、連合性リン脂質からリ
ポソームを形成し、これを重合させて高分子化するもの
である。この高分子化リポソームは優れた安定性を有す
ることが認められている。しかしながら、これを薬物の
生体投与に供するマイクロカプセルとして作動させるた
めには、生理活性物質を予めリポソーム内に内包させる
ことが必要となる。そこで、重合に先立って。

屯合性すン脂質すボンームに生理活性物質を内包してお
き、これを充分な安定性が得られる程度に重合させるこ
とととなるが、その重合には熱、紫外線、放射線、ラジ
カル重合開始剤などを使用するため、それらによって、
内包された生理活性物質が重合中に変性、劣化あるいは
分解し、本来の生理活性物質を連撮するマイクロカプセ
ルとして充分にａｆｌしないという欠点があった。

これを解決する手法として、穏和な条件で重合できる高
反応性の重合性リン脂質を開発すΔことが考えられる。

しかしながら、安定に長期保存できる重合性リン脂質は
現在はとんどない、また、これを重合させるための高温
処理や１発生する活性ラジカルが生理活性物質の変性を
引き起す危険性もある。

したがって、生理活性物質を変性させることなく安定な
小胞体内に内包させることのできる手法の開発が望まれ
ている。

［問題点を解決するための手段］ この発明によれば１重合性リン脂質化合物を含むカプセ
ル材料からなる小胞体を所定の割合で重合させ、ついで
これを凍結乾燥して粉末状態となし、しかる？＆該粉末
を水系媒体中に分散させた状７ｑで小胞体を再構成する
ことを特徴とする再構成−に合化小胞体の製造方法が提
供される。この再構成重合化小胞体を後架橋などにより
さらに重合させると、より安定な小胞体が得られる。

この発明に用いる重合性リン脂質化合物は、分子内に少
なくとも１つの毛合可簡な基（ビニルノ、シ　　ジエン
基、ジイン基等）を有するリン脂質化合物である。その
具体例を挙げると、以下の通りである。

（ここでｌｍ＝０または１．ｎ＝１−１０、Ｌ＝　１３
〜２１）。

（ここで、Ｒ＝−Ｈまたは−ＣＨ３、 ｎ＝８〜１６、ｍ＝１３〜２１入 （ここでｌｍ＝０またはｌ、ｎ＝１−１０゜乏＝　１２
〜２０）、 （ここで、ｎ＝６〜１６）、 （ココテ、ｘ　＝　ｉｔ　？、　ｔ＊　−（：Ｈ２０Ｒ
’：Ｙ　＝　−００１１１：（−ＣＨ２）ＣＩ２ＣＯＯ
（ＯＨ，）ｆＬＨ。

Ｒ＝　Ｒ’−または−ｃｏ（ｃｏ２）、ｆ３ｕ　。

ｎ＝１ｏ〜　１８）、 （ここで、ｎ＝１〜１０．Ａ＝１３〜２１）。

（ここで、ｎ＝５〜１１．１＝　１３〜２１）、（ここ
で、ｎ＝５〜１１．　　Ｊ！＝１３〜２１）、（ここで
、ｎ＝１〜１０、！＝１２〜２０）、ＣＨ２０ＣＯ（Ｃ
Ｈ，）、ＬＯＨ３ ■ （ここで、ｎ＝１２〜１６）、 （ここで、Ｒ−−Ｇｏ（ＣＨよ）−０（：Ｈ２ＣＯ−Ｃ
ＨＣＨ−ＯＨ（：Ｈ。

または−ＧＯ（ＣＨ，）、、Ｃ：Ｈヨ ＲＺ、、　−ＣＯ（ＣＨ，）、、０ＣＨ２ＣＨ−ＣＨＣ
Ｈ−ＣＨＣＨ。

または−ＣＣＨ２）ＩＬＣＨ３ ｎ＝６−１４　、　ｍ　＝　　ｌ　　Ｏ〜２　０　、北
＝１１〜１２）、 （ここで、ｎ＝８〜１２）、 ｘｐ（ｏ）（ｏ−″）ＯＣＲ２Ｃ（Ｃ）！、０ＣＯＲ）
３（ここで、Ｒ−−（ｃｏ、）、ｃＨ，または−ＣＨ−
ＣＨＣＨ−ＣＨＣＣＨ，）、、ＣＨ，。

ｘ＝−〇″″、″、マタＧＨ２０Ｈ２Ｎ　（ＣＨＪ）３
ｎ＝８〜２０ ｍ＝４〜１本）、 （ここで、ｎ＝６〜１２１．Ｊ＝１３〜２１）この発明
によれば、上記重合性リン脂質化合物を含むマイクロカ
プセル材料から、例えば、超音波照射法、フレンチプレ
ス法、インジェクションυ；、水和法などにそれ自体公
知の方法により小胞体（リポソーム）を形成する。この
リポソームをまず紫外線照射、放射線照射、ラジカル重
合開始剤等を用いて重合化する。この重合の際、重合性
リン脂質化合物として、重合可能な基を１つ有する化合
物を用いた場合、架橋は生じない、また、重合可能な基
を２つ有する重合性リン脂質を用いた場合１重合に当り
、親木性重合開始剤または疎水性重合開始剤を用いて重
合させると２木のうち一方の重合可能な基が優先して重
合に関与し、非架橋型の重合が生じる。これら非架橋８
１重合は、重合度２０〜３０以９Ｆとなるようにおこな
うことが望ましい、また、架橋型重合をおこなう場合、
その重合度はｌＯ以下とすることが好ましい。

こうして重合化された小胞体を通常の方法により凍結乾
燥し、粉状とする。この凍結乾燥した重合化小胞体は、
メタノールクロロホルム等の有機溶媒に可溶であること
が望ましい、この凍結乾燥して粉状にしたものは、長期
にわたって安定に保存可能である。

小胞体の再構成に当っては、上記凍結乾燥した重合化物
を水系媒体中に再分散させ、上記と同様のｆ法により小
胞体構造を再構成させる。この再構成時に、水系媒体中
に生理活性物質を共存させておけば、それを内包した小
胞体を得ることができる。しかる後、カラム分離法、遠
心分離法、透析などの方法により外水相に溶存する非内
包物質を分離する。

また、例えば２つの重合可能な基を有する重合性リン脂
質化合物を用い、上記非架橋型重合をおこなった場合、
小胞体を上記のように再構成した後残りの重合可崩な基
を利用した架橋反応を短時間あるいわ穏和な条件下でお
こなうことによって内包した生理活性物質を実質的に変
性させることなく小胞体の安定性を向上させることがで
きる。

なお、上記初めの重合に供される小胞体を１つの重合可
能な基を有するリン脂質化合物で構成し、小胞体の再構
成時に、重合性リン脂質化合物を添加し小胞体を再構成
し、後架橋しても同様に小胞体の安定性を向上させるこ
とができる。

［実施例Ｊ 実施例　１ 重合性リン脂質である１、２−ビス（２，４−オクタデ
カジェノイル）　−５ｎ−グリセロ−３＝ホスホコリン
をラジカル重合開始剤であるアゾビスイソブチロニトリ
ルとモル比１００：１で混合し、これを水中に懸濁させ
、超音波照射により半径的２０ｎｍの小胞体を得た。こ
れを６℃で２時間熟成させて小胞体を融合させ、半径を
約５０ｎｍとした。これを６０℃で６時間加熱してラジ
カル重合させた。得られた重合体はｌ−アシル鎖のジエ
ン基のみが重合した非架橋型のものであった。温度を室
温に戻した後、凍結乾燥法により重合体粉末を得た。こ
の重合体粉末を乾燥状態で窒素置換し、−２０℃以下の
低温で暗所で保存したところ６ケ月以り劣化しなかった
。この粉末を水中に分散させ、超音波照射（６０Ｗ、３
０分）すると、閉じた小胞体が再構成された。再構成小
胞体の生成は透過電子顕微鏡により確認した。

実施例　２ 重合性リン脂質である１、２−ビス（２、４−オクタデ
カジェノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを
水中に懸濁に懸濁させ１Ｍｉ音波照射により半径的２０
ｎｍの小胞体を得た。これを６℃で２時間熟成させて小
胞体を融合させ、半径を約５０ｎｍとした。これに水溶
性ラジカル重合開始剤であるアゾビスアミジノプロパン
塩酸塩をリン脂質３０モルに対して１モルの割合で添加
し、６０℃で４時間加熱してラジカル重合させた。得ら
れた重合体は２−アシル鎖のジエン基のみが重合した非
架橋型のものであった。温度を室温に戻した後、凍結乾
燥法により重合体粉末を得た。この重合体粉末を乾燥状
態で窒素置換し。

−２０℃以下の低温で暗所で保存したところ６ケ月以［
−劣化しなかった。この粉末を水中に分散させ、超７７
波照射（６・ＯＷ、３０分）すると、閉じた小胞体が再
構成された。再構成小胞体の生成は透過電子顕微鏡によ
り確認した。

実施例　３ 重合性リン脂−質である１　−（ｐ−ビニルベンゾイル
）７ナノイルー２−才クタデシル−グリセロ−３−ホス
ホコリンを水中に懸濁に懸濁させ、超音波照射により半
径的２０ｎｍの小胞体を得た。

これを６℃で３時間熟成させて小胞体を融合させ、半径
を約６０ｎｍとした。これに２５℃で６時間紫外線を照
射し光重合させた。得られた重合体は、ｌ−アシル鎖の
スチリル基のみが重合したものであった。温度を室温に
戻した後、凍結乾燥法により重合体粉末を得た。この重
合体粉末を水中に分散させ、超音波照射（６０Ｗ、３０
分）すると、閉じた小胞体が再構成された。

実施例　４ 重合性リン脂質である１−バルミトイル２−（２，４−
オクタデカジェノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ
コリンを水中に懸濁に懸濁させ、超音波照射により半径
的２０ｎｍの小胞体を得た。これを６℃で２時間熟成さ
せて小胞体を融合させ、半径を約５０ｎｍとした。これ
に水溶性ラジカル重合開始剤であるアゾビスアミジノプ
ロパン塩酸塩をリン脂質３０モルに対して１モルの’＋
’、１合で添加し、６０℃で４時間加熱してラジカル重
合させた。得られた重合体は２−アシル鎖のジエン基の
みが重合したものであった。温度を室温に戻した後、凍
結乾燥法により重合体粉末を得た。この重合体粉末を水
中に分散させ、超音波照射（６０Ｗ、３０分）すると、
閉じた小胞体が再構成された。再構成小胞体の生成は透
過電子顕微鏡により確認した。

実施例　５〜８ 実施例１〜４で得た重合化リン脂質粉末をそれぞれクロ
ロホルムに溶解し、約５０℃に保った水中に注射器を用
いて注入した。この時点でクロロホルムに溶解していた
重合化リン脂質は自己集合して小胞体を形成した。得ら
れた小胞体は透過電子顕微鏡により約５０〜１１０００
ｎの大きさであることがわかった。

実施例　９〜１２ 実施例１〜４で得た重合化リン脂質粉末をそれぞれ水中
に懸濁し、フレンチプレス法により小胞体を再構成させ
た。要した圧力は８００ｋｇ／ｃｍ２’であり、容易に
小胞体が形成された。その１Ｌ均半径は約３００ｎｍで
あり、多重小胞体も含まれていた。

実施例　１３〜１６ 実施例１〜４でず！ｔた重合化リン脂質粉末をそれぞれ
クロロホルムに溶解し、試験管内に移した後、減圧下で
試験管を回転させながら重合化リン脂質の薄膜を作製し
た。充分に乾燥した後、これに純水を静かに加え、４５
℃で熟成させた。約１０時間の熟成により半径１〜１１
００ＪＬの巨大な小胞体が多数得られた。光学顕微鏡で
観察したところ閉じたカプセル状の構造が確認できた。

実施例　１７〜２０ 実施例１〜４で得た重合化リン脂質粉末に純水を少；１
：添加し、こえを練り込んでガム状のリン脂質水和物と
した。これに純水を加え、所定の濃度（リン脂質として
１〜３重量％）にＪジ定した。これを４５℃でｌＯ昨間
熟成させると、半径３〜３０ｕＬｍの多重の小胞体が得
られた。

実施例　２１ 実施例１で得た重合化リン脂質の粉末を水中に懸濁し、
フレンチプレス法により８００ｋｇ／ａｍ　　の圧力で
小胞体を再構成させた。形成された小胞体の平均半径は
約３００ｎｍであり、多重小胞体も含まれていた。この
小胞体を構成する重合化リン脂質、の２−アシル鎖のジ
エン基を紫外−可視スペクトルの２５５　ｎｍにおける
吸収から確認した。

この再構成小胞体の分散水溶液に水溶性ラジカル毛合開
始剤であるアゾビスアミジノプロパン塩酸塩をリン脂質
５０モルに対し１モルの割合で添加し、窒素気流下、６
０℃で１０分間加熱して２−アシル、鎖のジエン基を重
合（架橋）させた、紫外−可視スペルトル測定による２
５５ｎｍにおけるジエン基に基づく吸収の減少から、約
３％のジエン基が重合したことを確認した。再重合した
小胞体は極めて安定で、凍結乾燥後もあらゆる有機溶媒
に不溶であった。また水溶液中でトライトンｘ−ｉｏｏ
等の非イオン系界面活性剤を添加しても小胞体は全く変
化せず、安定に小胞体構造を保っていることを光散乱測
定から確認した。

実施例　２２ 実施例２で得た重合化リンＪＩｆ１質の粉末をラジカル
重合開始剤であるアゾビスイソブチロニトリルとモル比
１００：ｌで混合し、水中に懸濁し、フレンチプレス法
により８００ｋｇ／ｃｍ２＝の圧力で小胞体を再構成さ
せた。形成された小胞体の平均半径は約３００ｎｍであ
り、多重小胞体も含まれていた。この小胞体を構成する
重合化リン脂質の１−アシル鎖のジエン基を紫外−可視
スペクトルの２５５ｎｍにおける吸収から確認した。

この再構成小胞体を窒素気流下、７０”Ｃ！で１０分間
加熱してｌ−アシル鎖のジエン基を重合（架橋）させた
、紫外−可視スペルトル測定による２５５ｎｍにおける
ジエン基に基づく吸収の減少から、約２５％のジエン基
が重合したことを確認した。再重合した小胞体は極めて
安定で、凍結乾燥後もあらゆる有機溶媒に不溶であった
。また水溶液中でトライトンｘ−ｉｏｏ等の非イオン系
界面活性剤を添加しても小胞体は全く変化せず、安定に
小胞体構造を保っていることを光散乱測定から確認した
。

実施例　２３〜２４ 実施例２１および２２において、それぞれ、フレンチプ
レス法の代りに、バス型の超音波照射器を用いて同様に
小胞体の再構成をおこなったところ、２０分の照射によ
り小胞体が再構成された。

得られた小胞体の平均半径は約３００〜５００ｎｍであ
り、多重小胞体が多く含まれていた。これた小胞体にお
いて、それぞれ、１−アシル鎖または２−アシル鎖の未
反応ジエン基の存在が紫外−１１ｆ視スペクトルから確
認された。これら未反応ジエン基は紫外線照射によって
重合（架橋）させることができ、１０分間の照射により
約８％のジエン基が反応した。この後重合した小胞体は
凍結乾燥後もあらゆる有機溶媒に不溶であり、後重合が
再構成小胞体の安定性向丘に有効であることが確認され
た。

実施例　２５ 実施例１で得た重合化リン脂質粉末を、２０＠。

ｔ−％のヘモグロビンを舎む生理食塩中に懸濁させ、５
℃に保たれた環境でフレンチプレス法により８００ｋｇ
／ｃｍ２−の圧力で小胞体を再構成させた。形成された
小胞体の平均半径は約３００ｎｍであり、多重層小胞体
も含まれていた。

この再構成小胞体の分散水溶液に３５５ｎｍの紫外光を
１０分間照射して２−アシル鎖のジエン基を重合（架橋
）させた、こうしてヘモグロビンを内包した重合化小胞
体を得た。この小胞体は極めて安定であり、超遠心法に
より上澄の非内包ヘモグロビンを完全に除いたものから
は、ヘモグロビンの漏出は、生理条件下では全く見られ
なかった。

実施例　２６ 実施例２で得た重合化リン脂質粉末をラジカル重合開始
剤であるアゾビスイソブチロニトリルとモル比１００：
１で混合し、２０重）五％のヘモグロビンを含む生理食
塩中に懸濁させ、５℃にてフレンチプレス法により８０
０ｋｇ／Ｃｍ？−の圧力で小胞体を再構成させた。形成
された小胞体の平均半径は約３００ｎｍであり、多重層
小胞体も含まれていた。

この再構成小胞体の分散水溶液に３５５ｎｍの紫外光を
１０分間照射してｌ−アシル釦のジエン基を重合（架橋
）させた、こうしてヘモグロビンを内包した重合化小胞
体を得た。この小胞体は極めて安定であった。また、ヘ
モグロビンの変性も認められず、酸素ガスの導入により
ヘモグロビンの層素化錯体に基づく可視スペクトル変化
が認められ、酸素化、脱酸素化は可逆的であった。また
ヒト血液と混合しても、赤血球の溶血、血液凝固などは
認められなかった。

実施例　２７〜２８ ヘモグロビンの代りに１重ｊ■り％濃度のヒト血＃＋’
？アルブミンを用いて、実施例２６および２６と同様の
操作をおこない、ヒト血清アルブミンを内包した後重合
小胞体をＩＩＩた。各小胞体を生理食塩中３７℃で静置
したとき、アルブミンの漏出は２４時間後で約２％であ
った。

実施例　２９〜３０ 実施例１および２で得た重合化リン脂質粉末を、それぞ
れ、超ｆｆ波照射により０．１Ｍのカルポキシフルオレ
ッセイン（ＣＦ：６）を含む水中でｉｌｆ分散させ、Ｃ
Ｆを内包した小胞体を再構成した。セファロースＣＬ４
Ｂカラムを用い未内包のＣＦを分離した後、未七合ジエ
ン基を１０分間の紫外光照射により重合（架橋）させた
。蛍光物質であるＣＦは０．１Ｍの濃度では自己濃度消
失しており蛍光発光は認められないが、重合化小胞体か
ら漏出すると蛍光を発するようになるので、その漏出率
は蛍光スペクトル測定から容易に算出できる。この実施
例で２１１Ｊ製した小胞体からのＣＦの漏れは、０．１
Ｍの塩化ナトリウム水溶液中、３０℃で静置したとき、
２４時間後で約９％であった。また２０℃では２４時間
後でも３％の漏れしか測定されなかった。

［発明の効果］ 以上述べたように、この発明によれば、生理活性物質を
変性させることなく安定な小胞体内に内包させることの
できる再構成重合化小胞体の製造方法が捉供される。す
なわち、この発明においては、まず、小胞体を形成した
後これを重合させ、ついでその重合化小胞体から再び小
胞体を作り、場合に応じてこれをさらに後重合に供する
。上記ｉｆＦ構成時に生理活性物質を共存させておけば
、生理活性物質は、初めの爪台の影響を何ら受けること
がない、こうして、生理活性物質が変性することなく安
定な小胞体に内包されることとなる。また、小胞体の安
定化向上のためにおこなう後架橋も穏和な条件でおこな
うことができるので、内包された生理活性物質は実質的
に変性しない。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）重合性リン脂質化合物を含むカプセル材料からな
   る小胞体を所定の割合で重合させ、ついでこれを凍結乾
   燥して粉末状態となし、しかる後該粉末を水系媒体中に
   分散させた状態で小胞体を再構成することを特徴とする
   再構成重合化小胞体の製造方法。
2. （２）重合性リン脂質化合物を含むカプセル材料からな
   る小胞体を所定の割合で重合させ、これを凍結乾燥して
   粉末状態となし、ついで該粉末を水系媒体中に分散させ
   た状態で小胞体を再構成し、しかる後この再構成小胞体
   をさらに重合させることを特徴とする再構成重合化小胞
   体の製造方法。