KR102513560B1 - 피코시아닌-항암제 컨쥬게이트를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물, 이를 포함하는 광역학치료용 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

피코시아닌-항암제 컨쥬게이트를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물, 이를 포함하는 광역학치료용 조성물 및 이의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102513560B1
KR102513560B1 KR1020200083575A KR20200083575A KR102513560B1 KR 102513560 B1 KR102513560 B1 KR 102513560B1 KR 1020200083575 A KR1020200083575 A KR 1020200083575A KR 20200083575 A KR20200083575 A KR 20200083575A KR 102513560 B1 KR102513560 B1 KR 102513560B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
phycocyanin
doxorubicin
anticancer agent
photodynamic therapy
treatment
Prior art date
Application number
KR1020200083575A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20210126469A (ko
Inventor
이창문
이호준
김민아
Original Assignee
전남대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 전남대학교 산학협력단 filed Critical 전남대학교 산학협력단
Publication of KR20210126469A publication Critical patent/KR20210126469A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102513560B1 publication Critical patent/KR102513560B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 피코시아닌(C-phycocyanin)-항암제 컨쥬게이트를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물, 이를 포함하는 광역학치료용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 빛 조사 시 활성산소종을 생성하는 피코시아닌을 항암제인 독소루비신(doxorubicin)과 함께 결합시킨 후 나노 크기로 제형화시킴으로써 생체 내의 병소에 축적을 유도하고, 빛을 조사하여 활성산소를 발생시킴과 동시에 항암제를 전달하여 항암제치료 및 광역학치료를 동시에 수행할 수 있다.
또한 다양한 암 치료에 적용가능할 뿐만 아니라 염증 등의 질환에도, 다양한 병소에 대하여서도 적용이 가능하여 새로운 치료법으로 활용될 수 있다.

Description

피코시아닌-항암제 컨쥬게이트를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물, 이를 포함하는 광역학치료용 조성물 및 이의 제조방법{Pharmaceutical composition for the treatment of cancer comprising phycocyanin-anticancer agent conjugate, composition for photodynamic therapy comprising the same and manufacturing method thereof}
본 발명은 피코시아닌(C-phycocyanin)-항암제 컨쥬게이트를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물, 이를 포함하는 광역학치료용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 빛 조사 시 활성산소종을 생성하는 피코시아닌을 항암제인 독소루비신과 공유결합시킨 후 나노입자로 형성하여 생체 내 투여함으로써, 병소에 빛을 조사하여 활성산소를 발생시킴과 동시에 항암제의 축적에 의한 항암제치료와 광역학치료가 모두 가능한 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
대표적인 암 치료 방법으로는 외과적 수술, 방사선 요법, 항암화학요법 등이 알려져 있으나, 일반적인 암 치료과정에서는 환자에게 극심한 고통이 유발되고 항암화학요법에서는 전신성 부작용이 비롯된다.
최근 비침습적이고 부작용을 최소화할 수 있는 암 치료 신기술로 빛을 이용한 치료법이 주목을 받고 있다. 광선치료(phototherapy)라 불리는 이 치료법은 광열치료(photothermal therapy)와 광역학치료(photodynamic therapy)로 나눌 수 있다. 광열치료는 빛을 흡수하는 물질에 특정 파장의 빛을 조사하였을 때 열을 발생시켜 암을 치료하는 기술이고, 광역학치료는 빛을 흡수 시 2차적인 화학반응에 의해 암을 사멸시키는 기술이다.
더 구체적으로, 광역학치료는 광감각제가 특정 파장의 빛에 의해 활성화되면서 조직 내의 산소와 결합하여 일중항 산소(singlet oxygen; 1O2)를 생성하여, 이들의 강한 화학적 반응이 주변 세포 분자들을 괴사시키는 원리를 이용하여 수행된다. 일중항 산소와 같은 활성산소종(reactive oxygen species; ROS)은 소량 존재할 때에는 근육 수축, 지방 대사, 줄기세포 분화 및 세포 유지 등 다양한 생리작용에 필수적인 존재이지만, 과발현 시 세포사멸, 발암, 조직의 노화 등의 원인이 되기도 한다.
특히, 광역학치료는 비침습적이고 반복적인 치료가 가능하여 그 효과를 증대시키기 용이하며, 항암화학요법과 같은 다른 치료법과 병행이 가능하여 보조치료법으로도 사용될 수 있는 큰 장점이 있다.
현재 연구되고 있는 광감각제 대부분은 난용성이고 생리학적 용매에서 쉽게 응집되는 현상으로 인하여 생체 내에 적용하기 어려울 뿐만 아니라, 광역학치료 효율을 감소시키는 요인이 된다. 따라서 최근에는 광감각제의 화학적 표면개질과 더불어 암 조직에 선택적으로 전달하기 위해 리포좀(liposomes), 마이셀(micelle), 고분자 나노입자(polymer-based nanoparticles)와 같은 나노캡슐화 접근 방법들이 시도되고 있다.
피코시아닌(phycocyanin)은 스피룰리나와 같은 청록색의 남조류에서 합성되는 α, β 폴리펩타이드로 이루어진 푸른색의 수용성 단백질이다. 이는 항염증(anti-inflammatory), 항암(anti-cancer), 항산화(anti-oxidant) 특성뿐만 아니라 광 안정성이 우수하여 식품 및 화장품과 같은 향장원료로도 사용되고 있다. 특히 약 620 nm 대의 파장을 가진 빛을 흡수하여 주위의 산소 분자를 활성산소종으로 전환시키는 특성을 가지고 있어, 이를 이용하여 여러 관련 연구가 시도된 바 있으나, 암 치료효과를 확인한 연구는 많이 이루어지지 않고 있다.
피코시아닌은 천연물질이기 때문에 생체적합성이 우수하여 기존의 광감각제의 문제점을 해결할 수 있을 것으로 기대되었다. 따라서 피코시아닌의 고유한 광역학 특성뿐만 아니라, 카르복실기를 가지고 있어 아민기를 가지는 약물이나 고분자 물질과의 합성이 용이하다는 장점을 이용하여, 암 치료를 위한 항암제의 도입이나 이의 선택적 전달을 위해 나노 제형화 시키는 연구가 필요하다.
이에 본 발명자들은 항암제치료-광역학치료를 동시에 수행하기 위한 피코시아닌(C-phycocyanin)-독소루비신(doxorubicin) 컨쥬게이트를 제조하여 암세포에서의 사멸 효과를 확인하였고, 이를 새로운 광역학 치료제제로써 활용할 수 있음을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 피코시아닌; 및 독소루비신, 메토트랙세이트(Methotrexate), 시스플라틴(Cisplatin) 및 레티노산(Retinoic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 항암제가 공유결합된 피코시아닌-항암제 컨쥬게이트를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 피코시아닌 및 독소루비신, 메토트랙세이트, 시스플라틴 및 레티노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 항암제가 공유결합된 피코시아닌-항암제 컨쥬게이트를 포함하는 광역학치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 다음 단계를 포함하는 광역학치료용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다:
피코시아닌 용액에 독소루비신(doxorubicin), 메토트랙세이트(Methotrexate), 시스플라틴(Cisplatin) 및 레티노산(Retinoic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 항암제를 첨가하여 교반하는 교반 단계;
용액을 동결건조하여 피코시아닌-항암제 컨쥬게이트 분말을 수득하는 동결건조 단계; 및
피코시아닌-항암제 컨쥬게이트 분말을 수용액 상에서 초음파 처리하는 나노입자 형성 단계.
본 발명의 또 다른 목적은 피코시아닌-항암제 컨쥬게이트의 항암제치료 및 광역학치료 용도에 관한 것이다.
본 발명은 피코시아닌(C-phycocyanin)-항암제 컨쥬게이트를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물, 이를 포함하는 광역학치료용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 조성물은 새로운 광역학 치료제제로써 활용이 가능하다.
본 발명자들은 항암제치료-광역학치료를 동시에 수행하기 위한 피코시아닌-독소루비신(doxorubicin) 컨쥬게이트를 제조하여 암세포에서의 사멸 효과를 확인하였다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 피코시아닌(C-phycocyanin); 및 독소루비신, 메토트랙세이트(Methotrexate), 시스플라틴(Cisplatin) 및 레티노산(Retinoic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 항암제가 공유결합된 피코시아닌-항암제 컨쥬게이트를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물이다.
상기 공유결합은 피코시아닌의 -COOH기 및 항암제의 -NH2기가 결합한 것일 수 있다.
상기 조성물은 피코시아닌-항암제 컨쥬게이트를 10 내지 1,000 ug/mL, 50 내지 1,000 ug/mL, 100 내지 1,000 ug/mL, 200 내지 1,000 ug/mL, 300 내지 1,000 ug/mL, 500 내지 1,000 ug/mL, 10 내지 800 ug/mL, 50 내지 800 ug/mL, 100 내지 800 ug/mL, 200 내지 800 ug/mL 또는 300 내지 800 ug/mL, 예를 들어, 500 내지 800 ug/mL 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 1,000 ug/mL를 초과하는 농도로 사용되는 경우, 정상 세포에 대하여서도 세포 독성을 유발하여 세포생존율을 감소시킬 수 있다.
상기 항암제는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육주입, 복강주입, 경피투여 및 병변내 주입으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법으로 투여되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따라 제조된 항암제는 암세포로의 선택적 전달을 통해 암세포에 축적될 수 있고, 축적된 항암제로서의 항암제치료 효과를 유도할 수 있다. 상기 항암제에 포함된 독소루비신은 세포 분열에 필요한 RNA나 DNA를 손상시켜 세포분열을 저해함으로써 항암 활성을 가진다.
본 발명의 다른 양태는 피코시아닌; 및 독소루비신, 메토트랙세이트, 시스플라틴 및 레티노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 항암제가 공유결합된 피코시아닌-항암제 컨쥬게이트를 포함하는 광역학치료용 조성물이다.
상기 공유결합은 피코시아닌의 -COOH기 및 항암제의 -NH2기가 결합한 것일 수 있다.
상기 조성물은 피코시아닌-항암제 컨쥬게이트를 10 내지 1,000 ug/mL, 50 내지 1,000 ug/mL, 100 내지 1,000 ug/mL, 200 내지 1,000 ug/mL, 300 내지 1,000 ug/mL, 500 내지 1,000 ug/mL, 10 내지 800 ug/mL, 50 내지 800 ug/mL, 100 내지 800 ug/mL, 200 내지 800 ug/mL 또는 300 내지 800 ug/mL, 예를 들어, 500 내지 800 ug/mL 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 1,000 ug/mL를 초과하는 농도로 사용되는 경우, 정상 세포에 대하여서도 세포 독성을 유발하여 세포생존율을 감소시킬 수 있다.
상기 광역학치료용 조성물은 정맥내 주입, 피하 주입, 근육주입, 복강주입, 경피투여 및 병변내 주입으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법으로 투여되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따라 제조된 광역학치료용 조성물은 암세포로의 선택적 전달을 통해 암세포에 축적될 수 있다. 이에 외부에서 빛을 조사함으로써 피코시아닌에서 활성산소종을 발생시킬 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 피코시아닌-독소루비신 컨쥬게이트는 635 nm의 레이저 조사에 의하여 활성산소를 효과적으로 생성하여 암세포의 세포생존율을 감소시켰고, 레이저를 조사하지 않은 경우에서도 항암제로서 기능하여 피코시아닌만 처리한 경우에 대비하여 세포생존율을 감소시켰다.
또한 본 발명에 따라 제조된 조성물은 450 내지 700 nm 범위에 해당하는 저에너지 레이저를 조사하여 활성산소종을 생성함으로써 500 nm 이상의 고에너지의 레이저를 이용한 광역학치료의 부작용을 줄일 수 있다.
피코시아닌-독소루비신 컨쥬게이트에 있어서, 피코시아닌의 강력한 항산화능력으로 인해 항암제인 독소루비신의 강력한 산화 독성이 완화될 수 있다. 이에 따라 심독성, 간독성 등의 유발을 감소시키고, 이에 따라 독소루비신의 기존 문제점을 해소할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 다음 단계를 포함하는 광역학치료용 조성물의 제조방법이다:
피코시아닌 용액에 독소루비신, 메토트랙세이트, 시스플라틴 및 레티노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 항암제를 첨가하여 교반하는 교반 단계;
용액을 동결건조하여 피코시아닌-항암제 컨쥬게이트 분말을 수득하는 동결건조 단계; 및
피코시아닌-항암제 컨쥬게이트 분말을 수용액 상에서 초음파 처리하는 나노입자 형성 단계.
교반 단계는 항암제의 첨가 이전에 가교제를 첨가하여 수행되는 것일 수 있다.
가교제는 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필) 카르보디이미드 하이드로클로라이드(N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) 및 1-하이드록시-2,5-다이옥소-3-피롤리딘에설포닉 에시드 모노소디움 솔트 하이드레이트(1-hydroxy-2,5-dioxo-3-pyrrolidinesulfonic acid monosodium salt hydrate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 피코시아닌 및 독소루비신은 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필) 카르보디이미드 하이드로클로라이드와 1-하이드록시-2,5-다이옥소-3-피롤리딘에설포닉 에시드 모노소디움 솔트 하이드레이트의 반응으로 인해 결합된다.
교반 단계는 1 내지 48시간, 1 내지 36시간, 1 내지 24시간, 12 내지 48시간, 또는 12 내지 36시간, 예를 들어, 12 내지 24시간 동안 수행되는 것일 수 있고, 24시간 동안 교반하는 것이 바람직하다. 반응시간은 상기의 시간을 준수하는 것이 피코시아닌과 독소루비신의 결합 형성에 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
동결건조 단계는 용액 중 미반응물의 제거 후 수행되는 것일 수 있다. 미반응물은 결합되지 않은 독소루비신 또는 가교제일 수 있다.
미반응물의 제거는 투석막을 이용한 투석, 원심분리 및 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법으로 수행될 수 있고, 예를 들어, 투석을 통하여 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
나노입자 형성 단계는 피코시아닌-독소루비신 컨쥬게이트가 수용액 상에서 분산되어 자기조립(self-assembly)됨으로써 나노 단위의 크기를 가지는 나노입자를 형성하는 과정이다.
본 명세서상의 용어 자기조립은, 무질서하게 존재하는 물질들이 일정한 규칙으로 인하여 제어된 구조체를 형성하거나 물질들이 일정한 양식으로 배치되는 현상을 의미한다. 자기조립은 언어적 의미 그대로 외력의 개입없이 물질과 주변 사이의 국부적 상호작용(local interaction)을 통해 스스로 수행되는 과정이다.
자기조립의 예시는 다양한 물질에서 찾아볼 수 있다. 결정 형성, 콜로이드 형성, 지질 이중층, 고분자 필름과 자기조립 박막 형성에서 최종 생성물은 자기조립 현상의 결과물로 해석할 수 있다. 그리고, 폴리펩타이드 사슬(polypeptide chain)이 구성물 간 상호작용으로 말미암아 접힘(folding) 과정을 통해 특정한 구조를 가지는 단백질로 변하는 현상 및 DNA의 접힘 과정 역시 자기조립이라 부를 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 피코시아닌-독소루비신 컨쥬게이트는 수용액 상에서 자기조립되어 구형의 나노입자를 형성하였다. 자기조립의 결과로 코어-쉘(core-shell) 구조가 형성될 수 있는데, 친수성인 피코시아닌이 쉘을 이루므로 코어 부분에 소수성 약물인 독소루비신을 담지할 수 있다.
본 발명은 피코시아닌(C-phycocyanin)-항암제 컨쥬게이트를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물, 이를 포함하는 광역학치료용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 빛 조사 시 활성산소종을 생성하는 피코시아닌을 항암제인 독소루비신(doxorubicin)과 함께 결합시킨 후 나노 크기로 제형화시킴으로써 생체 내의 병소에 축적을 유도하고, 빛을 조사하여 활성산소를 발생시킴과 동시에 항암제를 전달하여 항암제치료 및 광역학치료를 동시에 수행할 수 있다.
또한 다양한 암 치료에 적용가능할 뿐만 아니라 염증 등의 질환에도, 다양한 병소에 대하여서도 적용이 가능하여 새로운 치료법으로 활용될 수 있다.
도 1a는 피코시아닌(C-phycocyanin)-독소루비신(doxorubicin) 컨쥬게이트의 입도 분석 그래프이다.
도 1b는 피코시아닌-독소루비신 컨쥬게이트의 투과전자현미경(transmission electron microscopy; TEM) 사진이다.
도 2는 피코시아닌-독소루비신 컨쥬게이트의 푸리에 변환 적외선 분광학(fourier-transform infrared spectroscopy; FT-IR) 분석 그래프이다.
도 3은 피코시아닌-독소루비신 컨쥬게이트의 자외-가시선 분광광도계(UV-vis spectrophotometer) 분석 그래프이다.
도 4는 피코시아닌의 활성산소종 특성을 평가하는 1,3-디페닐이소벤조퓨란(1,3-diphenylisobenzofuran, DPBF) 소거 능력 그래프이다.
도 5a는 각질형성세포(정상세포)인 HacaT 세포(Human Keratinocyte Cell Lines)에 대하여 피코시아닌-독소루비신 컨쥬게이트의 독성을 평가한 그래프이다.
도 5b는 대장암세포인 CT26 세포(mouse colon carcinoma cells)에 대하여 피코시아닌-독소루비신 컨쥬게이트의 독성을 평가한 그래프이다.
도 5c는 CT26 세포에 대하여 레이저 조사 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 CT26 세포에서의 피코시아닌-독소루비신 컨쥬게이트에 의한 광역학 치료효과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.
실시예 1: 피코시아닌-독소루비신 컨쥬게이트 제조
본 발명자들은 15 mg의 피코시아닌(C-phycocyanin, Om food Co., Canada)을 0.1 M 농도를 가지는 10 mL의 보레이트 완충 용액(borate buffer solution, Sigma-aldrich Co., USA)에 녹여 피코시아닌 용액을 수득하였다. 그 후, 가교제로서 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필) 카르보디이미드 하이드로클로라이드(N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, Sigma-aldrich Co., USA) 6 mg 및 1-하이드록시-2,5-다이옥소-3-피롤리딘에설포닉 에시드 모노소디움 솔트 하이드레이트(1-hydroxy-2,5-dioxo-3-pyrrolidinesulfonic acid monosodium salt hydrate, Sigma-aldrich Co., USA) 6 mg를 피코시아닌 용액에 첨가하고, 항암제인 독소루비신(doxorubicin, Sigma-aldrich Co., USA) 1 mg을 연속적으로 첨가하고 24시간 동안 교반하여 반응시켰다.
상기 용액을 3일 동안 투석하여 결합되지 않은 가교제 및 독소루비신을 제거하였다. 이후 동결건조하여 분말 형태의 피코시아닌-독소루비신 컨쥬게이트를 수득하였고, 이를 수용액상에 분산시킨 후 프로브 균질 초음파기(NCET-12-0776)를 이용하여 20분 동안 초음파 처리하여 자기조립화를 유도하였다.
실시예 2: 피코시아닌-독소루비신 컨쥬게이트의 형태와 입도 분석
피코시아닌-독소루비신 컨쥬게이트를 수용액상에 분산시킨 후 초음파 처리하여 자기조립화를 통한 나노입자의 형성을 유도하였다. 제조된 나노입자의 형태 및 입자 크기 분포를 관찰하기 위해 투과전자현미경(transmission electron microscopy; TEM)과 동적 광 산란(dynamic light scattering; DLS)을 이용하여 측정하였다.
도 1a 및 1b에서 확인할 수 있듯이, 피코시아닌-독소루비신 컨쥬게이트 나노입자의 형태는 구형이었으며 균일한 형태를 가지고 있고, 입자의 크기는 283.55±1.86 nm였으며 이는 생체 내 주입이 가능한 크기였다. 이후 실험에 사용되는 피코시아닌-독소루비신 컨쥬게이트는 나노입자의 제형으로 준비하여 사용되었다.
실시예 3: 피코시아닌과 독소루비신의 결합 확인
피코시아닌-독소루비신 컨쥬게이트의 유효성분인 피코시아닌과 독소루비신의 결합 유무를 평가하기 위하여 푸리에 변환 적외선 분광학(fourier-transform infrared spectroscopy; FT-IR) 분석을 수행하고 자외-가시선 분광광도계(UV-vis spectrophotometer)를 이용하여 분석하였다.
도 2에서 확인할 수 있듯이, 피코시아닌-독소루비신 컨쥬게이트 피크에서 피코시아닌의 특징적인 3000 cm-1 대의 -OH 피크가 나타나며 -COOH 피크인 1000 내지 1500 cm-1 대의 피크가 이동한 것을 알 수 있다. 또한 800 내지 900 cm-1 대 피크를 통해서 독소루비신의 -NH2와 피코시아닌의 -COOH의 피크가 성공적으로 결합한 것을 보여준다.
도 3에서 확인할 수 있듯이, 피코시아닌-독소루비신 컨쥬게이트에서 624 nm 최대 흡수 피크를 가진 피코시아닌의 흡수 스펙트럼을 가져 화학적 합성 후에도 피코시아닌의 고유한 광역학 특성을 잃지 않고 유지함을 보여준다. 또한 독소루비신은 400 nm 파장에서 흡수 스펙트럼을 가지는데 피코시아닌에서는 관찰되지 않지만 피코시아닌-독소루비신 컨쥬게이트의 피크에서 독소루비신의 흡수 스펙트럼이 관찰되었다. 이를 통하여 피코시아닌과 독소루비신이 성공적으로 결합되었음을 알 수 있다.
실시예 4: 활성산소 생성 평가
피코시아닌-독소루비신 컨쥬게이트의 활성산소 생성 효율을 평가하기 위하여 1,3-디페닐이소벤조퓨란(1,3-diphenylisobenzofuran, DPBF) 시약을 이용한 활성산소 생성 실험을 수행하여 백분율로 나타내었다. MRL-ⅢCo, Seoul, Korea)을 이용하여 635 nm의 붉은 파장의 빛을 80 mW/cm2의 저에너지 전압으로 조사하였다. 레이저 조사는 635 nm의 저에너지 레이저로 선택하였다.
표 1 및 도 4에서 확인할 수 있듯이, 피코시아닌-독소루비신 컨쥬게이트와 피코시아닌 용액에 레이저를 조사한 그룹의 DPBF 흡광도는 30분 동안 60% 가까이 감소하였다. 반면에, 레이저를 조사하지 않은 피코시아닌-독소루비신 컨쥬게이트의 DPBF 흡광도는 시간이 지나도 감소하지 않음을 보였다.
이를 통하여, 피코시아닌-독소루비신 컨쥬게이트와 피코시아닌은 80 mW/cm2의 낮은 세기의 635 nm 레이저 조사에도 일중항 산소(Singlet Oxygen)와 같은 활성산소를 효과적으로 생성하는 것을 보여주었다.
레이저 조사시간 (min) 0 5 10 15 20 25 30
DBPF (with laser) 100 99.62 ± 0.09 99.06 ± 0.05 98.76 ± 0.19 98.51 ± 0.14 98.10 ± 0.08 97.72 ± 0.48
피코시아닌 100 98.57 ± 1.03 98.25 ± 1.24 97.48 ± 1.21 97.67 ± 0.49 97.23 ± 1.21 96.24 ± 1.18
피코시아닌-독소루비신 100 98.92 ± 0.37 97.80 ± 0.53 96.74 ± 0.69 95.50 ± 0.80 95.61 ± 0.74 95.23 ± 0.88
피코시아닌 (with laser) 100 87.52 ± 1.92 77.06 ± 1.30 67.74 ± 2.11 57.96 ± 2.57 51.58 ± 3.69 43.59 ± 3.27
피코시아닌-독소루비신 (with laser) 100 85.80 ± 0.79 73.44 ± 1.02 62.60 ± 1.17 56.01 ± 1.13 49.62 ± 2.21 43.97 ± 3.07
실시예 5: 세포 독성 평가
피코시아닌-독소루비신 컨쥬게이트를 생체 내에 적용하기에 앞서 세포에서의 독성 평가를 수행하여 표 2, 도 5a 및 5b에 백분율로 나타내었다. 대상 세포로는 각질형성세포(정상세포)인 HacaT 세포(Human Keratinocyte Cell Lines) 및 대장암세포인 CT26 세포(mouse colon carcinoma cells)를 사용하였다. 대상 세포에 피코시아닌 및 피코시아닌-독소루비신 컨쥬게이트 나노입자를 100 내지 500 ug/mL의 농도로 처리하고, 24시간 동안 37℃에서 배양한 뒤 무처리군의 세포생존율을 100%로 설정하고 이에 대비하여 비교하였다.
세포 ug/mL 0 100 200 300 400 500
HacaT 피코시아닌 100 104.36 ± 0.71 104.22 ± 2.16 106.29 ± 2.07 105.20 ± 3.02 104.36 ± 4.32
피코시아닌-독소루비신 나노입자 100 97.29 ± 4.25 95.44 ± 3.75 85.96 ± 8.00 78.70 ± 5.04 67.95 ± 7.58
CT26 피코시아닌 100 94.10 ± 1.60 93.69 ± 1.05 93.38 ± 4.11 90.03 ± 2.31 85.49 ± 4.03
피코시아닌-독소루비신 나노입자 100 79.89 ± 0.73 75.35 ± 1.74 68.15 ± 1.44 63.30 ± 2.52 59.05 ± 2.20
도 5a에서 확인할 수 있듯이, HacaT 세포에서 피코시아닌 단독 처리군은 100 내지 500 ug/mL의 농도에서는 세포생존율이 감소하지 않음을 보였다. 반면에 피코시아닌-독소루비신 컨쥬게이트를 처리한 군에서는 고농도에서는 세포생존율이 감소하였으나 100 내지 300 ug/mL의 농도에서는 세포생존율이 거의 변하지 않아, 저농도에서는 정상세포에 대한 독성이 발생하지 않음을 보여주었다.
도 5b에서 확인할 수 있듯이, CT26 세포에서 피코시아닌 단독 처리군은 500 ug/mL의 농도를 처리한 그룹을 제외하고는 세포생존율이 거의 변하지 않았다. 반면에 피코시아닌-독소루비신 컨쥬게이트를 처리한 군에서는 항암제의 독소루비신의 영향으로 인해 농도가 증가할수록 세포생존율이 감소함을 보였다.
세포생존율의 감소에 있어서 레이저 조사에 의한 영향 여부를 확인하기 위하여, CT26 세포에 피코시아닌-독소루비신 컨쥬게이트의 처리 없이 실시예 4와 동일한 조건으로 30분 동안 레이저를 조사하고 24시간 동안 37℃에서 배양한 뒤 결과를 확인하였다.
도 5c에서 확인할 수 있듯이, CT26 세포에서의 레이저 조사의 영향을 평가하였다. 그 결과 레이저 조사 시간이 길어져도 세포생존율이 거의 변하지 않음을 보였다.
이를 통하여 광감각제 없이 레이저 단독 조사의 경우 세포 독성이 없고 즉, 세포생존율에 영향을 주지 않는 것을 확인하였다.
실시예 6: 광역학 치료효과
광역학 치료효과를 평가하기 위하여 여러 그룹에서의 세포 생존율을 비교하였다. 피코시아닌 및 피코시아닌-독소루비신 나노입자를 100, 300 및 500 ug/mL 처리하고, 실시예 4와 동일한 조건으로 레이저를 조사하였다. 처리를 완료한 CT26 세포를 24시간 동안 37℃에서 배양한 뒤 무처리군의 세포생존율을 100%로 설정하고 이에 대비하여 비교하였다.
ug/mL 0 100 300 500
피코시아닌 100 98.11±5.15 97.59±2.50 87.90±3.53
피코시아닌(레이저 조사) 100 82.01±2.67 70.23±2.44 63.66±1.15
피코시아닌-독소루비신 100 81.93±2.70 72.21±4.56 51.21±3.75
피코시아닌-독소루비신(레이저 조사) 100 65.48±3.73 38.53±2.03 24.24±1.57
표 3 및 도 6에서 확인할 수 있듯이, 피코시아닌 처리 후 레이저를 조사한 그룹에서는 활성산소종 생성으로 인해 세포생존율이 감소한 경향을 보였다. 피코시아닌-독소루비신 컨쥬게이트를 단독으로 처리하였을 때 독소루비신의 영향으로 세포생존율이 감소하였다.
특히, 피코시아닌-독소루비신 컨쥬게이트 처리 후 레이저를 조사한 그룹은 피코시아닌의 우수한 광역학 특성과 독소루비신의 영향으로 인해 500 ug/mL의 농도에서 80% 가까이 세포생존율이 감소함을 보였다.
따라서, 본 연구에서 제안한 피코시아닌-독소루비신 컨쥬게이트는 효과적인 광역학 치료제제로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (12)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 다음 단계를 포함하는 광역학치료용 조성물의 제조방법:
    피코시아닌(C-phycocyanin) 용액에 독소루비신(doxorubicin), 메토트랙세이트(Methotrexate), 시스플라틴(Cisplatin) 및 레티노산(Retinoic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 항암제, N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필) 카르보디이미드 하이드로클로라이드 (N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride), 및 1-하이드록시-2,5-다이옥소-3-피롤리딘에설포닉 에시드 모노소디움 솔트 하이드레이트 (1-hydroxy-2,5-dioxo-3-pyrrolidinesulfonic acid monosodium salt hydrate)를 첨가 후 교반하여 피코시아닌과 항암제의 공유결합을 유도하는 교반 단계;
    용액을 동결건조하여 피코시아닌-항암제 컨쥬게이트 분말을 수득하는 동결건조 단계; 및
    피코시아닌-항암제 컨쥬게이트 분말을 수용액 상에서 초음파 처리하는 나노입자 형성 단계.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제8항에 있어서, 교반 단계는 1 내지 48시간 동안 수행되는 것인, 광역학치료용 조성물의 제조방법.
  12. 제8항에 있어서, 동결건조 단계는 용액 중 미반응물의 제거 후 수행되는 것인, 광역학치료용 조성물의 제조방법.
KR1020200083575A 2020-04-10 2020-07-07 피코시아닌-항암제 컨쥬게이트를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물, 이를 포함하는 광역학치료용 조성물 및 이의 제조방법 KR102513560B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200044155 2020-04-10
KR20200044155 2020-04-10

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20210126469A KR20210126469A (ko) 2021-10-20
KR102513560B1 true KR102513560B1 (ko) 2023-03-24

Family

ID=78268227

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200083575A KR102513560B1 (ko) 2020-04-10 2020-07-07 피코시아닌-항암제 컨쥬게이트를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물, 이를 포함하는 광역학치료용 조성물 및 이의 제조방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102513560B1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115364214A (zh) * 2022-08-23 2022-11-22 福州大学 一种光动力学疗法的光敏剂及其制备方法和应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101374820B1 (ko) * 2012-01-30 2014-03-17 광주과학기술원 페오포르바이드-α 컨쥬게이트 및 그의 용도
KR102065711B1 (ko) * 2018-01-04 2020-01-14 한국과학기술연구원 종양 인식형 광감각제-약물 접합체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 종양 예방 또는 치료용 약학 조성물

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Journal of Materials Chemistry B. 2017. Vol.5, pp.3300-3314.*
Journal of Nanoparticle Research. 2017. Vol.19, Article 272.*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20210126469A (ko) 2021-10-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yang et al. Red-light-triggered self-destructive mesoporous silica nanoparticles for cascade-amplifying chemo-photodynamic therapy favoring antitumor immune responses
Lei et al. Polydopamine-coated mesoporous silica nanoparticles for multi-responsive drug delivery and combined chemo-photothermal therapy
Li et al. Singlet oxygen-responsive micelles for enhanced photodynamic therapy
Zhou et al. Dancing with reactive oxygen species generation and elimination in nanotheranostics for disease treatment
Zhu et al. Polysarcosine brush stabilized gold nanorods for in vivo near-infrared photothermal tumor therapy
KR102081666B1 (ko) 암 치료용 약학 조성물
Moghassemi et al. Nanoemulsion applications in photodynamic therapy
WO2019114066A1 (zh) 一种基于黑磷的水凝胶近红外光可控释药系统及其制备方法
WO2017045192A1 (zh) 靶向肿瘤的声、光动力载药纳米胶束及其制备方法和用途
Wu et al. Enhanced photodynamic therapy/photothermo therapy for nasopharyngeal carcinoma via a tumour microenvironment-responsive self-oxygenated drug delivery system
Rao et al. Antibacterial nanosystems for cancer therapy
Wang et al. Chitosan-and hyaluronic acid-based nanoarchitectures in phototherapy: Combination cancer chemotherapy, immunotherapy and gene therapy
Li et al. Temperature-and pH-responsive injectable chitosan hydrogels loaded with doxorubicin and curcumin as long-lasting release platforms for the treatment of solid tumors
CN110790922B (zh) 一种聚卟啉类化合物的制备方法及应用
KR102513560B1 (ko) 피코시아닌-항암제 컨쥬게이트를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물, 이를 포함하는 광역학치료용 조성물 및 이의 제조방법
Dou et al. A ZIF-based drug delivery system as three-in-one platform for joint cancer therapy
Ren et al. Macrophage-mediated multi-mode drug release system for photothermal combined with anti-inflammatory therapy against postoperative recurrence of triple negative breast cancer
CN112546025B (zh) 一种Ce6@CMCS-DSP-IPI549抗肿瘤纳米传递系统的制备方法
Qin et al. O2-generating multifunctional polymeric micelles for highly efficient and selective photodynamic-photothermal therapy in melanoma
Morteza-Semnani et al. Preparation and In-vitro evaluation of ketoconazole-loaded niosome (ketosome) for drug delivery to cutaneous candidiasis
CN109953974B (zh) 一种酶-还原双响应性透明质酸-聚硫化丙烯共聚物纳米胶囊的制备方法
CN115581707B (zh) 一种壳寡糖-姜黄素纳米复合体的制备方法
Li et al. Integrated and hyaluronic acid-coated mesoporous silica nanoparticles conjugated with cisplatin and chlorin e6 for combined chemo and photodynamic cancer therapy
KR20190048819A (ko) 멜라닌 및 항암제가 로딩된 나노 베지클을 이용한 암 치료를 위한 광열치료용 조성물과 이의 제조방법
CN112870356B (zh) 一种肿瘤光动力疗法系列药物及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant