KR101311224B1 - 과산화수소 검출용 형광 나노 프로브 및 그 제조방법 - Google Patents

과산화수소 검출용 형광 나노 프로브 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 과산화수소와 반응하여 형광을 발생하는 술폰화 벤젠 화합물과 과산화수소를 실시간으로 검출하는데 사용 가능한 수계분산 형광 나노 프로브와 그 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 형광 나노 프로브는 아래의 술폰화 벤젠화합물 및 물을 포함하는 것이다.
Figure 112011031100999-pat00013

Description

과산화수소 검출용 형광 나노 프로브 및 그 제조방법 {FLUORESCENT NANOBROBE FOR DETECTING HYDROGEN PEROXIDE AND THE FABRICATION METHOD THEREOF}
본 발명은 형광을 나타내는 벤젠화합물, 과산화수소와 반응하여 형광을 나타내는 술폰화 벤젠 화합물, 상기 형광 반응을 유발하는 소수성 유기 염기를 포함하여 과산화수소의 실시간 검출에 사용 가능한 수계분산 형광 나노 프로브 및 그 제조방법 에 관한 것이다.
활성 산소는 호기성 생물의 생체 내에서 필수적으로 생성되지만 과다하게 생성되고 체내에 축적되는 경우, 암, 당뇨병, 알츠하이머병, 동맥경화, 관절염 등 광범위한 염증성 질환을 발생시키는 기작과 깊이 관련되어 있어 이를 생체 내/외에서 검출하는 것은 매우 중요하다.
활성 산소로는 단일항 산소 [singlet oxygen (1O2)], 하이드록시 라디칼 (OH-), 과산화물 음이온 [superoxide anion (O2 -)], 과산화수소 (H2O2)가 있는데, 이 중 과산화수소를 제외한 나머지는 생리적 환경에서 안정성이 매우 낮아서 과산화수소나 물로 쉽게 환원된다. 따라서 활성 산소의 과다 발현과 관련이 있는 질환을 진단함에 있어서는 활성 산소 중에서 안정성이 가장 높고, 생체 내에서 가장 높은 농도 (1 × 10-7 M)로 존재하는 과산화수소를 생체 내/외에서 검출하는 방법이 가장 유리하다.
과산화수소를 검출하는 대표적인 방법은 형광을 이용하는 방법 [문헌 1: Novuaki Soh, Anal . Bioanal . Chem . 386: 532-543 (2006)]과, 화학 발광을 이용하는 방법 [문헌 2: Ahao Lu 외, Trends Anal . Chem . 25: 985-995 (2006), 문헌 3: Zhenyu Zhang 외, Anal . Chim . Acta 541: 37-47 (2005)]이 널리 사용되고 있다.
과산화수소를 화학 발광으로 검출하는 방법은 여기광의 조사를 필요로 하지 않아서 배경 형광이나 여기광의 간섭이 전혀 없으므로 형광 검출법에 비해 낮은 발광 효율임에도 높은 잡음 대 신호비 (sgnal-to-noise ratio)를 얻을 수 있다는 장점이 있어 생체 내 검출에 있어 매우 유리하다. 그러나 절대적 신호 강도가 낮아 고감도의 검출기를 필요로 하고 빠른 시간 내에 소멸되어 검출 시간의 선정이 까다롭다는 단점이 있어 생체 외 검출을 위한 저가의 센서를 제작함에 있어서 한계점이 있다.
형광 검출법은 여기광을 필요로 하기 때문에 화학 발광 검출법과 비교하였을 때 배경 형광 (background fluorescence)이 신호의 검출을 방해할 수 있다는 단점이 있으나, 그 신호가 강하여 고감도의 검출기를 필요로 하지 않고 화학 발광과 달리 신호가 축적되기 때문에 검출 시간의 선정에 어려움이 없어 다양한 센서의 제작에 유리한 방법이 된다. 과산화수소의 형광 검출을 위해서는 과산화수소에 의해 쉽게 산화되는 형광 분자를 사용하여 산화에 의한 형광 변화를 측정 [문헌 4: Naoki Umezawa 외, Angew . Chem . Int . Ed . 38: 2899-2901 (1999)] 하거나 과산화수소에 의해 쉽게 떨어져 나갈 수 있는 치환기를 형광 분자에 결합시켜 그 치환기 분리에 의해 야기되는 형광 특성의 변화를 측정 [문헌 5: Evan W Miller 외, Nat . Chem . Biol. 3: 263-267 (2007), 문헌 6: Hatsuo Maeda 외, Angew . Chem . 116: 2443-2445 (2004)]하는 방법이 사용된다. 이러한 형광 검출법은 많은 장점이 있지만 반응 시간이 1시간 이상 소요되어 실시간 검출에는 적합하지 않다. 실시간 검출을 위하여 상기 반응 속도를 줄이는 것이 당면 과제라 할 수 있다.
본 발명의 목적은 종래 기술의 문제를 해결하고자 하는 것으로서, 빠른 반응 속도와 고효율의 과산화수소 검출용 형광 프로브를 제공하는 것이다. 구체적으로는, 과산화수소와 반응하여 형광을 발생하는 소수성 술폰화 벤젠 화합물과 소수성 술폰화 벤젠 화합물과 반응 촉진을 위한 유기 염기를 나노입자로 구성된 반응 공간 내에 집적함으로써 과산화수소의 검출 반응 속도가 증진된 형광 나노 프로브 및 그 제조방법, 그리고 상기 나노 프로브를 이용하여 과산화수소를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 형광 벤젠화합물은 아래의 화학식 1의 형광 벤젠화합물이다.
[화학식 1]
Figure 112011031100999-pat00001
,
상기 A는 에스테르, 알데히드, 니트릴, 니트로벤젠, 술폰화벤젠, 인단, 바비츄릭산 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 전자 받게 치환기이고, 상기 벤젠화합물은 아래의 화학식 2의 화합물일 수 있다.
[화학식 2]
Figure 112011031100999-pat00002
본 발명의 술폰화 벤젠화합물은 술폰화되어 형광이 소멸된 아래의 화학식 3의 술폰화 벤젠화합물이다.
[화학식 3]
Figure 112011031100999-pat00003
상기 A는 에스테르, 알데히드, 니트릴, 니트로벤젠, 술폰화벤젠, 인단, 바비츄릭산 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 전자 받게 치환기이고, 상기 술폰화 벤젠화합물은 아래의 화학식 4의 술폰화벤젠 화합물일 수 있다.
[화학식 4]
Figure 112011031100999-pat00004
한편, 본 발명의 형광 나노 프로브는 상기 술폰화 벤젠화합물 및 물을 포함하는 것이다.
본 발명에 의하면, 수계 분산 형광 나노 프로브 내부에 포함되는 소수성 술폰화 벤젠 화합물은 과산화수소 존재 시에 나노입자 내부에 공존하는 유기 염기에 의해 매우 빠르게 형광을 발현하여 실시간으로 과산화수소를 검출하는데 사용될 수 있으므로, 세포 영상, 생체 내 영상, 화학 분석 등에 있어서 광범위하게 사용될 수 있다.
본 발명에 의하면, 나노 입자 중심부에 과산화수소에 감응하는 소수성 술폰화 벤젠 화합물과 소수성 유기 염기를 함유한 상태에서 수계 분산 안정성이 우수하고, 생체 친화성 고분자 계면 활성제를 사용했을 때 의학, 생물학 분야에서 과산화수소를 검출하는데 널리 적용할 수 있는 효과적인 나노 입자를 제조할 수 있다.
본 발명에 의한 형광 나노 프로브의 수계 분산은 과산화수소와 반응 시 수 초 이내에 5 배 이상의 형광 증가를 보임으로써 실시간 과산화수소 검출에 이용될 수 있다.
본 발명에 의한 형광 분자는 도 1의 전자 받게 (A)에 따라 그 형광 파장을 조절할 수 있어 세포 영상, 생체 내 영상, 화학 분석 등의 용도에 따라 형광 파장을 선택하여 광범위하게 활용할 수 있다.
도 1은 실시예 1 (1)과 (2)의 방법으로 제조되는 형광 분자의 대표도 및 전자 받게 (A)가 결합된 DT, AD, DM, MN, SN, TM의 화학 구조식이다.
도 2는 실시예 1의 (3)의 방법으로 제조된 수계 분산 형광 나노 입자들의 여기 (a) 및 형광 (b) 스펙트럼이다.
도 3은 실시예 2의 (2)의 방법으로 제조된 수계 분산 형광 나노 프로브의 동적광산란법에 의해 측정된 입자 크기 분포 그래프이다.
도 4는 본 발명의 수계 분산 형광 나노 프로브와 과산화수소의 반응에 의한 형광 발생의 모식도이다.
도 5는 실시예 3의 (1)의 소수성 유기 염기의 기능 평가에 의해 측정된, 과산화수소를 첨가하기 전과 첨가 20분 후의 형광 스펙트럼이다 (점선 : 1-페닐이미다졸을 함유한 수계 분산 형광 나노 프로브, 실선 : 트리메틸벤조산을 함유한 수계 분산 형광 나노 프로브)
도 6은 실시예 3의 (2)의 소수성 유기 염기 종류에 따른 과산화수소 검출의 가속화 기능 평가에 의해 측정된 형광 스펙트럼과 시간에 따른 형광 증가의 변화 추이 그래프 (우측 상단 삽입 그래프)이다. ((a) 1-페닐이미다졸을 함유한 수계 분산 형광 나노 프로브, (b) 2-페닐이미다졸을 함유한 수계 분산 형광 나노 프로브)
형광 특성을 나타내는 본 발명의 벤젠화합물은 아래의 화학식 1의 형광 벤젠화합물이다.
[화학식 1]
Figure 112011031100999-pat00005
,
상기 A는 에스테르, 알데히드, 니트릴, 니트로벤젠, 술폰화벤젠, 인단, 바비츄릭산 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 전자 받게 치환기이다.
상기 화학식 1의 A에 따라, 상기 벤젠화합물은 아래의 화학식 2의 화합물인 것인 형광 벤젠화합물일 수 있다.
[화학식 2]
Figure 112011031100999-pat00006
본 발명의 술폰화 벤젠 화합물은 검출 등에 사용하기 위하여 형광 특성이 발현되지 않도록 술폰화되어 형광이 소멸된 아래의 화학식 3의 술폰화 벤젠화합물이다.
[화학식 3]
Figure 112011031100999-pat00007
역시, 상기 A는 에스테르, 알데히드, 니트릴, 니트로벤젠, 술폰화벤젠, 인단, 바비츄릭산 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 전자 받게 치환기이다.
상기 화학식 3의 A에 따라, 상기 술폰화 벤젠화합물은 아래의 화학식 4의 술폰화벤젠 화합물일 수 있다.
[화학식 4]
Figure 112011031100999-pat00008
한편, 본 발명의 목적 물질 존재 시, 형광을 발현하여 검출에 사용되는 형광 나노 프로브는 상기의 술폰화 벤젠화합물 및 물을 포함하는 것이다.
본 발명의 형광 나노 프로브 중 상기 술폰화 벤젠화합물의 함량은 전체 형광 나노 프로브 중 0.0001 내지 3 중량%인 것일 수 있고, 상기 물의 함량은 전체 형광 나노 프로브 중 44 내지 99.9898 중량%인 것일 수 있다.
본 발명의 형광 나노 프로브는 소수성 유기 염기를 더 포함하는 것일 수 있고, 상기 소수성 유기 염기의 함량은 전체 형광 나노 프로브 중 0.0001 내지 3 중량%인 것일 수 있고, 상기 소수성 유기 염기는 이미다졸계, 트리알킬아민계 및 피리딘계로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나인 것일 수 있다.
본 발명의 형광 나노 프로브는 계면활성제를 더 포함하는 것일 수 있고, 상기 계면활성제의 함량은 전체 형광 나노 프로브 중 0.01 내지 50 중량%인 것일 수 있고, 상기 계면활성제는 폴록사머 (poloxamer), 폴리소르베이트 (polysorbate) 및 소르비탄 (sorbitan) 알킬에스테르로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나인 것일 수 있다.
유기염기 및 계면활성제를 동시에 더 포함할 수도 있으며, 상기 술폰화 벤젠화합물과 상기 유기염기로 이루어진 코어 및 상기 계면활성제와 물로 이루어진 쉘로 이루어진 코어-쉘 구조인 것일 수 있다.
유기염기 및 계면활성제를 동시에 더 포함하는 경우에, 상기 술폰화 벤젠화합물의 함량은 0.0001 내지 3 중량%이고, 상기 유기 염기의 함량은 0.0001 내지 3 중량%이고, 상기 계면활성제의 함량은 0.01 내지 50 중량%이고, 상기 물의 함량은 44 내지 99.9898 중량%인 것일 수 있다.
본 발명의 형광 나노 프로브는 직경이 10 내지 200 ㎚인 나노입자일 수 있다.
과산화수소 검출은 유기용매에 본 발명의 술폰화 벤젠화합물이 용해되어 있는 것인 과산화수소 검출 용액을 그대로 사용할 수도 있다. 상기 과산화수소 검출 용액은 유기용매와 상기 화학식 3의 술폰화 벤젠화합물을 혼합하여 제조할 수 있고, 특히, 유기용매와 상기 화학식 4의 술폰화 벤젠화합물을 혼합하여 제조할 수 있다.
본 발명의 형광 나노 프로브 제조방법은 (a) 유기용매와 청구항 3의 화학식 3의 술폰화 벤젠화합물을 혼합하는 단계 및 (b) 상기 유기용매를 제거하여, 형광 나노 프로브를 얻는 단계를 포함하는 것이다.
상기 단계 (b)는, 상기 유기용매를 제거하고 물을 가하거나, 먼저 물을 가하고 상기 유기용매를 제거하여 형광 나노 프로브를 얻는 단계인 것일 수 있다.
상기 형광 나노 프로브 제조방법에서 상기 술폰화 벤젠화합물은 청구항 4의 화학식 4의 술폰화 벤젠화합물인 것일 수 있다.
단계 (a)에 계면활성제를 함께 혼합하는 것일 수 있고, 단계 (a)에 유기 염기를 함께 혼합하는 것일 수도 있다.
단계 (b) 이후에, (c) 형광 나노 프로브를 물에 분산시켜 수계 분산 나노 프로브를 얻는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명을 도면을 참조하여 더욱 상세히 설명한다.
본 발명은, 상기 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3에 해당하는 형광 분자의 구조에 관한 것이다.
상기 화학식 1 및 도 1의 형광 분자는 고체 및 분자 집합체 상태에서의 효율적인 형광을 얻기 위해 전자를 당기는 기능단 (A)이 도입됨으로써 가시광선 및 근적외선 영역인 400 내지 900 ㎚ 범위의 발광 파장을 보이는 것이 바람직하다.
특히, 상기 화학식 1에서 형광 분자는 화학구조 2에서 보는 바와 같이 그 전자 받게 (A)가 에틸에스터 (DT), 알데히드 (AD), 말로니트릴 (DM), 니트로페닐아세토니트릴 (NN), 페닐술포닐아세토니트릴(SN) 및 테트라말로니트릴인단 (TM)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있다.
또한, 본 발명은, 과산화수소 감응 소수성 술폰화 벤젠 화합물, 소수성 유기 염기, 계면활성제 및 물을 포함하는 수계 분산 형광 나노 프로브에 관한 것이다.
형광 나노 프로브가 분산된 수계 분산액의 총중량에 대하여, 상기 소수성 술폰화 벤젠 화합물의 함량은 0.0001 내지 3 중량%, 상기 소수성 유기 염기의 함량은 0.0001 내지 3 중량%, 상기 계면 활성제의 함량은 0.01 내지 50 중량%, 물의 함량은 44 내지 99.9898 중량%일 수 있다.
상기 과산화수소 감응 소수성 술폰화 벤젠 화합물은 화학식 1의 형광분자의 히드록시 그룹을 pentafluorobenzenesulfonyl chloride를 이용하여 술폰화한 화학식 3으로 표현되는 분자 구조를 갖는다. 화학식 2의 디에틸 2,5-디히드록시테레프탈레이트 (DT), 2,5-디히드록시테레프탈알데히드 (AD), 2,2'-(2,5-디히드록시-1,4-페닐렌)비스(메탄-1-일-1-일리덴)디말로니트릴 (DM), (2Z,2Z')-3,3'-(2,5-디히드록시-1,4-페닐렌)비스(2-(4-니트로페닐)아크릴로니트릴) (NN), (2Z,2Z')-3,3'-(2,5-디히드록시-1,4-(페닐술포닐)아크릴로니트릴) (SN) 및 2,2',2'',2'''-(2,2'-디히드록시-1,4-페닐렌)비스(메탄-1-일-1-일리덴)비스(1H-인덴-3,2,1(2H)-트릴리덴))테트라말로니트릴 (TM)로 구성되는 군에서 1종 이상 선택하여 술폰화한 분자일 수 있다.
유기 염기는 화학 발광을 통한 과산화수소 검출법에 있어서 과산화수소와 화학 발광 프로브 간의 반응을 촉진하는 데에 사용되고 있다. 본 발명에서는 느리게 일어나는 과산화수소와 술폰화 벤젠 화합물 간의 반응을 촉진하기 위하여 나노 공간 내에 소수성 유기 염기와 술폰화 벤젠 화합물을 집적하여 반응의 활성화 에너지을 낮추는 동시에 반응 분자 간의 거리를 가깝게 하는 이중 촉진 기능을 통한 빠른 반응을 유도하고자 하였다. 따라서, 상기 소수성 유기 염기는 상기 과산화수소 감응 술폰화 벤젠 화합물 및 계면활성제와 함께 균일하게 혼합되어 나노 입자를 형성 하고 과산화수소와의 반응을 촉진하는 유기 분자로서 바람직하게는 이미다졸계 (1-페닐이미다졸, 2-페닐이미다졸, 4-페닐이미다졸 등), 트리알킬아민계 (트리헥실아민 등), 피리딘계로 이루어진 군에서 1종 이상 선택된다.
계면활성제는 계면활성제로서의 역할과 소수성 술폰화 벤젠 화합물과 소수성 유기 염기를 포함하는 코어의 구조를 유지하는 지지체의 역할을 동시에 하는 것으로서, 본 발명의 나노 프로브를 생물학적, 의학적 용도로 활용하기 위해서는 생리 환경에서의 분산 안정성 및 적합성을 위하여 생체 적합성 계면 활성제인 것이 바람직하고 화학 분석적 용도로 활용하기 위해서는 그 외 다수의 계면 활성제 또한 적용이 가능하다.
따라서, 상기 계면 활성제는 폴록사머(poloxamer), 폴리소르베이트(polysorbate) 및 소르비탄 (sorbitan) 알킬에스테르로 구성된 군에서 1종 이상 선택되는 것이 바람직하다.
구체적으로는, 플루로닉® F 38, 플루로닉® F 68, 플루로닉? F 77, 플루로닉? F 87, 플루로닉? F 88, 플루로닉? F 98, 플루로닉® F 127, 플루로닉® P 181 및 P 407 (BASF 등록 상표) 등으로 이루어진 폴록사머, 트윈® 20, 트윈® 40, 트윈® 60, 트윈® 80 (ICI Americas Inc. 등록 상표) 등으로 이루어진 폴리소르베이트, 스판® 20, 스판® 40, 스판® 60, 스판® 65, 스판® 80, 스판® 85 (Croda International PLC 등록 상표) 등으로 이루어진 소르비탄 알킬에스테르일 수 있다.
상기 폴록사머, 특히 플루로닉® F-127 및 F-68은 미셀 (micelle) 또는 수화젤을 형성하므로, 의약학 분야에서 약물 또는 분자 영상용 조영제의 전달체로 많이 사용되는 물질로서, 그 나노 구조체의 중심부는 비교적 소수성이기 때문에 소수성 분자를 함유하기 쉽고, 표면은 친수성과 안티파울링 효과가 있는 폴리에틸렌글리콜 (PEG)로 둘러싸여 있어 상기 나노 프로브의 활용성을 생체 내 과산화수소 검출까지 넓힐 수 있다.
본 발명에 따른 수계 분산 형광 나노 프로브의 직경은 5 내지 500 ㎚, 바람직하게는 10 내지 200 ㎚일 수 있다. 상기 나노 입자가 이러한 직경 범위 내에 있을 경우에 임상 및 진단용으로 적합하기 때문이다 [문헌 7: D. Peer 외, Nature Nanotech . 2: 751-760 (2007)].
본 발명의 상기 수계 분산 형광 나노 프로브의 제조방법은, (a) 과산화수소 감응 소수성 술폰화 벤젠 화합물, 소수성 유기 염기 및 계면 활성제를 유기 용매에 용해시킨 다음, 상기 유기 용매를 제거하여 혼합물을 균일하게 고정하는 단계와, (b) 상기 단계 (a)의 생성물에 물을 가하여 과산화수소 감응 소수성 술폰화 벤젠 화합물, 소수성 유기 염기 및 계면 활성제로 이루어진 나노 프로브의 수분산액을 형성시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 단계 (a)의 유기 용매는 디클로로메탄, 테트라하이드로푸란, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 메탄올로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있다. 이들 유기 용매는 상온(常溫)에서 증발시켜 제거할 수 있다.
상기 단계 (b)에서의 물은 증류수를 사용할 수 있다. 물의 양은 형광 나노 프로브의 총중량에 대하여 2 내지 10000배인 것일 수 있다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명하겠다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 형광 분자 합성 및 나노 입자 제조, 형광 특성 분석
(1) 2,5-디하이드록시벤젠-1,4-디카르보알데히드 (AD)의 합성
0.5 g의 2,5-디메톡시벤젠-1,4-디카르보알데히드와 25 mL의 보론트리브로마이드를 150 mL의 클로로벤젠에 녹인 후 상온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 종료 후 반응 혼합물을 탄산나트륨으로 중화하고 물과 디클로로메탄으로 추출한 후 디클로로메탄에서 재결정하여 2,5-디하이드록시벤젠-1,4-디카르보알데히드를 얻었다. 생성물의 수득율, 성상 및 NMR 분석 결과는 아래와 같다.
수득율 70 %, 노란색 결정. 1H-NMR (300 MHz, DMSO, TMS): δ=10.30 (s, 2H), 7.20 (s, 2H; aromatic).
(2) 형광 분자 (DM, SN, NN, TM)의 합성
2,5-디하이드록시기를 포함하는 벤젠링의 1,4-위치에 여러 종류의 전자받개를 도입함으로써 여러 파장대의 형광을 보여주는 분자들을 합성하였다. 각각 2 당량의 말로니트릴, 2-(4-니트로페닐)아세토니트릴, 2-(페닐술포닐)아세토니트릴, 1,3-비스(다이시아노메틸리딘)인단을 1 당량의 2,5-디하이드록시벤젠-1,4-디카르보알데히드와 함께 에탄올에 녹인 후 80 ℃에서 6 시간 동안 교반하였다. 반응 후 생성되는 각각의 침전물은 필터 후 에탄올에서 재결정하였다. 생성물은 NMR을 이용 구조 분석하였다. 이와 같은 방법으로 얻어진 형광 염료의 구조는 도 1에 나타내었으며 합성 수득율, 생성물의 성상 및 NMR 결과는 아래와 같다. 도 1은 실시예 1 (1)과 (2)의 방법으로 제조되는 형광 분자의 대표도 및 전자 받게 (A)가 결합된 DT, AD, DM, MN, SN, TM의 화학 구조식이다.
DM: 수득율 56 %, 노란색 분말. 1H-NMR (300 MHz, DMSO, TMS): δ=8.94 (s, 2H), 7.92 (s, 2H; aromatic).
SN: 수득율 56 %, 노란색 분말. 1H-NMR (300 MHz, DMSO, TMS): δ=9.19 (s, 2H), 8.17 (s, 2H; aromatic), 8.02 (d, 4H; aromatic), 7.77 (t, 2H; aromatic), 7.70 (t, 4H; aromatic).
NN: 수득율 64 %, 노란색 분말. 1H-NMR (300 MHz, DMSO, TMS): δ=8.36 (d, 4H; aromatic), 8.26 (s, 2H), 8.01 (d, 4H; aromatic), 7.16 (s, 2H; aromatic).
TM: 수득율 47 %, 적색 분말. 1H-NMR (300 MHz, DMSO, TMS): δ=10.28 (s, 2H), 7.91 (d, 4H; aromatic), 7.39 (d, 4H; aromatic), 7.22 (s, 2H; aromatic), 5.71 (s, 2H; hydroxy).
(3) 나노 입자 제조 및 형광 특성 분석
상기 실시예 1의 (2)에서 합성된 형광 분자와 디에틸 2,5-디히드록시테레프탈레이트 (DT)를 소수성 유기 염기인 1-페닐이미다졸과 함께 플루로닉® F-68의 코어에 집적한 나노 입자를 만들어 그 형광 특성을 평가 하였다.
나노 입자의 제조는 먼저 10 mg의 플루로닉® F-68, 각각 0.01 mg의 실시예 1의 (2)에서 합성된 형광 분자들 및 DT와 1-페닐이미다졸 1 mg을 디클로로메탄 0.3 mL에 용해시키고 균일하게 혼합한 다음, 상온에서 용매를 증발시켰다.
그 다음, 증류수 1 mL를 첨가하고, 균일하게 혼합하여 코어에 형광 분자와 소수성 유기 염기가 축적된 수계 분산 나노 입자를 얻었다.
제조한 나노 입자의 형광 특성은 형광 분광 광도계 (Fluorescence Spectrophotometer, Hitachi F-7000)를 이용하여 각각의 수계 분산에 대한 형광 스펙트럼 및 그 형광에 대한 여기 스펙트럼을 얻고, 이를 각각 도 2a 및 2b에 나타내었다. 도 2는 실시예 1의 (3)의 방법으로 제조된 수계 분산 형광 나노 입자들의 여기 (a) 및 형광 (b) 스펙트럼이다.
형광 스펙트럼에서 볼 수 있는 바와 같이 치환된 전자 받게의 전자 당김 세기에 따라 그 형광이 400 내지 800 ㎚의 광범위한 범위에서 발광되어 생물학, 의학 및 화학 분석 등 넓은 분야에서 용도에 따라 그 형광 파장을 선택할 수 있다.
또한, 여기 스펙트럼에서 보이는 바와 같이 그 여기광 또한 300 내지 670 ㎚에 이르는 넓은 범위에서 선택 가능하다.
실시예 2: 과산화수소 감응 소수성 술폰화 벤젠 화합물 합성 및 이를 함유한 수계분산 형광 나노 프로브의 제조
(1) 디에틸 2,5-비스(((pentafluorophenyl)sulfonyl)oxy)terephthalate (FSDT)의 합성
과산화수소와 반응하여 떨어져 나가 형광 변화를 유발하는 기능단인 펜타플루오로페닐술포네이트는 그 구조 및 용도를 기존의 특허 [문헌 8: Hatsuo Meada 외, 미국 특허 US7491832 B2]에서 참조하였다.
0.2 g의 DT를 5 mL의 테트라히드로퓨란에 잘 녹인 후, 0.5 g의 펜타플루오로벤젠술포닐 클로라이드 (pentafluorobenzenesulfonyl chloride)와 0.2 mL의 트리에틸아민을 DT 용액에 넣고 실온에서 6시간 반응 하였다. 이 후 결정성 물질을 여과하여 제거하고 반응 혼합물을 에틸아세테이트에서 재침전시켜 생성물을 얻었다. 생성물의 수득율, 성상 및 NMR 분석 결과는 아래와 같다.
수득율 92 %, 흰색 분말. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS): δ=7.88 (s, 2H; aromatic), 4.38 (q, 4H), 1.42 (t, 6H).
(2) 수계 분산 형광 나노 프로브의 제조
플루로닉® F-68 10 mg과, 상기 실시예 2의 (1)에서 합성된 과산화수소 감응 소수성 술폰화 벤젠 화합물인 FSDT 0.1 mg과 1-페닐이미다졸, 2-페닐이미다졸, 4-페닐이미다졸, 트리핵실아민 중 하나의 유기 염기 1 mg을 디클로로메탄 0.3 mL에 용해시키고 균일하게 혼합한 다음, 상온에서 용매를 증발시켰다.
그 다음, 증류수 1 mL를 첨가하고, 균일하게 혼합하여 코어에 형광 프로브와 염기성 분자가 축적된 수계 분산 나노 입자를 얻었다.
제조된 수계 분산 형광 나노 프로브의 입자 크기 분포를 동적광산법 (BI-9000AT digital autocorrelator, Brookhaven)으로 측정하고 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3은 실시예 2의 (2)의 방법으로 제조된 수계 분산 형광 나노 프로브의 동적광산란법에 의해 측정된 입자 크기 분포 그래프이다.
도 3에서 보는 바와 같이, 형광 나노 프로브는 수계 분산 상태에서 그 평균 직경이 103 ㎚의 분포를 보였다.
실시예 3: 수계분산 형광 나노 프로브의 과산화수소 검출 특성 평가
(1) 소수성 유기 염기의 반응 촉진 기능 평가
도 4는 본 발명의 수계 분산 형광 나노 프로브와 과산화수소의 반응에 의한 형광 발생의 모식도이다. 본 특허의 수계 분산 형광 나노 프로브는 도 4로 도식화한 바와 같이 과산화수소 감응 술폰화 벤젠 화합물과 과산화수소간의 반응을 나노입자 내에 함께 집적한 소수성 유기 염기에 의해 가속화 하여 매우 빠른 시간 내에 과산화수소를 검출할 수 있다.
이러한 유기 염기의 반응 촉진 작용을 입증하기 위하여 대조군으로 나노 프로브의 중심부에 과산화수소 감응 술폰화 벤젠 화합물과 산성 분자인 1,3,5-트리메틸벤조산을 집적한 나노 프로브를 상기 실시예 2의 (2)와 동일한 방법으로 제조하였다. 제조된 대조군 수계 분산 나노 프로브와 상기 실시예 2의 (2)에서 제조된 1-페닐이미다졸을 함유한 수계 분산 형광 나노 프로브의 각각 1 mL에 0.4 mmol의 과산화수소를 첨가하여 20 분 후의 형광 스펙트럼을 관찰하여 도 5에 나타내었다. 도 5는 실시예 3의 (1)의 소수성 유기 염기의 기능 평가에 의해 측정된, 과산화수소를 첨가하기 전과 첨가 20분 후의 형광 스펙트럼이다 (점선 : 1-페닐이미다졸을 함유한 수계 분산 형광 나노 프로브, 실선 : 트리메틸벤조산을 함유한 수계 분산 형광 나노 프로브)
1,3,5-트리메틸벤조산을 함유한 대조군의 형광은 20 분경과 후에도 1.2 배 증가하여 그 형광 변화가 거의 없었으나 1-페닐이미다졸을 함유한 수계 분산 형광 나노 프로브는 23 배까지 그 형광이 증가하여 유기 염기에 의한 반응 속도 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
(2) 유기 염기에 따른 과산화수소 검출의 가속화 기능 평가
상기 실시예 3의 (1)에 유기 염기가 과산화수소 검출 반응을 촉진함을 확인 하였기에 본 실시예에서는 염기 종류에 따른 가속화 기능의 차이를 평가하였다.
상기 실시예 2의 (2)에 제조된 1-페닐이미다졸, 2-페닐이미다졸, 4-페닐이미다졸, 트리핵실아민을 함유한 수계 분산 나노 형광 프로브 1 mL에 과산화수소 0.4 mmol을 첨가 한 후 시간에 따른 형광 스펙트럼을 관찰하여 그 결과 중 1-페닐이미다졸 및 2-페닐이미다졸을 함유한 나노 프로브의 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6은 실시예 3의 (2)의 소수성 유기 염기 종류에 따른 과산화수소 검출의 가속화 기능 평가에 의해 측정된 형광 스펙트럼과 시간에 따른 형광 증가의 변화 추이 그래프 (우측 상단 삽입 그래프)이다. ((a) 1-페닐이미다졸을 함유한 수계 분산 형광 나노 프로브, (b) 4-페닐이미다졸을 함유한 수계 분산 형광 나노 프로브)
1-페닐이미다졸을 함유한 나노 프로브는 과산화수소를 첨가하자마자 형광 세기가 6.5 배 증가하였고 1분 이내에 약 14 배까지 증가하여 실시간으로 과산화수소를 검출하는데 있어서 충분한 반응 속도를 보였다.
2-페닐이미다졸을 함유한 나노 프로브는 과산화수소를 첨가한 후 시간에 비례하여 서서히 형광의 증가를 보여주었고 4-페닐이미다졸 및 트리핵실아민을 함유한 나노 프로브는 과산화수소 첨가 이전에 이미 형광이 상당히 증가하여 유기 염기의 선택에 따른 과산화수소 검출 특성이 각각 다르게 나타남을 확인하였다.

Claims (25)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 하기 화학식 4의 술폰화벤젠 화합물, 계면활성제 및 물을 포함하는 형광 나노 프로브.
    [화학식 4]
    Figure 112013031710819-pat00012
  5. 제4항에 있어서, 상기 형광 나노 프로브는 유기 염기를 더 포함하는 것인 형광 나노 프로브.
  6. 제4항에 있어서, 상기 술폰화 벤젠화합물의 함량은 전체 형광 나노 프로브 중 0.0001 내지 3 중량%인 것인 형광 나노 프로브.
  7. 제4항에 있어서, 상기 물의 함량은 전체 형광 나노 프로브 중 44 내지 99.9898 중량%인 것인 형광 나노 프로브.
  8. 제5항에 있어서, 상기 유기 염기는 소수성 유기 염기인 것인 형광 나노 프로브.
  9. 제8항에 있어서, 상기 소수성 유기 염기의 함량은 전체 형광 나노 프로브 중 0.0001 내지 3 중량%인 것인 형광 나노 프로브.
  10. 제8항에 있어서, 상기 소수성 유기 염기는 이미다졸계, 트리알킬아민계 및 피리딘계로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나인 것인 형광 나노 프로브.
  11. 삭제
  12. 제4항에 있어서, 상기 계면활성제의 함량은 전체 형광 나노 프로브 중 0.01 내지 50 중량%인 것인 형광 나노 프로브.
  13. 제4항에 있어서, 상기 계면활성제는 폴록사머 (poloxamer), 폴리소르베이트 (polysorbate) 및 소르비탄 (sorbitan) 알킬에스테르로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나인 것인 형광 나노 프로브.
  14. 제5항에 있어서, 상기 형광 나노 프로브는 상기 술폰화 벤젠화합물과 상기 유기염기가 코어를 이루고, 상기 계면활성제가 쉘을 이루는 코어-쉘 구조인 것인 형광 나노 프로브.
  15. 제14항에 있어서, 상기 술폰화 벤젠화합물의 함량은 0.0001 내지 3 중량%이고, 상기 유기 염기의 함량은 0.0001 내지 3 중량%이고, 상기 계면활성제의 함량은 0.01 내지 50 중량%이고, 상기 물의 함량은 44 내지 99.9898 중량%인 것인 형광 나노 프로브.
  16. 제4항에 있어서, 상기 형광 나노 프로브는 직경이 10 내지 200 ㎚인 나노입자인 것인 형광 나노 프로브.
  17. 제4항의 형광 나노 프로브가 용매에 분산되어 있는 과산화수소 검출 용액.
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. (a) 유기용매, 하기 화학식 4의 술폰화 벤젠화합물 및 계면활성제를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계;
    (b) 상기 혼합물로부터 상기 유기용매를 제거하여, 형광 나노 프로브를 얻는 단계; 및
    (c) 상기 형광 나노 프로브를 물에 분산시켜 수계 분산 나노 프로브를 얻는 단계
    를 포함하는 형광 나노 프로브 제조방법.
    [화학식 4]
    Figure 112013031710819-pat00020
  21. 제20항에 있어서, 상기 단계 (b)는,
    상기 유기용매를 제거하고 물을 가하거나, 먼저 물을 가하고 상기 유기용매를 제거하여 형광 나노 프로브를 얻는 단계인 것인 형광 나노 프로브 제조방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 계면활성제의 함량은 전체 형광 나노 프로브 중 0.01 내지 50 중량%인 것인 형광 나노 프로브 제조방법.
  23. 제20항에 있어서, 단계 (a)에 유기 염기를 함께 혼합하는 것인 형광 나노 프로브 제조방법.
  24. 제20항에 있어서, 상기 형광 나노 프로브는 상기 술폰화 벤젠화합물과 상기 유기 염기가 코어를 이루고, 상기 계면활성제가 쉘을 이루는 코어-쉘 구조인 것인 형광 나노 프로브 제조방법.
  25. 삭제
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