CN113563249B - 一种基于方酸菁的比率型荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于方酸菁的比率型荧光探针及其制备方法与应用，属于化学材料的制备及在分析测试领域的应用技术领域。本发明提供的比率型荧光探针，可特异性的识别次氯酸根离子，表现出很高的选择性和灵敏度；在与次氯酸根离子作用后，该探针的荧光波长从643nm转变为485nm。同时，该荧光探针也可用于细胞成像和检测细胞内的次氯酸根离子。本发明提供的这种化合物合成过程简单，具有较高的荧光量子产率，同时具有良好的光稳定性和热稳定性，其识别次氯酸根离子检测限为5.6nM；在细胞成像实验中，能够用于外源性和内源性的次氯酸根离子的荧光成像检测，其成像效果良好。

Description

一种基于方酸菁的比率型荧光探针及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及化学材料的制备及在分析测试领域的应用技术领域，更具体地，涉及一种基于方酸菁的比率型荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
活性氧(ROS)在许多病理和生理过程中发挥着重要作用。次氯酸(HClO)及其共轭碱次氯酸根(ClO-)具有很强的氧化性，在免疫系统中作为一种有效的抗菌药物。次氯酸根是免疫细胞中重要的活性氧之一，主要由髓过氧化物酶(MPO)催化过氧化氢(H2O2)和氯离子的反应产生。虽然内源性次氯酸根的存在可以破坏入侵的细菌和病原体，保护人体健康，但如果次氯酸根浓度异常，无论是不足还是过量，都会导致动脉粥样硬化、风湿病、神经元变性、癌症等多种人类疾病。因此，开发高选择性、高灵敏度的次氯酸根探针具有重要意义。
尽管目前已经发展起来的用于检测次氯酸根的方法有很多，然而，大多数的方法都存在一些明显的缺点，如激发和发射波长短，光稳定性差，荧光较弱，反应慢，毒性高等阻碍了在实际使用中的应用。相比之下，比率型荧光探针利用发射强度的比值在不同的波长提供了一种内在的校正，因此具有更高的准确度。此外，大多数的小分子荧光探针都易产生强烈的π-π堆积，从而导致荧光淬灭。幸运的是，近年来，基于聚集诱导发光(AIE)效应的小分子荧光探针，因其具备能够有效避免聚集荧光淬灭，易于修饰及易于合成等特点而备受科研工作者的青睐。与此同时，方酸因其具有在近红外区的吸收和发射、高摩尔吸光系数、低生物毒性、易于合成和良好的化学/光稳定性等特点，常作为受体核应用于光电材料及生物领域。方酸与AIE的有机结合因此成为一种很好的方案。为解决探针荧光淬灭等以上问题，开发一种低成本，易于合成，聚集诱导发光增强，低生物毒性，发射波长长，高选择性和高灵敏度的次氯酸根荧光探针具有极其广阔的应用前景。
发明内容
本发明解决了现有技术中荧光探针激发和发射波长短，光稳定性差，荧光较弱，反应慢以及毒性高的技术问题，提供一种比率型荧光探针及其制备方法和应用。该荧光探针具有长波长发射，低生物毒性低，高灵敏度和选择性等技术优点。
根据本发明的第一方面，提供了一种基于方酸菁的比率型荧光探针，该荧光探针以四苯基乙烯取代的二苯胺衍生物和四苯基乙烯取代的吲哚衍生物为给体，以方酸为受体；所述荧光探针的结构式如式Ⅰ所示：
Figure BDA0003182623100000021
按照本发明的另一方面，提供了所述的基于方酸菁的比率型荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)将4-溴-四苯基乙烯和2,3,3-三甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼烷-2-取代)-3H-吲哚溶解于水和有机溶剂A的混合溶液中，所述有机溶剂A为四氢呋喃、二甲基亚砜或N,N-二甲基甲酰胺；在惰性气体的保护下，加入催化剂Pd(PPh3)4和无机碱K2CO3，充分反应后，进行萃取分离，所得到的有机相进行干燥，然后减压旋蒸除去溶剂，柱分离提纯产物，干燥后得到结构式如式Ⅱ所示的化合物：
Figure BDA0003182623100000031
(2)将步骤(1)得到的结构式如式Ⅱ所示的化合物与1,4-丁磺酸内酯溶于有机溶剂B中，所述有机溶剂B为邻二氯苯、甲苯或硝基苯；在惰性气体的保护下进行加热，充分反应后冷却，然后进行减压抽滤，上层滤饼用石油醚洗涤后，然后干燥得到结构式如式Ⅲ所示的化合物：
Figure BDA0003182623100000032
(3)将步骤(2)得到的结构式如式Ⅲ所示的化合物与3-((4-((2-乙基己基)氧)苯基)(4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯基)胺基)-3-环丁烯-4-羟基-1,2-二酮溶解于苯类和醇类的混合有机溶剂C中，在惰性气体的保护下，充分反应后，减压旋蒸除去反应溶剂，然后进行柱层析；所得产物溶于有机溶剂D中，所述有机溶剂D为有机溶剂E与有机溶剂F的混合溶剂，所述有机溶剂E为二氯甲烷、三氯甲烷或四氢呋喃，所述有机溶剂F为甲醇、乙醇或丙酮；再加入饱和NaHCO3水溶液或饱和Na2CO3水溶液，搅拌后，再萃取后干燥，即得到结构式如式Ⅰ所示的荧光探针。
优选地，步骤(1)中，4-溴-四苯基乙烯、2,3,3-三甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼烷-2-取代)-3H-吲哚、Pd(PPh3)4和K2CO3的物质的量之比为1：(1～1.2)：0.05：(2～3)，4-溴-四苯基乙烯在水和有机溶剂A的混合溶液中的浓度为0.05mg/mL～0.5mg/mL。
优选地，步骤(2)中，结构式如式Ⅱ所示的化合物与1,4-环丁磺酸内酯的物质的量之比为1：(2～3)，结构式如式Ⅱ所示的化合物在有机溶剂B中的浓度为0.05mg/mL～0.1mg/mL。
优选地，步骤(3)中，结构式如式Ⅲ所示的化合物与3-((4-((2-乙基己基)氧)苯基)(4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯基)胺基)-3-环丁烯-4-羟基-1,2-二酮的物质的量之比为1：(1～1.1)，结构式如式Ⅲ所示的化合物在混合有机溶剂C中的浓度为0.01mg/mL～0.1mg/mL。
按照本发明的另一方面，提供了所述的基于方酸菁的比率型荧光探针用于制备细胞成像试剂的应用。
按照本发明的另一方面，提供了所述的基于方酸菁的比率型荧光探针用于制备检测次氯酸根离子试剂的应用。
优选地，所述次氯酸根离子为细胞中内源性或外源性的次氯酸根离子。
优选地，将所述基于方酸菁的比率型荧光探针和环氧乙烷-环氧丙烷-环氧乙烷的三嵌段聚合物加入到能与水互溶的有机溶剂中，在超声的条件下加入到水中，再进行超声处理，使所述基于方酸菁的比率型荧光探针与环氧乙烷-环氧丙烷-环氧乙烷的三嵌段聚合物自组装得到核壳结构的纳米粒子，然后进行透析除去有机溶剂，得到纳米粒子；将所述纳米粒子加入到细胞培养液中，所述纳米粒子被细胞胞吞后，与次氯酸根离子反应，荧光波长蓝移，从而实现细胞内次氯酸根的检测。
优选地，所述基于方酸菁的比率型荧光探针和环氧乙烷-环氧丙烷-环氧乙烷的三嵌段聚合物的质量比为1：(2～20)；所述纳米粒子的浓度为0.1mg/mL～0.2mg/mL。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
(1)本发明制备的比率型荧光探针分子能够对次氯酸根离子产生比率荧光响应，比率荧光强度与次氯酸根的浓度具有良好的线性关系，加入次氯酸根后，荧光的波长从643nm蓝移至485nm，目视可见的明显变化。与传统的单一波长荧光增强或减弱的探针相比，能更有效地避免环境干扰，使结果更加可信。
(2)本发明制备的比率型荧光探针对次氯酸根离子具有良好的选择性，在激发波长为380nm的条件下，只有次氯酸根离子能够引起荧光探针的比率荧光变化，而其他的阴离子(氯离子，碳酸根离子，亚硫酸氢根离子等)、活性氧(过氧化氢、单线态氧、羟基自由基等)等不能导致荧光变化，且该荧光探针具有高的灵敏度。研究表明是在次氯酸根离子的作用下，该比率型荧光探针的碳碳双键发生氧化裂解，而其它阴离子或活性氧则不能使该比率型荧光探针分解。
(3)本发明制备的比率型荧光探针能够有效的避免聚集导致淬灭(ACQ)现象，在实际应用过程中更加具有优势。
(4)本发明制备的比率型荧光探针具有很好的热稳定性和光稳定性，热重分析表明其损失5％质量时的温度为345℃，说明该荧光探针的热稳定性很好。同时，该比率型荧光探针在120mW/cm-1的冷光源照射30min后，其吸收强度几乎无任何变化，表明该荧光探针具有良好的光稳定性。
(5)本发明提供荧光探针合成过程简单，具有较高的荧光量子产率，同时具有良好的光稳定性和热稳定性，其识别次氯酸根离子检测限为5.6nM；在细胞成像实验中，能够用于外源性和内源性的次氯酸根离子的荧光成像检测，其成像效果良好。
(6)本发明制备的比率型荧光探针，使用表面活性剂包裹成核壳结构后形成大小均一的纳米粒子，平均粒径为7.6nm，有利于细胞胞吞，能够用于细胞成像，借助于共聚焦显微镜观察，能够对外源性和内源性的次氯酸根离子进行有效地检测。
附图说明
图1为本发明荧光探针TPE-SQ的氢谱图。
图2为本发明荧光探针与次氯酸根离子比率响应的荧光光谱图，其中，激发波长为380nm。
图3为本发明荧光探针在485nm和643nm处的荧光强度比值(F485/F643)随次氯酸根离子浓度的变化图，其中，直线为线性拟合曲线。
图4为本发明荧光探针与次氯酸根离子(100μM)作用后的MALDI-TOF-MS质谱图。其中，插图为推测的反应机理。
图5为本发明荧光探针在加入不同当量的次氯酸根离子(0-100μM)后紫外-可见吸收光谱图。
图6为本发明荧光探针在加入不同种类的阴离子(100μM)后的荧光光谱图，其中，激发波长为380nm。
图7为加入不同种类的阴离子(100μM)，本发明荧光探针在485nm和643nm处的荧光强度比值(F485/F643)柱状图，其中，激发波长为380nm。
图8为(上)在加入不同种类的阴离子(100μM)后，本发明荧光探针在日光下的照片；(下)在加入不同种类的阴离子(100μM)后，本发明荧光探针在手提式紫外灯(365nm)照射下的照片。
图9为本发明荧光探针在加入不同种类的活性氧(100μM)后的荧光光谱图。其中，激发波长为380nm。
图10为加入不同种类的活性氧(100μM)，本发明荧光探针在485nm和643nm处的荧光强度比值(F485/F643)柱状图。其中，激发波长为380nm。
图11为本发明荧光探针在使用冷光源照射不同时间后的紫外-可见吸收光谱图。
图12为用两亲性高分子(F127)包裹本发明荧光探针制备成荧光探针纳米粒子的示意图。
图13为荧光探针纳米粒子的粒径分布图。
图14为荧光探针纳米粒子在活的Hela细胞中的共聚焦显微镜成像照片。
图15为荧光探针纳米粒子在活的RAW264.7细胞中的共聚焦显微镜成像照片。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供了一种比率型荧光探针，所述探针的分子式为C85H77N2O6SNa，该荧光探针以四苯基乙烯取代的二苯胺衍生物和四苯基乙烯取代的吲哚衍生物为给体，以方酸为受体；其结构式如下：
Figure BDA0003182623100000081
本发明提供的比率型荧光探针的制备方法，该荧光探针的制备流程如下式所示：
Figure BDA0003182623100000082
该制备方法包括以下步骤：将4-溴-四苯基乙烯和2,3,3-三甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼烷-2-取代)-3H-吲哚进行suzuki反应得到产物1，之后将产物1与1,4-丁磺酸内酯进一步反应得到产物2，接下来与3-((4-((2-乙基己基)氧)苯基)(4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯基)胺基)-3-环丁烯-4-羟基-1,2-二酮通过简单的缩合反应得到产物，最后在与饱和碳酸氢钠水溶液进行离子化即得到荧光探针分子TPE-SQ。
本发明基于方酸菁的比率型荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)将一定量的4-溴-四苯基乙烯和2,3,3-三甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼烷-2-取代)-3H-吲哚溶解于水和有机溶剂A的混合溶液中，所述有机溶剂为四氢呋喃、二甲基亚砜或N,N-二甲基甲酰胺，水和有机溶剂的的体积比为3：1；在惰性气体的保护下，加入催化剂Pd(PPh3)4和无机碱K2CO3，回流反应一定时间，充分反应后，进行萃取分离，所得到的有机相进行干燥，然后减压旋蒸除去溶剂，柱分离提纯产物，干燥后得到产物1；结构如下述式Ⅱ：
Figure BDA0003182623100000091
(2)将一定量的产物1与1,4-丁磺酸内酯溶于有机溶剂B中，所述有机溶剂为邻二氯苯、甲苯或硝基苯；在惰性气体的保护下，加热反应一定时间(30-40h)，充分反应后，冷却至室温，然后直接进行减压抽滤，上层滤饼用石油醚洗涤后，然后干燥得到产物2；结构如下述式Ⅲ：
Figure BDA0003182623100000092
(3)将一定量的产物2与3-((4-((2-乙基己基)氧)苯基)(4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯基)胺基)-3-环丁烯-4-羟基-1,2-二酮溶解于苯类和醇类的混合有机溶剂C中，苯类与醇类的体积比为1：1中，苯类为甲苯、乙基苯或二甲苯等，醇类为丁醇、戊醇、异丙醇或异丁醇等，在惰性气体的保护下，回流反应一定时间(20-30h)，充分反应后，减压旋蒸除去反应溶剂，然后进行柱层析，所得的产物溶于有机溶剂D中，所述有机溶剂D为有机溶剂E与有机溶剂F的混合溶剂，所述有机溶剂E为二氯甲烷、三氯甲烷或四氢呋喃，所述有机溶剂F为甲醇、乙醇或丙酮；再加入饱和NaHCO3水溶液或饱和Na2CO3水溶液，室温搅拌一定时间后，再萃取后干燥，即得到结构式如式Ⅰ所示的荧光探针TPE-SQ。
取产物TPE-SQ和购买的商用环氧乙烷-环氧丙烷-环氧乙烷的三嵌段聚合物(F127)配制成一定浓度的四氢呋喃溶液，在超声的条件下快速加入到水中，加入完成后再继续超声2min，然后转移至透析袋(Mw＝3500Da)透析24h，期间每3-4h更换一次水，得到纳米粒子。
本发明提供的荧光探针用于细胞中次氯酸根离子的检测，通过上述荧光探针与表面活性剂F127自组装成纳米粒子，然后被细胞胞吞后，使用共聚焦显微镜观察，可观察到红色荧光，而当细胞内次氯酸根粒子浓度较高时，该荧光探针纳米粒子会被次氯酸根离子分解，分解后的探针片段会发出蓝绿色荧光，因此，可通过共聚焦显微镜观察有无蓝绿色荧光进而实现对细胞内次氯酸根离子的检测。
实施例1：比率型荧光探针TPE-SQ的制备
具体步骤如下：
(1)化合物1的合成：
依次将4-溴-四苯基乙烯(0.50g,1.22mmol)，2,3,3-三甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼烷-2-取代)-3H-吲哚(0.35g,1.22mmol)，Pd(PPh3)4(0.07g,0.06mmol)和K2CO3(0.42g,3.05mmol)加入到50mL的Schlenk管中，然后抽真空，通N2各3次后，注射溶剂THF和H2O，然后加热至80℃，反应24h。停止反应后，冷却至室温，加入CH2Cl2进行萃取3次，然后合并有机层，并用饱和NaCl水溶液洗涤后，加入Na2SO4进行干燥。干燥充分后，过滤并用旋转蒸发仪旋出溶剂，然后进行柱层析(乙酸乙酯：石油醚＝1：10)，得到化合物为黄色固体(0.43g,72.6％)。1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):7.54(d,J＝8.0Hz,1H,ArH),7.49(dd,J＝8.0,1.7Hz,1H,ArH),7.45(d,J＝1.5Hz,1H,ArH),7.36(d,J＝8.3Hz,2H,ArH),7.15-7.02(m,17H,ArH),2.29(s,3H,-CH3),1.32(s,6H,-C(CH3)2)。
(2)化合物2的合成
将化合物1(0.30g,0.61mmol)加入到Schlenk管中，然后抽真空，通N2各3次后，注射溶剂邻二氯苯(5mL)和1,4-丁磺酸内酯(0.10g,0.74mmol)，加热至135℃，反应36h。停止反应后，冷却至室温，然后直接进行减压抽滤，上层粗产物用石油醚洗涤后，即得到产物为灰白色固体(0.16g,40.4％)。1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):7.85(d,J＝8.5Hz,1H,ArH),7.71(dd,J＝8.4,1.4Hz,1H,ArH),7.62–7.60(m,1H,ArH),7.32(d,J＝8.3Hz,2H,ArH),7.19–7.11(m,11H,ArH),7.11–7.03(m,6H,ArH),4.91–4.76(m,2H,-NCH2-),3.07(s,3H,-CH3),2.97(t,J＝6.7Hz,2H,-CH2SO3 –),2.26–2.17(m,2H,-CH2-),2.12–2.05(m,2H,-CH2-),1.62(s,6H,-C(CH3)2)。
(3)荧光探针TPE-SQ的合成
依次将产物2(0.10g,0.15mmol)与3-((4-((2-乙基己基)氧)苯基)(4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯基)胺基)-3-环丁烯-4-羟基-1,2-二酮(0.10g,0.15mmol)加入到二口瓶中，搭建成Dean-Stark装置，然后抽真空，通N2各3次后，注射溶剂干燥的正丁醇(3mL)和干燥的甲苯(3mL)。将体系加热至140℃，反应24h。停止反应后，用旋转蒸发仪旋出溶剂后，直接进行柱层析(甲醇：二氯甲烷＝1：40)，即得到初产物，然后将初产物溶解于10mL的二氯甲烷中，再加入5mL的甲醇和10mL的饱和碳酸氢钠的水溶液，室温下搅拌1h，即得到终产物为紫色固体(0.05g,27％)。其结构表征核磁共振氢谱，见图1。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):7.79(s,1H,ArH),7.60(d,J＝8.0Hz,1H,ArH),7.51(d,J＝8.3Hz,2H,ArH),7.39(d,J＝8.4Hz,1H,ArH),7.26–6.93(m,40H,ArH),5.76(s,1H,-C＝CH-),4.05(s,2H,-NCH2-),3.90(d,J＝5.6Hz,2H,-OCH2-),2.49-2.43(m,2H,-CH2SO3 –),1.81–1.65(m,5H,-CH,-CH2-),1.63(s,6H,-C(CH3)2),1.51–1.27(m,8H,-CH2-),0.97–0.84(m,6H,-CH3).13C NMR(100MHz,DMSO-d6,δ):183.8,175.4,170.0,158.4,143.7,143.6,143.5,143.3,142.4,141.9,141.6,140.6,140.2,138.1,135.6,131.7,131.4,131.2,131.1,128,4,128.3,128.2,127.4,127.2,127.1,127.0,126.3,124.6,114.9,70.6,51.4,49.3,40.6,30.4,28.9,27.1,26.3,23.8,23.0,14.5,11.4.HR-ESI-MS:m/z calcd.for C85H77N2O6S-:1253.55078[M-H+],found1253.5500[M-H+]。
实施例2：次氯酸根离子的检测实验
取14个5mL样品瓶，分别加入实施例1中所得的荧光探针溶液0.2mL(该荧光探针原溶液的浓度为0.2mM)，依次加入3.8mL的水溶液，搅拌2min之后，分别将4μL浓度为[ClO-]＝0(a),0.5×10-2M(b),1.0×10-2M(c),1.5×10-2M(d),2.0×10-2M(e),2.5×10-2M(f),3.0×10-2M(g),4.0×10-2M(h),5.0×10-2M(i),6.0×10-2M(j),7.0×10-2M(k),8.0×10-2M(l),9.0×10-2M(m),1.0×10-1M(n)的次氯酸根溶液加入14个样品瓶中，常温下搅拌2min后，以380nm为激发波长，分别测定每个样品的发射光谱，得到14个样品的荧光光谱图，见图2。测定结果表明：该比率型荧光探针在485nm处的荧光强度微弱的上升，而643nm处的荧光强度随着次氯酸根浓度的逐渐增加而明显下降。此外，通过计算荧光光谱在485nm与643nm的发光强度比(F485/F643)，数据表明F485/F643与ClO-浓度在25-70μM范围内呈良好的线性关系，相关系数(R2)为0.9848，见图3。
实施例3：比率型荧光探针作用的机理探究实验。
取1个5mL样品瓶，分别加入实施例1中所得的荧光探针溶液0.2mL(该荧光探针原溶液的浓度为0.2mM)，依次加入3.8mL的水溶液，搅拌2min之后，将4μL浓度为[ClO-]＝0.1M的次氯酸根溶液加入到样品瓶中，常温下搅拌2min后，做MALDI-TOF-MS实验，见图4。测定结果表明：由MALDI-TOF-MS实验数据得到两个强的分子离子峰：552.47和627.43，推测其机理为：该荧光探针在次氯酸根离子的作用下，首先发生加氧环化反应，生成化合物3，然后化合物3分解成化合物4和化合物5(分子离子峰为627.23)，而化合物4在次氯酸根离子的作用下，进一步生成化合物6(分子离子峰为552.32)，推测机理与实验数据相吻合。同时，通过紫外滴定实验证明，该荧光探针随着次氯酸根离子浓度的增加，其特征吸收逐渐消失，也证明了该荧光探针发生分解，与上述质谱实验数据一致，见图5。
实施例4：其他阴离子与次氯酸根离子的对比检测实验
取14个5mL样品瓶，分别加入实施例1中所得的荧光探针溶液0.2mL(该荧光探针原溶液的浓度为0.2mM)，依次加入3.8mL的水溶液，搅拌2min之后，分别将浓度为0.1M的F-,Cl-，Br-，I-,HCO3 -,CO3 2-,HSO3 -,SO3 2-,SO4 2-,SCN-,S2O3 2-,OAc-,NO2 -,ClO4 -,ClO-溶液各取4μL加入到样品瓶中，常温下搅拌2min后，以380nm为激发波长，分别测定每个样品的荧光光谱，见图6。并得到比率型荧光探针在485nm和643nm处的荧光强度比值(F485/F643)，见图7。另外，对加入不同种类的阴离子(100μM)后，对样品进行拍照，包括(上)在日光下和(下)在手提式紫外灯(365nm)照射下的照片，见图8。测定结果表明：除了次氯酸根离子外，其他上述各种阴离子对该比率型荧光探针没有响应。
实施例5：其他活性氧与次氯酸根离子的对比检测实验
取14个5mL样品瓶，分别加入实施例1中所得的荧光探针溶液0.2mL(该荧光探针原溶液的浓度为0.2mM)，依次加入3.8mL的去离子水溶液，搅拌2min之后，分别将浓度为0.1M的·OH,1O2,ClO-,H2O2,TBHP,TBO·,ONOO-水溶液各取4μL加入到样品瓶中，常温下搅拌2min后，以380nm为激发波长，分别测定每个样品的荧光光谱，见图9。并得到比率型荧光探针在485nm和643nm处的荧光强度比值(F485/F643)，见图10。测定结果表明：除了次氯酸根离子外，其他上述各种活性氧对该比率型荧光探针没有响应。
实施例6：比率型荧光探针的光稳定性测试
取1个5mL样品瓶，加入实施例1中所得的荧光探针溶液0.2mL(该荧光探针原溶液的浓度为0.2mM)，依次加入3.8mL的水溶液，搅拌2min之后，测定样品的紫外可见吸收光谱(测试范围为300-700nm)，然后将样品拿到冷光灯(120mW/cm-2)下照射5min后，再测试样品的紫外可见吸收光谱，每照射5min记录一组数据(0-30min)，共记录7组数据，见图11。测定结果表明：该比率型荧光探针具有良好的光稳定性。
实施例7：检测次氯酸根的比率型荧光探针纳米粒子的制备方法
具体步骤为：将比率型荧光探针TPE-SQ(1mg)和购买的商用表面活性剂聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)(Pluronic F127)(12mg)加入到5mL的样品瓶中，再加入0.5mL的THF，充分溶解后，在超声的条件下快速的将上述溶液加入到去离子水(10mL)中，加入完成后再继续超声2min，然后转移至透析袋(MWCO＝3500Da)透析24h，期间每3-4h更换一次去离子水，透析完成后即得到大小均一的比率型荧光探针纳米粒子。其制备方法的示意图，见图12。测定结果表明：该比率型荧光探针纳米粒子的平均粒径为7.6nm，见图13。
实施例8：细胞成像实验
为了检测外源性ClO-，本实施例采用Hela细胞对本发明荧光探针进行了共聚焦显微镜荧光成像。见图14，其中，图14中的a-d为仅使用荧光探针纳米粒子对Hela细胞孵育30min后的共聚焦荧光成像照片，图14中的e-h为使用荧光探针纳米粒子对Hela细胞孵育30min后，再加入ClO-(100μM)继续孵育30min后的共聚焦荧光成像照片。测定结果表明：如图14中的c所示，加入10μM本发明荧光探针纳米粒子的Hela细胞孵育30min后，在红光通道下呈现出红色荧光，说明本发明荧光探针具有较好的细胞成像效果。而在加入ClO-(100μM)，经培养30min后呈现出绿色荧光，而红色荧光消失，见图14中的g和14中的h，与荧光光谱测试的识别响应效果基本一致。该细胞成像实验证实了本发明荧光探针可用于外源性ClO-的监测。
本实施例利用RAW 264.7细胞对内源性ClO-进行了共聚焦显微镜荧光成像，RAW264.7细胞能够在LPS和PMA的刺激下产生内源性ClO-。见图15，其中，图15中的a-d为仅使用荧光探针纳米粒子对RAW 264.7细胞孵育2h后的共聚焦荧光成像照片，图15中的e-h为先将RAW 264.7细胞与LPS(1μg mL-1)孵育12h，再加入PMA(1μg mL-1)孵育0.5h之后，然后加入荧光探针纳米粒子孵育2h后的共聚焦荧光成像照片。测定结果表明：将5μM的荧光探针与RAW264.7细胞培养2h，该细胞在红色通道下呈现较强的红色荧光，见图15中的c，而由于细胞内的ClO-浓度过低，其绿色荧光几乎没有。但当RAW 264.7细胞与LPS(1μg mL-1)培养12h，再与PMA(1μg mL-1)培养0.5h之后，再次加入荧光探针培养2h后，该细胞在红光通道的荧光几乎不可见，而同时绿光通道荧光明显增强，见图15中的g和15中的h。该实验初步实现了对细胞中内源性ClO-荧光检测，同时为生物体的ClO-检测提供了可行性。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于方酸菁的比率型荧光探针，其特征在于，该荧光探针以四苯基乙烯取代的二苯胺衍生物和四苯基乙烯取代的吲哚衍生物为给体，以方酸为受体；所述荧光探针的结构式如式Ⅰ所示：
Figure FDA0003685136600000011
2.如权利要求1所述的基于方酸菁的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将4-溴-四苯基乙烯和2,3,3-三甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼烷-2-取代)-3H-吲哚溶解于水和有机溶剂A的混合溶液中，所述有机溶剂A为四氢呋喃、二甲基亚砜或N,N-二甲基甲酰胺；在惰性气体的保护下，加入催化剂Pd(PPh3)4和无机碱K2CO3，充分反应后，进行萃取分离，所得到的有机相进行干燥，然后减压旋蒸除去溶剂，柱分离提纯产物，干燥后得到结构式如式Ⅱ所示的化合物：
Figure FDA0003685136600000021
(2)将步骤(1)得到的结构式如式Ⅱ所示的化合物与1,4-丁磺酸内酯溶于有机溶剂B中，所述有机溶剂B为邻二氯苯、甲苯或硝基苯；在惰性气体的保护下进行加热，充分反应后冷却，然后进行减压抽滤，上层滤饼用石油醚洗涤后，然后干燥得到结构式如式Ⅲ所示的化合物：
Figure FDA0003685136600000022
(3)将步骤(2)得到的结构式如式Ⅲ所示的化合物与3-((4-((2-乙基己基)氧)苯基)(4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯基)胺基)-3-环丁烯-4-羟基-1,2-二酮溶解于苯类和醇类的混合有机溶剂C中，在惰性气体的保护下，充分反应后，减压旋蒸除去反应溶剂，然后进行柱层析；所得产物溶于有机溶剂D中，所述有机溶剂D为有机溶剂E与有机溶剂F的混合溶剂，所述有机溶剂E为二氯甲烷、三氯甲烷或四氢呋喃，所述有机溶剂F为甲醇、乙醇或丙酮；再加入饱和NaHCO3水溶液或饱和Na2CO3水溶液，搅拌后，再萃取后干燥，即得到结构式如式Ⅰ所示的荧光探针。
3.如权利要求2所述的基于方酸菁的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，4-溴-四苯基乙烯、2,3,3-三甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼烷-2-取代)-3H-吲哚、Pd(PPh3)4和K2CO3的物质的量之比为1：(1～1.2)：0.05：(2～3)，4-溴-四苯基乙烯在水和有机溶剂A的混合溶液中的浓度为0.05mg/mL～0.5mg/mL。
4.如权利要求2或3所述的基于方酸菁的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，结构式如式Ⅱ所示的化合物与1,4-环丁磺酸内酯的物质的量之比为1：(2～3)，结构式如式Ⅱ所示的化合物在有机溶剂B中的浓度为0.05mg/mL～0.1mg/mL。
5.如权利要求2或3所述的基于方酸菁的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，结构式如式Ⅲ所示的化合物与3-((4-((2-乙基己基)氧)苯基)(4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯基)胺基)-3-环丁烯-4-羟基-1,2-二酮的物质的量之比为1：(1～1.1)，结构式如式Ⅲ所示的化合物在混合有机溶剂C中的浓度为0.01mg/mL～0.1mg/mL。
6.如权利要求1所述的基于方酸菁的比率型荧光探针用于制备细胞成像试剂的应用，其特征在于，所述基于方酸菁的比率型荧光探针自组装得到核壳结构的纳米粒子。
7.如权利要求1所述的基于方酸菁的比率型荧光探针用于制备检测次氯酸根离子试剂的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述基于方酸菁的比率型荧光探针自组装得到核壳结构的纳米粒子，所述次氯酸根离子为细胞中内源性或外源性的次氯酸根离子。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述基于方酸菁的比率型荧光探针和环氧乙烷-环氧丙烷-环氧乙烷的三嵌段聚合物加入到能与水互溶的有机溶剂中，在超声的条件下加入到水中，再进行超声处理，使所述基于方酸菁的比率型荧光探针与环氧乙烷-环氧丙烷-环氧乙烷的三嵌段聚合物自组装得到核壳结构的纳米粒子，然后进行透析除去有机溶剂，得到纳米粒子；将所述纳米粒子加入到细胞培养液中，所述纳米粒子被细胞胞吞后，与次氯酸根离子反应，荧光波长蓝移，从而实现细胞内次氯酸根的检测。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述基于方酸菁的比率型荧光探针和环氧乙烷-环氧丙烷-环氧乙烷的三嵌段聚合物的质量比为1：(2～20)；所述纳米粒子的浓度为0.1mg/mL～0.2mg/mL。
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