KR20230151724A - 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 칼슘 알지네이트 비드 및 이를 이용한 황화 다당류의 반연속적 생산방법 - Google Patents
포르피리듐 크루엔툼이 담지된 칼슘 알지네이트 비드 및 이를 이용한 황화 다당류의 반연속적 생산방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20230151724A KR20230151724A KR1020220051429A KR20220051429A KR20230151724A KR 20230151724 A KR20230151724 A KR 20230151724A KR 1020220051429 A KR1020220051429 A KR 1020220051429A KR 20220051429 A KR20220051429 A KR 20220051429A KR 20230151724 A KR20230151724 A KR 20230151724A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- calcium alginate
- porphyridium cruentum
- alginate beads
- culture
- porphyridium
- Prior art date
Links
- 239000011324 bead Substances 0.000 title claims abstract description 171
- 235000010410 calcium alginate Nutrition 0.000 title claims abstract description 133
- 239000000648 calcium alginate Substances 0.000 title claims abstract description 133
- 229960002681 calcium alginate Drugs 0.000 title claims abstract description 133
- OKHHGHGGPDJQHR-YMOPUZKJSA-L calcium;(2s,3s,4s,5s,6r)-6-[(2r,3s,4r,5s,6r)-2-carboxy-6-[(2r,3s,4r,5s,6r)-2-carboxylato-4,5,6-trihydroxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylate Chemical compound [Ca+2].O[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)O[C@@H](C([O-])=O)[C@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O2)C([O-])=O)O)[C@H](C(O)=O)O1 OKHHGHGGPDJQHR-YMOPUZKJSA-L 0.000 title claims abstract description 133
- 241001494715 Porphyridium purpureum Species 0.000 title claims abstract description 123
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 title claims abstract description 68
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 68
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 title claims abstract description 68
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 title abstract description 3
- 108060006184 phycobiliprotein Proteins 0.000 claims abstract description 49
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 33
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 30
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 22
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 claims abstract description 16
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims abstract description 16
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims abstract description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims abstract description 12
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 claims abstract description 12
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000012136 culture method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 25
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 15
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Substances N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 12
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 11
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 10
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 10
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 10
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 claims description 5
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 claims description 5
- 241000206618 Porphyridium Species 0.000 claims description 2
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 abstract description 2
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 abstract 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 55
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 31
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 21
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 20
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 19
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 7
- 108010053210 Phycocyanin Proteins 0.000 description 7
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 7
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 7
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 6
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 6
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 5
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 5
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 235000018343 nutrient deficiency Nutrition 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005299 abrasion Methods 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 4
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 3
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical class CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 2
- HVBSAKJJOYLTQU-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzenesulfonic acid Chemical compound NC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 HVBSAKJJOYLTQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 208000000412 Avitaminosis Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 2
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 2
- 206010021135 Hypovitaminosis Diseases 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 2
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- FDJOLVPMNUYSCM-UVKKECPRSA-L cobalt(3+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2,7, Chemical compound [Co+3].N#[C-].C1([C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)[N-]\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O FDJOLVPMNUYSCM-UVKKECPRSA-L 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- HHEAADYXPMHMCT-UHFFFAOYSA-N dpph Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+](=O)[O-])=CC([N+]([O-])=O)=C1[N]N(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 HHEAADYXPMHMCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 description 2
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 description 2
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 2
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 2
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 208000030401 vitamin deficiency disease Diseases 0.000 description 2
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- 241001474374 Blennius Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010028275 Leukocyte Elastase Proteins 0.000 description 1
- 102000016799 Leukocyte elastase Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LUVOJBWJNHWVNG-UHFFFAOYSA-N [Na].[Na].[Na].OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O Chemical compound [Na].[Na].[Na].OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O LUVOJBWJNHWVNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 230000006727 cell loss Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000002849 elastaseinhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Substances OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N phenol;sulfuric acid Chemical class OS(O)(=O)=O.OC1=CC=CC=C1 OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 1
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 229950000244 sulfanilic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
- C12M25/16—Particles; Beads; Granular material; Encapsulation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Botany (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 칼슘 알지네이트 비드 및 이를 이용한 황화 다당류의 반연속적 생산방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은, (1) 미세조류인 포르피리듐 크루엔툼(Porphyridium cruentum) 배양물을 소듐 알지네이트(sodium alginate) 용액과 혼합하는 단계; (2) 상기 (1) 단계에서 혼합된 혼합물을 0.2~0.6 mL min-1의 유속으로 폴리에틸렌글리콜(PEG) 6000 및 CaCl2가 함유된 수용액에 첨가하고 교반하여 미세조류가 담지된 칼슘 알지네이트 비드를 형성시키는 단계; 및 (3) 상기 미세조류가 담지된 칼슘 알지네이트 비드는 CaCl2 가 함유된 수용액에서 추가 교반 후, 증류수로 세척하는 단계를 포함하는 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 칼슘 알지네이트 비드의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 구형의 칼슘 알지네이트 비드, 상기 칼슘 알지네이트 비드를 이용한 포르피리듐 크루엔툼의 고정배양방법 및 상기 칼슘 알지네이트 비드를 이용한 포르피리듐 크루엔툼으로부터 황화 다당류 또는 피코빌리 단백질을 대량생산하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 칼슘 알지네이트 비드 및 이를 이용한 황화 다당류의 반연속적 생산방법에 관한 것이다.
해양 미세조류 유래의 황화 다당류는 항암, 항산화, 항바이러스 및 면역 조절을 포함하는 다양한 생물학적 활성을 가지는 천연 화합물이다. 따라서 화장품, 건강기능식품 및 의약품 등 다양한 산업에 황화 다당류를 적용하는 방법이 제시되고 있으며, 황화 다당류의 가치와 수요가 증가하고 있다.
적색 미세조류인 포르피리듐 크루엔툼(Porphyridium cruentum)은 다량의 피코빌리 단백질과 황화 다당류를 생산할 수 있으며, 황화 다당류를 포함하는 세포 외 고분자 물질을 지속 생산하여 세포 외로 분비하는 특징을 갖는다. 따라서 포르피리듐 크루엔툼을 이용할 경우, 배양배지에서 황화 다당류를 쉽게 수확할 수 있고, 황화 다당류를 수확하기 위해 세포 파괴가 요구되지 않는다는 장점이 있는데, 이는 포유류, 버섯 또는 거대조류와 같은 다른 천연 공급원으로부터 황화 다당류를 수확하는 방법과는 다른 큰 차이점이다. 또한 포르피리듐 크루엔툼의 면적당 황화 다당류 생산성은 다른 공급원보다 상대적으로 높아, 포르피리듐 크루엔툼은 황화 다당류 생산을 위한 강력한 천연 공급원이다.
그러나 포르피리듐 크루엔툼을 이용한 황화 다당류의 상업화는 비용이 많이 소요되는 경제적인 문제가 있어 이를 극복하기 위한 생산 기술의 개선이 필요하다.
특히, 포르피리듐 크루엔툼 배양물에서 황화 다당류를 수확하기 위해서는 먼저 세포와 세포 외 고분자 물질을 분리해야 하는데, 포르피리듐 크루엔툼 세포는 직경이 2~5 μm에 불과하며, 세포 외 고분자 물질 층에 캡슐화되어 있어 자연 침강만으로는 이들을 분리할 수 없다. 따라서 세포와 세포 외 고분자 물질의 분리를 위해 원심분리, 응집, 여과 등의 추가 공정이 반드시 요구되며, 이에 따라 에너지가 소비되고 경제성이 저하된다.
또 다른 방법으로 포르피리듐 크루엔툼과 세포 외 고분자 물질을 분리하기 위한 몇 가지 세포 고정배양방법이 개발된 바 있다. 이러한 기술은 특정 기질의 표면에 세포를 고정하여 배양하는 것으로, 세포로부터 생산된 세포 외 고분자 물질만이 배지에 용해되기 때문에 세포와 세포 외 고분자 물질을 쉽게 분리할 수 있는 장점이 있다. 그러나 기질 외부에 세포를 고정하여 배양하기 위해서는 특수한 형태의 배양기가 요구되는 문제가 있고, 기질과 세포가 강하게 결합하지 않아 세포 유실이 발생할 수 있으며, 외부 오염원(세균, 곰팡이 등)에 취약한 단점이 존재하여 추가적인 개선이 요구된다는 문제가 있다.
따라서 이러한 종래 문제점을 해결하면서 포르피리듐 크루엔툼으로부터 황화 다당류를 고효율로 생산할 수 있는 새로운 방법의 개발이 필요하다.
이에 본 발명자들은 포르피리듐 크루엔툼을 칼슘 알지네이트 비드 내부에 고정화하여 배양하는 방법을 개발하였는데, 칼슘 알지네이트 비드를 이용하여 포르피리듐 크루엔툼을 내부에 고정시키고 반 연속적으로 배양함으로써 세포 성장 및 황화 다당류의 생산을 증진시킬 수 있으며, 세포와 세포 외 고분자 물질을 손쉽게 분리하여 저비용으로 포르피리듐 크루엔툼으로부터 황화 다당류를 연속적으로 대량 생산할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 포르피리듐 크루엔툼으로부터 황화 다당류 또는 피코빌리 단백질을 대량 생산할 수 있는 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 칼슘 알지네이트 비드의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 방법으로 제조된 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 구형의 칼슘 알지네이트 비드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 구형의 칼슘 알지네이트 비드를 이용한 포르피리듐 크루엔툼의 고정배양방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 구형의 칼슘 알지네이트 비드를 이용하여 배양하는 단계를 포함하는, 포르피리듐 크루엔툼으로부터 황화 다당류 또는 피코빌리 단백질을 대량생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은, (1) 미세조류인 포르피리듐 크루엔툼(Porphyridium cruentum) 배양물을 소듐 알지네이트(sodium alginate) 용액과 혼합하는 단계; (2) 상기 (1) 단계에서 혼합된 혼합물을 0.2~0.6 mL min-1의 유속으로 폴리에틸렌글리콜(PEG) 6000 및 CaCl2가 함유된 수용액에 첨가하고 교반하여 미세조류가 담지된 칼슘 알지네이트 비드를 형성시키는 단계; 및 (3) 상기 미세조류가 담지된 칼슘 알지네이트 비드는 CaCl2가 함유된 수용액에서 추가 교반 후, 증류수로 세척하는 단계를 포함하는, 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 칼슘 알지네이트 비드의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (1) 단계의 포르피리듐 크루엔툼 배양물과 소듐 알지네이트(sodium alginate) 용액은 1:2의 부피비로 혼합하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 혼합물을 폴리에틸렌글리콜(PEG) 6000 및 CaCl2가 함유된 수용액에 첨가하는 것은, 바늘이 장착된 주사기로 상기 혼합물을 옮긴 후, 주사기 펌프를 이용하여 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜(PEG) 6000 및 CaCl2가 함유된 수용액은 40~50%(w/v) 폴리에틸렌글리콜(PEG) 6000 및 2~5%(w/v) CaCl2가 함유된 수용액일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (2) 단계의 교반은 500~700rpm으로 수행하는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된, 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 구형의 칼슘 알지네이트 비드를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 칼슘 알지네이트 비드는 2~5mm의 직경크기를 갖는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 구형의 칼슘 알지네이트 비드를 이용한 포르피리듐 크루엔툼의 고정배양방법을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 구형의 칼슘 알지네이트 비드를 이용하여 배양하는 단계를 포함하는, 포르피리듐 크루엔툼으로부터 황화 다당류 또는 피코빌리 단백질을 대량생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배양은 25℃에서 120rpm으로 교반하면서 60 μmol m-2s-1의 세기로 청색광원을 조사하면서 배양하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배양은 비타민이 결핍된 배지에서 배양하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배양은 초기 15일째까지는 비타민이 결핍된 배지에서 배양하다가 이후 질소가 결핍된 배지로 교체하여 30일째까지 추가 배양을 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 황화 다당류 또는 피코빌리 단백질은 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 구형의 칼슘 알지네이트 비드 배양액으로부터 분리하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 황화 다당류 또는 피코빌리 단백질을 상기 배양액에서 분리한 다음, 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 구형의 칼슘 알지네이트 비드는 신선한 배양배지로 옮겨 다시 배양함으로써 황화 다당류 또는 피코빌리 단백질의 생산을 연속적으로 유도하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 구형의 칼슘 알지네이트 비드를 이용할 경우, 비드 내부에 포르피리듐 크루엔툼을 안정적으로 고정시킬 수 있고, 배양 조건의 제어를 통해 황화 다당류 및 피코빌리 단백질과 같은 생리활성물질의 생산을 증진시킬 수 있으며, 상기 생리활성물질을 세포와 쉽게 분리하여 수집할 수 있을 뿐만 아니라, 배지의 교체를 통해 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 구형의 칼슘 알지네이트 비드로부터 생리활성물질을 연속적으로 생산할 수 있다.
도 1은 본 발명의 칼슘 알지네이트 비드를 이용한 포르피리듐 크루엔툼의 배양 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 칼슘 알지네이트 비드의 직경 크기에 따른 배양 시간별 내마모성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 칼슘 알지네이트 비드 사용 및 청색 광원 조사에 따른 포르피리듐 크루엔툼의 (a) 세포 성장 곡선, (b) 일일 황화 다당류 생산성, (c) 피코빌리단백질 생산량 및 (d) 세포 내 피코빌리단백질 함량을 측정한 결과를 나타낸 것으로, 대조군(control)은 비드 사용 없이 세포를 배양한 군을 나타낸 것이고, bead군은 본 발명의 칼슘 알지네이트 비드로 고정배양한 군을 나타낸 것이며, bead(blue)군은 칼슘 알지네이트 비드를 이용하고 동시에 청색광원을 조사하여 배양한 군을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 칼슘 알지네이트 비드 사용 및 청색 광원 조사에 따른 포르피리듐 크루엔툼의 배양 15일 및 30일에 수확한 세포 외 고분자 물질의 구성 원소 분석을 나타낸 것이고(a 및 b), 세포 외 고분자 물질의 생리활성을 분석한 결과를 나타낸 것이다(c 및 d).
도 5는 본 발명의 칼슘 알지네이트 비드 사용 및 영양소 결핍 조건(질소결핍:-N, 비타민 결핍:-V, 질소 및 비타민 동시 결핍: -NV)에서 포르피리듐 크루엔툼의 (a) 세포 성장 곡선, (b) 일일 황화 다당류 생산성, (c) 피코빌리단백질 생산량 및 (d) 세포 내 피코빌리단백질 함량을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 칼슘 알지네이트 비드의 직경 크기에 따른 배양 시간별 내마모성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 칼슘 알지네이트 비드 사용 및 청색 광원 조사에 따른 포르피리듐 크루엔툼의 (a) 세포 성장 곡선, (b) 일일 황화 다당류 생산성, (c) 피코빌리단백질 생산량 및 (d) 세포 내 피코빌리단백질 함량을 측정한 결과를 나타낸 것으로, 대조군(control)은 비드 사용 없이 세포를 배양한 군을 나타낸 것이고, bead군은 본 발명의 칼슘 알지네이트 비드로 고정배양한 군을 나타낸 것이며, bead(blue)군은 칼슘 알지네이트 비드를 이용하고 동시에 청색광원을 조사하여 배양한 군을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 칼슘 알지네이트 비드 사용 및 청색 광원 조사에 따른 포르피리듐 크루엔툼의 배양 15일 및 30일에 수확한 세포 외 고분자 물질의 구성 원소 분석을 나타낸 것이고(a 및 b), 세포 외 고분자 물질의 생리활성을 분석한 결과를 나타낸 것이다(c 및 d).
도 5는 본 발명의 칼슘 알지네이트 비드 사용 및 영양소 결핍 조건(질소결핍:-N, 비타민 결핍:-V, 질소 및 비타민 동시 결핍: -NV)에서 포르피리듐 크루엔툼의 (a) 세포 성장 곡선, (b) 일일 황화 다당류 생산성, (c) 피코빌리단백질 생산량 및 (d) 세포 내 피코빌리단백질 함량을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 포르피리듐 크루엔툼으로부터 유용한 생리활성 물질을 대량 생산할 수 있기 위한 포르피리듐 크루엔툼이 캡슐화된 칼슘 알지네이트 비드 및 이의 용도를 제공함에 특징이 있다.
본 발명자들은 기존의 미세조류 배양방법에 비해 쉽고 저렴하게 반연속적으로 포르피리듐 크루엔툼으로부터 유용한 생리활성 물질을 수득할 수 있는 방법을 연구하던 중, 칼슘 알지네이트 비드를 이용할 경우 포르피리듐 크루엔툼을 효과적으로 고정 배양할 수 있고, 배양 후 미세조류 및 생리활성 물질 분리를 위한 응집 또는 여과와 같은 추가적인 공정을 수행하지 않고도 쉽게 생리활성 물질을 수득할 수 있음을 확인하였다.
뿐만 아니라 본 발명의 칼슘 알지네이트 비드를 이용하여 포르피리듐 크루엔툼으로부터 생리활성 물질의 생산을 향상시킬 수 있는 최적의 배양 조건을 확립하였다.
그러므로 본 발명은 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 칼슘 알지네이트 비드의 제조방법을 제공할 수 있으며, 상기 방법은, (1) 미세조류인 포르피리듐 크루엔툼(Porphyridium cruentum) 배양물을 소듐 알지네이트(sodium alginate) 용액과 혼합하는 단계; (2) 상기 (1) 단계에서 혼합된 혼합물을 0.2~0.6 mL min-1의 유속으로 폴리에틸렌글리콜(PEG) 6000 및 CaCl2가 함유된 수용액에 첨가하고 교반하여 미세조류가 담지된 칼슘 알지네이트 비드를 형성시키는 단계; 및 (3) 상기 미세조류가 담지된 칼슘 알지네이트 비드는 CaCl2가 함유된 수용액에서 추가 교반 후, 증류수로 세척하는 단계를 포함한다.
상기 방법을 구체적으로 설명하면, 먼저 미세조류인 포르피리듐 크루엔툼(Porphyridium cruentum) 배양물을 소듐 알지네이트(sodium alginate) 용액과 혼합하여 혼합물을 제조한다.
이때 상기 소듐 알지네이트 용액은 1.5~2%(w/v)의 소듐 알지네이트가 포함된 용액일 수 있고, 여기에 Tween 80이 함유된 용액을 사용할 수 있다.
또한, 상기 포르피리듐 크루엔툼 배양물과 소듐 알지네이트 용액은 용액의 점도, 비드의 크기, 비드 외벽의 두께 및 내구성을 고려하여 1:2의 부피비로 혼합하여 혼합물을 제조할 수 있다.
다음으로, 상기 혼합물을 폴리에틸렌글리콜 및 염화칼슘이 함유된 수용액으로 펌핑시켜 미세조류가 담지된 칼슘 알지네이트 비드를 형성시킨다. 구체적으로 상기 혼합물은 0.2~0.6 mL min-1의 유속으로 폴리에틸렌글리콜(PEG) 6000 및 CaCl2가 함유된 수용액에 첨가하고 교반하여 미세조류가 담지된 칼슘 알지네이트 비드를 형성시킨다.
상기 폴리에틸렌글리콜(PEG) 6000 및 CaCl2가 함유된 수용액은 40~50% (w/v) 폴리에틸렌글리콜(PEG) 6000 및 2~5% (w/v) CaCl2가 함유된 수용액일 수 있고, 상기 수용액은 내부 직경이 60~100mm인 비이커에 담겨 있다.
본 발명에서는 내부 직경이 60~100mm인 비이커를 사용하였는데, 이는 본 발명의 칼슘 알지네이트 비드 제조 조건에서 제조 용기의 내부 직경이 60 mm 미만이면 비드가 뭉쳐질 우려가 있고, 만일 100mm를 초과하게 되면 비드의 형태가 균일하지 않게 제조될 수 있다. 바람직하게는 제조 용기의 내부 직경은 85 mm인 것을 사용할 수 있다.
또한 상기 혼합물을 폴리에틸렌글리콜(PEG) 6000 및 CaCl2가 함유된 수용액에 첨가하는 것은, 바늘이 장착된 주사기로 상기 혼합물을 옮긴 후, 주사기 펌프를 이용하여 수행할 수 있으며, 상기 주사기의 바늘 끝은 상기 수용액 표면 위에 수직이 되도록 설정하고 상기 수용액 상에 상기 혼합물을 떨어뜨리면서 첨가한다.
또한, 상기 혼합물을 상기 수용액 상에 첨가하는 과정은 수용액을 교반하면서 진행할 수 있는데, 칼슘 알지네이트 비드 제조 시 수용액의 교반 속도는 500 ~ 700 rpm으로 수행할 수 있고, 바람직하게는 600 rpm으로 실시할 수 있다.
상기 칼슘 알지네이트 비드 제조 조건에서 교반 속도가 500 rpm 미만이면 비드가 뭉쳐질 우려가 있고, 700 rpm을 초과하면 비구형의 비드가 제조될 우려가 있으므로 본 발명에서 칼슘 알지네이트 비드 제조 시 용액의 교반 속도는 500 ~ 700 rpm으로 실시하는 것이 좋다.
또한, 본 발명에서 제조하는 칼슘 알지네이트 비드의 형태는 구형의 형태를 갖는 특징이 있는데, 제조과정에서 비드의 형태는 상기 혼합물을 폴리에틸렌글리콜(PEG) 6000 및 CaCl2가 함유된 수용액에 바늘이 장착된 주사기를 이용하여 첨가하는 과정에서 바늘의 내경, 바늘 끝의 각도, 바늘과 용액의 거리, 유속에 의해서도 영향을 받을 수 있다.
미세조류가 담지된 칼슘 알지네이트 비드가 1차적으로 형성되고 나면, 다음으로 상기 미세조류가 담지된 칼슘 알지네이트 비드는 CaCl2가 함유된 수용액에서 추가 교반 후, 증류수로 세척하는 단계를 수행하여, 본 발명의 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 칼슘 알지네이트 비드를 수득할 수 있다.
이상 기술된 방법에 의해 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 구형의 칼슘 알지네이트 비드를 제조할 수 있다.
본 발명의 방법으로 제조된 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 칼슘 알지네이트 비드는 균일한 구형의 형태를 갖는 특징이 있으며, 구형의 형태를 갖도록 제조됨으로써 유용한 생리활성물질의 생산 증대를 위한 배양 조건으로 청색 광원을 조사할 경우, 광원이 비드에 균일하게 조사될 수 있다. 만일 제조된 비드가 비구형 형태를 갖게 되면 비드에 균일한 광원 조사가 안된다는 문제점이 있다.
또한 본 발명의 방법으로 제조된 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 칼슘 알지네이트 비드는 2~5mm의 직경크기를 갖는 특징이 있다.
만일 비드의 직경크기가 2mm 미만이면 비드 제조 시 균일성이 저해될 우려가 있고, 반면 5mm를 초과하게 되면 내마모성이 저해될 우려가 있다. 바람직하게 본 발명의 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 칼슘 알지네이트 비드의 직경크기는 2.5mm일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는, 서로 다른 직경크기(2.5mm, 5mm)를 갖는 칼슘 알지네이트 비드를 제조하고 각 비드에 대한 내마모성 평가를 수행하였는데, 2.5mm 직경크기의 비드는 5mm 직경크기의 비드에 비해 내마모성이 현저하게 우수한 것으로 나타났다. 따라서 2.5mm의 직경크기를 갖는 칼슘 알지네이트 비드는 오랜 배양시간 및 교반이 진행되는 중에도 마모되지 않고 온전한 형태를 그대로 유지할 수 있다.
또한 본 발명의 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 칼슘 알지네이트 비드는 비드 내부에 담지된 포르피리듐 크루엔툼 생산 생리활성물질(황화 다당류, 피코빌리 단백질, 세포외 고분자 물질, 대사물질 등)이 비드를 통과하여(칼슘 알지네이트 벽(wall)을 통과하여) 비드 외부로 분비될 수 있다.
따라서 이러한 특징으로 인해 본 발명의 칼슘 알지네이트 비드를 사용하게 되면, 배양된 미세조류 또는 사용한 비드를 파쇄하는 과정 없이 생리활성 물질을 수득할 수 있고, 또한 미세조류와 생산된 생리활성 물질의 분리를 위한 원심분리, 응집 또는 여과와 같은 추가의 고정이 필요하지 않아 경제적인 잇점이 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 구형의 칼슘 알지네이트 비드를 이용한 포르피리듐 크루엔툼의 고정배양방법을 제공한다.
본 발명의 칼슘 알지네이트 비드를 이용할 경우, 포르피리듐 크루엔툼을 상기 비드 내부에 캡슐화시켜 고정 배양할 수 있고, 본 발명의 비드 제조에 사용한 알지네이트는 독성이 없고 투명하므로 비드 내부에 고정화된 미세조류는 광합성을 통해 성장할 수 있다.
또한 본 발명은 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 구형의 칼슘 알지네이트 비드를 이용하여 배양하는 단계를 포함하는, 포르피리듐 크루엔툼으로부터 황화 다당류 또는 피코빌리 단백질을 대량생산하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 칼슘 알지네이트 비드를 이용하여 포르피리듐 크루엔툼으로부터 유용한 생리활성 물질인 황화 다당류 또는 피코빌리 단백질의 생산을 증진시킬 수 있는 배양 조건을 확립하기 위한 실험을 수행하였는데, 칼슘 알지네이트 비드 사용 없이 배양한 군(대조군), 칼슘 알지네이트 비드를 사용한 군, 칼슘 알지네이트 비드 및 청색광원을 조사하여 배양한 군을 대상으로 세포 생산성, 황화 다당류 및 피코빌리 단백질 생산성을 분석한 결과, 칼슘 알지네이트 비드를 사용하지 않은 군에 비해 칼슘 알지네이트 비드를 사용한 군이 세포 생산성, 황화 다당류 및 피코빌리 단백질 생산성이 증가한 것으로 나타났고, 칼슘 알지네이트 비드와 청색광원을 동시에 적용한 군이 가장 높은 세포 생산성, 황화 다당류 및 피코빌리 단백질 생산성을 나타내었다.
이를 통해 본 발명자들은 칼슘 알지네이트 비드를 사용하여 포르피리듐 크루엔툼을 배양할 경우, 청색광원을 함께 조사하게 되면 포르피리듐 크루엔툼으로부터 황화 다당류 또는 피코빌리 단백질을 대량생산 할 수 있음을 알 수 있었고, 바람직한 배양 조건은 25℃에서 120rpm으로 교반하면서 60 μmol m-2s-1의 세기로 청색광원을 조사하여 수행할 수 있다.
본 발명의 다른 일실시예에서는, 배양배지의 조건을 달리한 상태에서 황화 다당류 또는 피코빌리 단백질의 생산 증진을 유도할 수 있는지 확인하기 위해, 영양분 결핍 조건 하에서 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 칼슘 알지네이트 비드를 배양한 후, 배양 시간에 따른 세포 생산성, 황화 다당류 및 피코빌리 단백질 생산성을 분석하였다.
그 결과, 비타민이 결합된 조건에서 배양한 경우, 세포 생산성이 가장 우수한 것으로 나타났다. 또한, 황화 다당류 및 피코빌리 단백질의 생산성 분석에서는 배양 15일째까지의 초기 배양 동안에는 비타민 결핍 조건이 가장 높은 효율을 보이는 것으로 나타났고, 이후 30일째까지의 배양 동안에는 질소가 결핍된 조건으로 배양한 군이 가장 높은 효율을 보이는 것으로 나타났다.
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 구형의 칼슘 알지네이트 비드를 이용하여 포르피리듐 크루엔툼 배양 시, 청색 광원을 함께 조사하거나 또는 영양소 결핍 배지에서 배양하거나, 또는 이들의 동시 수행을 통해, 포르피리듐 크루엔툼으로부터 황화 다당류 및 피코빌리 단백질의 생산을 극대화시킬 수 있음을 알 수 있었다.
또한 상기 포르피리듐 크루엔툼으로부터 생산된 황화 다당류 또는 피코빌리 단백질의 분리 및 수득은 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 구형의 칼슘 알지네이트 비드 배양액으로부터 분리할 수 있는데, 상기 황화 다당류 또는 피코빌리 단백질은 포르피리듐 크루엔툼에서 생산 및 분비되고 상기 비드를 통과하여 배양액 내에 존재한다.
따라서 배양액만을 수집한 후, 배양액으로부터 이들 물질을 분리하는 과정을 통해 쉽게 대량 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 구형의 칼슘 알지네이트 비드는 배양 배지만을 교체하는 과정을 통해 지속적으로 사용 가능한 특징이 있다.
즉, 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 구형의 칼슘 알지네이트 비드를 배양한 배양액에서 유용한 생리활성 물질을 분리한 다음, 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 구형의 칼슘 알지네이트 비드는 신선한 배양배지로 옮겨 다시 배양하는 과정을 통해 황화 다당류 또는 피코빌리 단백질의 생산을 연속적으로 유도할 수 있는 특징이 있다.
따라서 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 구형의 칼슘 알지네이트 비드는 배지만을 교체하는 간단한 과정으로 황화 다당류 또는 피코빌리 단백질을 반연속적으로 생산할 수 있다.
나아가 본 발명의 칼슘 알지네이트 비드를 이용하여 포르피리듐 크루엔툼으로부터 생산된 황화 다당류 또는 피코빌리 단백질은 종래 방법으로 생산된 황화 다당류 또는 피코빌리 단백질과 동일한 성상 및 활성을 가지고 있음을 확인하였다.
그러므로 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 구형의 칼슘 알지네이트 비드를 이용할 경우, 비드 내부에 포르피리듐 크루엔툼을 안정적으로 고정시킬 수 있고, 배양 조건의 제어를 통해 황화 다당류 및 피코빌리 단백질과 같은 생리활성물질의 생산을 증진시킬 수 있으며, 상기 생리활성물질을 세포와 쉽게 분리하여 수집할 수 있을 뿐만 아니라, 배지의 교체를 통해 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 구형의 칼슘 알지네이트 비드로부터 생리활성물질을 연속적으로 생산할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
칼슘 알지네이트 비드의 제조
칼슘 알지네이트 비드의 제조는 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 5 mL의 세포 배양물(포르피리듐 크루엔툼 함유 배양물)을 1.92%(w/v) 소듐 알지네이트와 1%(w/v) Tween 80이 포함된 수용액 10 mL와 혼합하였다. 이후 상기 혼합물을 바늘(내경 0.97 mm)이 장착된 5 mL 주사기로 옮긴 후 주사기 펌프를 이용하여 45% (w/v) PEG 6000 및 3% (w/v) CaCl2가 포함된 수용액 150 mL이 담긴 비이커(내경 85 mm)에 0.4 mL min-1의 유속으로 펌핑하였다. 이때 바늘의 끝은 용액 표면의 3 cm 위에 수직으로 설정하였고, 교반기를 이용하여 비이커를 600 rpm으로 교반하였다. 펌핑이 끝난 후 비이커를 15분간 추가 교반하였고 제조된 칼슘 알지네이트 비드는 멸균 증류수로 3회 세척하였다. 세척한 칼슘 알지네이트 비드는 1% (w/v) CaCl2 이 함유된 수용액 100 mL로 옮겨 30분간 추가 교반 후 멸균 증류수로 3회 세척하여 본 발명에 따른 포르피리듐 크루엔툼이 캡슐화된 칼슘 알지네이트 비드를 제조하였다.
<실시예 2>
칼슘 알지네이트 비드의 내마모성 평가
칼슘 알지네이트 비드에 대한 내마모성 평가를 진행하였는데, 평가는 포르피리듐 크루엔툼이 포함되지 않은 무세포 칼슘 알지네이트 비드를 제조하여 사용하였다. 이때 상기 비드를 직경이 각각 2.5mm 및 5mm가 되도록 제조하였다. 미세조류 세포가 첨가되지 않은 칼슘 알지네이트 비드를 배지 150 mL가 담긴 플라스크에 각각 넣고 150 rpm 및 25℃에서 진탕하고, 15일 및 30일 후에 비드를 건져내어 60℃에서 24시간 동안 건조한 후 건조중량을 측정하였다. 이후 마모율은 다음 식에 따라 계산하였다.
마모율(%) = (1 - DW / DW0) × 100
상기 식에서 DW는 실험일의 건조중량, DW0은 0일의 건조중량을 나타낸다.
본 발명자들은 내마모성 분석을 통해 미세조류의 배양과정에 적합한 비드 조건을 확립하였고, 비드의 직경과 내마모성과의 관련성을 확인하였다. 분석 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 배양 조건에서 직경 5mm의 비드 무게는 실험 15일 및 30일에 각각 45.2 ± 2.9% 및 60.0 ± 9.3% 감소하는 것으로 나타났다. 반면, 직경 2.5mm의 비드 무게는 실험 15일차와 30일차에 각각 18.5±6.7%, 20.4±3.7% 감소하는 것으로 나타났다.
이러한 결과를 통해, 본 발명자들은 2.5mm 직경을 갖는 비드를 사용하는 것이 5mm 직경을 갖는 비드를 사용하는 것에 비해 내마모성이 더 우수하므로 고정배양 조건에 더 적합하다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 3>
본 발명의 칼슘 알지네이트 비드를 이용한 포르피리듐 크루엔툼의 최적 배양조건 확립
포르피리듐 크루엔툼은 개량된 f/2 배지를 이용하여 배양하였는데, 구체적으로 배지의 조성은, 여과된 해수 950 mL 당 NaNO3 1.5 g, Na2SiO3·9H2O 30 mg, NaH2PO4·H2O 5 mg, Na2EDTA·2H2O 4.36 mg, FeCl3·6H2O 3.15 mg, MnCl2·4H2O 180 μg, thiamine·HCl 100 μg, ZnSO4·7H2O 22 μg, CoCl2·6H2O 10 μg, CuSO4·5H2O 9.8 μg, Na2MoO4·2H2O 6.3 μg, vitamin B12 0.5 μg, biotin 0.5 μg이 첨가된 배지를 이용하였고, 배양 전 고압 멸균키를 이용하여 121℃, 20분 조건에서 살균하여 이용하였다.
황화 다당류를 생산하기 위한 배양은 칼슘 알지네이트 비드에 포르피리듐 크루엔툼을 고정배양한 것을 실험군으로 하였고, 동일 환경에서 칼슘 알지네이트 비드를 이용하지 않은 군을 대조군으로 하여 30일간 배양하였다.
또한, 황화 다당류를 생산하기 위한 포르피리듐 크루엔툼의 배양은 25℃, 120 rpm, 60 μmol m-2 s-1의 LED 조건으로 설정된 광생물반응기에서 수행되었고, 이때 칼슘 알지네이트 비드의 고정배양과 광원의 동시 적용 가능성을 확인하기 위해 청색 LED를 이용하여 배양하였다. 또한, 칼슘 알지네이트 비드를 이용한 포르피리듐 크루엔툼의 고정배양은 15일간 배양 후 배지의 70%를 신선한 배지로 교체하여 다시 배양하는 반 연속적 배양으로 수행하였고 하기의 분석들을 수행하였다.
<3-1> 포르피리듐 크루엔툼의 세포 바이오매스 분석
상기 기술된 배양 조건으로 배양한 포르피리듐 크루엔툼의 세포 바이오매스를 분석하였는데, 배양 중 세포 바이오매스의 변화는 동일한 비율의 대조군과 실험군을 채취하고 건조중량을 측정하고 비교하는 방식으로 이루어졌다. 이때 실험군의 경우, 10 mL의 3% (w/v) 트리-소듐 시트르산 용액을 첨가하고 15분간 초음파 처리하여 칼슘 알지네이트를 제거하는 과정을 수행하였다. 이후 멸균수(pH = 4)로 3회 세척하여 세포 외 고분자 물질을 제거하고 1.2 μm 유리 섬유 필터를 이용하여 세포를 여과한 후 60℃에서 24시간 동안 건조하여 세포의 중량을 측정하였다.
그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 대조군(칼슘 알지네이트 비드를 사용하지 않고 미세조류 배양군)에 비해 칼슘 알지네이트 비드로 세포를 고정 배양한 실험군에서 포르피리듐 크루엔툼의 세포 바이오매스가 월등히 증가한 것으로 나타났다. 또한, 칼슘 알지네이트 비드로 세포를 고정 배양한 군들 중에서 청색광을 조사한 군이 청색광을 조사하지 않은 군에 비해 세포 바이오매스가 더 높은 것으로 나타났다.
이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 칼슘 알지네이트 비드의 이용과 청색 광원의 처리는 포르피리듐 크루엔툼의 세포 성장을 효과적으로 증진시킬 수 있는 방법임을 알 수 있었다.
<3-2> 일일 황화 다당류 생산성 분석
본 발명자들은 각 실험군에 대한 일일 황화 다당류 생산성을 분석하였다. 황화 다당류의 생산성은 수정된 페놀-황산법에 따라 분석되었다. 각 배양한 배양물로부터 상층액 2 mL를 채취하여 80% (v/v) 페놀 50 μL 및 95.5% (v/v) H2SO4 5 mL를 첨가하고 반응물을 25℃에서 10분간 방치한 후, 수조로 옮겨 30℃에서 20분간 방치하였다. 이후, 25℃의 암 조건에서 4시간 동안 안정화한 후 멀티-분석용 마이크로플레이트 리더(multi-detection microplate reader)를 이용하여 480 nm의 광학 밀도 값을 측정하였다. 이때 검량곡선은 포도당을 기준으로 작성하여 사용하였다.
그 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이, 3일~15일 동안 배양한 군의 경우, 칼슘 알지네이트 비드를 이용하지 않은 대조군 및 칼슘 알지네이트 비드로 세포를 고정시켜 배양한 군 모두 일일 황화 다당류의 생산성을 유사한 것으로 나타났으나, 칼슘 알지네이트 비드를 이용하고 동시에 청색광을 조사한 군은 일일 황화 다당류의 생산성이 증가한 것으로 나타났다. 또한, 18~30일 동안 배양한 군에서는 본 발명의 칼슘 알지네이트 비드를 이용한 군이 칼슘 알지네이트 비드를 이용하지 않은 대조군에 비해 황화 다당류의 생산성이 월등히 증가한 것을 확인할 수 있었다.
<3-3> 피코빌리단백질 생산성 분석
다음으로 각 배양 조건에서의 피코빌리단백질 생산성을 분석하였다. 피코빌리단백질 생산성은 동결-해동 방법으로 안료를 추출하고 분광분석기를 이용하여 흡광도를 측정하는 방식으로 수행하였다. 이때 실험군의 경우 상기와 동일한 방법으로 칼슘 알지네이트를 제거하였다. 수확한 세포를 15 mL 코니칼 튜브로 옮기고 5 mL의 0.1 M 인산버퍼(pH=6)를 첨가한 후 -20℃에서 동결하였다. 그 후, 25℃에서 해동하고 1분 동안 강하게 볼텍싱한 후, 다시 -20℃에서 동결하는 것을 3회 반복하였다. 3회 이후, 10분간 3500 rpm으로 원심분리하여 세포 파편을 제거한 후 상층액을 채취하여 565, 620, 650 nm의 흡광도를 측정하였다. 이후 피코에리트린(PE), 피코시아닌(PC) 및 알로 피코시아닌(AC) 농도는 다음 식에 따라 계산하였다.
PE (mg L-1) = (A565 - 2.8 × PC - 1.34 × AP) / 12.7
PC (mg L-1) = (A620 - 0.7 × A650) / 7.38
AP (mg L-1) = (A650 - 0.19 × A620) / 5.65
피코빌리단백질(mg L-1) = PE + PC + AP
각 산출된 결과로부터 세포당 안료 함량은 상기한 식으로부터 계산된 안료 함량을 측정한 세포 건조중량으로 나누어 분석하였다.
분석 결과, 배양 30일째 대조군, 본 발명의 비드로 세포고정 배양한 군 및 본 발명의 비드로 세포고정 배양하고 청색광을 조사한 군에 대한 피코빌리단백질 함량은 각각 1.52 ± 0.01, 2.34 ± 0.12 및 5.48 ± 0.23 mg L-1인 것으로 나타났다(도 3c). 특히 비드를 이용하고 청색광을 조사한 군의 경우, PE(phycoerythrin), PC(phycocyanin) 및 AP(allophycocyanin)의 모든 색소의 함량이 유의하게 높은 함량을 나타내었고, 이들의 함량은 대조군(control)에 비해 각각 372 ± 10%, 295 ± 10%, 233 ± 27%인 것으로 나타났다(도 3c).
또한, 세포내 피코빌리단백질의 함량 분석 결과도 본 발명의 비드로 세포고정 배양을 수행하면서 청색광을 함께 조사한 군이 가장 높은 세포내 피코빌리단백질의 함량 결과를 나타내었다(도 3d).
이상의 결과를 통해 본 발명자들은 칼슘 알지네이트 비드로 세포를 고정배양하면서 동시에 청색광을 조사할 경우, 가장 효과적으로 세포 성장을 유도할 수 있고 동시에 황화 다당류 및 피코빌리단백질과 같은 유용성분의 생산성을 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 4>
본 발명의 칼슘 알지네이트 비드로 고정시켜 배양한 포르피리듐 크루엔툼에서 생산된 세포 외 고분자 물질의 구성원소 분석
본 발명의 칼슘 알지네이트 비드로 고정시켜 배양한 포르피리듐 크루엔툼에서 생산된 세포 외 고분자 물질에 대한 성분 분석을 원소분석기를 이용하여 수행하였다. 이를 위해 알코올 침전법을 이용하여 세포 배양물로부터 수집된 상층액에서 세포 외 고분자 물질을 추출하였다. 추출은 수집한 상층액을 95% (v/v) 에탄올에 1:3의 부피비로 첨가하고, 4℃에서 24시간 동안 침전하였다. 이후 생성된 침전물을 원심분리하고 동결 건조하였으며, 완전히 건조된 후, 침전물 1.8 g을 원소분석기로 1150℃에서 설파닐산(sulfanilic acid)와 벤조산(benzoic acid)을 표준물질로 하여 분석하였다.
그 결과, 칼슘 알지네이트 비드로 세포를 고정시켜 배양한 군과 칼슘 알지네이트 비드를 이용하지 않고 세포를 배지에 분주하여 배양한 군(대조군) 사이의 원소 조성에는 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다. 배양 15일째에 대조군, 칼슘 알지네이트 비드 배양군 및 칼슘 알지네이트 비드와 청색광 조사 배양군에서 수득한 황 함량은 각각 16.0 ± 0.6 wt%, 16.4 ± 1.2 wt% 및 17.9 ± 1.0 wt%인 것으로 나타났고(도 4a), 30일째 배양한 실험결과에서는 황 함량이 각각 17.0±1.0 wt%, 15.7±0.3 wt% 및 16.3±0.3 wt%인 것으로 나타났다(도 4b).
이러한 결과는 칼슘 알지네이트 비드로 세포를 고정시켜 배양해도 세포 자체에 큰 이상을 초래하지 않으며, 생리활성 물질의 생산에도 큰 문제가 없음을 의미한다.
<실시예 5>
본 발명의 칼슘 알지네이트 비드로 고정시켜 배양한 포르피리듐 크루엔툼에서 생산된 세포 외 고분자 물질의 생리활성분석
본 발명의 칼슘 알지네이트 비드로 고정시켜 배양한 포르피리듐 크루엔툼에서 생산된 세포 외 고분자 물질의 생리활성을 분석하였는데, 상기 세포로부터 생산된 세포 외 고분자 물질의 항산화 활성은 DPPH(2,2-diphenyl-1-picryhydrazyl ) 비색 분석법을 이용하여 분석하였다. 포르피리듐 크루엔툼으로부터 생산된 세포 외 고분자 물질을 증류수 20 μL에 용해한 후 DPPH-메탄올의 혼합물(0.09 mg mL-1) 180 μL이 담긴 마이크로플레이트에 첨가하고 25℃의 암 조건에서 30분간 반응시켰다. 이후 517 nm에서 증류수가 용해된 동량의 DPPH 용액을 블랭크로 하여 흡광도를 측정하고 항산화 활성을 정량하였다.
또한, 포르피리듐 크루엔툼으로부터 생산된 세포 외 고분자 물질의 콜라게나아제 억제 활성의 분석은 Collagenase activity colorimetric assay kit MAK293을 이용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다. 먼저, 포르피리듐 크루엔툼으로부터 생산된 세포 외 고분자 물질을 증류수에 용해하였고, 용액 2 μL와 동봉된 콜라게나제(collagenase) 10μL를 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 용액이 첨가되지 않은 콜라게나제 10 μL를 음성 대조군으로 사용하였고, 동봉된 콜라게나제 어세이 버퍼를 이용하여 시료와 음성 대조군의 부피를 100 μL로 조정하였다. 이후 실온에서 10분간 반응시키고 억제율(%)을 하기 식으로 계산하였다.
억제율(%) = [(Activity음성 대조군 - Activity시료) / Activity음성 대조군] × 100
또한, 포르피리듐 크루엔툼으로부터 생산된 세포 외 고분자 물질의 엘라스타제 억제 활성은 Neutrophil elastase activity assay kit MAK246을 이용하여 수행되었다. 먼저, 동봉된 어세이 버퍼 200 μL를 마찬가지로 동봉된 효소 스탠다드(enzyme standard)에 첨가하였다. 이후 용액 2 μL와 어세이 버퍼 48 μL를 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 억제 대조군은 어세이 버퍼를 이용하여 1:25로 희석하였다. 96-웰 플레이트에 세포 외 고분자 물질이 용해된 증류수, 억제 대조군, 어세이 버퍼 25 μL를 각각 첨가하여 시료, 양성 대조군, 음성 대조군을 설정하고 37℃에서 5분간 반응시켰다. 이후 어세이 버퍼 23 μL와 동봉된 기질 2 μL를 첨가하고 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 450 및 505 nm에서 형광을 측정하였다. 이어서 T1 및 T2에서의 형광값을 측정하여 각각 R1 및 R2로 설정하고, 억제율(%)을 다음 식에 따라 계산하였다.
ΔRelative fluorescence units (ΔRFU) = R2 - R1
억제율(%) = (ΔRFU시료 / ΔRFU대조군) × 100
또한, 포르피리듐 크루엔툼으로부터 생산된 세포 외 고분자 물질의 히알루로니다제 억제 활성은 흡광 분석법으로 분석하였다. 히알루로니다제 100 μL와 50 mM NaCl 및 0.01% BSA(bovine serum albumin)이 포함된 소듐 인산화 버퍼(sodium phosphate buffer) (100 mM, pH 7, 37℃) 100 μL로 구성된 분석 배지를 제조하였다. 이후 세포 외 고분자 물질이 용해된 증류수 50 μL와 분석 배지를 혼합하고 37℃에서 10분간 반응시켰다. 이후 히알루론산 용액 (0.03% in 300 mM sodium phosphate, pH 5.35) 형태의 기질 100 μL를 첨가하여 37℃에서 45분간 반응시켰다. 소화되지 않은 히알루론산은 1 mL 산 알부민 용액(acid albumin solution: 0.1% BSA in 24 mM sodium acetate and 79 mM CH3COOH, pH 3.75)을 이용하여 침전시켰다. 혼합물을 25℃에서 10분간 반응시킨 후 600 nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소가 없을 때의 흡광도는 최대 억제율을 지니는 대조군으로 하였으며, 아스코르브산을 양성 대조군으로 하였다. 억제율(%)을 다음 식에 따라 계산하였다.
억제율(%) = (A시료 / A대조군) × 100
분석 결과, 도 4c 및 4d에 나타낸 바와 같이, 칼슘 알지네이트 비드로 세포를 고정시켜 배양한 군 및 칼슘 알지네이트 비드를 이용하지 않고 현탁 배양한 군에서 추출한 생리활성물질에 대한 활성분석은 모든 실험군 및 대조군에서 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다.
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 칼슘 알지네이트 비드를 이용하여 포르피리듐 크루엔툼을 고정배양시키는 방법이 생리활성 성분의 활성에 큰 영향을 주지 않으며 세포에도 영향을 주지 않아 큰 문제없이 사용할 수 있는 방법임을 확인함에 따라 생리활성 성분을 대량 수득할 수 있는 장점을 갖는 본 발명은 종래 배양방법을 대체할 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 6>
칼슘 알지네이트 비드 및 영양분 결핍 유도를 통한 세포 생산성 및 일일 다당류 생산성 변화 분석
나아가 본 발명자들은 본 발명의 칼슘 알지네이트 비드를 이용한 세포 고정배양과 함께 세포의 생산성 및 유용 생리활성 물질의 생산성을 극대화시킬 수 있는 배양 조건을 확인하기 위해, 영양분을 결핍시킨 배앵 조건에서의 세포 바이오매스 및 황화 다당류 생산 변화를 조사하였다. 영양분 결핍 조건은 질소가 제거된 배지 이용, 비타민 제거 배지 이용, 질소 및 비타민 모두가 제거된 배지를 이용한 군에 대해 분석하였다. 이때 배지는 앞서 사용한 개량된 f/2 배지의 조성에서 질소원(NaNO3) 및/또는 비타민(vitamin B12 및 biotin)을 제거한 영양분 결핍 배지를 제조하여 사용하였다. 또한, 고정배양과 영양분 결핍을 이용한 포르피리듐 크루엔툼의 배양은 25℃, 120 rpm, 60 μmol m-2 s-1의 청색 LED 조건으로 설정된 광생물반응기에서 반 연속적 배양으로 이루어졌으며, 세포 바이오매스, 황화 다당류, 피코빌리단백질 생산성 분석은 앞서 기재한 방법과 동일한 방법으로 수행하였다. 분석 결과는 하기 표 1 및 도 5에 나타내었다.
그 결과, 상기 표 1 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 영양소 결핍 유도 조건에서 세포 생산성 및 황화 다당류의 생산은 초기 15일째까지의 배양은 비타민을 제거한 배지로 배양하고(-V), 이후 30일째까지의 배양은 질소를 제거한 배지에서 배양한 경우(-N), 황화 다당류를 가장 많은 양으로 생산할 수 있음을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (14)
- (1) 미세조류인 포르피리듐 크루엔툼(Porphyridium cruentum) 배양물을 소듐 알지네이트(sodium alginate) 용액과 혼합하는 단계;
(2) 상기 (1) 단계에서 혼합된 혼합물을 0.2~0.6 mL min-1의 유속으로 폴리에틸렌글리콜(PEG) 6000 및 CaCl2가 함유된 수용액에 첨가하고 교반하여 미세조류가 담지된 칼슘 알지네이트 비드를 형성시키는 단계; 및
(3) 상기 미세조류가 담지된 칼슘 알지네이트 비드는 CaCl2가 함유된 수용액에서 추가 교반 후, 증류수로 세척하는 단계를 포함하는,
포르피리듐 크루엔툼이 담지된 칼슘 알지네이트 비드의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 (1) 단계의 포르피리듐 크루엔툼 배양물과 소듐 알지네이트(sodium alginate) 용액은 1:2의 부피비로 혼합하는 것을 특징으로 하는, 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 칼슘 알지네이트 비드의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 혼합물을 폴리에틸렌글리콜(PEG) 6000 및 CaCl2가 함유된 수용액에 첨가하는 것은, 바늘이 장착된 주사기로 상기 혼합물을 옮긴 후, 주사기 펌프를 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는, 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 칼슘 알지네이트 비드의 제조방법. - 제3항에 있어서,
상기 폴리에틸렌글리콜(PEG) 6000 및 CaCl2가 함유된 수용액은 40~50% (w/v) 폴리에틸렌글리콜(PEG) 6000 및 2~5% (w/v) CaCl2가 함유된 수용액인 것을 특징으로 하는, 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 칼슘 알지네이트 비드의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 (2) 단계의 교반은 500~700rpm으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 칼슘 알지네이트 비드의 제조방법. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된, 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 구형의 칼슘 알지네이트 비드.
- 제6항에 있어서,
상기 칼슘 알지네이트 비드는 2~5mm의 직경크기를 갖는 것을 특징으로 하는, 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 구형의 칼슘 알지네이트 비드. - 제6항의 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 구형의 칼슘 알지네이트 비드를 이용한 포르피리듐 크루엔툼의 고정배양방법.
- 제6항의 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 구형의 칼슘 알지네이트 비드를 이용하여 배양하는 단계를 포함하는,
포르피리듐 크루엔툼으로부터 황화 다당류 또는 피코빌리 단백질을 대량생산하는 방법. - 제9항에 있어서,
상기 배양은 25℃에서 120rpm으로 교반하면서 60 μmol m-2s-1의 세기로 청색광원을 조사하면서 배양하는 것을 특징으로 하는, 포르피리듐 크루엔툼으로부터 황화 다당류 또는 피코빌리 단백질을 대량생산하는 방법. - 제9항에 있어서,
상기 배양은 비타민이 결핍된 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 포르피리듐 크루엔툼으로부터 황화 다당류 또는 피코빌리 단백질을 대량생산하는 방법. - 제9항에 있어서,
상기 배양은 초기 15일째까지는 비타민이 결핍된 배지에서 배양하다가 이후 질소가 결핍된 배지로 교체하여 30일째까지 추가 배양을 수행하는 것을 특징으로 하는, 포르피리듐 크루엔툼으로부터 황화 다당류 또는 피코빌리 단백질을 대량생산하는 방법. - 제9항에 있어서,
상기 황화 다당류 또는 피코빌리 단백질은 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 구형의 칼슘 알지네이트 비드 배양액으로부터 분리하는 것을 특징으로 하는, 포르피리듐 크루엔툼으로부터 황화 다당류 또는 피코빌리 단백질을 대량생산하는 방법. - 제13항에 있어서,
상기 황화 다당류 또는 피코빌리 단백질을 상기 배양액에서 분리한 다음, 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 구형의 칼슘 알지네이트 비드는 신선한 배양배지로 옮겨 다시 배양함으로써 황화 다당류 또는 피코빌리 단백질의 생산을 연속적으로 유도하는 것을 특징으로 하는, 포르피리듐 크루엔툼으로부터 황화 다당류 또는 피코빌리 단백질을 대량생산하는 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220051429A KR20230151724A (ko) | 2022-04-26 | 2022-04-26 | 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 칼슘 알지네이트 비드 및 이를 이용한 황화 다당류의 반연속적 생산방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220051429A KR20230151724A (ko) | 2022-04-26 | 2022-04-26 | 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 칼슘 알지네이트 비드 및 이를 이용한 황화 다당류의 반연속적 생산방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230151724A true KR20230151724A (ko) | 2023-11-02 |
Family
ID=88747789
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020220051429A KR20230151724A (ko) | 2022-04-26 | 2022-04-26 | 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 칼슘 알지네이트 비드 및 이를 이용한 황화 다당류의 반연속적 생산방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20230151724A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117487666A (zh) * | 2024-01-03 | 2024-02-02 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种紫球藻胞外多糖的生产工艺 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20090128287A (ko) | 2008-06-10 | 2009-12-15 | 충남대학교산학협력단 | 단방향 전단력을 이용한 미세유체 칩을 사용한 단분산성알지네이트 비드의 합성방법 및 세포의 캡슐화방법 |
| KR101797356B1 (ko) | 2016-04-29 | 2017-11-13 | 서강대학교산학협력단 | 알지네이트 필름과 광섬유를 포함하는 미세조류 배양 시스템 및 이의 제조 방법 |
-
2022
- 2022-04-26 KR KR1020220051429A patent/KR20230151724A/ko unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20090128287A (ko) | 2008-06-10 | 2009-12-15 | 충남대학교산학협력단 | 단방향 전단력을 이용한 미세유체 칩을 사용한 단분산성알지네이트 비드의 합성방법 및 세포의 캡슐화방법 |
| KR101797356B1 (ko) | 2016-04-29 | 2017-11-13 | 서강대학교산학협력단 | 알지네이트 필름과 광섬유를 포함하는 미세조류 배양 시스템 및 이의 제조 방법 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117487666A (zh) * | 2024-01-03 | 2024-02-02 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种紫球藻胞外多糖的生产工艺 |
| CN117487666B (zh) * | 2024-01-03 | 2024-05-07 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种紫球藻胞外多糖的生产工艺 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hertzberg et al. | Studies of alginate-immobilized marine microalgae | |
| CN106675557B (zh) | 一种n掺杂碳量子点的制备方法及其产品、应用 | |
| WO2007029627A1 (ja) | アスタキサンチン含量の高い緑藻抽出物およびその製造方法 | |
| CN106190853B (zh) | 一种高产藻蓝蛋白的红藻培养方法 | |
| Han et al. | Effect of Pseudoalteromonas sp. MEBiC 03485 on biomass production and sulfated polysaccharide biosynthesis in Porphyridium cruentum UTEX 161 | |
| KR20160114102A (ko) | 피코시아닌의 합성에서의 개선 | |
| KR20230151724A (ko) | 포르피리듐 크루엔툼이 담지된 칼슘 알지네이트 비드 및 이를 이용한 황화 다당류의 반연속적 생산방법 | |
| US10745351B2 (en) | Method of producing phycocyanin powder | |
| CN101292023B (zh) | 制造纯且高品质的微藻的起始试剂盒 | |
| CN111925943B (zh) | 天津拟甲小球藻及其培养方法与应用 | |
| CN1309820C (zh) | 一种能够无光照异养生长小球藻的培养方法 | |
| CN109929802A (zh) | 一种基于Transwell孔板上室培养细胞下室吸附分离外泌体的方法和应用 | |
| Fakhri et al. | Biomass, pigment production, and nutrient uptake of Chlorella sp. under different photoperiods | |
| CN105695355B (zh) | 一种利用两轮共培养和絮凝法制备菌藻细胞的方法 | |
| CN112143669B (zh) | 一株蓝菌藻及其培养方法和应用 | |
| JP6604590B2 (ja) | ユーグレナ及びその培養方法並びにパラミロン及びその製造方法 | |
| Putri et al. | Flocculants optimization in harvesting freshwater microalgae Haematococcus pluvialis | |
| CN111705103B (zh) | 一种筛选真阳性不出菇的食用菌变异菌株的方法 | |
| US8067225B2 (en) | Microalga species and its application for animal, human consumption and in obtaining carotenoids | |
| González et al. | Growth and total carotenoid content in four Chilean strains of Haematococcus pluvialis Flotow, under laboratory conditions | |
| CN112225787B (zh) | 一种抑制棕囊藻生长的方法 | |
| RU2518282C1 (ru) | Питательная среда для глубинного культивирования туляремийного микроба | |
| RU2753608C2 (ru) | Способ получения нуклеината натрия из микроводоросли Chlorella vulgaris Beijerink | |
| Gharekhan et al. | Diatoms from Saline Ecosystems and Biotechnological Applications: An Overview | |
| RU2742056C1 (ru) | Способ получения нуклеината натрия из микроводоросли Chlorella vulgaris Beijerink |