KR20090128287A

KR20090128287A - 단방향 전단력을 이용한 미세유체 칩을 사용한 단분산성알지네이트 비드의 합성방법 및 세포의 캡슐화방법

Info

Publication number: KR20090128287A
Application number: KR1020080054373A
Authority: KR
Inventors: 이창수; 최창형
Original assignee: 충남대학교산학협력단
Priority date: 2008-06-10
Filing date: 2008-06-10
Publication date: 2009-12-15

Abstract

본 발명은 단분산성 알지네이트 비드의 합성방법 및 세포 캡슐화 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 단방향 전단력을 이용한 미세유체 방식(biasedshear force driven microflow)에 의하여 미세유체 칩을 제작하는 단계; 및 상기 제작된 미세유체 칩 내의 미세유체 채널 구조를 이용하여 헥사데칸, 계면활성제, 칼슘용액 및 알지네이트 용액의 혼합으로 균일한 알지네이트 비드를 합성하는 단계;를 포함하는 단분산성 알지네이트 비드의 합성방법, 상기 방법으로 제조된 단분산성의 알지네이트 비드 및 상기 방법을 이용한 균일한 알지네이트 비드에 의한 세포 캡슐화 방법에 관한 것이다. 본 발명은 단방향 전단력을 통한 혼합물의 물방울을 형성한 후에 채널 구조를 이용한 효과적인 혼합을 통하여 균일한 비드가 제조될 수 있으며, 특히 분산상의 부피유속과 케필러리 수를 이용한 다양한 조건에서 단분산성 비드의 제조와 함께 미세유체 칩을 통해 부피 유속과 계면장력의 변화 및 점도의 조절을 통하여 비드의 크기를 조절할 수 있을 뿐만 아니라 칩 내부에서 세포를 직접 캡슐화하는 방법을 제공함으로써 균일한 알지네이트 비드의 합성 및 이를 이용한 세포 캡슐화 방법을 제시하고 있다.

알지네이트 비드, 단분산성 비드, 단방향 미세유체 칩, 세포 캡슐화

Description

단방향 전단력을 이용한 미세유체 칩을 사용한 단분산성 알지네이트 비드의 합성방법 및 세포의 캡슐화방법{Production Method of Mono-Dispersion Alginate Bead Applying Microfluidic Chip Using Singular Direction Shearing Force, and Capsulation Method of the Cell}

본 발명은 단방향 전단력을 이용한 미세유체 칩을 사용한 단분산성 알지네이트 비드의 합성방법 및 세포의 캡슐화방법에 관한 것이다.

미세유체 칩(microfluidic chip)이란, 칩 내에 형성되어 있는 미세채널로 미량의 분석 대상 물질을 흘려보내면서, 그 안에 존재하는 각종 물질을 분석할 수 있는 칩을 의미한다. 상기 미세유체 칩은 랩온어칩(lab-on-a-chip, LOC : '칩 위의 실험실' 이라는 의미)이라고 하여, 작은 칩 내에서 분석 대상 물질을 한 번에 분석할 수 있는 칩의 형태로 개발되고 있다. 미세유체 칩은 물질의 분석, 분리, 및 합성 등을 위하여 사용되고 있으며, 점차로 그 사용 분야가 확대되고 있다. 따라서, 상기 랩온어칩을 개발하기 위해서는 플라스틱이나 유리, 실리콘 등의 표면에 용액 이 흐를 수 있는 미세 채널로 회로를 생성한 후, 시료의 전처리, 분리, 희석, 혼합, 생화학 반응, 검출 등을 하나의 칩에 소형화 및 집적화시킬 수 있어야만 한다. 따라서, 상기 랩온어칩에 있어서 미세유체 공학 기술의 중요성은 굉장히 크게 된다. 미세유체 칩은 포토리소그래피나 고온-엠보싱(hot-embossing), 몰딩 등의 미세가공 기술로 만들어진 미세채널 구조에 덮개를 덮어 미량의 유체를 보관(contain)하거나 조절(manipulate)할 수 있도록 한 칩으로, 소모되는 시약의 양을 줄이고 분석시간을 짧게 할 수 있다는 장점을 가지고 있다.

하이드로젤은 다량의 수분과 유전자, 펩타이드, 단백질 및 세포 등을 쉽게 함유할 수 있는 3차원 입체 구조를 지닌 친수성 고분자이다. 하이드로젤은 친수성 고분자로써 물을 다량 흡수 할 수 있으며 생물학적인 요소 또한 함유할 수 있다. 하이드로젤은 그들이 지닌 특이적인 성질, 즉, 높은 범위의 수축 팽창력, 높은 확산도 등의 성질로 인하여 컨택트 렌즈, 인공장기, 약물전달, 미용 및 생물학적 센서 등에 이용될 수 있다. 특히, 구형의 하이드로젤 비드는 고유의 생체친화성 및 친수성 성질로 인해 바이오센서, 조영제, 약물전달기구, 세포전달체, 및 세포 혹은 조직의 이식에 매우 활용가치가 높은 재료로 알려져 있다. 추가로, 단분산성 하이드로젤 비드는 다분산성 하이드로젤에 비하여 구별되는 특징을 갖는데, 우수한 신호 검출, 분석, 및 모델링을 할 수 있는 도구로 사용가능한 장점을 지니고 있어, 입자의 크기를 조절할 수 있으면서 단분산성 입자를 생산할 수 있는 기술이 현재 절대적으로 요구되고 있다.

그 중에서 알지네이트 비드는 자연으로부터 얻어진 다량류로 구성되어 있어 무독성, 생분해능력이 탁월하며 합성방법이 매우 간편하고 빨라서 널리 이용되고 있다. 이런 알지네이트는 칼슘과 같은 2가 양이온을 이용하여 쉽게 가교가 이루어진다. 생성되는 알지네이트 비드는 다양한 생물학적 분자 예를 들어, DNA, 단백질, 효소, 항체, 세포 등을 캡슐화에 사용되고 있다. 보다 작은 비드가 선호되는 이유는 보다 쉽게 이식이 되고 제한적으로 분산이 되며 기계적 강도가 우수하기 때문이다. 이런 이유로 100 ㎛ 이하 크기의 알지네이트 비드가 요구되어진다. 알지네이트 비드를 합성하기 위한 전통적인 방법에는 이멀젼화, 내부가교법, 스프레이법 등이 있다. 하지만 이러한 방법은 크기를 변화시키기가 매우 어렵고, 가교가 되기 전에 유착이 발생하여 균일한 비드를 얻을 수가 없다. 제안된 다른 방법으로, 노즐진동법과 공기를 이용한 이멀젼화 방법이 있다. 이 방법의 경우에 상대적으로 작은 크기를 만들 수 있었으나, 분산도는 여전히 줄일 수 없었다.

종래의 하이드로젤 비드나 폴리머 비드의 생성방법[유화중합에 의한 폴리머 비드의 제조방법(2006.12.15), 특허출원 제2000-0056980호; 베타싸이크로덱스트린 함유 칼슘 알지네이트 겔 비드의 쌀성형물 및 그의 제조 방법(2006.10.23), 특허출원 제2006-0102679호; 생균력 증진을 위한 농업용 미생물제 미세캡슐화(2005.08.20), 특허출원 제 2005-0080306호]은 마이크로 노즐을 이용하거나 유화중합 방법을 사용하여 분산도(polydispersity)가 매우 높은 다분산성 비드를 생산 한 것으로, 단분산성 비드를 생산한 것은 아니다.

최근 들어, 미세유체 칩은 단분산성의 마이크로 입자를 합성하는 동시에 유체의 부피유속과 채널 구조를 이용하여 입자의 크기 조절을 손쉽게 할 수 있는 도구로써 제공되었다. 그러나 대부분 하이드로젤의 원료가 점도가 높아 보고된 문헌은 소수에 불과하다. 공개된 문헌(Lab chip, Huang et al., 6, 954, 2006)은 수력학적인 미세 초점 방법을 이용하여 마이크로 비드를 합성하였다. 하지만 이 방법은 채널 내에서 가교가 이루어진 것이 아닌 외부의 가교제가 담긴 곳으로 알지네이트 물방울을 보내 수행되어졌다. 채널내에서 가교가 이루어지지 않고 외부로 유출이 될 경우에 전달되는 경로에서 유착이 일어나기 쉽다. 또한, 제한된 용해도를 갖는 CaI를 연속상에 희석함으로써 채널의 길이를 조절하여 계면사이에서 발생하는 확산에 의하여 가교를 유도하여 알지네이트 비드를 형성하였다(J. Amer. Chem. Soc, Zhang et al., 128, 12205-12210, 2006). 하지만 확산에 의존하는 반응이기 때문에 반응속도가 매우 느린 단점을 가지고 있다.

이에 본 발명자들은 효율적으로 단분산성 알지네이트 비드를 생성하기 위한 노력을 하던 중, 단방향 전단 미세 유체 시스템을 사용하여 단분산성 알지네이트 비드를 손쉽게 제조할 수 있었으며, 특히 주입되는 유체의 다양한 변수를 고려하여 단분산성 알지네이트 비드가 형성되는 최적의 조건을 찾을 수 있었다. 아울러, 연속상의 부피유속과 계면장력의 변화를 통하여 손쉽게 다양한 크기의 알지네이트 비 드를 합성할 수 있었다. 또한, 세포를 분산도에 영향없이 알지네이트 젤 내부에 캡슐화시킬 수 있는 다재다능한 미세유체 칩을 제작함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 상기한 바와 같은 종래의 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 장치의 제작이 간편하며 미세유체 칩 내에서 단방향 전단력을 이용한 물방울 형성 및 물방울 내부의 혼합을 통하여 기존의 벌크 에멀젼 중합법의 단점인 입자 분산도를 최소화하고 연속상의 유속과 계면활성제의 농도 및 분산상의 점도 등의 다양한 변수를 조절함으로써 비드의 크기를 손쉽게 조절할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 칩 내에서 간편하게 세포를 알지네이트젤 내부에 캡슐화할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ⅰ) 단방향 전단력을 이용한 미세유체 방식(biasedshear force driven microflow)에 의하여 미세유체 칩을 제작하는 단계; 및 ⅱ) 상기 제작된 미세유체 칩 내의 미세유체 채널 구조를 이용하여 헥사데칸, 계면활성제, 칼슘용액 및 알지네이트 용액의 혼합으로 균일한 알지네이트 비 드를 합성하는 단계;를 포함하는 단분산성 알지네이트 비드의 합성방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 단분산성의 알지네이트 비드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법을 이용하여 균일한 알지네이트 비드에 의한 세포 캡슐화 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 단방향 전단을 통한 미세유체 칩으로 단분산성 고분자 하이드로젤 비드를 제조하는 방법 및 상기 칩에서 직접 세포를 캡슐화시키는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로는, 단방향 전단을 통해 안정된 비드가 합성이 되는 최적의 조건에 대한 조사를 수행하고 다양한 변수, 즉, 부피유속, 계면활성제의 농도 및 점도를 이용하여 알지네이트 비드의 크기가 조절이 됨을 증명하였다. 또한, 세포를 주입할 수 있는 채널 구조를 추가함으로써 칩에서 직접 하이드로젤 반응물과의 혼합을 통하여 하이드로젤 내부에 형광이 발현되는 세포가 갇히도록 하여 입자가 균일하면서 생성된 입자의 기계적 강도가 우수한 물성을 갖는 비드 합성을 미세유체 칩을 통해 구현한 방법을 제공한다.

본 발명은 ⅰ) 단방향 전단력을 이용한 미세유체 방식(biasedshear force driven microflow)에 의하여 미세유체 칩을 제작하는 단계; 및 ⅱ) 상기 제작된 미 세유체 칩 내의 미세유체 채널 구조를 이용하여 헥사데칸, 계면활성제, 칼슘용액 및 알지네이트 용액의 혼합으로 균일한 알지네이트 비드를 합성하는 단계;를 포함하는 단분산성 알지네이트 비드의 합성방법을 제공한다.

본 발명의 단분산성 알지네이트 비드의 합성방법에 있어서, 상기 미세유체 방식은, 연속상의 헥사데칸 부피유속을 이용, 연속상의 계면활성제의 농도를 조절, 또는 알지네이트 용액의 분산상의 점도를 조절함으로써 균일한 단분산성 알지네이트 비드의 크기를 조절하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 단분산성 알지네이트 비드의 합성방법에 있어서, 상기 미세유체 칩은 사면이 동일한 소수성을 가지는 것이 바람직하고, ⅰ) 유리기판을 세척한 후 그 위에 PDMS 전중합체(prepolymer)를 스핀코팅하는 단계; ⅱ) 상기 코팅된 표면을 경화시켜 점착성을 유도하는 단계; ⅲ) 상기 점착성을 가지는 표면 위에 유체가 흐를 수 있는 채널이 포함된 PDMS 몰드를 올려놓는 단계; 및 ⅳ) 상기 몰드를 추가적으로 경화시켜 완전하게 접착된 미세유체 채널이 형성되는 단계를 포함하여 제작되는 것이 바람직하고, 이때 상기 채널이 포함된 PDMS 몰드는 포토리소그래피를 통해 얻어진 실리콘 마스터에 PDMS를 경화시켜 제작되는 것이 보다 바람직하다.

또한, 본 발명의 단분산성 알지네이트 비드의 합성방법에 있어서, 상기 헥사데칸, 계면활성제, 칼슘용액 및 알지네이트 용액은 혼합된 물방울을 형성한 후에 상기 미세유체 칩의 미세유체 채널 구조내로 주입되는 것이 바람직하다.

상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 특징은 도 2에 도시된 바와 같다. 즉, 단방향 전단력을 이용한 미세유체 칩으로 섞이지 않는 헥사데 칸(hexadecane)의 전단력을 이용하여 단분산 형태의 알지네이트 혼합물을 형성하고 구부러진 채널을 이용하여 확산과 재순환을 통해 반응을 촉진시킴으로써 단분산성의 비드를 합성한다.

본 발명에 의하여 제조되는 알지네이트 비드는 알지네이트 용액과 가교제인 칼슘이 반응하여 생성되는데, 이를 응용한다면 보다 넓게는 다양한 하이드로젤 비드를 제조하는데 사용되고, 아울러 보다 넓게는 일반적인 단분산성 비드를 제조하는데 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 단분산성 알지네이트 비드의 합성방법은 구부러진 채널 내에서 확산과 재순환이 연속적으로 유도되어 이루어진 혼합에 의하여 비드의 채널 내의 유착을 막는 것이 바람직하다. 또한, 상기 합성방법의 특징은 확산에만 의존할 경우 반응속도가 매우 느리므로, 단방향 전단력을 이용한 미세유체 칩에서 구부러진 채널을 흘러가도록 하여 완전한 혼합이 이루어지도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명이 목적으로 하는 단분산성 알지네이트 비드를 합성하기 위해서는 사면이 동일한 소수성의 특징을 가진 미세유체 칩을 제작하는 것이 요구되고, 본 발명자들은 실시예를 통하여 안정된 알지네이트 비드가 형성이 되는 최적의 유체의 부피유속을 밝혀내고 이를 이용하여 생산효율의 증가와 분산도를 낮추었다. 또한, 연속상의 부피유속 및 계면장력, 점도를 조절함으로써 자유자재로 비드의 크기를 조절할 수 있었다.

상기 알지네이트 비드를 형성하기 위한 채널 내의 두개의 반응물의 반응 기 작은 도 12로 간단히 나타낼 수 있다.

본 발명에 따른 단분산성 알지네이트 비드의 합성방법은 단방향 전단력을 통해 형성된 물방울의 최적화된 혼합과 유착방지로 이루어질 수 있으며, 기본적으로 미세유체 칩의 견고한 본딩 방법에 의하여 마이크로 시린지 펌프로의 유체 주입시 새는 일이 없이 안정되게 비드가 형성될 수 있다.

또한, 본 발명의 미세유체 칩의 제작방법은 채널의 사면이 모두 소수성의 특징을 가지면서 반응물의 주입시 압력강하에 견디는 미세유체 칩을 제작하는 단계; 상기 미세 유체 칩의 주입구로 마이크로 시린지 펌프를 이용하여 각 반응물을 주입하는 단계; 고형화된 부산물을 이미지 프로그램을 사용하여 분석하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다. 보다 구체적으로는, 미세유체 칩을 제작하기 위해 PDMS 몰드를 준비하고, 칩의 바닥면으로 사용될 유리를 유기 용매를 이용하여 세척을 한다. PDMS 몰드는 사진 식각(Photolithography)을 통해 채널이 형성된 실리콘 마스터에 PDMS 전중합체(prepolymer)와 경화제를 10 : 1의 비율로 섞은 후에 65℃에서 2시간 정도 열적 경화 후에 실리콘 마스터로부터 분리하여 얻을 수 있다.

미세유체 칩의 제작과정을 보다 자세히 설명하면 다음과 같다.

세척이 된 유리기판을 PDMS 전중합체로 스핀코팅(spin-coating)한 후에 65℃에서 50분간 부분적인 열적 경화를 시킨다. 해당 시간 동안 완전히 경화되지 않고 표면이 점착성을 띄게 된다. 앞서 제작한 채널이 포함된 PDMS는 점착성을 가지는 유리기판과 접합되고 다시 2시간 동안 완전히 경화시켜 하나의 마이크로 유체 칩을 완성할 수 있다(도 11 및 도 1 참조).

본 발명의 칩을 위한 도면제작에 있어서, 마이크로 채널 구조는 오토캐드(AutoCAD) 프로그램이 사용되었다. 도 2 및 도 3은 본 발명에서 사용된 각각의 마이크로 채널의 구조로서 도 2는 단방향 전단력을 이용한 미세유체 칩의 구조로써 단분산성 알지네이트를 합성하기 위해 이용되었다. 구부러진 채널 구간은 알지네이트 용액과 칼슘용액의 혼합물이 헥사데칸의 전단력에 의해 형성된 후 효율적인 혼합이 이루어지도록 유도하기 위해 제작되었다. 도 3은 도 2의 구조에서 세포의 캡슐화를 위하여 기존의 분산상의 2개의 주입구 중간에 배치하여 세포현탁액이 주입되도록 하는 구조를 가지고 있다. 또한 구부러진 구간을 통해 세포와 혼합물간의 혼합을 유도하였다. 본 발명에서 사용된 모든 미세유체 칩은 소수성의 헥사테칸(hexadecane)의 연속상 주입구와 친수성의 반응물(알지네이트, 칼슘클로라이드)의 주입을 위한 통로로 구성되어 있다. 무극성 헥사데칸의 단방향성의 전단력을 통해 층류로 흐르는 두개의 칼슘용액과 알지네이트 용액은 연속적으로 물방울이 형성이 되며 연속상에 둘러싸인 상태에서 물방울 안에서 확산과 대류현상에 의하여 반응이 진행된다. 특히, 급격하게 구부러진 채널구역 내에서 물방울 내부의 재순환이 유도되어 고효율의 혼합이 이루어졌다(도 14 참조).

그 결과, 형성된 하드드로젤(알지네이트 비드)은 젤간의 유착이 발생하지 않는다(도 6 참조). 그 결과, 크기 및 분산도가 매우 양호한 단분산성 하이드로젤이 제조된다(도 7 참조).

본 발명의 유체 주입방법에 있어서, 소수성과 친수성의 두 섞이지 않는 유체는 마이크로 시린지 펌프(Harvard apparatus PHD 2000, U.S.A.)를 사용하여 각각 주입되었다. 1 ㎖ 용량의 일회용 주사기에는 친수성인 두 개의 반응물 알지네이트와 칼슘클로라이드 그리고 소수성의 헥사데칸(Hexadecane)을 넣고 타이곤 튜브(Tygon tube)를 이용하여 각각의 용액을 미세유체 칩에 주입시킨다. 알지네이트와 칼슘클로라이드는 분산상으로써 개별적으로 두 개의 주입구를 통해 주입되고 소수성의 용액(Hexadecane)은 연속상으로 남은 주입구로 주입된다(도 13 참조).

본 발명의 안정된 하이드로젤 비드를 형성하기 위한 최적의 상태는 분산상의 유속과 케필러리 수에 의해 결정되며, 상도표는 하이드로젤 비드가 한정된 구간에서만 안정된 형태로 형성됨을 나타낸다(도 4 참조). 또한, 이를 통해 채널내에 상도표에 따른 유체 변동, 안정된 비드, 층류가 일어나는 부위를 확인할 수 있다(도 5 참조). 그 결과, 일정한 유속 이상과 제한된 케필러리 수의 영역에서만 단분산성의 하이드로젤이 생성된다.

또한, 연속상의 부피유속과 계면활성제의 농도에 따라 균일한 알지네이트 비드을 형성하는데 있어 비드의 크기가 조절된다(도 8 참조). 구체적으로, 연속상의 부피유속이 증가함에 따라 전단력이 상승하여 보다 작은 알지네이트 비드가 생산되고, 단위시간당 공급되는 분산상의 부피는 연속상의 부피유속의 증가로 인하여 감 소된다. 연속상에 녹아 있는 계면활성제의 농도는 연속상과 분산상의 계면장력에 영향을 주며 농도가 증가함에 따라 계면장력은 낮아지게 되므로, 분산상과 연속상의 접촉면을 증가시켜 생성되는 알지네이트 비드의 크기를 작게 한다. 그 결과, 일정한 농도 이상의 계면활성제가 연속상에 포함이 되어야 안정된 형태의 비드를 얻을 수 있다.

또한, 분산상의 점도, 즉 알지네이트 수용액의 농도가 알지네이트 비드 크기를 변화시킨다(도 9 참조). 즉, 알지네이트 수용액의 농도가 증가함에 따라 비드의 크기는 감소하므로, 이를 이용하면 알지네이트 비드 크기를 조절할 수 있다.

본 발명의 비드 분석방법에 있어서, 형성된 비드의 형태의 관찰은 흑백 CCD카메라가 장착된 현미경(Nikon, TE2000, Japan)이 사용되었다. 생성된 비드 크기의 분포는 Image J와 Image Pro(Media cybernetic)가 사용되었다. 비드 크기의 분산도는 표준편차를 평균크기로 나눈값으로 정의 되는 CV(coefficient of variation)로 계산되었다.

결론적으로, 일반적인 마이크로 규모의 하이드로젤 비드를 형성하기 위해서 미세 초점방식을 이용하여 외부로 가교되지 않은 알지네이트 물방울을 칼슘용액이 담긴 곳으로 전달시키거나 연속상에 한정된 용해도를 가진 칼슘을 녹여 채널을 흐르는 동안 확산에 의해 가교되도록 하였다. 이와 같은 방법의 단점은 유착으로 인해 분산도가 증가하거나 반응시간이 느린 점이다. 따라서, 본 발명은 이를 해결하 기 위해 단방향 전단력을 이용하여 구부러진 채널구조에서 혼합이 이루어지도록 하여 유착을 방지하고 빠른 반응이 유도되어 이를 극복할 수 있었다.

상기 균일한 알지네이트 비드에 의한 세포 캡슐화 방법에 있어서, 상기 세포 캡슐화 방법은 ⅰ) 단방향 전단력을 이용한 미세유체 방식에 의하여 칩 내에서 알지네이트 비드 내부에 세포 캡슐화를 위한 주입구를 갖는 미세유체 칩을 제작하는 단계; ⅱ) 상기 제작된 미세유체 칩 내의 미세유체 채널 구조를 이용하여 헥사데칸, 계면활성제, 칼슘용액 및 알지네이트 용액과 함께 세포 현탁액을 주입하는 단계; 및 ⅲ) 상기 주입된 물질의 혼합으로 상기 세포가 알지네이트 비드에 의해 캡슐화되는 단계;를 포함하는 것이 바람직하다.

상기한 바와 같이 캡술화를 위한 본 발명의 특징은 도 3에 도시된 바와 같다. 즉, 상기 세포 현탁액을 별도로 주입하여 캡슐화를 수행하기 위해 도 2에 도시된 채널을 개선하여 비드 내부에 세포가 캡슐화된 비드가 제조됨으로써 세포를 캡슐화시킬 수 있다. 즉, 도 3은 도 2에 나타난 기존의 구조에 칼슘용액과 알지네이트 용액 주입구의 경계에 추가된 마이크로 채널을 보여주는데, 알지네이트젤은 가운데로 유입되는 세포현탁액을 가둔 채로 고형화가 된다. 그 결과, 내부에 형광이 발현된 이스트 세포는 미세유체 칩의 세포 캡슐화 과정을 통해 내부에 존재한다(도 11 참조). 이를 다양한 현미경을 통해 확인하였다(도 10a, 도 10b 및 도 10c 참조). 캡슐화 이후에도 세포의 생존성을 GFP 형광을 통해 확인할 수 있다. 알지네이트 비드내에 캡슐화되는 세포의 수는 일정한데, 이는 유체의 부피유속을 변화시켜 조절할 수 있다.

이상에서와 같이 본 발명에 의하면, 사면이 균일한 미세유체 칩을 제작하기 쉽고 비용도 적게 들며, 구부러진 채널이 포함된 단방향 전단력을 이용한 미세유체 칩으로 강한 혼합을 유도하여 단분산성의 마이크로 크기의 알지네이트 비드를 경제적으로 얻을 수 있다. 이런 특성을 이용하여 세포를 같이 혼합하여 알지네이트 젤 내부에 가두어 캡슐화를 함으로써 상업적, 경제적인 이득을 얻을 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 치환 및 균등한 타 실시예로 변경할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백할 것이다.

<실시예 1> 미세유체 칩의 제작

본 발명자들은 본 발명에 사용된 PDMS 전중합체(prepolymer)의 부분적 가교를 통한 점착성을 이용한 본딩 방법을 사용했다. 먼저 바닥면으로 활용될 유리기판을 가로 × 세로(2.5㎝ × 5.0㎝)로 자르고, 이소프로필(Isopropyl), 아세톤(Acetone)으로 각각 5분씩의 초음파 세척기를 이용하여 세척을 한 후에 PDMS 전중합체를 6,000 rpm에 1분간 스핀코팅(spin-coating)하였다. 상기 과정은 채널이 포함된 PDMS와의 접촉시에 케필러리 힘에 의해 바닥면에 코팅된 전중합체가 채널 내부로 유입되는 것을 방지하기 위함이다. 이에 의하여, PDMS 전중합체는 65℃에서 50분간 열적 경화를 거치지만 완전히 경화되지 않아 점착성의 얇은 막을 형성하게 되었다. 미체유체 구조를 가진 PDMS는 해당 점착성 표면과 접합하여 전면이 소수성을 띄는 하나의 미세유체 칩이 완성되었다(도 1).

<실시예 2> 반응에 필요한 유체의 시린지 펌프를 이용한 주입

상기 실시예 1에서 제작된 미세유체 칩을 흑백 CCD카메라가 장착된 현미경(NIKON, SMZ800, Japan) 스테이지에 올려놓고, 상기 미세유체 칩에 시린지 펌프를 이용하여 유속을 조절하면서 반응에 필요한 유체를 주입하였다. 상기 과정은 먼저 연속상인 헥사데칸과 계면활성제 혼합물이 채널 내부에 주입이 되도록 하여 분산상의 표면 흡착을 최소화 하였고, 칼슘용액이 알지네이트 주입구로 흘러가지 않고 동시에 주입되도록 하여 반응 전에 주입구가 막히는 것을 방지하였다. 미세 유체 칩과 시린지 펌프의 연결은 타이곤튜브(Tygon tube)를 사용하여 형성된 주입구에 직접 연결함으로써 주입된 유체의 압력이 새지 않도록 하였다.

<실시예 3> 단방향 전단력을 이용한 미세유체 방식

단방향 전단력을 이용한 미세유체 방식은 총 3개의 주입구로 구성이 되어있다. 도 2에 나타내는 것과 같이, 반응을 위한 분산상으로 칼슘용액과 알지네이트용액의 두가지 주입구가 필요하며, 단분산성 물방울을 형성하기 위해 소수성의 헥사데칸이 이용되었다. 무극성 헥사데칸의 단방향성의 전단력을 통해 층류로 흐르는 두개의 칼슘용액과 알지네이트 용액은 연속적으로 물방울로 형성되며 연속상에 둘러싸인 상태에서 물방울 안에서 확산과 대류현상에 의하여 반응이 진행된다. 특히, 급격하게 구부러진 채널구역 내에서 물방울 내부의 재순환이 유도되어 고효율의 혼합이 이루어졌다. 도 14는 구부러진 채널내에서 헥사데칸의 전단력으로 생긴 혼합물의 물방울이 1 - 4 구간을 거치면서 재순환이 반복됨으로써 완전한 혼합이 이루어짐을 보여준다. 도 6은 상기 미세유체 칩에서 합성된 하이드로젤 비드를 보여주는 현미경 사진이며, 이는 하이드로젤간의 유착이 발생하지 않았음을 보여주고 있다. 도 7은 합성된 하이드로젤 비드를 이미지분석 프로그램을 이용하여 크기를 측정 및 분산도를 측정한 것이다. 측정된 분산도는 1.1% 이하이었으며, 이를 통하여 미세유체 칩을 통한 단분산성 하이드로젤이 합성되었음을 알 수 있었고, 기계적 강도도 우수함을 확인하였다.

<실시예 4> 단방향 전단력을 이용한 미세유체 방식에서 단분산성 하이드로젤이 형성되는 영역

상기 실시예 3의 균일한 하이드로젤 비드의 합성에 있어서, 안정된 하이드로젤 비드를 형성하기 위한 최적의 상태를 결정하기 위해서 다양한 분산상의 유속과 케필러리 수(Ca = Uμ/γ, U: 연속상의 부피유속, μ: 연속상의 점도 γ: 연속상과 분산상간의 계면장력)의 영향을 조사하였다. 도 4는 하이드로젤 비드가 한정된 구간에서만 안정된 형태로 형성이 된다는 것을 보여주는 상도표이다. 도 5는 상도표에 따른 채널내에서 일어나는 실험적 현상(Fluctuation: 유체 변동, Droplets: 안정된 비드, Laminar:층류)을 나타낸다. 상도표에 나타난 바와 같이, 낮은 분산상의 부피유속에서(0.6 ㎕/min 이하) 유속의 불균일성이 확인되었다. 이는 안정된 하이드로젤 비드의 생산을 위해서 최소한의 분산상의 유속이 요구됨을 나타낸다. 단, 0.6 ㎕/min 이상의 분산상의 유속에서, 케필러리 수가 4.3 x 10^-2~ 1.5 x 10^-1의 제한된 영역에서만 단분산성의 하이드로젤을 생산할 수 있었다. 분산상의 유속이 증가할수록 안정된 하이드로젤을 형성할 수 있는 케필러리 수의 영역은 감소됨을 확인하였다. 연속상이 2.0 ㎕/min 이상의 높은 유속이 되면, 연속상의 전단력은 물방울을 형성하기에 충분하지 않게 되어 층류가 형성이 된다. 이를 통하여 칼슘용액과 알지네이트 용액 사이의 접촉시간 및 단면적을 증가시켜 반응이 빠르게 진행되어 채널이 막히거나 젤이 표면에 흡착되게 된다.

<실시예 5> 하이드로젤 크기조절을 위한 연속상의 부피 유속과 계면활성제 농도의 효과

상기 실시예 3의 균일한 알지네이트 비드를 형성하는데 있어서, 미세유체 칩에서 비드의 크기를 조절하기 위하여, 연속상의 부피유속과 계면활성제의 농도의 효과를 알아보았다. 도 8은 연속상의 부피유속과 계면활성제 농도에 따른 알지네이트비드의 크기 변화를 나타낸다. 첫째, 연속상의 부피유속에 대한 효과 실험으로 동일한 유속의 분산상(0.8 ㎕/min) 및 동일한 계면활성제의 농도(0.2-2%) 조건에서, 연속상의 부피유속을 변화시킴으로써 알지네이트 비드의 크기변화를 알아보았다. 그 결과, 연속상의 부피유속이 증가함에 따라 전단력이 상승하여 보다 작은 알지네이트 비드를 생산할 수 있었다. 단위시간당 공급되는 분산상의 부피는 연속상의 부피유속의 증가로 인하여 감소된다. 둘째, 채널로 유입되는 모든 유체의 부피유속이 동일한 조건에서 계면활성제의 농도의 증가에 따른 크기 변화를 알아보았다. 연속상에 녹아 있는 계면활성제의 농도는 연속상과 분산상의 계면장력에 영향을 주며 농도가 증가함에 따라 계면장력은 낮아지게 된다. 즉, 계면장력의 감소는 분산상과 연속상의 접촉면을 증가시킴으로써 생성되는 알지네이트 비드의 크기를 작게 한다. 반면에, 계면활성제가 포함되지 않을 경우에는 안정된 형태의 비드가 형성되지 않는다. 결국 0.2% 이상의 계면활성제가 연속상에 포함이 되어야 안정된 형태의 비드를 얻을 수 있었다.

<실시예 6> 분산상의 점도가 하이드로젤 비드에 미치는 영향

상기 실시예 3의 균일한 알지네이트 비드를 형성하는데 있어서, 분산상의 점도, 즉 알지네이트 수용액의 농도의 알지네이트 비드 크기변화에 대한 영향을 조사하였다. 도 9는 알지네이트 수용액의 농도 변화에 따른 점도의 증가와 알지네이트 비드 크기의 변화에 연관성을 보여준다. 본 실험에서 알지네이트 수용액 농도의 효과를 확인하기 위해 0.5%(40cp)에서 2%(240cp)가 사용되었다. 주입된 유체의 동일한 부피유속에서, 알지네이트 수용액의 농도가 증가함에 따라 비드의 크기는 감소하였다. 이를 이용하여 알지네이트 비드 크기를 조절할 수 있었다. 하지만, 점도가 높아질수록 구형태의 비드 보다는 채널에 닿은 납작한 형태의 플러그가 생성되거나 비드가 형성되지 았았다.

<실시예 7> 미세유체 칩을 이용한 하이드로젤 내부로의 세포의 캡슐화과정

상기 실시예 3의 균일한 알지네이트 비드를 형성하는데 있어서, 세포현탁액을 별도로 주입하기 위해 상기 실시예 3의 미세유체 칩의 구조에 별도로 채널을 추가하였다. 도 3은 도 2에 나타난 기존의 구조에 칼슘용액과 알지네이트 용액 주입구의 경계에 추가된 마이크로 채널을 보여준다. 그 결과, 알지네이트젤은 가운데로 유입되는 세포현탁액을 가둔채로 고형화가 되고 이는 비드의 분산도에 거의 영향을 주지 않는다. 도 11은 내부에 형광이 발현된 이스트 세포가 미세유체 칩의 세포 캡슐화 과정을 통해 내부에 존재함을 나타낸다. 도 10a는 광학현미경, 도 10b는 형광현미경으로부터 얻은 사진이며, 도 10c는 두 개의 사진을 중첩시켜 얻은 캡슐화된 세포의 사진이다. GFP 형광을 통하여 세포의 생존성을 간접적으로 증명 할 수 있는데, 이를 이용하여 캡슐화과정 이후에도 세포가 여전히 살이 있음을 확인하였다. 알지네이트 비드내에 캡슐화되는 세포의 수는 대략 2개이며 이는 유체의 부피유속을 변화시킴으로써 조절할 수 있었다.

도 1은 본 발명에 사용된 미세유체 칩의 실제 사진이다.

도 2는 단방향 전단력을 통한 미세유체 방식(Biased shear force driven method)의 캐드도면 사진이다.

도 3은 세포 캡슐화를 위해 개선된 미세유체 방식의 캐드도면 사진이다.

도 4는 단방향 전단력을 통한 미세유체 방식을 사용시 안정된 비드가 생성되는 영역을 보여주는 상도표이다.

도 5는 상도표에서 보여지는 세가지 형태의 채널내 물방울 흐름을 보여주는 현미경 사진이다.

도 6은 단방향 전단력을 통한 미세유체 방식의 사용시에 형성된 균일한 비드의 형태를 보여주는 현미경 사진이다.

도 7은 칩 내에서 형성된 알지네이트 비드의 균일성을 보여주는 분산도이다.

도 8은 칩 내에서 연속상의 부피유속 및 계면활성제의 농도를 조절함으로써 알지네이트 비드의 크기 조절이 가능함을 보여주는 그래프이다.

도 9는 칩 내에서 분산상(알지네이트 용액)의 점도를 조절함으로써 알지네이트 비드의 크기 조절이 가능함을 보여주는 그래프이다.

도 10은 형광을 가진 세포(이스트)가 칩 내에서 알지네이트 비드 내에 캡슐화를 보여주는 현미경 사진으로, 이때 도 10a는 광학현미경, 도 10b는 형광현미경으로부터 얻은 사진이며, 도 10c는 두 개의 사진을 중첩시켜 얻은 캡슐화된 세포의 사진이다.

도 11은 본 발명에서 제작된 사면이 소수성을 가지는 미세유체 칩의 제작과정을 간략하게 나타낸 것이다.

도 12는 본 발명에서 합성된 알지네이트 비드를 생성하기 위한 채널 내에서의 두 개의 반응물, 즉 알지네이트와 칼슘 간의 반응 메카니즘으로, 본 발명에서 형성된 알지네이트가 가교제인 칼슘과 반응하여 가교되는 과정을 나타낸 화학식(모식도)이다.

도 13은 발명에서 제작된 미세유체 칩내에 반응물을 주입하는 방법을 나타내는 단면도이다.

도 14는 본 발명에서 알지네이트 물방울이 채널 내의 구부러진 채널을 통해 혼합이 이루어지는 과정을 나타낸 모식도이다.

Claims

ⅰ) 단방향 전단력을 이용한 미세유체 방식(biasedshear force driven microflow)에 의하여 미세유체 칩을 제작하는 단계; 및

ⅱ) 상기 제작된 미세유체 칩 내의 미세유체 채널 구조를 이용하여 헥사데칸, 계면활성제, 칼슘용액 및 알지네이트 용액의 혼합으로 균일한 알지네이트 비드를 합성하는 단계;를 포함하는 단분산성 알지네이트 비드의 합성방법.
제 1항에 있어서,

상기 미세유체 방식은, 연속상의 헥사데칸 부피유속을 이용함으로써 균일한 단분산성 알지네이트 비드의 크기를 조절하는 것을 특징으로 하는 단분산성 알지네이트 비드의 합성방법.
제 1항에 있어서,

상기 미세유체 방식은, 연속상의 계면활성제의 농도를 조절함으로써 균일한 단분산성 알지네이트 비드의 크기를 조절하는 것을 특징으로 하는 단분산성 알지네이트 비드의 합성방법.
제 1항에 있어서,

상기 미세유체 방식은, 알지네이트 용액의 분산상의 점도를 조절함으로써 균일한 단분산성 알지네이트 비드의 크기를 조절하는 것을 특징으로 하는 단분산성 알지네이트 비드의 합성방법.
제 1항에 있어서,

상기 미세유체 칩은 사면이 동일한 소수성을 가진 것을 특징으로 하는 단분산성 알지네이트 비드의 합성방법.
제 1항에 있어서,

상기 미세유체 칩은

ⅰ) 유리기판을 세척한 후 그 위에 PDMS 전중합체(prepolymer)를 스핀코팅하는 단계;

ⅱ) 상기 코팅된 표면을 경화시켜 점착성을 유도하는 단계;

ⅲ) 상기 점착성을 가지는 표면 위에 유체가 흐를 수 있는 채널이 포함된 PDMS 몰드를 올려놓는 단계; 및

ⅳ) 상기 몰드를 추가적으로 경화시켜 완전하게 접착된 미세유체 채널이 형 성되는 단계를 포함하여 제작되는 것을 특징으로 하는 단분산성의 알지네이트 비드의 합성방법.
제 6항에 있어서,

상기 채널이 포함된 PDMS 몰드는 포토리소그래피를 통해 얻어진 실리콘 마스터에 PDMS를 경화시켜 제작되는 것을 특징으로 하는 단분산성의 알지네이트 비드의 합성방법.
제 1항에 있어서,

상기 헥사데칸, 계면활성제, 칼슘용액 및 알지네이트 용액은 혼합된 물방울을 형성한 후에 상기 미세유체 칩의 미세유체 채널 구조내로 주입되는 것을 특징으로 하는 단분산성의 알지네이트 비드의 합성방법.
제 1항 내지 제 8항의 어느 한 항의 방법으로 제조된 단분산성의 알지네이트 비드.
제 1항의 내지 제 9하의 방법을 이용한 균일한 알지네이트 비드에 의한 세포 캡슐화 방법.
제 10항에 있어서,

상기 세포 캡슐화 방법은

ⅰ) 단방향 전단력을 이용한 미세유체 방식에 의하여 칩 내에서 알지네이트 비드 내부에 세포 캡슐화를 위한 주입구를 갖는 미세유체 칩을 제작하는 단계;

ⅱ) 상기 제작된 미세유체 칩 내의 미세유체 채널 구조를 이용하여 헥사데칸, 계면활성제, 칼슘용액 및 알지네이트 용액과 함께 세포 현탁액을 주입하는 단계; 및

ⅲ) 상기 주입된 물질의 혼합으로 상기 세포가 알지네이트 비드에 의해 캡슐화되는 단계;를 포함하는 균일한 알지네이트 비드에 의한 세포 캡슐화 방법.