CN105802620A - 制备水溶性荧光碳点的方法及荧光碳点在抗菌及区分细菌中的应用 - Google Patents

制备水溶性荧光碳点的方法及荧光碳点在抗菌及区分细菌中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种制备水溶性荧光碳点的方法及荧光碳点在抗菌及区分细菌中的应用，其中，所述制备水溶性荧光碳点的方法主要包括碳点制备和碳点纯化两步，该方法以季铵盐化硅烷试剂和甘油为原料，利用溶剂热法或微波法成功一步制备出表面季铵盐化的碳点。该碳点不但可以有效杀死革兰氏阳性菌，而且能选择性地实现对革兰氏阳性菌的多色荧光成像，从而可用于区分革兰氏阳性菌和阴性菌。此外，该碳点还具有在水溶液中分散性好、细胞毒性低、成本低、提纯简便等优点。

Description

制备水溶性荧光碳点的方法及荧光碳点在抗菌及区分细菌中的应用
技术领域
本发明涉及纳米材料，尤其是一种采用一步法制备具有抗菌及细菌成像性能的荧光碳点的方法，以及水溶性荧光碳点在选择性杀死革兰氏阳性菌以及区分革兰氏阳性菌和阴性菌中的应用。
背景技术
近年来，各种各样的碳材料(如碳纳米管、碳点、石墨烯、富勒烯等)逐渐兴起，引起了人们的广泛关注。碳材料由于具有良好的生物相容性及原料廉价易得的优点，使其被广泛用于生物检测、催化、能源、电子器件以及载药等方面。而荧光碳点作为一种新型零维碳材料，由于其简单的制备过程、良好的生物兼容性、良好的光稳定性及易表面修饰等优点被广泛用于药物载体、生物成像、生化检测等方面，但是目前为止尚未有碳点用于抗菌方面的报道。
季铵盐类抗菌剂是一类化合物的通称，由于其表面带有正电荷，可以以静电吸附的方式与带负电的细菌表面相结合，带有正电荷的季铵基亲水头部可取代细菌表面对细胞膜具有稳定作用的Mg2+、Ca2+，引起细菌胞膜渗透性调节功能的丧失以及钾离子和质子的外泄。此外，具有疏水长碳烷烃链的季铵盐衍生物可以穿透细菌的胞壁，与细胞膜中的磷脂双分子层和膜蛋白发生作用，通过扰动细菌细胞膜磷脂双分子层的稳定状态，从而引起细胞膜溶解、内容物泄漏和细菌死亡。这类通过作用于细菌细胞壁/细胞膜而产生抗菌效果的抗菌试剂可以有效避免细菌产生耐药性，因此季铵盐类抗菌剂具有十分广阔的应用前景。
与此同时，常见抗生素的大量使用也迫切需要我们寻找新型的抗菌试剂。另一方面，治疗细菌感染时首先需要区分革兰氏阳性菌和阴性菌，因为这两类细菌所对应的抗生素常常是不同的。但是传统的革兰氏染色法操作复杂，并且区分效果不够明显，因此迫切需要发明一种可以简便、有效地区分革兰氏阴性菌和阳性菌的新方法。
发明内容
发明目的：一个目的是提供一种制备具有抗菌及细菌成像性能的荧光碳点的方法，以解决现有技术存在的上述问题。进一步的目的是提供一种水溶性荧光碳点在选择性杀死革兰氏阳性菌以及区分革兰氏阳性菌和阴性菌中的应用。
技术方案：一种制备水溶性荧光碳点的方法，包括如下步骤：
步骤1、制备抗菌碳点：向甘油中加入季铵盐化硅烷试剂，搅拌均匀后置于水热反应釜中，在240～280℃的条件下反应2～8小时，获得抗菌碳点；
步骤2、纯化碳点：通过离心或过滤去除沉淀，用截留分子量为1000的透析袋盛装上清液，放在水中透析，获得纯净的碳点水溶液。
优选的，在步骤1中，所述甘油占溶液总体积的百分比为50～91％。更为优选的，所述甘油占溶液总体积的百分比为66.7±0.5％。进一步优选的，所述甘油占溶液总体积的百分比为66.7％。
优选的，所述季铵盐化硅烷试剂为二甲基十二烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵、二甲基十四烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵、二甲基十六烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵、二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵、二甲基十二烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]溴化铵、二甲基十四烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]溴化铵、二甲基十六烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]溴化铵、或二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]溴化铵。
进一步优选的，所述季铵盐化硅烷试剂为二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵，或二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]溴化铵。
一种水溶性荧光碳点在抗菌及区分细菌中的应用，其中，所述水溶性荧光碳点的制备方法包括如下步骤：
步骤1、制备抗菌碳点：向甘油中加入季铵盐化硅烷试剂，搅拌混匀，置于微波反应器中，在240～280℃条件下反应3～15分钟，得到抗菌碳点；
步骤2、纯化碳点：通过离心或过滤去除沉淀，用截留分子量为1000的透析袋盛装上清液，放在水中透析，获得纯净的碳点水溶液。
优选的，在步骤1中，所述甘油占溶液总体积的百分比为50～91％。进一步优选的，所述甘油占溶液总体积的百分比为66.7±0.5％。更为优选的，所述甘油占溶液总体积的百分比为66.7％。
优选的，所述季铵盐化硅烷试剂为二甲基十二烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵、二甲基十四烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵、二甲基十六烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵、二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵、二甲基十二烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]溴化铵、二甲基十四烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]溴化铵、二甲基十六烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]溴化铵、或二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]溴化铵。
进一步优选的，所述季铵盐化硅烷试剂为二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵，或二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]溴化铵。
有益效果：本发明将新型季铵盐化硅烷分子应用于碳点的制备中，制得的碳点具有良好的水溶性及优异的特异性抗菌性能，且具有荧光发光性质。
具体而言，本发明方法制得的碳点相对于现有碳点，具有以下突出的优势：
(1)碳点制备过程仅需一步，且利用微波反应器及水热反应釜均可制备，方法简单、产率高、产量大、成本低，并且后续提纯过程简单(仅需离心、过滤或透析)，有利于广泛使用。
(2)优异的抗菌性能。对革兰氏阳性菌具有良好的抑菌、杀菌效果。
(3)细胞毒性低。具备作为体内抗菌试剂的潜力。
(4)良好的荧光发光性能。该碳点具有良好的成像效果，可实现细胞多色成像。并能够选择性地使革兰氏阳性菌成像，从而可以有效区分革兰氏阳性菌和阴性菌。
(5)良好的水溶性和分散性。所制得的碳点具有很好的水溶性和分散性，适合在含水的生物体系中的各种应用。
附图说明
图1a和图1b分别为本发明制备碳点的流程图和反应原理示意图。
图2a和图2b分别为本发明制得的碳点的透射电子显微镜图及对应的粒径分析图。
图3为本发明制得的碳点对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)的细菌存活率测试结果。
图4为本发明制得的碳点对大肠杆菌(革兰氏阴性菌)的细菌存活率测试结果。
图5为本发明制得的碳点对正常肺细胞(AT-II)的毒性。
图6为本发明制得的碳点对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)的共聚焦荧光成像结果。
图7为本发明制得的碳点对大肠杆菌(革兰氏阴性菌)的共聚焦荧光成像结果。
具体实施方式
实施例1
溶剂热法制备水溶性荧光抗菌碳点，原理和过程见图1a、图1b，该方法主要包括以下步骤：
(1)碳点制备：往甘油中加入季铵盐化硅烷试剂，搅拌混匀后在水热反应釜中以260℃反应4h，即得到抗菌碳点；
(2)碳点纯化：离心或过滤除去沉淀，上清液用截留分子量为1000的透析袋在水中透析，即得纯净的碳点水溶液。其粒径表征结果(透射电子显微镜TEM)见图2a和图2b。其中，所述甘油的体积分数为66.7％。
实施例2
溶剂热法制备水溶性荧光抗菌碳点，该组实施例与实施例1类似，区别在于：在水热反应釜中以240℃反应6h，所述甘油的体积分数为91％。
实施例3
溶剂热法制备水溶性荧光抗菌碳点，该实施例与实施例1类似，区别在于：在水热反应釜中以280℃反应2h，所述甘油的体积分数为50％。
实施例4
溶剂热法制备水溶性荧光抗菌碳点，该组实施例与实施例1类似，区别在于：所述二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵替换为二甲基十二烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵、二甲基十四烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵、二甲基十六烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵、二甲基十二烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]溴化铵、二甲基十四烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]溴化铵、二甲基十六烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]溴化铵、或二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]溴化铵。
实施例5
微波法制备水溶性荧光抗菌碳点，与实施例1类似，区别在于：步骤1中改为在微波反应器中以280℃条件下反应3min，所述甘油的体积分数为50％。
实施例6
微波法制备水溶性荧光抗菌碳点，与实施例1类似，区别在于：步骤1中改为在微波反应器中以240℃条件下反应15min，所述甘油的体积分数为91％。
实施例7
测试实施例1的碳点对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)的抑菌能力，方法如下：
选取培养过夜的金黄色葡萄球菌，以1:100的比例稀释，在37℃培养箱中生长2～3个小时至细菌在600nm的浊度为0.5左右。金黄色葡萄球菌在与含有不同浓度碳点(0,1,2.5,5,10,20μg/mL)的培养基以1:10的比例稀释过后，置于37℃培养箱2.5h后，利用酶标仪采用CCK-8检测法测定450nm处的吸光度，实验结果见图3。实验结果表明，在细菌个数为1×106～1×107cfu/mL情况下，碳点浓度为10μg/mL时，即可杀死几乎所有金黄色葡萄球菌。
实施例8
测试实施例1的碳点对大肠杆菌(革兰氏阴性菌)的抑菌能力，方法如下：
选取培养过夜的大肠杆菌，以1:100的比例稀释，在37℃培养箱中生长2～3个小时至细菌在600nm的浊度为0.5左右。大肠杆菌以含有不同浓度碳点(0,10,20,50,100μg/mL)的培养基以1:10的比例稀释过后，置于37℃培养箱2.5h后，利用酶标仪采用CCK-8检测法测定450nm的吸光度，实验结果见图4。在细菌个数为1×106～1×107cfu/mL情况下，碳点浓度为100μg/mL时，对大肠杆菌有一定的抑菌效果。
实施例9
测试实施例1的碳点对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)的最小抑菌浓度(MIC)，方法如下：
选取培养过夜的金黄色葡萄球菌，以1:100的比例稀释，在37℃培养箱中生长至细菌在600nm的浊度为0.5左右。金黄色葡萄球菌在与含有不同浓度碳点(0,0.25,0.5,1,2,4,8,16μg/mL)的培养基以1:100的比例稀释(即细菌个数为1×105～1×106cfu/mL)过后，置于37℃培养箱14～18h后，没有出现明显浑浊的浓度，即为碳点对金黄色葡萄球菌的MIC。
实验结果表明，在金黄色葡萄球菌的个数为1×105～1×106cfu/mL时，该碳点浓度为4μg/mL时，没有出现浑浊，4μg/mL即为对金黄色葡萄球菌的MIC。
实施例10
测试实施例1的碳点对藤黄微球菌(革兰氏阳性菌)的最小抑菌浓度(MIC)，方法如下：
选取培养过夜的藤黄微球菌，以1:100的比例稀释，在37℃培养箱中生长至细菌在600nm的浊度为0.5左右，此时细菌的个数约为1×108cfu/mL。藤黄微球菌在与含有不同浓度碳点(0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32μg/mL)的培养基以1:100的比例稀释过后，置于37℃培养箱中培养14～18h后，菌液没有出现明显浑浊的加药浓度，即为碳点对藤黄微球菌的MIC。实验结果表明，在藤黄微球菌个数为1×105～1×106cfu/mL情况下，该碳点浓度为2μg/mL时，没有出现浑浊，2μg/mL即为该碳点对藤黄微球菌的MIC。
实施例11
测试实施例1的碳点对枯草芽孢杆菌(革兰氏阳性菌)的最小抑菌浓度(MIC)，方法如下：选取培养过夜的枯草芽孢杆菌，以1:100的比例稀释，在37℃培养箱中生长至细菌在600nm的浊度为0.5左右，此时细菌的个数约为1×108cfu/mL。枯草芽孢杆菌在与含有不同浓度碳点(0、0.25、0.5、1、2、4、6、8、16、32μg/mL)的培养基以1:100的比例稀释过后，置于37℃培养箱中培养14～18h后，菌液没有出现明显浑浊的加药浓度，即为碳点对枯草芽孢杆菌的MIC。实验结果表明，在枯草芽孢杆菌个数为1×105～1×106cfu/mL情况下，该碳点浓度为6μg/mL时，没有出现浑浊，6μg/mL即为该碳点对枯草芽孢杆菌的MIC。
实施例12
测试实施例1的碳点对大肠杆菌(革兰氏阴性菌)的最小抑菌浓度(MIC)，方法如下：
选取培养过夜的大肠杆菌，以1:100的比例稀释，在37℃培养箱中生长2～3个小时至细菌在600nm的浊度为0.5左右，此时细菌的个数约为1×108cfu/mL。大肠杆菌在与含有不同浓度碳点(0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32μg/mL)的培养基以1:100的比例稀释过后，置于37℃培养箱14～18h后，没有出现明显浑浊的浓度，即为碳点对大肠杆菌的MIC。实验结果表明，在大肠杆菌的个数为1×105～1×106cfu/mL时，该碳点浓度在大于32μg/mL时，依然会出现浑浊现象，故该碳点对大肠杆菌的MIC大于32μg/mL.
实施例13
测试实施例1的碳点对变形杆菌(革兰氏阴性菌)的最小抑菌浓度(MIC)，方法如下：
选取培养过夜的变形杆菌，以1:100的比例稀释，在37℃培养箱中生长2～3个小时至细菌在600nm的浊度为0.5左右，此时细菌的个数约为1×108cfu/mL。变形杆菌与含有不同浓度碳点(0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32μg/mL)的培养基以1:100的比例稀释过后，置于37℃培养箱中培养14～18h后，使菌液没有出现明显浑浊的碳点的浓度，即为该碳点对变形杆菌的MIC。实验结果表明，在变形杆菌个数为1×105～1×106cfu/mL时，该碳点浓度在大于32μg/mL时，依然会出现浑浊现象，故该碳点对变形杆菌的MIC大于32μg/mL。
实施例14
测试实施例1的碳点对绿脓杆菌(革兰氏阴性菌)的最小抑菌浓度(MIC)，方法如下：
选取培养过夜的绿脓杆菌，以1:100的比例稀释，在37℃培养箱中生长2～3个小时至细菌在600nm的浊度为0.5左右，此时细菌的个数约为1×108cfu/mL。绿脓杆菌与含有不同浓度碳点(0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32μg/mL)的培养基以1:100的比例稀释过后，置于37℃培养箱中培养14～18h后，使菌液没有出现明显浑浊的碳点的浓度，即为该碳点对绿脓杆菌的MIC。实验结果表明，在绿脓杆菌个数为1×105～1×106cfu/mL时，该碳点浓度在大于32μg/mL时，依然会出现浑浊现象，故该碳点对绿脓杆菌的MIC大于32μg/mL。
实施例15
测试实施例1的碳点的细胞毒性，方法如下：
选择正常肺细胞AT-II，利用酶标仪采用MTT检测法分别测定浓度为0,2.5,5,10,20,30μg/mL的碳点对AT-II毒性(碳点加入细胞24小时之后测定)，结果见图5。实验结果表明碳点浓度在大于细菌MIC的浓度下，细胞仍有60％以上的存活率，说明该碳点具有良好的生物相容性。
实施例16
验证实施例1的碳点对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌代表)的成像效果，方法如下：
将培养过夜的金黄色葡萄球菌，以1:100的比例稀释，在37℃培养箱中生长2～3个小时至细菌在600nm的浊度为0.5左右，此时细菌的个数约为1×108cfu/mL，加入碳点至最终浓度为0.1mg/mL。在37℃中的摇床中培养2小时后，用7000rpm的速度离心，去掉上清液，加入50μLPBS重新分散菌液，取10μL滴至盖玻片上在共聚焦显微镜用488nm的激光激发观察。结果见图6，表明该季铵盐化碳点能实现对金黄色葡萄球菌的荧光成像。
实施例17
验证实施例1的碳点对大肠杆菌(革兰氏阴性菌代表)的成像效果，方法如下：
将培养过夜的大肠杆菌，以1:100的比例稀释，在37℃培养箱中生长2～3个小时至细菌在600nm的浊度为0.5左右，此时细菌的个数约为1×108cfu/mL，加入碳点至最终浓度为0.1mg/mL。在37℃中的摇床中培养2小时后，用7000rpm的速度离心，去掉上清液，加入50μLPBS重新分散菌液，取10μL滴至盖玻片上在共聚焦显微镜用488nm的激光激发观察。结果见图7，表明该季铵盐化碳点对大肠杆菌的成像效果很弱。
总之，本发明以难溶于水的季铵盐化硅烷试剂(以“二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵”为例)和具有良好水溶性的甘油为原料，利用微波反应器或者水热反应釜，首次制得了具有良好荧光发光性质、良好水溶性、且具备广谱抗菌性能的季铵盐化碳点。透射电子显微镜图表明该碳点尺寸分布均匀，平均尺寸在3.5nm左右，且具有良好的分散性。细菌毒性实验表明，该碳点对革兰氏阳性菌(如金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌和枯草芽孢杆菌等)有良好的杀菌性能，而对革兰氏阴性菌的抑菌效果较弱。此外，该碳点对革兰氏阳性菌可以实现较好的荧光多色成像，从而达到高效区分革兰氏阴性菌和阳性菌的目的。该发明所制得的碳点有望被广泛应用于医学领域、制药业及日用化工业(家用消毒产品，化妆品等)等领域。
简言之，本发明以季铵盐化硅烷试剂和甘油为原料，利用溶剂热法或微波法成功一步制备出表面季铵盐化的碳点。该碳点不但可以有效杀死革兰氏阳性菌，而且能选择性地实现对革兰氏阳性菌的多色荧光成像，从而可用于区分革兰氏阳性菌和阴性菌。此外，该碳点还具有在水溶液中分散性好、细胞毒性低、成本低、提纯简便等优点。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种等同变换，这些等同变换均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中及不同实施例之间的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.一种制备水溶性荧光碳点的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、制备抗菌碳点：向甘油中加入季铵盐化硅烷试剂，搅拌均匀后置于水热反应釜中，在240~280℃的条件下反应2~8小时，获得抗菌碳点；
步骤2、纯化碳点：通过离心或过滤去除沉淀，用截留分子量为1000的透析袋盛装上清液，放在水中透析，获得纯净的碳点水溶液。
2.如权利要求1所述的制备水溶性荧光碳点的方法，其特征在于，在步骤1中，所述甘油占溶液总体积的百分比为50~91%。
3.如权利要求2所述的制备水溶性荧光碳点的方法，其特征在于，所述甘油占溶液总体积的百分比为66.7±0.5%。
4.如权利要求3所述的制备水溶性荧光碳点的方法，其特征在于，所述的季铵盐化硅烷试剂为二甲基十二烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵、二甲基十四烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵、二甲基十六烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵、二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵、二甲基十二烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]溴化铵、二甲基十四烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]溴化铵、二甲基十六烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]溴化铵、或二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]溴化铵。
5.如权利要求3所述的制备水溶性荧光碳点的方法，其特征在于，所述的季铵盐化硅烷试剂为二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵，或二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]溴化铵。
6.水溶性荧光碳点在抗菌及区分细菌中的应用，其特征在于，所述水溶性荧光碳点的制备方法包括如下步骤：
步骤1、制备抗菌碳点：向甘油中加入季铵盐化硅烷试剂，搅拌混匀，置于微波反应器中，在240~280℃条件下反应3~15分钟，得到抗菌碳点；
步骤2、纯化碳点：通过离心或过滤去除沉淀，用截留分子量为1000的透析袋盛装上清液，放在水中透析，获得纯净的碳点水溶液。
7.如权利要求6所述的水溶性荧光碳点在抗菌及区分细菌中的应用，其特征在于，在步骤1中，所述甘油占溶液总体积的百分比为50~91%。
8.如权利要求6所述的水溶性荧光碳点在抗菌及区分细菌中的应用，其特征在于，所述甘油占溶液总体积的百分比为66.7±0.5%。
9.如权利要求6所述的水溶性荧光碳点在抗菌及区分细菌中的应用，其特征在于，所述的季铵盐化硅烷试剂为二甲基十二烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵、二甲基十四烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵、二甲基十六烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵、二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵、二甲基十二烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]溴化铵、二甲基十四烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]溴化铵、二甲基十六烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]溴化铵、或二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]溴化铵。
10.如权利要求6所述的水溶性荧光碳点在抗菌及区分细菌中的应用，其特征在于，所述的季铵盐化硅烷试剂为二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵，或二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]溴化铵。
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