CN109722242B - 一种乳杆菌来源的碳量子点及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种乳杆菌来源的碳量子点及其制备方法，属于纳米发光材料制备的技术领域。本发明的碳量子点是以乳杆菌为碳源，采用水热法来制备的，碳量子点的直径3±1nm，荧光发射峰在430‑470nm。本发明工艺简单、制备成本低、绿色环保，制备的碳量子点对青枯雷尔氏菌和地毯草黄单胞菌具有很强的抑制作用，可用于防治植物细菌病害。
Description
技术领域
本发明属于纳米发光材料制备的技术领域，具体涉及一种乳杆菌来源的碳量子点及其制备方法。
背景技术
碳量子点(CDs)由碳元素构成，而碳元素是生命体最重要的组成元素之一，生命体基本结构物质的主要骨架如氨基酸和核苷酸等都是由碳元素组成的。碳量子点作为荧光性能优异的纳米材料(<10nm)，具有良好的荧光性能、良好的生物相容性、生物毒性低等优点也引起了研究人员的极大兴趣，在生物、化学领域中作为细胞标记、传感器、活体成像等研究中发挥着重要作用。
Hua等(Hua X W,Bao Y W,Wang H Y,et al.Bacteria-derived fluorescentcarbon dots for microbial live/dead differentiation[J].Nanoscale,2016,9(6):2150.)合成的碳量子点可以识别活的和死的金黄色葡萄球菌；李红霞等(李红霞,王兴域,关凤,等.碳量子点槲皮素复合物的制备及其抑菌性能研究[J].西北师范大学学报(自然科学版),2015,5):70-73.)合成的碳量子点槲皮素复合物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有明显的抑制作用；Liu等(Liu J,Lu S,Tang Q,et al.One-step hydrothermal synthesisof photoluminescent carbon nanodots with selective antibacterial activityagainst Porphyromonas gingivalis[J].Nanoscale,2017,9(21):7135.)合成的碳量子点可以抑制牙龈卟啉单胞菌。
青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)是植物细菌性青枯病的病原菌，可危害许多重要的经济作物等44个科的数百种植物，如番茄、花生、生姜、烟草等。地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)会导致植物叶片、果实、根、茎产生斑点、枯萎和软腐等病症，是一类严重危害农业的细菌病害，如木薯枯萎病、柑橘溃疡病和棉豆的白叶枯病等。
CDs的制备方法有很多种，通常可分为自上而下法(将碳骨架彻底粉碎而生成CDs的方法，包括弧光放电法、电化学法和激光销蚀法等)和自下而上法(以一些有机分子作为前驱体碳源来合成CDs，模板法、微波消解合成法、超声振荡法、溶剂热法、强酸氧化法以及水热法等)，其中水热法合成过程比较简单、经济且绿色环保。
目前，还未见碳量子点对青枯雷尔氏菌、地毯草黄单胞菌这两种植物病原菌的抑制研究。
发明内容
为此，需要提供一种碳量子点，解决植物病原菌的防治问题。
为实现上述目的，发明人提供了如下技术方案：
一种乳杆菌来源的碳量子点的制备方法，是以乳杆菌为碳源，采用水热法来制备碳量子点。
所述的水热法包括以下步骤：
(1)出发菌株活化：将乳杆菌划线于固体培养基平板上，30-35℃倒置培养2-3天；
(2)碳量子点的制备：刮取乳杆菌菌落用超纯水分散均匀，置于聚氟乙烯反应釜中，170-190℃反应6-10h，冷却后过滤；进一步纯化，所得溶液即为乳杆菌来源的碳量子点溶液。
进一步的，所述的乳杆菌为干酪乳杆菌FJAT-13741，学名Lactobacillus caseiFJAT-13741，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M 2018901，保藏日期为2018年12月17日，保藏地址为武汉大学保藏中心。
进一步的，所述的过滤方法包括采用0.22μm的尼龙过滤膜过滤。
进一步的，所述的纯化方法包括透析方法，即采用1000-1500Da透析袋透析18-24h，每隔6-8h换一次水。
一种乳杆菌来源的碳量子点，是由上述制备方法制得的，所述的碳量子点的直径3±1nm，荧光发射峰在430-470nm。
进一步的，所述的乳杆菌来源的碳量子点在防治植物病原菌中的应用。
本发明的有益效果是：
(1)本发明的制备方法工艺简单、制备成本低、绿色环保。
(2)本发明以乳杆菌为碳源，有效利用了乳杆菌的抑菌作用，为细菌病害防治奠定了基础。
附图说明
图1为具体实施方式所述的碳量子点对青枯雷尔氏菌FJAT-91的抑制作用，图中每个培养皿最上端的孔添加的是空白对照，其余三个孔添加的均为制备的碳量子点。
图2为具体实施方式所述的碳量子点对地毯草黄单胞菌FJAT-10151的抑制作用，图中每个培养皿最上端的孔添加的是空白对照，其余三个孔添加的均为制备的碳量子点。
图3为具体实施方式所述的碳量子点CDs-C的红外光谱。
图4为具体实施方式所述的碳量子点CDs-C的紫外光谱。
图5为具体实施方式所述的碳量子点CDs-C的透射电镜图。
图6为具体实施方式所述的碳量子点CDs-C紫外照射下的荧光，其中，左图为紫外光下CDs-C显示蓝色荧光，右图为日光灯下CDs-C显示为黄色。
图7为具体实施方式所述的碳量子点CDs-C的激发/发射光谱和波长依赖性发射，其中a图为CDs-C的激发/发射光谱，图中最大激发、发射波长分别为360nm、450nm；b图为波长依赖性发射光谱，图中从左到右的发射峰的激发波长分别为330、340、350、360、370、380、390、400nm。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。
实施例1碳量子点的制备
1.供试菌株与培养基
出发菌株：菌株干酪乳杆菌FJAT-13741(Lactobacillus casei FJAT-13741，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M 2018901，保藏日期为2018年12月17日，保藏地址为武汉大学保藏中心)，菌株发酵乳杆菌L.fermentum FJAT-46744(邓元源,刘芸,刘欣,等.福建省腌菜中乳酸菌的分离与鉴定[J].食品安全质量检测学报,2018，9(3):481-490.)和菌株植物乳杆菌L.plantarum FJAT-7926(陈倩倩,刘芸,刘波,等.植物乳杆菌(FJAT-7926)生物学特性研究[J].福建农业学报,2014(7):678-681.)，-80℃甘油冷冻保存，现保藏在福建省农业科学院生物资源研究所。
植物病原菌株：菌株青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearum FJAT-91(郑雪芳,陈德局,等高效离子交换色谱法分析青枯雷尔氏菌无致病力epsD突变菌株的异质性[J].色谱,2018(1):23-29.)，菌株地毯草黄单胞菌Xanthomonas axonopodis FJAT-10151(郑梅霞,朱育菁,刘波,等.微生物多糖胶质高产菌株的筛选与鉴定[J].食品科学,2016,37(15):171-178.)，-80℃甘油冷冻保存，现保藏在福建省农业科学院生物资源研究所。
培养基：NA液体培养基(牛肉膏3g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，水1L)，NA固体培养基是在NA液体培养基基础中加入18g琼脂，NA半固体培养基则是NA液体培养基基础中加入9g琼脂。MRS培养基(蛋白胨10g，牛肉粉5g，酵母粉4g，葡萄糖20g，吐温801mL，七水合磷酸氢二钾2g，三水合乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，七水合硫酸镁0.20g，四水合硫酸锰0.05g，琼脂15g，水1L)。
2.碳量子点的制备
出发菌株的活化：-80℃冰箱取菌株FJAT-13741、菌株FJAT-46744和菌株FJAT-7926冻存管，待其回温到室温，于超净台内划线于MRS培养基平板上，倒置于生物培养箱30℃培养2d。
分别刮取菌株FJAT-13741、菌株FJAT-46744和菌株FJAT-7926菌落，用10mL超纯水分散均匀，将样品装25mL的聚氟乙烯反应釜中，180℃反应8h，自然冷却，用0.22μm的尼龙过滤头过滤，用1000Da透析20h，每隔8h换一次水。透析袋内溶液即为碳量子点溶液。得到的碳量子点分别为CDs-C(FJAT-13741)、CDs-F(FJAT-46744)和CDs-P(FJAT-7926)。
3.抑菌实验
病原菌发酵液的获得：-80℃冰箱取菌株FJAT-91、菌株FJAT-10151冻存管，待其回温到室温，于超净台内划线于NA固体培养基上划线，倒置于生物培养箱30℃培养2d后，挑取单菌落进行第二次划线培养，保证活化菌落形态单一。挑取第二次活化后的单菌落于各含100mLNA液体培养基的250mL锥形瓶中，于30℃、170r/min摇床中培养培养2d，备用，采用紫外分光光度计检测病原菌发酵液在600nm的吸光度值。
分别取1mL菌株FJAT-91和菌株FJAT-10151的发酵液与200mL50℃的NA半固体培养基混合后，倒入已制备好的NA固体培养基中，制成含病原菌的双层培养基；待培养基凝固后，用直径9mm的打孔器在平板上打孔，在孔内分别加入200μL碳量子点样品CDs-C、CDs-F和CDs-P，以水为对照，30℃恒温培养2d。观察抑菌效果。
4.实验结果
碳量子点CDs-C、CDs-F和CDs-P对植物病原菌青枯雷尔氏菌FJAT-91(OD600nm＝1.93)和地毯草黄单胞菌FJAT-10151(OD600nm＝1.15)均具有抑制效果，如图1和图2所示。CDs-C、CDs-F和CDs-P对青枯雷尔氏菌FJAT-91的抑菌效果如表1所示，CDs-C的效果最好，抑菌圈直径大小为31.76±1.42mm；CDs-C、CDs-F和CDs-P对地毯草黄单胞菌FJAT-10151的抑菌效果如表2所示，CDs-C的效果最好，抑菌圈直径大小为18.50±0.75mm。实验结果表明，乳杆菌本身对青枯雷尔氏菌和地毯草黄单胞菌等病原菌的抑菌效果很弱，制成碳量子点后具有明显的抑菌效果，因此，可将碳量子点溶液喷洒于植物叶片或果实上，用于植物病原菌的防治。
表1碳量子点对青枯雷尔氏菌FJAT-91的抑菌效果
表2碳量子点对地毯草黄单胞菌FJAT-10151的抑菌效果
实施例2碳量子点的表征
1.碳量子点的制备
出发菌株的活化：-80℃冰箱取菌株FJAT-13741冻存管，待其回温到室温，于超净台内划线于MRS培养基平板上，倒置于生物培养箱30℃培养2d。
刮取菌株FJAT-13741的菌落，用10mL超纯水分散均匀，将样品装25mL的聚氟乙烯反应釜中，180℃反应10h，自然冷却，用0.22μm的尼龙过滤头过滤，用1000Da透析24h，每隔8h换一次水。透析袋内溶液即为碳量子点溶液，得到的碳量子点即为CDs-C。
2.结构表征
(1)透射电镜扫描：采用HITACHI HT7700对碳量子点的形貌进行分析，用3％戊二醛固定样品后，用磷酸盐缓冲液洗涤三次后制作铜网底片，再用1％的磷钨酸染色，干燥后采用透射电子显微镜观察，电压为80Kv。
(2)红外光谱分析：采用德国布鲁克公司傅立叶红外光谱仪，利用溴化钾压片法对所制备的量子点在波长范围400～4000cm-1范围内进行测试。
3.荧光分光光度分析
采用Horiba公司的Fluoromax-4荧光光谱仪进行荧光测定，狭缝为2nm。
4.实验结果
(1)红外光谱分析
碳量子点的红外光谱分析如图3所示。3425cm-1处的吸收峰为-OH伸缩振动，3159cm-1处的吸收峰为-NH2伸缩振动，1637cm-1为C＝O的伸缩振动，1397cm-1，1121cm-1和1058cm-1处的吸收峰为C-O-C伸缩振动，说明碳量子点表面富含大量的羧基和羟基，表明碳量子点具有很强的亲水性。这些基团对CDs-C的改性和应用起到重要的作用，大量的羧基和羟基使得其具有极强的溶解性，冻干后极易吸潮。
(2)紫外光谱分析
碳量子点CDs-C的紫外吸收光谱如图4所示，碳量子点CDs-C在235nm处有最大吸收峰。
(3)透射分析
碳量子点CDs-C的透射电镜图如图5所示，碳量子点CDs-C的粒度分布窄，单分散性好，平均直径为3nm，为非结晶性物质。
(4)荧光分析
图6是碳量子点在365nm紫外灯照射下的荧光，可以看出，碳量子点具有荧光性。其最大激发/发射波长分别为360nm/450nm，在360nm光的激发下可发射出450nm的荧光，如图7a所示；CDs-C随着激发波长的增大，其荧光发射峰从430nm红移至470nm，发射峰强度先增大后减小，如图7b所示，其发射具有明显的波长依赖性。
实施例2
从-80℃冰箱取菌株FJAT-13741冻存管，待其回温到室温，于超净台内划线于MRS培养基平板上，倒置于生物培养箱30℃培养2d。刮取菌株FJAT-13741的菌落，用10mL超纯水分散均匀，将样品装25mL的聚氟乙烯反应釜中，170℃反应10h，自然冷却，用0.22μm的尼龙过滤头过滤，用1500Da透析18h，每隔6h换一次水。透析袋内溶液即为碳量子点CDs-C溶液。
实验结果显示，制得的碳量子点的直径3±1nm，荧光发射峰在430-470nm。制成的碳量子点溶液可喷洒于植物上，用于植物病原菌的防治。
实施例3
从-80℃冰箱取菌株FJAT-13741冻存管，待其回温到室温，于超净台内划线于MRS培养基平板上，倒置于生物培养箱30℃培养2d。刮取菌株FJAT-13741的菌落，用10mL超纯水分散均匀，将样品装25mL的聚氟乙烯反应釜中，190℃反应6h，自然冷却，用0.22μm的尼龙过滤头过滤，用1000Da透析24h，每隔8h换一次水。透析袋内溶液即为碳量子点CDs-C溶液。
实验结果显示，制得的碳量子点的直径3±1nm，荧光发射峰在430-470nm。制成的碳量子点溶液可喷洒于植物上，用于植物病原菌的防治。
综上所述，本发明以乳杆菌为碳源，采用一种工艺简单、制备成本低、绿色环保的水热法制备了荧光碳量子点。该量子点具有丰富的羟基和羧基，可能是由于乳杆菌可产乳酸，乳酸是一种含有羟基的羧酸。乳杆菌制备的碳量子点对青枯雷尔氏菌和地毯草黄单胞菌均具有抑制作用，获得的量子点CDs-C为液体，也可制成粉末，便于调配合适的浓度喷洒于植物上，用于植物细菌病害的防治。
需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。
Claims (3)
1.一种乳杆菌来源的碳量子点的制备方法，其特征在于：所述的制备方法是以乳杆菌为碳源，采用水热法来制备碳量子点，包括以下步骤：
出发菌株活化：将乳杆菌划线于固体培养基平板上，30-35℃倒置培养2-3天；所述的乳杆菌为干酪乳杆菌FJAT-13741，学名Lactobacillus casei FJAT-13741，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号 CCTCC M 2018901，保藏日期为2018年12月17日，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山武汉大学保藏中心；
碳量子点的制备：刮取乳杆菌菌落用超纯水分散均匀，置于聚氟乙烯反应釜中，170-190℃反应6-10 h，冷却后用0.22 µm的尼龙过滤膜过滤；然后用1000 -1500Da透析袋透析18-24h，每隔6-8 h换一次水；所得溶液即为乳杆菌来源的碳量子点溶液。
2.一种乳杆菌来源的碳量子点，其特征在于：所述的碳量子点是由权利要求1所述的制备方法制得的，所述的碳量子点的直径3±1nm，荧光发射峰在430-470 nm。
3.一种如权利要求2所述的乳杆菌来源的碳量子点在防治青枯雷尔氏菌和地毯草黄单胞菌中的应用。
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