CN107418566A - 一种碳量子点的制备方法及其在生物膜成像上的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术与纳米材料领域。本发明提供了一种碳量子点的制备方法及其在生物膜成像上的应用。以植物乳杆菌发酵液为原料，利用水热反应一步制备出碳量子点。该碳量子点制备工艺简单、成本较低、绿色环保且易于实现。所制备碳量子点量子产率可达12％，具有较强的光稳定性、良好的水溶性等优点，并可用于生物膜微生物成像。相比于已商业化的生物膜微生物染料，该碳量子点的生物膜微生物成像过程，具有无需避光、孵育时间短、免清洗、可长时间成像观察和不破坏生物膜的优势，并且可同时进行红色和绿色双通道成像。

Description

一种碳量子点的制备方法及其在生物膜成像上的应用
技术领域
本发明属于纳米材料与生物技术领域，具体涉及一种以植物乳杆菌发酵液为原料的碳量子点制备方法，以及该碳量子点在微生物生物膜成像上的应用。
背景技术
生物膜是由胞外多糖、蛋白质以及核酸甚至是脂质等胞外聚合物组成的致密的网状结构。生物膜的形成是一个动态的过程，主要包括以下四个阶段：微生物可逆性粘附的定殖阶段、不可逆性粘附的集聚阶段、生物被膜的成熟阶段和微生物的脱落与再定植阶段。生物膜无处不在，涉及人类生存的各个方面，生物膜一旦形成就会造成食品、医药用品以及食品、医药加工环境、设备的交叉污染。生物膜的形成增加了微生物抵抗不良环境的能力，使其不容易被消除，这也是细菌引起感染难以治愈的重要原因。例如，细菌可在人体组织如皮肤、牙齿、牙龈、尿道、肺及其它器官的表面形成生物膜，引起诸如支气管炎、牙周炎、慢性前列腺炎、心瓣膜性心内膜炎等疾病。此外细菌还能黏附到有些医疗器械的材料表面及与人类健康相关的设施表面并形成生物膜，由此造成流行性传染病。由于其极大的危害性，生物膜已经成为全球关注的热点，因此研究生物膜的形成机制以及生物膜是如何发挥作用的，对有害微生物的控制以及消除起着至关重要的作用。
联合荧光探针的激光共聚焦法成为研究生物膜结构、组成以及动态过程的有力工具。它可以实现活体的、实时的、含水生物膜在不被破坏的情况下的观察，并能够3D成像。因此，开发具有良好生物相容性、荧光稳定性、孵育时间短、成像时间长并且可以实时原位检测的荧光标记探针是非常必要的。传统染料往往染色时间较长、荧光不稳定、长时间观察容易淬灭、染色后需要清洗才能观察，并且在染色时破坏生物膜的结构。最近十几年以来，各类具有优异性能的碳纳米材料(如碳纳米管、碳纳米纤维、碳纳米球、碳量子点、石墨烯和富勒烯等)引起了人们的广泛关注。其中，碳量子点由于其优良的特性以及合成方法的简便性，自发现以来一直是材料领域的研究热点。同时，在制备碳量子点过程中可以参杂其他成分，制得的量子点量子产率较高，在细胞成像以及载药方面的应用更大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以植物乳杆菌发酵液为原料制备碳量子点的方法，并将其作为荧光探针，用于生物膜成像，解决传统商业生物膜染料成本高、需要清洗、孵育时间长、破坏生物膜等问题，提供了一种价格低廉、操作方便的生物膜染料。
本发明以植物乳杆菌发酵液为原料，利用水热法一步制备出具有优良性能的碳量子点。透射电子显微镜结果表明该碳量子点尺寸分布均匀、平均尺寸在1.6nm左右、且具有良好的分散性和光稳定性。同时植物乳杆菌发酵液制备方便，发酵时间短，成本低廉。生物膜成像实验表明，该碳量子点对生物膜具有良好的成像效果，无需孵育，无需避光，免清洗，是一种性能优良的新型生物膜染料。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种碳量子点的制备方法，包括以下步骤：
(1)将植物乳杆菌接种于培养基中，静止培养，获得植物乳杆菌发酵液；
(2)将步骤(1)得到的发酵液加入水热反应釜中，置于烘箱中进行水热反应；将获得的浅棕色液体与大颗粒杂质分离，并用0.22um滤膜进行过滤，获得碳量子点溶液。
优选地，所述培养基为液体MRS培养基。
优选地，所述植物乳杆菌从云南泡菜分离得到，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，菌株号为LCC-605，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编430072。保藏编号为CCTCC NO:M 2016491，在NCBI上的登录号为：KX443590，保藏日期为2016年9月18日，该菌株已申请中国专利201710025113.0。
优选地，所述步骤(1)中植物乳杆菌按体积比1～3％进行接种，培养温度25～42℃，培养时间12～24h。
优选地，所述步骤(2)中反应温度为120～240℃，反应时间为12～48h。
更优选地，所述步骤(2)中反应温度为200℃，反应时间为24h。
由于发酵液本身含水，所以上述步骤(2)无需额外加水。
上述任一所述的制备方法制备得到的碳量子点。
上述任一所述的制备方法制备得到的碳量子点在微生物生物膜成像中的应用。
其中，将所述微生物生物膜用上述制备方法中步骤(2)得到的碳量子点溶液进行染色，染色后用激光共聚焦显微镜进行观察。
优选地，所述微生物生物膜包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、希瓦氏菌或里氏木霉生物膜。
优选地，所述碳量子点溶液的浓度为0.1～10mg/mL。
优选地，所述碳量子点溶液的浓度为6mg/mL。
有益效果：本发明利用水热法一步完成了碳量子点的合成，制得的碳量子点具有良好的水溶性和光稳定性，及优异的生物膜成像特性。
具体而言，本发明方法制备的碳量子点相对于现有技术，具有以下突出的优势：
(1)本发明操作步骤简单，不需要经过表面钝化剂处理或修饰即可得到碳量
子点，可大量制备。
(2)本发明只需以植物乳杆菌发酵液为原料，易于获得，价格便宜且绿色环保。
(3)本发明所制得的目标碳量子点在水溶液中具有良好的溶解度和分散性。
(4)目标碳量子点紫外光光照下稳定，受温度、pH影响较小。
(5)目标碳量子点的量子产率较高，以硫酸奎宁(量子产率54％)为参比物质，所得碳量子点的量子效率为12％。
(6)目标碳量子点能够很好的用于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生物膜成像，表现出孵育时间短、无需避光、免清洗、染色后可以长时间观察以及不破坏生物膜等优势。
附图说明
图1为实施例3中碳量子点的透射电镜示意图。
图2为实施例3中碳量子点的粒径分布示意图。
图3为实施例4中碳量子点的红外光谱示意图。
图4为实施例5中碳量子点的zeta电位结果示意图。
图5为实施例6中碳量子点的荧光图谱以及荧光成像示意图。
图6为实施例8中碳量子点对培养5d的大肠杆菌生物膜染色的激光共聚焦观察结果，激发波长为488nm(从左到右依次为荧光场、明场和二者融合场)。
图7为实施例8中碳量子点对培养5d的大肠杆菌生物膜染色的激光共聚焦观察3D图，激发波长为488nm。
图8为实施例9中碳量子点对培养5d的金黄色葡萄球菌生物膜染色的激光共聚焦观察结果，激发波长为488nm(从左到右依次为荧光场、明场和二者融合场)。
图9为实施例9中碳量子点对培养5d的金黄色葡萄球菌生物膜染色的激光共聚焦观察3D图，激发波长为488nm。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1植物乳杆菌发酵液的制备
将甘油管保藏的植物乳杆菌LCC-605按体积比为1～3％比例接种于液体MRS培养基中，置于25～42℃静止培养12～24h，获得的发酵液备用。
实施例2碳量子点溶液的制备
取30mL实施例1制备的发酵液置于100mL的水热反应釜中。放于烘箱中120～240℃，反应12～48h，具体反应条件见表1。反应结束后去除残渣，剩余液体过滤备用。当反应温度为200℃，反应时间为24h时，所得碳量子点的量子产率为12％。
表1不同反应条件下碳量子点的制备
序号 反应温度(℃) 反应时间(h)
1 120 48
2 200 24
3 240 12
量子产率的测定方法：
测定待测碳量子点溶液和参比物质硫酸奎宁的吸光度，测定待测碳量子点溶液和硫酸奎宁在同一激发波长下的荧光强度，然后按下式计算待测碳量子点的荧光量子产率。
Yu＝Ys·(Fu/Fs)·(As/Au)
式中，Yu和Ys分别表示待测物质和参比物质的荧光量子产率，Fu和Fs分别表示待测物质和参比物质的荧光强度，Au和As分别表示待测物质和参比物质对该波长激发光的吸光度。
实施例3碳量子点的透射电镜观察
实施例2制备的碳量子点的透射电镜观察：将过滤好的碳量子点溶液用去离子水稀释10倍，取10uL滴在400目的铜网上，用透射电镜(JEM-2100,JEOL Ltd.,Japan)进行观察。结果显示该碳量子点近似球形结构(图1)，分布均匀，平均粒径约为1.6nm(图2)。
实施例4碳量子点的红外光谱扫描
将实施例2制备的碳量子点冻干，采用FTIR(Nicolet iS50,Thermo Scientific,USA)进行检测，结果见图3，该碳量子点含有N-H，C-H，C＝O，C-N和C-O-C。
实施例5碳量子点的zeta电位检测
将实施例2制备的碳量子点置于zeta电位检测池中，利用DLS仪对其电位进行检测，检测结果如图4所示，结果显示该碳量子点带负电。
实施例6碳量子点的荧光光谱扫描及紫外光下的成像
将实施例2制备的碳量子点进行荧光光谱扫描及紫外光下成像：激发波长选择300～600nm范围，每隔40nm测定一次发射波长及荧光强度。结果如图5，该碳量子点在紫外光照射下，发出蓝紫色荧光，荧光发射光谱具有激发波长依赖性，随着激发波长的增加(300～520nm)，发射波长的峰值从342偏移至544nm。
实施例7生物膜的制备
(1)菌株来源：E.coli DH5α(大肠杆菌)来源于中国工业菌种保藏中心(CICC,Beijing,China)，S.aures ATCC 29213(金黄色葡萄球菌)购于美国组织培养库ATCC(Manassas,VA,USA)。
(2)将上述细菌置于LB培养基中37℃，180rpm过夜。之后将细菌以体积比1:100的比例接种于稀释10倍的LB培养基中，然后以100uL/孔的接种量转接到普通96孔激光共聚焦专用培养板中或者以2mL/皿的接种量转接到玻璃底的激光共聚焦细胞培养皿中，置于28℃静止培养1～5d。
实施例8碳量子点在大肠杆菌生物膜成像中的应用
将实施例7培养5d制备得到的大肠杆菌生物膜用PBS缓冲液清洗3次后，用6mg/mL的碳量子点溶液进行染色，立即采用激光共聚焦显微镜(TCS SP8,Leica,Germany)进行观察。激发波长为488nm，检测500～565nm的发射。结果见图6、图7，该碳量子点可以用于大肠杆菌生物膜成像。
实施例9碳量子点在金黄色葡萄球菌生物膜成像中的应用
将实施例7培养5d制备得到的金黄色葡萄球菌生物膜用PBS缓冲液清洗3次后，用6mg/mL的碳量子点溶液进行染色，立即采用激光共聚焦显微镜(TCS SP8,Leica,Germany)进行观察。激发波长为488nm，检测500～565nm的发射。结果见图8、图9。该碳量子点可以用于金黄色葡萄球菌生物膜成像。
实施例10碳量子点在绿脓杆菌生物膜成像中的应用
生物膜的制备方法同实施例7，生物膜的成像方法同实施例8，不同的是生物膜为绿脓杆菌生物膜，使用0.1mg/mL的碳量子点进行染色。该碳量子点可以用于绿脓杆菌生物膜成像。
实施例11碳量子点在希瓦氏菌生物膜成像中的应用
生物膜的制备方法同实施例7，生物膜的成像方法同实施例8，不同的是生物膜为希瓦氏菌生物膜，使用10mg/mL的碳量子点溶液进行染色。该碳量子点可以用于希瓦氏菌生物膜成像。
实施例12碳量子点在里氏木霉生物膜成像中的应用
生物膜的制备方法同实施例7，生物膜的成像方法同实施例8，不同的是生物膜为里氏木霉生物膜，使用6mg/mL的碳量子点进行染色。该碳量子点可以用于里氏木霉生物膜成像。

Claims (10)

1.一种碳量子点的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将植物乳杆菌接种于培养基中，静止培养，获得植物乳杆菌发酵液；
(2)将步骤(1)得到的发酵液加入水热反应釜中，置于烘箱中进行水热反应，过滤获得碳量子点溶液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述培养基为液体MRS培养基。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCTCC NO:M 2016491。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中植物乳杆菌按体积比1～3％进行接种，培养温度25～42℃，培养时间12～24h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中反应温度为120～240℃，反应时间为12～48h。
6.权利要求1-5任一所述的制备方法制备得到的碳量子点。
7.权利要求6所述的碳量子点在微生物生物膜成像中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将所述微生物生物膜用碳量子点溶液进行染色，染色后用激光共聚焦显微镜进行观察。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述微生物生物膜包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、希瓦氏菌或里氏木霉生物膜。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述碳量子点溶液的浓度为0.1～10mg/mL。
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