CN113830750B - 一种兼有抗菌及抗氧化活性野老鹳草碳点的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种兼有抗菌及抗氧化活性野老鹳草碳点的制备方法,包括如下步骤:以野老鹳草地上部分粉末为原料,采用水热法合成目标碳点。本发明制得的具有荧光特性的野老鹳草碳点,相对于同质量的水提液法具有明显的抗菌活性及抗氧化活性和稳定性,而且没有明显的细胞毒性,可应用于抑菌洗化产品、食品保鲜及化妆品等多个研究领域。
Description
技术领域
本发明涉及纳米发光材料制备领域,尤其涉及一种兼有抗菌及抗氧化活性野老鹳草碳点的制备方法。
背景技术
碳量子点,又称碳点或碳纳米点,由于其具有良好的亲水性、稳定性、耐光性和生物相溶性,对机体毒性低,且表面容易功能化,是最具前景的新一代碳纳米材料,已被广泛应用于生物医药相关的各个研究领域。目前,碳量子点的制备方法主要有水热法、煅烧法、微波法和电化学法等。但是现有技术中制备出的碳量子点不具有明显的抗菌活性及抗氧化活性。
野老鹳草为牻牛儿苗科植物野老鹳草干燥的地上部分,具有“祛风除湿、舒筋活络”之功效。野老鹳草原产于美洲,我国为逸生,常见于荒地、田园、路边和沟边,全国多个省份均有分布。由于野老鹳草对环境适应能力强,生长速度快,一旦田间发生草害,会严重影响农作物的产量和品质,因此,野老鹳草通常被认为是一种有害的杂草。在临床上,野老鹳草主要用于治疗风湿痹痛,肢体麻木,筋骨酸痛等症,是一种相当有开发利用价值的药用植物。
发明内容
针对上述的技术问题,本发明提出一种兼有抗菌及抗氧化活性野老鹳草碳点的制备方法,所制备的碳点具有明显的抗菌活性及抗氧化活性,且该碳点制备方法简单,碳点的稳定性良好,具有良好的荧光特性和生物相溶性。
为了达到上述目的,本发明的技术方案是这样实现的:
一种兼有抗菌及抗氧化活性野老鹳草碳点的制备方法,包括如下步骤:以野老鹳草地上部分粉末为原料,采用水热法合成反应;将反应生成物通过高速离心获取野老鹳草碳点溶液;野老鹳草碳点溶液经过滤、透析、干燥后制得。
优选地,所述野老鹳草地上部分粉末是将干燥野老鹳草地上部分用粉碎机打磨成粉状后过筛制得。
优选地,所述水热法的具体步骤为取少量野老鹳草地上部分粉末,加入蒸馏水,充分混匀后于高温反应釜中密闭反应,得反应生成物。
优选地,所述水热法的反应温度为160℃~220℃,反应时间为6~10 h。
优选地,将所述反应生成物高速离心后,所得上清液为老鹳草碳点溶液。
优选地,所述老鹳草碳点溶液经滤膜过滤、蒸馏水透析后,于低温冷冻干燥仪中干燥,得到野老鹳草碳点。
优选地,所述野老鹳草碳点具有球形结构。
优选地,所述野老鹳草碳点的平均粒径为3~5 nm。
本发明的有益效果:
1. 本发明野老鹳草碳点的制备方法具有过程简单、操作方便,且无污染,低能耗的特点;
2. 所制备的野老鹳草碳点相比于同质量野老鹳草水提液具有更强的抗菌活性、抗氧化活性、稳定性和较低的细胞毒性;
3. 基于野老鹳草碳点的上述性能,本发明所获得的碳点可应用于抑菌洗化产品、食品保鲜及化妆品等领域。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1不同温度条件下制备野老鹳草碳点的荧光光谱;
图2为实施例2的相同温度(220℃)下不同时间制备野老鹳草碳点的荧光光谱;
图3为实施例2的野老鹳草碳点与相同质量野老鹳草水浸液紫外-可见吸收光谱图;
图4为实施例2的野老鹳草碳点的红外光谱图;
图5为实施例2的野老鹳草碳点TEM形态图;
图6为实施例2的不同浓度野老鹳草碳点对ABTS自由基的清除率;
图7为实施例2的不同浓度野老鹳草碳点对DPPH自由基的清除率;
图8为实施例2的不同浓度野老鹳草碳点对超氧阴离子的清除率;
图9为实施例2的不同浓度野老鹳草碳点对羟基自由基的清除率;
图10为实施例2的不同浓度野老鹳草碳点对A549细胞存活率。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明的所述的一种兼有抗菌及抗氧化活性野老鹳草碳点的制备方法,包括如下步骤:以野老鹳草地上部分粉末为原料,该野老鹳草地上部分粉末是将干燥野老鹳草地上部分用粉碎机打磨成粉状后过80目筛子制得,然后将原料先采用水热法反应即在原料加入蒸馏水,充分混匀后于高温反应釜中密闭反应,反应温度为160℃~220℃,反应时间为6~10h,得反应生成物;然后将所述反应生成物高速离心后,所得上清液为老鹳草碳点溶液;再将老鹳草碳点溶液经滤膜过滤、蒸馏水透析后,于低温冷冻干燥仪中干燥,得到野老鹳草碳点。
所述野老鹳草碳点具有球形结构,平均粒径为3~5 nm。
所得的野老鹳草碳点经紫外光谱、红外光谱、荧光光谱及扫描电镜表征鉴定后,对所得的野老鹳草碳点的抗菌及抗氧化活性进行测定。
实施例1:
称取0.1克野老鹳草粉末于15 mL去离子水中,于超声仪中超声30 min,随后将混合液加入到25 mL聚四氟乙烯内衬的反应釜中于160℃~220℃温度下反应8 h。待反应物冷却至室温后,反应液于8000 rpm离心15 min。上清液经0.22 μm的微孔滤膜过滤后,用1 kDa透析袋于4℃下透析12 h,透析产物于真空冷冻干燥后备用。
如图1所示,与同质量野老鹳草水浸液相比,在370 nm波长激发下,反应液在437nm处的荧光强度明显增强,其中在220℃反应条件下,荧光强度最强。
该实施例制备得到的野老鹳草碳点进行抗菌活性研究:
(1)抑菌圈的测定
采用纸片扩散法,选取具有代表性的革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌作为实验菌株,探究野老鹳草碳点的抑菌能力。首先将培养稀释后的菌液(1.5×106 CFU/mL)均匀涂布于固体培养基上,待菌液完全风干后,用无菌镊子在超净工作台中将含有不同制备方法所制备碳点的滤纸片放于培养基上并轻轻按压,使滤纸片贴紧固体培养基;然后用封口膜密封后,于37℃恒温培养箱中培养16 h。取同质量浓度的野老鹳草水浸液为对照,培养结束后,测量抑菌圈大小。
结果如表1和表2所示,不同温度下所制备的野老鹳草碳点均具有一定的抑菌活性,相比而言,220℃所获得的野老鹳草碳点具有更强的抑菌活性,不仅对金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用,而且对大肠杆菌也有一定的抑菌活性。而在此反应温度下,随着反应时间的延长,碳点的综合抑菌能力下降,因此野老鹳草碳点最佳制备条件为220℃条件下,将野老鹳草粉末水浸液反应8 h。
表1 不同温度条件下制备野老鹳草碳点的抑菌圈
表2 相同制备温度(220℃)下不同制备时间野老鹳草碳点的抑菌圈
(2)最低抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定
为了进一步测定最佳制备条件下野老鹳草碳点的抗菌活性,采用微量倍比稀释法在96孔板上对碳点的最低抑菌浓度和最小杀菌浓度进行了测定。首先将含在不同浓度野老鹳草碳点的菌液放置于37℃培养16~18 h;取出96孔板后,每孔加入25 μL氯化三苯基四氮唑(5mg/mL),再置于37℃培养2~4 h观察结果。根据96孔中的颜色进行判断,若接种细胞的孔呈红色,表明有细菌生长,若无颜色变化,表示无细菌生长,其最小浓度即为最低抑菌浓度。将检测最低抑菌浓度中未见细菌生长孔的培养物均匀涂布于固体培养基上,置37℃培养24 h,以平板上菌落数小于5的最小稀释浓度即为最小杀菌浓度。结果表明,220℃条件下,反应8h所获得的野老鹳草碳点对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为625 μg/mL,最小杀菌浓度为5.0 mg/mL,对大肠杆菌的最低抑菌浓度为2.5 mg/mL,最小杀菌浓度为2.5 mg/mL。
实施例2:
称取0.1克野老鹳草粉末于15 mL去离子水中,于超声仪中超声30 min,随后将混合液加入到25 mL聚四氟乙烯内衬的反应釜中于220℃下反应6-14 h。待反应物冷却至室温后,反应液于8000 rpm离心15 min。上清液经0.22 μm的微孔滤膜过滤后,用1 kDa透析袋于4℃下透析12 h,透析产物于真空冷冻干燥后备用。
如图2所示,在370 nm激发下,220℃制备温度下反应8 h后所获得的野老鹳草碳点荧光强度最强。如图3所示,与同质量野老鹳草水浸液相比,220℃,8 h条件下所制备的野老鹳草碳点在200 nm~400 nm波长处的吸收有明显变化,表明野老鹳草碳点制备成功。如图4所示,红外光谱鉴定表明,野老鹳草碳点含有羟基(3403 cm-1为-OH的伸缩振动)和羧基(2931 cm-1为C-H伸缩振动,1593 cm-1和1403 cm-1为COO-的反对称和对称伸缩振动,1076cm-1为C-O-C的伸缩振动)。如图5所示,TEM分析表明,野老鹳草碳点呈规则的圆球形,其粒径最大约为6 nm,最小约为2 nm,大多数碳点的粒径为2~4 nm,表明所制备的野老鹳草碳点的粒径较为均一。
该实施例制备得到的野老鹳草碳点进行抗菌活性研究:
(1)清除ABTS自由基测定:
配ABTS储备液(称取ABTS固体0.0384 g,过硫酸钾固体0.01324 g,溶于去离子水,定容至100 mL),于室温、避光条件下放置12~16 h。取适量的ABTS储备液,用去离子水稀释至溶液在734 nm处的吸光值为0.7左右,即为ABTS工作液,然后加入不同浓度的野老鹳草碳点溶液,于室温、避光处反应10 min,随后测定734 nm处的吸光值,用下列公式计算清除率,以Vc溶液作阳性对照。
清除率/% =(A-A0)/A0×100%
式中:A表示样品溶液的吸光度;A0表示未加样品时ABTS溶液的吸光度。
如图6所示,Vc清除ABTS自由基的IC50值为2.08 μg/mL,野老鹳草水浸液的IC50值估算约为58.64 μg/mL,而野老鹳草碳点的IC50值为11.63 μg/mL。
(2)清除DPPH自由基测定:
配制DPPH测试液(称取DPPH固体0.0246 g,溶于100 mL 95%乙醇中,超声5 min,充分混匀),然后用95%乙醇稀释至其517 nm处的吸光值在0.7~0.9之间,然后加入不同浓度的野老鹳草碳点溶液,于室温、避光处反应5 min,随后测定517 nm处的吸光值,用下列公式计算清除率,以Vc溶液作阳性对照。
清除率/% = (A-A0)/A0×100%
式中:A表示样品溶液的吸光度;A0表示未加样品时DPPH溶液的吸光度。
如图7所示,Vc清除DPPH自由基的IC50值为2.55 μg/mL,野老鹳草水浸液的IC50值估算约为49.36 μg/mL,而野老鹳草碳点的IC50值为14.39 μg/mL。
(3)清除超氧阴离子的测定:
首先测定邻苯三酚自氧化速率V0:在试管中加5 mL Tris-HCI缓冲液(50 mmol/L,pH=8.2),然后加入2 mL蒸馏水,于25℃恒温水浴中放置20 min,再加入0.5 mL邻苯三酚溶液(0.3 mmol/L),充分混匀后立即倒入比色皿中测定325 nm处的吸光度,每反应30 s记录一组,共反应5 min,以吸光度和反应时间为指标作回归分析,斜率即为邻苯三酚自氧化速率V0。
样品清除超氧阴离子速率V1的测定:在试管中加5 mL Tris-HCI缓冲液(50 mmol/L,pH=8.2),然后加入1.8 mL蒸馏水及0.2 mL不同浓度的野老鹳草碳点溶液,于25℃恒温水浴中放置20 min,再加入0.5 mL邻苯三酚溶液(0.3 mmol/L),充分混匀后立即倒入比色皿中测定325 nm处的吸光度,每反应30 s记录一组,共反应5 min,以吸光度和反应时间为指标作回归分析,斜率即为样品清除超氧阴离子速率V1。根据以下公式,计算清除率,以VC溶液作阳性对照。
清除率/%=(V1-V0)/V0× 100%
如图8所示,Vc清除超氧阴离子的IC50值为0.12 mg/mL,野老鹳草水浸液的IC50值估算约为49.19 mg/mL,而野老鹳草碳点的IC50值为1.63 mg/mL。
(4)清除羟自由基的测定:
在试管中分别加入2 mL的磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L,pH=7.4),0.3 mL邻菲罗啉溶液(5 mmol/L),充分混匀后,加入0.2 mL FeSO4溶液(7.5 mmol/L),立即混匀后加入不同浓度的野老鹳草碳点溶液;充分混匀后,加入1% H2O2溶液1 mL,用蒸馏水补充总体积至8 mL,于37 ℃下保温1 h,测在536 nm下的吸收度(A2)。另外以不加样品溶液的吸光度为A1,不加H2O2溶液的吸光度为A0,根据以下公式,计算清除率,以Vc溶液作阳性对照。
清除率%=(A2-A0)/(A1-A0) × 100%
如图9所示,Vc清除羟基自由基的IC50值为0.15 mg/mL,野老鹳草水浸液的IC50值估算约为62.45 mg/mL,野老鹳草碳点的IC50值为2.21 mg/mL。
上述研究结果表明:本研究所制备的碳点具有非常优异的抗氧化性能,而且抗氧化性能相对于野老鹳草水浸液大大提升。
稳定性:将所制备的野老鹳草碳点密封贮存于4℃冰箱,并于保存时间15天和30天后,分别测定其抗氧化活性,结果如表3所示,在此贮存条件下,与新鲜制备的野老鹳草碳点相比,保存后的野老鹳草碳点仍具有良好的抗氧化活性。
表3 野老鹳草碳点保存不同时间抗氧化活性的稳定性
细胞毒性:将不同浓度的野老鹳草碳点与A549细胞共培养,考察野老鹳草碳点的细胞毒性,结果如图10所示,野老鹳草碳点在1.0 mg/mL浓度范围内,A549细胞仍保持95%以上的细胞存活率,表明所制备的野老鹳草碳点具有较低的细胞毒性,适合用于食品保鲜及化妆品等产品的开发及利用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种兼有抗菌及抗氧化活性野老鹳草碳点的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
以野老鹳草地上部分粉末为原料,采用水热法反应;
将反应液通过高速离心获取野老鹳草碳点溶液;
野老鹳草碳点溶液经过滤、透析、干燥后制得;
所述水热法的具体步骤为取少量野老鹳草地上部分粉末,加入去离子水,于超声仪中超声30 min,充分混匀后于高温反应釜中密闭反应,得反应生成物。
2.根据权利要求1所述的兼有抗菌及抗氧化活性野老鹳草碳点的制备方法,其特征在于,所述野老鹳草地上部分粉末是将干燥野老鹳草地上部分用粉碎机打磨成粉状后过筛制得。
3.根据权利要求1或2所述的兼有抗菌及抗氧化活性野老鹳草碳点的制备方法,所述水热法的反应温度为160℃~220℃,反应时间为6~10 h。
4.根据权利要求3所述的兼有抗菌及抗氧化活性野老鹳草碳点的制备方法,其特征在于,将所述反应生成物高速离心后,所得上清液为老鹳草碳点溶液。
5.根据权利要求4所述的兼有抗菌及抗氧化活性野老鹳草碳点的制备方法,其特征在于,所述老鹳草碳点溶液经滤膜过滤、蒸馏水透析后,于低温冷冻干燥仪中干燥,得到野老鹳草碳点。
6.根据权利要求1或2或4或5所述的兼有抗菌及抗氧化活性野老鹳草碳点的制备方法,其特征在于,所述野老鹳草碳点具有球形结构。
7.根据权利要求6所述的兼有抗菌及抗氧化活性野老鹳草碳点的制备方法,其特征在于,所述野老鹳草碳点的平均粒径为3~5 nm。
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