CN116077559B - 一种仙鹤草碳点及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种仙鹤草碳点及其制备方法和应用。该仙鹤草碳点的制备方法，包括：对仙鹤草进行水提处理，获得仙鹤草水提液；将仙鹤草水提液进行水热反应，收集反应产物，得到仙鹤草碳点。本发明提供的仙鹤草碳点的制备方法，首先获得仙鹤草水提液，然后再进行水热处理，所获得的仙鹤草碳点对于乳腺肿瘤细胞具有显著的杀伤效果，优于仙鹤草水提液以及以仙鹤草粉末为原料获得的仙鹤草碳点。

Description

一种仙鹤草碳点及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种仙鹤草碳点的制备方法和应用，属于生物医药技术领域与纳米材料科学技术领域。

背景技术

乳腺肿瘤是母犬临床常见肿瘤之一，发病率可高达25%～42%，是人类乳腺肿瘤发病率的三倍。目前，手术切除是治疗犬乳腺肿瘤最常见的方式，其次是放疗和化疗。然而，传统手术切除疗法对犬创伤大，术后并发症多且易引起肿瘤细胞的转移。放射疗法对犬有明显的生理毒性，而化学疗法则对正常细胞产生较大伤害。

仙鹤草是蔷薇科植物龙牙草的地上部分，其主要成分为仙鹤草酚、仙鹤草内酯及有机酸等。近年来许多研究发现，仙鹤草可以通过诱导癌细胞加速凋亡，直接杀伤癌细胞，拮抗抗癌物质，调节宿主免疫细胞等途径有效发挥抗乳腺肿瘤作用。因此，开展对仙鹤草的进一步研究，对其进行充分地开发，有效提高其对于犬乳腺肿瘤的治疗效果，更好地指导临床用药，是目前有待解决的问题。

发明内容

基于上述现状，本发明公开一种仙鹤草碳点的制备方法，通过首先制备仙鹤草水提液后再采用一步水热法，所获得的仙鹤草碳点较单纯的仙鹤草水提液，抗犬乳腺肿瘤药效有了很大的提升。本发明还提供采用上述制备方法制得的仙鹤草碳点以及该仙鹤草碳点的应用。

为实现上述目的，本发明第一方面提供一种仙鹤草碳点的制备方法，包括：

对仙鹤草进行水提处理，获得仙鹤草水提液；

将仙鹤草水提液进行水热反应，收集反应产物，得到仙鹤草碳点。

本发明提供的仙鹤草的制备方法，通过首先获得仙鹤草水提液，然后以仙鹤草水提液为原料进行水热反应，所获得的仙鹤草碳点对于犬乳腺肿瘤的抑制和杀伤效果远高于仙鹤草水提液。

本发明中，可采用中药领域常规的水提方式获得仙鹤草水提液。在较为优选的方式中，是将仙鹤草与水混合，煎煮一次或多次，每次至少30 min，对收集的粗提液进行过滤，从而获得仙鹤草水提液。

特别是，通过合理控制煎煮过程中的料液比和煎煮方式，更能够有利于提高仙鹤草碳点对于犬乳腺肿瘤的抑制和杀伤效果。在具体实施过程中，是将2-4重量份的仙鹤草浸没于20-200重量份的水中，先武火煮沸，再转文火煎，如此煎煮两次或更多次，每次30 min-60 min，将每次所获得的水煎液合并、过滤，获得仙鹤草水提液。为提高后续水热合成时的反应效率，在过滤前或过滤后，还可以进行浓缩，比如可以将水煎液浓缩至每1 mL粗提液含生药量100 mg左右再进行过滤；或者也可以先过滤，然后对获得的仙鹤草水提液进行浓缩处理。

不难理解，在加热之前，还可以首先将仙鹤草浸泡于水中至少30 min，比如30-60min，以利于仙鹤草中有效成分的充分溶出，然后再进行煎煮。

本发明中，对仙鹤草水提液实施的水热反应，具体可以是将仙鹤草水提液转移到反应釜中，于120-180℃下反应至少4小时，比如4-8小时。

水热反应完成后，待反应釜冷却至室温，取出反应釜中的反应产物，收集其中的仙鹤草碳点。具体的，可以先对反应产物进行离心处理，收集上清液；然后对上清液进行过滤，收集滤液；随后对滤液进行透析，收集保留液；最后对保留液进行干燥，得到仙鹤草碳点。

其中，上述离心处理，可以在10000-12000 g的离心力下进行，离心时间可根据反应产物的量调整，通常不低于10 min；收集上清液，然后用0.22 μm滤膜过滤，收集滤液；随后对滤液进行透析，采用MW:1000 Da透析袋，透析时间可控制在24小时或者更长，并且在透析过程中，每隔6-8小时换一次水；最后对收集的保留液进行干燥，比如可以采取冷冻干燥的方式，控制温度在零下40℃-零下60℃，冷冻时间为36-72小时，最终得到颗粒均匀的仙鹤草碳点。

本发明第二方面提供一种采用上述第一方面所述的制备方法所制得的仙鹤草碳点。

在高分辨透射电镜下观察本发明所提供的仙鹤草碳点，呈现为颗粒均匀、分散性良好的圆球状，粒径为2-6 nm，晶格间距为0.273 nm。

该仙鹤草碳点具有一般碳点材料的特点，如形貌为类球形或球形、颗粒尺寸小于10 nm、荧光激发依赖特性等。并且，仙鹤草碳点对犬乳腺肿瘤细胞具有非常显著的杀伤效果，远优于仙鹤草水提液对乳腺肿瘤细胞的抑制和杀伤作用，也优于以仙鹤草粉碎后的颗粒为原料制得的仙鹤草碳点对乳腺肿瘤细胞的抑制和杀伤作用。

本发明第三方面提供上述第二方面所述仙鹤草碳点的应用。

本发明中的仙鹤草碳点，不仅能够用于细胞成像，而且还可以用于制备抗乳腺肿瘤药物中。该乳腺肿瘤可以是犬乳腺肿瘤，也可以是人乳腺肿瘤、猫乳腺肿瘤。

本发明提供的仙鹤草碳点的制备方法，通过首先以仙鹤草为原料获得仙鹤草水提液，然后通过一步简单的水热合成获得仙鹤草碳点。与仙鹤草水提液相比，该仙鹤草碳点对犬乳腺肿瘤细胞的抑制和杀伤效果显著提高；与采用仙鹤草粉末为原料制得的仙鹤草碳点相比，本发明提供的仙鹤草碳点，对犬乳腺肿瘤细胞的抑制和杀伤效果也具有明显的优势。并且，该处理方法简单可行，非常利于实际推广和应用。

本发明提供的仙鹤草碳点，除了可以用于生物成像等领域外，还可以用于制备抗犬乳腺肿瘤乃至抗人、猫乳腺肿瘤的药物中。

附图说明

图1为本发明实施例1制得的仙鹤草碳点的高分辨透射电子显微镜图；

图2为本发明实施例1制得的仙鹤草碳点的红外光谱图；

图3为本发明实施例1制得的仙鹤草碳点的紫外可见吸收光谱图；

图4为本发明实施例1制得的仙鹤草碳点的荧光光谱图；

图5为CMT-U27细胞在不同浓度的仙鹤草水提液和仙鹤草碳点溶液中的存活情况图，其中a：各处理条件下的存活曲线、b：各处理条件下的IC50值；

图6为本发明实施例1制得的仙鹤草碳点的细胞荧光成像图。

实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例不是本发明全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例提供一种仙鹤草碳点的制备方法，包括如下步骤：

S1、取2-4 g仙鹤草，用20-200 mL蒸馏水浸泡30-60 min；先武火煮沸，再转文火煎，如此煎煮2次、每次30-60 min后合并滤液；滤网过滤2次，得到仙鹤草水提液，置于4℃冰箱保存备用。

S2、取20-40 mL步骤S1制得的仙鹤草水提液转移到50 mL反应釜中；随后将反应釜置于真空干燥箱中，反应温度为120-180℃，反应时间为4-8小时。

S3、待反应釜冷却至室温后，取出反应产物于10000-12000 g下离心约30 min；收集上清液用0.22 μm滤膜过滤；过滤后的液体于MW:1000 Da透析袋中透析24小时，每隔6-8小时换一次水；将透析后的液体置于冷冻干燥机内干燥，温度为-60℃，时间为36-72小时，得到仙鹤草碳点。

下面进一步列举具体实施例以详细说明本发明。应理解，下述具体实施例具体的工艺参数等仅是合适范围中的一个示例。

实施例1

S1、取20 g仙鹤草，用200 mL蒸馏水浸泡约30 min后；先武火煮沸，再转文火煎，武火和文火煎煮共30 min，如此煎煮两次，合并两次水煎液，浓缩成每1 mL含生药量100 mg的粗提液；滤网过滤2次，得到仙鹤草水提液，置于4℃冰箱保存备用。

S2、取30 mL步骤S1制得的仙鹤草水提液转移到50 mL反应釜中；随后将反应釜置于真空干燥箱中，反应温度约为160℃，反应时间为8小时。

S3、待反应釜冷却至室温后，取出反应产物于12000 g下离心30 min；收集上清液用0.22 μm滤膜过滤；过滤后的液体于MW:1000 Da透析袋中透析24小时，每隔约8小时换一次水；将透析后的液体置于冷冻干燥机内干燥，温度为-60℃，时间为72小时左右，得到仙鹤草碳点。

试验例1

在高分辨透射电子显微镜下观察实施例1制得的仙鹤草碳点的形貌，如图1左（a）和右（b）所示，该仙鹤草碳点为球形，颗粒非常均匀且具有良好的分散性，平均直径为2-6nm，晶格间距为0.273 nm。

试验例2

采用傅利叶红外光谱仪分析实施例1制备的仙鹤草碳点的表面结构，图2中3200-3500 cm^-1处的特征峰归因于O-H，1641cm^-1处的特征峰对应碳点结构中的C=C键。由此红外光谱图可知，该仙鹤草碳点的表面存在羟基、双键等特征官能团。

试验例3

将实施例1制备的仙鹤草碳点配制成碳点溶液，置于紫外可见分光光度计中扫描，如图3所示，该碳点溶液在355 nm附近存在吸收峰。

仙鹤草碳点在可见光下呈棕黄色，见图3中的插图I；仙鹤草碳点在365 nm紫外光下发出蓝色荧光，见图3中的插图II。

试验例4

将实施例1制备的仙鹤草碳点配制成碳点溶液，置于荧光光谱仪中，用380-540 nm的不同激发波长的光激发，如图4所示，发射波长随着激发波长的增加逐渐红移，说明仙鹤草碳点具有荧光激发依赖特性。

试验例5

将2 g的仙鹤草粉末与20 mL的水混合，搅拌均匀后转移到50 mL反应釜中，随后将反应釜置于真空干燥箱中，反应温度为160 ℃，反应时间为8小时。然后按照实施例1的步骤S3的工艺条件，获得仙鹤草碳点。

取实施例1中步骤S1获得的仙鹤草水提液和步骤S3中获得的仙鹤草碳点，以及本试验例中获得的仙鹤草碳点，分别配制成不同浓度的仙鹤草碳点溶液，与犬乳腺肿瘤细胞CMT-U27共孵育48小时后，用CCK-8试剂（Cell Counting Kit-8，细胞计数试剂）分别检测仙鹤草水提液及两种仙鹤草碳点溶液对CMT-U27细胞的杀伤作用，结果如图5所示。

为方便区分实施例1与本试验例中获得的仙鹤草碳点，将实施例1中获得的仙鹤草碳点记为仙鹤草碳点A，将本试验例中获得的仙鹤草碳点记为仙鹤草碳点B。同理，将由实施例1与本试验例中的仙鹤草碳点A/B配制成的溶液相应称为仙鹤草碳点溶液A与仙鹤草碳点溶液B。

由图5左（a）可知，随着仙鹤草碳点溶液A/B以及仙鹤草水提液浓度增大，CMT-U27细胞的存活率均呈明显下降趋势，说明仙鹤草碳点溶液和仙鹤草水提液对CMT-U27细胞均具有抑制和杀伤作用；在相同浓度下，CMT-U27细胞在仙鹤草碳点溶液A/B中的存活率明显低于仙鹤草水提液，说明仙鹤草碳点溶液A/B对于CMT-U27细胞的抑制和杀伤作用明显高于仙鹤草水提液；在浓度大于等于0.50 mg/mL的条件下，仙鹤草碳点溶液A/B对于CMT-U27细胞的抑制和杀伤作用近似，但是在浓度小于0.50 mg/mL的条件下，仙鹤草碳点溶液A对于CMT-U27细胞的抑制和杀伤作用明显优于仙鹤草碳点溶液B，说明采用实施例1的制备工艺所获得的仙鹤草碳点，对于犬乳腺肿瘤细胞的抑制和杀伤作用具有明显优势。

由图5右（b）可知，仙鹤草水提液的IC50为0.807 mg/mL，仙鹤草碳点溶液A的IC50为0.149 mg/mL，仙鹤草碳点溶液B的IC50为0.293 mg/mL，说明采用实施例1所获得的仙鹤草碳点对犬乳腺肿瘤细胞具有更为显著的抑制和杀伤效果。

试验例6

取实施例1制备的仙鹤草碳点，与乳腺肿瘤细胞共孵育进行活细胞成像。具体操作为：待细胞贴壁后，在培养基中加入浓度为20 mg/mL的碳点溶液5 μL，于37℃条件下与细胞共孵育，6小时后使用共聚焦显微镜下进行细胞成像，如图6所示，观察到细胞在405 nm激发波长下呈蓝色荧光。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (5)

1.一种仙鹤草碳点的制备方法，其特征在于，包括：

对仙鹤草进行水提处理，获得仙鹤草水提液；

将所述仙鹤草水提液进行水热反应，水热反应的温度为120-180℃，时间不低于4小时，收集反应产物，得到仙鹤草碳点；

其中，所述对仙鹤草进行水提处理，包括：

将2-4重量份的仙鹤草浸没于20-200重量份的水中，先武火煮沸，再转文火煎，煎煮至少两次，每次30-60 min；合并水煎液后浓缩、过滤，获得仙鹤草水提液；

所述收集反应产物，包括：

对反应产物进行离心处理，离心力为10000-12000 g，离心时间不低于10分钟，收集上清液；

采用0.22 μm的滤膜对上清液进行过滤，收集滤液；

采用截留分子量为1000 Da的透析袋对滤液进行透析，收集保留液，其中透析时间不低于24小时，且每隔6-8小时换一次水；

对保留液进行干燥，干燥温度为零下40℃-零下60℃，时间为36-72小时，得到所述仙鹤草碳点。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在煎煮之前，还包括：将仙鹤草在水中浸泡至少30 min。

3.权利要求1或2所述的制备方法制得的仙鹤草碳点。

4.根据权利要求3所述的仙鹤草碳点，其特征在于，所述仙鹤草碳点的直径为2-6 nm。

5.权利要求3或4所述的仙鹤草碳点在制备抗乳腺肿瘤药物中的应用。

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