CN114940487B - 一种人参碳点及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药领域,特别是涉及一种人参碳点及其制备方法和用途,所述制备方法包括如下步骤:1)将人参粉末与水混合得到混合液;2)将步骤1)的混合液进行水热反应,收集反应产物即得到人参碳点。所述人参碳点可用于制备鳞状细胞癌治疗产品中。本发明的人参碳点以人参为原料直接制备成碳点更符合中药熬制的过程,更全面的发挥人参治疗恶性肿瘤的作用,相比传统化疗药物生物相容性好,细胞毒性低,副作用小,能特异性杀死鳞状细胞癌,靶向性强,对正常上皮细胞没有明显细胞毒性,与抗肿瘤治疗的免疫靶向药物和传统化疗药物相比制备工艺简单,成本低廉,副作用低,作用效果强。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域,特别是涉及一种人参碳点及其制备方法和用途。
背景技术
治疗恶性肿瘤的传统化疗药物虽然具有一定的治疗作用,但因普遍存在的副损伤大、细胞毒性强、靶向性不足、抗药耐药、价格昂贵等不足,尚不能满足鳞状细胞癌的临床治疗需要,临床工作中急需新型抗癌药物。新型抗癌药物中,碳点是一类纳米材料、具有良好的生物医学性质,来源广泛,将中药制备成碳点能增加原材料在水介质中的溶解度,将难溶的中药通过炭化提取其衍生碳点,在保留原生物活性或降低毒副作用的同时改善水溶性差等物理性质,提高了中药的生物利用度。人参是具有抗恶性肿瘤作用的中药材,主要通过提取其中有效成分进行研究和制备中成药进行临床应用,但有效成分单体提取和制备成本高,化学合成的成分毒性高,人参有效成分上尚不完全清楚,已知的有效单体不能体现人参的抗恶性肿瘤作用,临床效果有限。现有技术中通过单一人参成分化学合成制备的碳点不足以说明人参传统中医的全部抗肿瘤作用,更不满足抗肿瘤需要。同时人参复杂的结构组成不仅增加了设计、研究的难度和成本,也在一定程度上降低了超小尺寸碳点在水溶性、生物相容性方面的优势,增大了后续体系稳定性的保持和后续作用的难度。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种人参碳点及其制备方法和用途,用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的,本发明提供一种人参碳点的制备方法,所述制备方法包括如下步骤:
1)将人参粉末与水混合得到混合液;
2)将步骤1)的混合液进行水热反应,收集反应产物即得到人参碳点。
优选的,人参粉末和水的质量比为1:2~20。
优选的,所述水热反应的温度为100~300℃。
优选的,所述水热反应的时间为3~15小时。
优选的,步骤2)中还包括将收集的反应产物过滤。
优选的,步骤2)中还包括将过滤后的产物透析。
本发明还提供所述制备方法得到的人参碳点。
本发明还提供一种药物组合物,所述药物组合物包括所述人参碳点和药学上可接受的载体或辅料。
本发明还提供所述人参碳点或药物组合物在制备至少具备以下功效之一的产品中的用途:
1)铁死亡诱导剂;
2)鳞状细胞癌治疗产品;
3)抑制鳞状细胞癌的迁移;
4)诱导鳞状细胞癌的凋亡。
如上所述,本发明的人参碳点及其制备方法和用途,具有以下有益效果:以人参为原料直接制备成碳点更符合中药熬制的过程,更全面的发挥人参治疗恶性肿瘤的作用。相比传统化疗药物生物相容性好,细胞毒性低,副作用小,能特异性杀死鳞状细胞癌,靶向性强,对正常上皮细胞没有明显细胞毒性,同时能抑制鳞状细胞癌的迁移浸润,与抗肿瘤治疗的免疫靶向药物和传统化疗药物相比制备工艺简单,成本低廉,副作用低,作用效果强。
附图说明
图1显示为本发明的人参碳点的制备流程示意图及溶液照片图。
图2显示为本发明的人参碳点的透射电镜照片。
图3显示为本发明的人参碳点的紫外吸收和荧光光谱。
图4显示为本发明的人参碳点的EDS谱图。
图5显示为本发明的人参碳点的CCK-8实验结果。
图6显示为本发明的人参碳点的凋亡实验结果。
图7显示为本发明的人参碳点的Transwell和划痕实验结果。
图8显示为本发明的人参碳点抗肿瘤机制研究的实验结果。
具体实施方式
鉴于现有恶性肿瘤化疗药和人参提取物存在的不足,本发明以具有抗恶性肿瘤作用的中药材人参为原料,提供一种人参碳点的制备方法,所述制备方法包括如下步骤:
1)将人参粉末与水混合得到混合液;
2)将步骤1)的混合液进行水热反应,收集反应产物即得到人参碳点。
在一种实施方式中,所述人参粉末通过将干人参研磨粉碎得到。所述人参粉末中含有人参的全部有效成分,例如人参皂苷、挥发油、多糖、肽、氨基酸类、维生素、微量元素等。
本发明步骤1)中对人参粉末和水的比例没有特别限制,人参粉末可以在水中充分分散即可,本领域技术人员可以根据实际应用情况、原料情况以及产物要求进行选择和调整。在一种实施方式中,人参粉末和水的质量比为1:2~20。在一较佳的实施方式中,人参粉末和水的质量比为1:5~15。在一更佳的实施方式中,人参粉末和水的质量比为1:7~13。
本发明对所述水热反应的温度没有特别限制,本领域技术人员可以根据实际常规水热反应的条件、原料情况以及产物要求进行选择和调整。在本发明的某些实施方式中,所述水热反应的温度为100~300℃。在一较佳的实施方式中,所述水热反应的温度为150~250℃。在一更佳的实施方式中,所述水热反应的温度为180~220℃。
本发明对所述水热反应的时间没有特别限制,本领域技术人员可以根据实际常规水热反应的条件、原料情况以及产物要求进行选择和调整。在本发明的某些实施方式中,所述水热反应的时间为3~15小时。在一较佳的实施方式中,所述水热反应的时间为5~12小时。在一更佳的实施方式中,所述水热反应的时间为6~10小时。
在本发明的某些实施方式中,收集反应产物的方法为离心后收集上清液。
在本发明的某些实施方式中,步骤2)中还包括将收集的反应产物过滤。
过滤的目的是除去较大的颗粒。在本发明的某些实施方式中,通过0.22μm滤膜过滤。过滤后得到深黄色溶液。
在本发明的某些实施方式中,步骤2)中还包括将过滤后的产物透析。透析的作用为去除未反应的试剂以及其他小副产物。
本发明对透析的方法没有特别限制,本领域技术人员可以根据实际常规透析的条件以及产物要求进行选择和调整。在本发明的某些实施方式中,透析为用水透析12~36小时。
本发明还提供所述制备方法得到的人参碳点。
所述人参碳点的尺寸没有特别限制,可根据实际需求制备不同大小的人参碳点。在本发明的某些实施方式中,所述人参碳点的直径为10nm以内。所述人参碳点的直径例如为1~2nm、2~3nm、3~4nm、4~5nm、5~6nm、6~7nm、7~8nm、8~9nm、9~10nm。在一更佳的实施方式中,所述人参碳点的直径为3~5nm。
所述人参碳点具有蓝色荧光。
所述人参碳点能被细胞摄取。
所述人参碳点能特异性杀死鳞状细胞癌,抑制鳞状细胞癌的迁移浸润,而对正常上皮细胞没有毒性。
本发明还提供一种药物组合物,所述药物组合物包括所述人参碳点和药学上可接受的载体或辅料。
所述药物组合物的形式无特殊限制,可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
所述药物组合物主要针对的对象为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。
“药学上可接受的”是指当药物适当地给予动物或人时,它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。
“药学上可接受的载体或辅料”应当与所述有效成分相容,即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类,如乳糖、葡萄糖和蔗糖;淀粉,如玉米淀粉和土豆淀粉;纤维素及其衍生物,如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素;西黄蓍胶粉末;麦芽;明胶;滑石;固体润滑剂,如硬脂酸和硬脂酸镁;硫酸钙;植物油,如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油;多元醇,如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇;海藻酸;乳化剂,如Tween;润湿剂,如月桂基硫酸钠;着色剂;调味剂;压片剂、稳定剂;抗氧化剂;防腐剂;无热原水;等渗盐溶液;磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。
本发明还提供所述人参碳点或药物组合物在制备至少具备以下功效之一的产品中的用途:
1)铁死亡诱导剂;
2)鳞状细胞癌治疗产品;
3)抑制鳞状细胞癌的迁移;
4)诱导鳞状细胞癌的凋亡。
铁死亡主要是细胞内脂质活性氧生成与降解的平衡失调所致。当细胞抗氧化能力降低,脂质活性氧堆积,就能引起细胞氧化性死亡,即铁死亡。铁死亡可以被多种化合物所诱导(例如索拉非尼、本发明的人参碳点),虽然各种诱导剂发生的信号通路可能不同,但是上游通路最终都是通过直接或间接影响谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPXs)的活性,降低细胞抗氧化能力,致使脂质过氧化反应增加,脂质活性氧增多,引起铁死亡的发生。本发明中,所述铁死亡诱导剂通过抑制谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX-4)和/或升高环氧合酶2(COX-2)诱导铁死亡发生。
本发明首次证明了人参碳点可以诱导铁死亡。更进一步的,人参碳点可以通过诱导铁死亡达到疾病治疗目的。所述疾病例如为炎症性疾病或肿瘤。所述肿瘤例如为胰腺癌、乳腺癌、鳞状细胞癌等。
所述人参碳点还可以通过诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞的活性、抑制肿瘤细胞的迁移达到治疗肿瘤的目的。
本发明中对所述鳞状细胞癌的级别、类型、发生部位不做限制。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围;在本发明说明书和权利要求书中,除非文中另外明确指出,单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1人参碳点的制备
使用水热法合成人参碳点,如图1所示,将干人参通过微型研磨机粉碎成粉末,然后将1g粉末加入10mL水溶液中并充分搅拌,将溶液转移到聚四氟乙烯衬里的反应釜中,在烘箱中200℃下加热8小时。随后,将反应釜冷却至室温,所得混合物离心(8000r/min,10分钟),收集上清液,通过0.22μm滤膜过滤除去大颗粒,得到深黄色溶液。将溶液在透析袋中用去离子水透析24小时,以去除未反应的试剂以及其他小副产物,最终得到纯化后的人参碳点供表征和其他实施例备用。
将纯化后的产物利用JEM-2100F场发射透射电子显微镜,在200kV的加速电压下拍摄透射电子显微镜(TEM)照片,结果如图2所示,碳点形状均匀,无明显聚集,平均直径约4nm。
将纯化后的产物用Lambda 950紫外可见分光光度计进行紫外可见吸收光谱的检测,结果如图3所示,荧光光谱发射峰在400nm处和紫外吸收峰298nm处。
将纯化后的产物由Inca X-Max仪器测量EDS谱,结果如图4所示,产物主要含有O和C元素。
实施例2CCK-8检测与人参碳点共培养的细胞的活性
取对数生长期细胞,计数细胞浓度为5×103个/mL,于96孔板每孔加入200μL细胞悬液,使每孔细胞数量为1×103个,于37℃、5%CO2培养箱培养24小时,使细胞贴壁。吸去培养基,每孔加入100μL含不同浓度碳点的培养基,培养24小时。避光条件下吸去培养基,向每孔中加入100μL培养基、10μL的CCK-8溶液,继续置于37℃、5%的CO2培养箱中培养1小时后,应用酶标仪于波长450nm测吸光度值。
结果如图5所示,CCK-8测定表明,碳点在正常永生化角质形成细胞系(HaCaT)中可以在较高浓度(>400μg/mL)维持生长,碳点在浓度250-300μg/mL时对鳞状细胞癌细胞系(Cal-27、SCC-25和SCC-7)的细胞增殖没有显著影响,但GCDs在较高浓度下可观察到抑制鳞状细胞癌细胞系生长。
实施例3检测与人参碳点共培养的细胞的凋亡率
将Cal-27细胞以2×105细胞/孔的密度接种在6孔板中,并培养过夜使细胞贴壁。吸去培养基,每孔加入2mL含不同浓度碳点的培养基,培养24小时。收集培养基到离心管内备用,消化细胞后将旧培养基一并加入对应离心管中,离心(1000r/min,5min,4℃)收集细胞并用冷PBS洗涤两次,加入100μL结合缓冲液重悬细胞。按照凋亡试剂盒说明书,加入5μLAnnexin V/FITC溶液轻轻混匀后室温避光孵育10min,再加入5μL的PI(碘化丙啶)溶液并加400μL PBS,立即使用流式细胞仪检测细胞的凋亡率。
结果如图6所示,用不同浓度的碳点处理的Cal-27细胞(鳞状细胞癌)的细胞凋亡测定表明,在300μg/mL的浓度下诱导Cal-27细胞的凋亡。
实施例4检测与人参碳点共培养的细胞的迁移情况
Transwell实验:聚碳酸酯膜(孔径为8μm)的24孔Transwell小室进行评估。将细胞与不同浓度碳点溶液一起孵育24小时。收集细胞并以每孔5×104个细胞接种在上室中,并与DMEM一起培养。将含有10%FBS的DMEM添加到下室中。24小时后,下膜细胞用甲醇固定,结晶紫染色。在显微镜下拍摄细胞图像。
结果如图7所示,Transwell测定显示,人参碳点诱导的Cal-27和SCC-7细胞迁移到下膜的百分比分别约为对照组的20%和30%。
划痕试验:将细胞接种在6孔板中,每孔2×105个细胞并培养至完全汇合。用200μl移液器的尖端在每个孔中划三个平行的划痕,并测量划痕面积。取培养基,每孔加入2mL含有不同浓度碳点的无FBS培养基。24小时后,用甲醇固定细胞并用结晶紫染色。捕获划痕区域的图像。用显微镜观察划痕区域并用ImageJ软件分析。
结果如图7所示,划痕试验中,未经碳点处理的Cal-27细胞和SCC-7细胞比与GCD共培养的细胞迁移率更高。
实施例5人参碳点治疗肿瘤的机制研究
利用Westernblot研究人参碳点的抗肿瘤机制,步骤如下:将Cal-27细胞接种在6孔板中并培养过夜,用含有不同浓度碳点的2mL培养基更换培养基。24小时后,用RIPA缓冲液裂解细胞以获得细胞蛋白。蛋白质提取物在SDS-PAGE上运行并转移到聚偏二氟乙烯膜上。在室温下用5%BSA密封1小时,并在4℃下与一抗孵育过夜。然后加入二抗,室温孵育1h。信号检测采用增强型化学发光试剂,谱带密度采用ImageJ软件分析。
Western blot结果如图8所示,结果表明,在Cal-27细胞与300μg/mL的碳点作用后,谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX-4)降低,环氧合酶2(COX-2)升高,由于GPX-4和COX-2为铁死亡的标志物,证明人参碳点通过诱导肿瘤细胞发生铁死亡从而达到抗肿瘤目的。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案,并不能理解为对本发明的限制。此外,本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化,在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述,但应当理解,本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上,各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
Claims (5)
1.人参碳点在制备鳞状细胞癌治疗产品中的用途,其特征在于,所述人参碳点通过如下制备方法获得,所述制备方法包括如下步骤:
1)将人参粉末与水混合得到混合液,所述人参粉末和水的质量比为1:2~20;
2)将步骤1)的混合液进行水热反应,所述水热反应的温度为180~220℃,所述水热反应的时间为6~10小时,收集反应产物,将收集的反应产物过滤,将过滤后的产物透析即得到人参碳点。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述人参粉末通过将干人参研磨粉碎得到。
3.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,收集反应产物的方法为离心后收集上清液。
4.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,步骤2)中通过0.22μm滤膜过滤。
5.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述人参碳点的直径为10nm以内;和/或,所述人参碳点具有蓝色荧光。
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