JP6961100B2 - アントシアニン−フコイダン複合体を有効成分として含有する免疫増強剤、免疫抗ガン剤及び抗ガン剤の副作用緩和剤 - Google Patents

アントシアニン−フコイダン複合体を有効成分として含有する免疫増強剤、免疫抗ガン剤及び抗ガン剤の副作用緩和剤 Download PDF

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Description

本発明は、アントシアニンとフコイダンとのイオン結合によって形成されるアントシアニン−フコイダン複合体（ａｎｔｈｏｙａｎｉｎ−ｆｕｃｏｉｄａｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）を有効成分として含有する免疫増強剤及び抗ガン剤の副作用緩和用抗ガン補助剤組成物に関する。
癌征服を目標として世界的に次世代塩基配列（ＮＧＳ）基盤の癌誘電体分析と環境など多様な要因を基盤とした患者カスタマイズド精密医療のために、広範囲な研究が進められているが、癌疾患は、依然として治療が難しく、死亡に至る恐ろしい疾病として認識されており、抗ガン剤によって治療されたとしても、胃癌の場合、再発率は５５％、大腸癌２０〜５０％、肺癌２０％〜５０％、子宮癌５％〜２０％、そして、乳癌の場合、１０〜１５％であると報告（国立癌センター）された。
免疫反応は、自己と非自己とを確認し、非自己を除去するための細胞性、体液性反応を言い、免疫力が減少すれば、本来の機能を行うことができず、結局、我が身は、外部物質の攻撃に容易に感染される。癌の場合、減少した免疫活性によって免疫に関与する免疫細胞が癌細胞を攻撃することができず、癌が除去されない。
アントシアニンは、主に植物の花や果実などに含まれている天然色素配糖体であって、ブラックカラント、ブルーベリー、アロニア、チェリー、黒米、ブドウ、赤キャベツのような植物に多く含有されている。主に強力な日光紫外線、苛酷な寒さと高い湿度との環境で高濃度のアントシアニンが見つけられるが、その理由は、強烈な日光紫外線が植物細胞核のＤＮＡを破壊させて、植物体の生命に影響を与えるために、植物表面や中間層に紫外線吸収物質であるアントシアニンを生成させて保護するためである。
このようなアントシアニンは、天然物から抽出が容易であって、量産が可能であり、老化、免疫反応、糖尿、バクテリア感染症、神経系疾患、癌などに薬理活性に優れた物質として知られている。これにより、アントシアニンに対する人の関心が増加し、世界的なウェルビーイング（ｗｅｌｌ−ｂｅｉｎｇ）熱風によってアントシアニンを含有した製品の市場規模が次第に大きくなっている。
アントシアニンは、食べ物で摂取した時、最も大きな効果が表われるが、胃腸管で留まる時間、低い腸管壁透過性、低い溶解度、商業化のための工程上での不安定性や温度、周辺の酸素と光、消化管内のｐＨ及び酵素または他の栄養分によって生体内では５％以下の低い活性を示す。
これにより、アロニアのような植物体から抽出された天然物であるアントシアニンの生体内安定性を改善させて、免疫機能を増進させることにより、効果的な抗ガン治療剤として使える研究開発が必要な実情である。
本発明は、前記問題点を解決するために、天然抽出物であるフコイダンをアントシアニンとイオン結合させることにより、安定性と溶解度とを向上させたアントシアニン複合体を免疫増強剤、免疫抗ガン剤及び抗ガン剤の副作用緩和用抗ガン補助剤組成物として提供することである。
本発明は、アロニア抽出物及びフコイダンからなり、前記アロニア抽出物のうち、シアニジンの陽イオンと前記フコイダンの陰イオンとのイオン結合が形成され、シアニジン分子間のπ−π結合が形成されたことを特徴とするアロニア抽出物−フコイダン複合体を提供する。
本発明は、アロニア抽出物及びフコイダンからなり、前記アロニア抽出物のうち、シアニジンの陽イオンと前記フコイダンの陰イオンとのイオン結合が形成され、シアニジン分子間のπ−π結合が形成されたことを特徴とするアロニア抽出物−フコイダン複合体を有効成分として含有する免疫増強剤を提供する。
本発明は、アロニア抽出物及びフコイダンからなり、前記アロニア抽出物のうち、シアニジンの陽イオンと前記フコイダンの陰イオンとのイオン結合が形成され、シアニジン分子間のπ−π結合が形成されたことを特徴とするアロニア抽出物−フコイダン複合体を有効成分として含有する免疫抗ガン剤を提供する。
本発明は、アロニア抽出物及びフコイダンからなり、前記アロニア抽出物のうち、シアニジンの陽イオンと前記フコイダンの陰イオンとのイオン結合が形成され、シアニジン分子間のπ−π結合が形成されたことを特徴とするアロニア抽出物−フコイダン複合体を有効成分として含有する抗ガン用健康食品を提供する。
また、本発明は、アロニア抽出物及びフコイダンからなり、前記アロニア抽出物のうち、シアニジンの陽イオンと前記フコイダンの陰イオンとのイオン結合が形成され、シアニジン分子間のπ−π結合が形成されたことを特徴とするアロニア抽出物−フコイダン複合体を有効成分として含有する抗ガン補助剤を提供する。
本発明によれば、生体適合性及び生分解性の高い天然抽出物であるフコイダンの陰イオンをアントシアニンの陽イオンとイオン結合させたアロニア抽出物−フコイダン複合体は、生体内酸性条件でもアントシアニンの安定性と溶解度とを向上させることにより、腫瘍動物モデルの免疫活性を増加させ、抗ガン剤処理によって減少した体重を回復させることにより、寿命を延長させる効果が確認されることによって、前記アロニア抽出物−フコイダン複合体を免疫増強剤、免疫抗ガン剤及び抗ガン剤の副作用を緩和させるための抗ガン補助剤として提供することである。
シアニジン−フコイダン結合による複合体（Ｃｙａｐｌｅｘ−Ｆ８）の構造である。 アロニア抽出物−フコイダン複合体の吸光度及び光学イメージを確認した結果である。 アロニア抽出物−フコイダン複合体のＤＬＳ結果（左側）及びアロニア抽出物−フコイダン複合体の走査電子顕微鏡の分析結果である。 アロニア抽出物とアロニア抽出物−フコイダン複合体のアロニア抽出物との分解度の差を確認した結果である。 アロニア抽出物−フコイダン複合体の抗ガン効能及び正常細胞に対する死滅率を確認した結果であって、（ａ）ＨＣＴ−１１６、（ｂ）Ｈｅｐ−Ｇ２、（ｃ）ＮＩＨ／３Ｔ３及び（ｄ）ＨＵＶＥＣでアロニア抽出物−フコイダン含量によるＩＣ５０を確認した結果である。 アロニア抽出物−フコイダン複合体の免疫因子の分泌を通じた免疫誘導レベルを確認した結果である。 発癌物質と腫瘍促進剤とが処理された実験動物にＰＢＳ、フコイダン（Ｆｕ）、アロニア抽出物（Ａｒｏｎｉａ Ｂｉｏ−ａｃｔｉｖｅ Ｆｒａｃｔｉｏｎｓ；ＡＢＦ）及びアロニア抽出物−フコイダン複合体（Ｃｙａｐｌｅｘ−Ｆ８）を２２週間毎日経口投与し、腫瘍生成の有無を確認した結果である。 発癌物質と腫瘍促進剤とが処理された実験動物にＰＢＳ、フコイダン（Ｆｕ）、アロニア（ＡＢＦ）及びアロニア抽出物−フコイダン複合体（Ｃｙａｐｌｅｘ−Ｆ８）を２２週間毎日経口投与し、実験５週、９週、１２週、１６週、１８週、２０週及び２２週目に腫瘍成長の抑制効果を確認した結果である。 発癌物質と腫瘍促進剤とが処理された実験動物にＰＢＳ、フコイダン（Ｆｕ）、アロニア抽出物（ＡＢＦ）及びアロニア抽出物−フコイダン複合体（Ｃｙａｐｌｅｘ−Ｆ８）を２２週間毎日経口投与し、実験９週、１１週、１４週、１６週、１８週及び２２週目に腫瘍成長の抑制効果を確認した結果である。 発癌物質と腫瘍促進剤とが処理された実験動物にＰＢＳ、フコイダン（Ｆｕ）、アロニア抽出物（ＡＢＦ）及びアロニア抽出物−フコイダン複合体（Ｃｙａｐｌｅｘ−Ｆ８）経口投与後、各実験群で実験動物の体重及び生存率を確認した結果である。 発癌物質と腫瘍促進剤とが処理された実験動物にＰＢＳ、フコイダン（Ｆｕ）、アロニア抽出物（ＡＢＦ）及びアロニア抽出物−フコイダン複合体（Ｃｙａｐｌｅｘ−Ｆ８）経口投与後、腫瘍結節数（Ｎｏｄｕｌｅ ｃｏｕｎｔｓ）及び腫瘍面積（Ｔｕｍｏｒ ａｒｅａ）の増加率を確認した結果である。 発癌物質と腫瘍促進剤とが処理された実験動物にＰＢＳ、フコイダン（Ｆｕ）、アロニア抽出物（ＡＢＦ）及びアロニア抽出物−フコイダン複合体（Ｃｙａｐｌｅｘ−Ｆ８）が経口投与された実験動物の主要臓器である心臓、肺、肝、腎臓及び脾臓組織をヘマトキシリン＆エオシン染色した結果である。 発癌物質と腫瘍促進剤とが処理された実験動物にＰＢＳ、フコイダン（Ｆｕ）、アロニア抽出物（ＡＢＦ）及びアロニア抽出物−フコイダン複合体（Ｃｙａｐｌｅｘ−Ｆ８）が経口投与された実験動物の腫瘍組織をヘマトキシリン＆エオシン染色した結果である。 発癌物質と腫瘍促進剤とが処理された実験動物にＰＢＳ、フコイダン（Ｆｕ）、アロニア抽出物（ＡＢＦ）及びアロニア抽出物−フコイダン複合体（Ｃｙａｐｌｅｘ−Ｆ８）が経口投与された実験動物の血しょう内ＩＦＮ−γレベルを確認した結果である。 癌細胞移植で腫瘍生成が誘導された実験動物にドキソルビシン静脈注射後、ＰＢＳ、フコイダン（Ｆｕ）、アロニア抽出物（ＡＢＦ）及びアロニア抽出物−フコイダン複合体（Ｃｙａｐｌｅｘ−Ｆ８）を経口投与後、腫瘍成長の抑制効果を確認した結果である。 癌細胞移植で腫瘍生成が誘導された実験動物にドキソルビシン静脈注射後、ＰＢＳ、フコイダン（Ｆｕ）、アロニア抽出物（ＡＢＦ）及びアロニア抽出物−フコイダン複合体（Ｃｙａｐｌｅｘ−Ｆ８）を経口投与後、腫瘍成長の抑制効果（Ａ）、体重変化（Ｂ）及び生存率（Ｃ）を確認した結果である。 マウス動物モデルにドキソルビシンを実験１日及び５日目（総２回）に静脈注射後、ＰＢＳ、フコイダン（Ｆｕ）、アロニア抽出物（ＡＢＦ）及びアロニア抽出物−フコイダン複合体（Ｃｙａｐｌｅｘ−Ｆ８）を１４日間経口投与し、実験５日及び１４日目に血中ＣＤ８＋Ｔ細胞とＮＫ細胞レベルとを確認した結果である。 マウス動物モデルにドキソルビシンを実験１日及び５日目（総２回）に静脈注射後、ＰＢＳ、フコイダン（Ｆｕ）、アロニア抽出物（ＡＢＦ）及びアロニア抽出物−フコイダン複合体（Ｃｙａｐｌｅｘ−Ｆ８）を１４日間経口投与し、実験最終日である１４日目に動物モデルの脾臓を摘出して、脾臓重量を確認した結果である。
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明者らは、生体適合性を有するフコイダンの陰イオンがアロニア由来のアントシアニンであるシアニジンの陽イオンとイオン結合して複合体を生成することにより、胃、小腸及び血液でも、シアニジンを構造的に安定化させて、体内と類似した条件で免疫活性を向上させ、生体利用率と生理活性とに優れた複合体で提供されることを確認することによって、本発明を完成した。
本発明は、アロニア抽出物及びフコイダンからなり、前記アロニア抽出物のうち、シアニジンの陽イオンと前記フコイダンの陰イオンとのイオン結合が形成され、シアニジン分子間のπ−π結合が形成されたことを特徴とするアロニア抽出物−フコイダン複合体を提供することができる。
より詳細には、前記シアニジンは、アロニア抽出物から分離精製されたシアニジン−３−グルコシド（Ｃｙａｎｉｄｉｎｅ−３−Ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ；Ｃ３Ｇ）であるが、これに限定されるものではない。
本発明のアントシアニンは、花という意味のアンソス（Ａｎｔｈｏｓ）と青色を意味するシアノス（ｃｙａｎｏｓ）というギリシャ語が合わせられた言葉であって、主にベリー類の果実、花、茎が外部刺激から自己自身を保護するために、ファイトケミカルの１種類であるアントシアニン色素を作り出す。このようなアントシアニンは、自然界で約６００種が存在し、そのうち、シアニジン−３−グルコシド（Ｃ３Ｇ）の活性が最も優れ、特に、抗老化、抗酸化、抗ガン、抗代謝性疾患の作用に優れている。
前記複合体は、アロニア抽出物とフコイダンとが０．１：１０〜１０：０．１重量比で形成されうる。
前記複合体は、５０〜５００ｎｍの範囲の平均直径を有するナノ複合体である。
本発明は、アロニア抽出物及びフコイダンからなり、前記アロニア抽出物のうち、シアニジンの陽イオンと前記フコイダンの陰イオンとのイオン結合が形成され、シアニジン分子間のπ−π結合が形成されたことを特徴とするアロニア抽出物−フコイダン複合体を有効成分として含有する免疫増強剤を提供することができる。
前記アロニア抽出物−フコイダン複合体は、免疫因子の発現を誘導して免疫細胞の活性を増加させるものである。
本発明の一実施例によれば、アロニア抽出物（ＡＢＦ）５０μg／ｍｌが含まれたアロニア抽出物（ＡＢＦ）溶液またはフコイダン５００μg／ｍｌの濃度が含まれたフコイダン溶液と５０μg／ｍｌの濃度のアロニア抽出物（ＡＢＦ）及び５００μg／ｍｌの濃度のフコイダン濃度が含まれたアロニア抽出物−フコイダン複合体をＨＣＴ−１１６（ヒト大腸細胞）、ＳＫＢＲ−３（ヒト乳癌細胞）及びＨｅｐ−Ｇ２（ヒト肝細胞）にそれぞれ処理した結果、図６のように、ＩＬ−６がアロニア抽出物（ＡＢＦ）とフコイダンとを単独で処理した時よりも、アロニア抽出物−フコイダン複合体を処理した時、高く分泌され、アロニア抽出物（ＡＢＦ）とフコイダンとが処理された細胞から分泌されたＩＬ−６の量を合わせた量よりもアロニア抽出物−フコイダン複合体を処理した細胞から分泌されたＩＬ−６の量がさらに多いことを確認することができた。
前記結果から、前記アロニア抽出物−フコイダン複合体は、生体内免疫因子の発現を誘導して免疫細胞の活性を増加させることが確認された。
したがって、本発明は、アロニア抽出物及びフコイダンからなり、前記アロニア抽出物のうち、シアニジンの陽イオンと前記フコイダンの陰イオンとのイオン結合が形成され、シアニジン分子間のπ−π結合が形成されたことを特徴とするアロニア抽出物−フコイダン複合体を有効成分として含有する免疫抗ガン剤を提供することができる。
前記アロニア抽出物−フコイダン複合体は、免疫因子の発現を誘導して免疫細胞の活性を増加させて、癌細胞を死滅させるものである。
前記癌細胞は、固形癌の癌細胞であり、より詳細に、前記固形癌は、大腸癌、乳癌、肺癌、胃癌、上皮性卵巣癌、脳癌、皮膚癌及び肝癌からなる群から選択されうるが、これらに限定されるものではない。
本発明の他の一実施例によれば、アントシアニンと複合体の癌細胞に対する抗ガン効果と正常組織細胞に対する毒性とを確認するために、アロニア抽出物（ＡＢＦ）５０μg／ｍｌが含まれたアロニア抽出物（ＡＢＦ）溶液またはフコイダン２００μg／ｍｌの濃度が含まれたフコイダン溶液と５０μg／ｍｌの濃度のアロニア抽出物（ＡＢＦ）及び２００μg／ｍｌの濃度のフコイダン濃度が含まれたアロニア抽出物−フコイダン複合体を最初の濃度で１／２に希釈する階段希釈法を使用して、それぞれ８個の試料を製造した後、ＨＣＴ−１１６（ヒト大腸細胞）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ラット胚線維芽細胞）、ＨＵＶＥＣ（内皮細胞；ＡＴＣＣ）及びＨｅｐ−Ｇ２（ヒト肝細胞）にそれぞれ処理して、前記試料の癌細胞死滅レベルを確認した結果、図５のように、ＨＣＴ−１１６及びＨｅｐ−Ｇ２のアロニア抽出物（ＡＢＦ）の溶液に対するＩＣ５０値は、それぞれ２７μg／ｍｌ及び１７μg／ｍｌと確認され、アロニア抽出物−フコイダン複合体に対するＩＣ５０値は、１２μg／ｍｌ及び５．２μg／ｍｌと確認された。また、正常組織細胞であるＮＩＨ／３Ｔ３及びＨＵＶＥＣでは、アロニア抽出物（ＡＢＦ）溶液に対するＩＣ５０値がそれぞれ４１μg／ｍｌ及び５３μg／ｍｌと表われ、アロニア抽出物−フコイダン複合体に対するＩＣ５０値は、３８μg／ｍｌ及び３８μg／ｍｌであると確認された。
前記結果から、癌細胞に対するアロニア抽出物−フコイダン複合体のＩＣ５０値が、アロニア抽出物（ＡＢＦ）溶液よりも低く表われることによって、前記アロニア抽出物−フコイダン複合体は、アロニア抽出物（ＡＢＦ）よりもさらに少量で癌細胞を効果的に死滅させることが確認され、正常組織細胞に対するアロニア抽出物−フコイダン複合体のＩＣ５０値が、癌細胞よりもさらに高く表われることが確認されることによって、アロニア抽出物−フコイダン複合体は、正常細胞に対する細胞毒性なしに癌細胞を効果的に死滅させることが確認された。
本発明の一具体例において、前記アロニア抽出物−フコイダン複合体を有効成分として含有する癌疾患の予防または治療用薬学組成物は、通常の方法によって、注射剤、顆粒剤、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、坐剤、ゲル、懸濁剤、乳剤、点滴剤または液剤からなる群から選択された何れか１つの剤型を使用することができる。
本発明の他の具体例において、アロニア抽出物−フコイダン複合体を有効成分として含有する癌疾患の予防または治療用薬学組成物は、薬学組成物の製造に通常使う適切な担体、賦形剤、崩壊剤、甘味剤、被覆剤、膨張剤、潤滑剤、滑沢剤、香味剤、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、及び潤滑剤からなる群から選択される１つ以上の添加剤をさらに含みうる。
具体的に、担体、賦形剤及び希釈剤は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、非晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油を使用し、経口投与のための固型製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固型製剤は、前記組成物に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調剤することができる。また、単純な賦形剤の以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使用することができる。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などがあり、よく使われる単純希釈剤である水、流動パラフィンの以外に、さまざまな賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれうる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤などが含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使われる。坐剤の基剤としては、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、トウイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使われる。
本発明の一実施例によれば、前記薬学組成物は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、腹腔内、胸骨内、経皮、鼻側内、吸入、局所、直腸、経口、眼球内または皮内経路を通じて通常の方式で対象体に投与することができる。
前記アロニア抽出物−フコイダン複合体の望ましい投与量は、対象体の状態及び体重、疾患の種類及び程度、薬物形態、投与経路及び期間によって変わり、当業者によって適切に選択されうる。本発明の一実施例によれば、これに制限されるものではないが、１日投与量が０．０１〜２００ｍｇ／ｋｇ、具体的には、０．１〜２００ｍｇ／ｋｇ、より具体的には、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇである。投与は、一日一回投与することもでき、数回に分けて投与することもでき、これにより、本発明の範囲が制限されるものではない。
本発明において、前記「対象体」は、ヒトを含む哺乳動物であるが、これらに限定されるものではない。
また、本発明は、アロニア抽出物及びフコイダンからなり、前記アロニア抽出物のうち、シアニジンの陽イオンと前記フコイダンの陰イオンとのイオン結合が形成され、シアニジン分子間のπ−π結合が形成されたことを特徴とするアロニア抽出物−フコイダン複合体を有効成分として含有する抗ガン用健康食品を提供することができる。
前記健康食品は、前記アロニア抽出物−フコイダン複合体の以外に、他の食品または食品添加物と共に使われ、通常の方法によって適切に使われる。有効成分の混合量は、その使用目的、例えば、予防、健康または治療的処置によって適するように決定される。
前記健康食品に含有された化合物の有効容量は、前記治療剤の有効容量に準じて使用することができるが、健康及び衛生を目的とするか、または健康調節を目的とする長期間の摂取の場合には、前記範囲以下であり、有効成分は安全性面で何らの問題がないために、前記範囲以上の量でも使われうるということは確実である。
前記健康食品の種類には、特別な制限がなく、例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンデー類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含んだ酪農製品、各種スープ、飲み物、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などが挙げられる。
また、本発明は、アロニア抽出物及びフコイダンからなり、前記アロニア抽出物のうち、シアニジンの陽イオンと前記フコイダンの陰イオンとのイオン結合が形成され、シアニジン分子間のπ−π結合が形成されたことを特徴とするアロニア抽出物−フコイダン複合体を有効成分として含有する抗ガン補助剤を提供することができる。
前記抗ガン補助剤は、抗ガン剤投与による副作用を緩和させ、前記抗ガン剤投与による副作用は、体重または免疫因子の減少及び悪液質（ｃａｃｈｅｘｉａ）からなる群から選択されるものである。
以下、本発明の理解を助けるために、実施例を挙げて詳細に説明する。但し、下記の実施例は、本発明の内容を例示するものであり、本発明の範囲が、下記の実施例に限定されるものではない。本発明の実施例は、当業者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。
＜実施例１＞アロニア抽出物−フコイダン複合体の製造
アロニア抽出物（ＡＢＦ）［（株）ｊｂｋｌａｂ］２０ｍｇをリン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）ｐＨ３（ＰＢ３）水溶液２０ｍｌに沈殿物が見えないように溶解させ、フコイダン［（株）ｈａｅｗｏｎ ｂｉｏｔｅｃｈ］２００ｍｇを蒸留水２０ｍｌに沈殿物が見えないように溶解させた後、フコイダン溶液にアロニア抽出物溶液を添加し、室温で７２時間撹拌させて、アロニア抽出物−フコイダン複合体（Ｃｙａｐｌｅｘ−Ｆ８）を製造した。
一方、アロニア抽出物（ＡＢＦ）とフコイダンとを前記複合体の製造に使われた同量で溶解させて、比較例として使用した。
＜実施例２＞アロニア抽出物−フコイダン複合体の特性確認
１．アロニア抽出物−フコイダン複合体の形成確認
初日から６日目までアロニア抽出物（ＡＢＦ）溶液とアロニア抽出物−フコイダン複合体サンプルとを得て、前記サンプルを１／１０に希釈した後、分光光度計（ＵＶ−１６０１、Ｓｈｉｍａｄｚｕ，ＪＡＰＡＮ）で光学密度を測定して結果を得た。また、アロニア抽出物（ＡＢＦ）溶液とアロニア抽出物−フコイダン複合体原液とで光学写真を得た。
その結果、図２のように、アロニア抽出物−フコイダン複合体は、アロニア抽出物のうち、シアニジンの陽イオン性とフコイダンの陰イオン性とが合って形成するイオン結合で複合体が形成され、複合体の形成にシアニジン分子どうしのπ−π相互作用も寄与すると確認された。また、アロニア抽出物−フコイダンが複合体を形成しながら、π−π相互作用によってシアニジンが有していた最大吸光度が図２のようにレッドシフトすることを確認し、光学写真で複合体を形成したサンプルは、アロニア抽出物（ＡＢＦ）溶液よりも紫色を帯びることが確認された。
２．アロニア抽出物−フコイダン複合体のサイズ確認
完成された複合体２ｍｌをポリスチレンキュベット（ＤＴＳ００１２）に入れた後、ゼータ電位＆ナノ粒度分析器（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ｎａｎｏ ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．，Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて複合体のサイズを確認した。また、完成された複合体１０μlをカバーガラスに載せて６０℃オーブンで一晩中乾燥させ、走査電子顕微鏡（Ｓ−４８００、ＨＩＴＡＣＨＩ，Ｌｔｄ．，Ｕ．Ｓ．Ａ）でイメージを得た。
ゼータ電位＆ナノ粒度分析器の分析結果である図３の左側写真を参照すれば、複合体は、約３８０ｎｍ程度のナノサイズと確認された。また、図３の右側写真である走査電子顕微鏡イメージでは、サイズが約８５ｎｍであると確認された。
３．多様なｐＨ条件下で複合体の構造的安定性の増進効果の確認
前記アロニア抽出物−フコイダン複合体の製造方法で作られた複合体４０ｍｌを１３０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離した後、上澄み液は除去し、残っている沈殿物は、ＰＢ３（ｐＨ３）とｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ（ｐＨ７）とに再分散させた後、経時的に分光光度計でアントシアニン溶液と共に測定して、構造的安定性の増進効果を確認した。
その結果、図４のように、アロニア抽出物（ＡＢＦ）は、ｐＨが低い環境（ｐＨ３）で安定し、ｐＨが高くなるほど分解が起こった。
より詳細に、アロニア抽出物（ＡＢＦ）が人体に処理されるならば、人体が有するｐＨ７．４に露出され、結局、分解が起こると予想され、実際に図４のように、アントシアニンは、経時的に分解が表われたが、アロニア抽出物−フコイダン複合体は、経時的にある程度一定に吸光度値を保持することを確認することができる。
前記結果から、アロニア抽出物−フコイダン複合体は、生体内酸性条件でも優れた安定性を示すことを確認することができた。
＜実施例３＞アロニア抽出物−フコイダン複合体の試験管内細胞毒性及びサイトカイン分泌の確認
１．アロニア抽出物−フコイダンナノ粒子の試験管内細胞毒性の確認
アロニア抽出物とフコイダン複合体の癌細胞に対する抗ガン効果と正常組織細胞に対する毒性とを確認した。
まず、アロニア抽出物（ＡＢＦ）５０μg／ｍｌが含まれたアロニア抽出物（ＡＢＦ）溶液またはフコイダン２００μg／ｍｌの濃度が含まれたフコイダン溶液と５０μg／ｍｌの濃度のアロニア抽出物（ＡＢＦ）及び２００μg／ｍｌの濃度のフコイダン濃度が含まれたアロニア抽出物−フコイダン複合体試料を準備し、残りのサンプルは、前述した最初の濃度で１／２に希釈する階段希釈法を使用して、それぞれ８個ずつサンプルを製造した。
実験細胞であるＨＣＴ−１１６（ヒト大腸細胞癌腫；韓国細胞株銀行）及びＨＵＶＥＣ（内皮細胞；ＡＴＣＣ）をペニシリン及びストレプトマイシンと１０％ ＦＢＳとが添加されたＲＰＭＩ １６４０（Ｗｅｌｌｇｅｎｅ）培地で培養し、Ｈｅｐ−Ｇ２（ヒト肝細胞癌腫；韓国細胞株銀行）及びＮＩＨ／３Ｔ３（ラット胚線維芽細胞；韓国細胞株銀行）をペニシリン及びストレプトマイシンが含まれたＤＭＥＭ培地で培養した。
２４ウェルプレート上に前記細胞株をそれぞれウェル当たり５×１０４細胞でシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）し、一晩中培養した。以後、細胞をＤＭＥＭとＦＢＳとが無添加されたＲＰＭＩ及び多様な濃度のサンプルと共に３７℃で２４時間培養した後、ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ培地及び１０％の細胞計数キット−８（ＣＣＫ−８）溶液（ＣＣＫ−８キット、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，ＫＯＲＥＡ）に露出させて、３７℃で４時間培養した後、４５０ｎｍでの光学密度で細胞毒性を確認した。
その結果、図５のように、ＨＣＴ−１１６及びＨｅｐ−Ｇ２のアロニア抽出物（ＡＢＦ）の溶液に対するＩＣ５０値は、それぞれ２７μg／ｍｌ及び１７μg／ｍｌと確認され、アロニア抽出物−フコイダン複合体に対するＩＣ５０値は、１２μg／ｍｌ及び５．２μg／ｍｌと確認された。また、正常組織細胞であるＮＩＨ／３Ｔ３及びＨＵＶＥＣでは、アロニア抽出物（ＡＢＦ）溶液に対するＩＣ５０値がそれぞれ４１μg／ｍｌ及び５３μg／ｍｌで表われ、アロニア抽出物−フコイダン複合体に対するＩＣ５０値は、３８μg／ｍｌ及び３８μg／ｍｌであると確認された。
前記結果から、癌細胞に対するアロニア抽出物−フコイダン複合体のＩＣ５０値が、アロニア抽出物（ＡＢＦ）溶液よりも低く表われることが確認されることによって、前記複合体は、アロニア抽出物（ＡＢＦ）単独溶液よりもさらに少量で癌細胞を効果的に死滅させることが確認された。また、正常組織細胞に対するアロニア抽出物−フコイダン複合体のＩＣ５０値が、癌細胞よりもさらに高く表われることが確認されることによって、アロニア抽出物−フコイダン複合体は、アロニア抽出物（ＡＢＦ）溶液を単独で使用した時よりも抗ガン効果が高く、正常組織細胞に対する細胞毒性は低いと確認された。
２．アロニア抽出物−フコイダンナノ粒子によって死滅された細胞から分泌されたサイトカインの確認
アロニア抽出物（ＡＢＦ）５０μg／ｍｌが含まれたアロニア抽出物（ＡＢＦ）溶液またはフコイダン５０μg／ｍｌの濃度が含まれたフコイダン溶液と５０μg／ｍｌの濃度のアロニア抽出物（ＡＢＦ）及び５００μg／ｍｌの濃度のフコイダン濃度が含まれたアロニア抽出物−フコイダン複合体試料を準備した。
実験細胞であるＨＣＴ−１１６（ヒト大腸細胞癌腫；韓国細胞株銀行）及びＳＫＢＲ−３（ヒト乳癌細胞；韓国細胞株銀行）をペニシリン及びストレプトマイシンと１０％ ＦＢＳとが添加されたＲＰＭＩ １６４０（Ｗｅｌｌｇｅｎｅ）培地で培養し、Ｈｅｐ−Ｇ２（ヒト肝細胞癌腫；韓国細胞株銀行）は、ペニシリン及びストレプトマイシンが含まれたＤＭＥＭ培地で培養した。
６ウェルプレート上に培養された各細胞株をウェル当たり３×１０５細胞でシーディングし、一晩中培養した。次いで、多様な濃度のサンプルが含まれた２ｍｌのＤＭＥＭ及びＦＢＳ無添加ＲＰＭＩ培地で３７℃、２４時間培養し、培養培地を回収した後、回収された培地でＩＬ−６、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αサイトカインレベルをＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，ＫＯＲＥＡ）で確認した。
その結果、図６のように、前記３個の細胞株いずれもでＩＬ−１β及びＴＮＦ−αのサイトカインは分泌されず、ＩＬ−６は、アロニア抽出物（ＡＢＦ）とフコイダンとを単独で処理した時よりも、アロニア抽出物−フコイダン複合体を処理した時、高く分泌された。また、アロニア抽出物（ＡＢＦ）とフコイダンとが単独処理された細胞から分泌されたＩＬ−６の量を合わせた量よりもアロニア抽出物−フコイダン複合体を処理した細胞から分泌されたＩＬ−６の量がさらに多いことを確認することができた。
＜実施例４＞アロニア抽出物−フコイダン複合体の腫瘍生成の抑制効果の確認
発癌物質と腫瘍促進剤とが処理された実験動物でアロニア抽出物−フコイダン複合体の発癌抑制効果を確認した。
Ｂａｌｂ／ｃ（ｎ＝５）マウスの背中部分を除毛した後、発癌物質である７，１２−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚ［ａ］ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ（ＤＭＢＡ）２００ｎｍｏｌ／ａｃｅｔｏｎｅ ２００μＬを背中部分に塗布し、同じ部位に腫瘍促進剤である１２−Ｏ−Ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ−１３−ａｃｅｔａｔｅ（ＴＰＡ）４μｇ／ａｃｅｔｏｎｅ ２００μＬを２２週間に週２回処理した。
前記実験動物をＰＢＳ、アロニア抽出物（ＡＢＦ）、フコイダン（Ｆｕ）及びアロニア抽出物−フコイダン複合体（Ｃｙａｐｌｅｘ−Ｆ８）実験群に区分し、各実験群に適するようにフコイダン（Ｆｕ）２００μl（８０ｍｇ／ｍＬ）を８００ｍｇ／ｋｇまたはアロニア抽出物２００μl（１０ｍｇ／ｍＬ）を１００ｍｇ／ｋｇで経口投与し、Ｃｙａｐｌｅｘ−Ｆ８ ２００μl（Ｆｕ ８０ｍｇ、ＡＢＦ １０ｍｇ／ｍＬ）をＦｕ ８００ｍｇ及びＡＢＦ １００ｍｇ／ｋｇで２２週間毎日経口投与し、毎週１回実験動物の重量、生存率及び誘導された腫瘍結節個数及び広さを確認した。
その結果、図７ないし図９のように、発癌物質及び腫瘍促進剤の塗布及び薬物投与９週目からＰＢＳ実験群で腫瘍結節が表われ、その以後に腫瘍の個数と広さとが増加したが、図１１のように、ＦｕまたはＡＢＦが投与された実験群で発癌抑制効果が確認され、特に、Ｃｙａｐｌｅｘ−Ｆ８実験群の発癌抑制効能に優れることを確認することができた。
また、実験最後の週である２２週目に、各実験群の実験動物の主要臓器である心臓、肺、肝及び脾臓組織を摘出して、ヘマトキシリン＆エオシン染色（Ｈ＆Ｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を行った。
その結果、図１２のように、各実験群別の主要臓器の特異な差異点は確認されていないが、図１３のように、背中に誘導された腫瘍組織の場合、ＰＢＳ実験群が最も広い面積に腫瘍が誘導されたことを確認することができ、Ｃｙａｐｌｅｘ−Ｆ８実験群の腫瘍誘導面積が最も少ないことを確認することができた。
一方、薬物投与１１週目から眼窩採血方法で各実験動物の血液２００μlを採取した後、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して血しょうを分離し、ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（４８５−ＭＩ−１００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて血しょう内存在するＩＦＮ−γを定量分析した。
その結果、図１４のように、１１週目から２２週目まであらゆる実験群で大きな差なしに体内免疫機能の恒常性を保持していることを確認することができた。
＜実施例５＞アロニア抽出物−フコイダン複合体と抗ガン剤の併用投与の効果確認
アロニア抽出物−フコイダン複合体と抗ガン剤との併用投与による抗ガン効果を確認した。
Ｂａｌｂ／ｃ（ｎ＝５）マウスにそれぞれＳＫ−ＢＲ−３（ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｉｃｅを移植し、移植１週間後、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ；ＤＯＸ）１０ｍｇ／ｋｇを２週間に週１回静脈投与し、ドキソルビシン投与日を除き、あらゆる実験群にそれぞれフコイダン（Ｆｕ）２００μl（１６０ｍｇ／ｍＬ）を８００ｍｇ／ｋｇまたはアロニア抽出物２００μl（ＡＢＦ；２０ｍｇ／ｍＬ）を１００ｍｇ／ｋｇで投与し、Ｃｙａｐｌｅｘ−Ｆ８ ２００μl（Ｆｕ １６０ｍｇ、ＡＢＦ ２０ｍｇ／ｍＬ）をＦｕ １６００ｍｇ及びＡＢＦ ２００ｍｇ／ｋｇずつ１日２回毎日２週間経口投与した。
その結果、図１５及び図１６の（Ａ）のように、フコイダン、アロニア抽出物（ＡＢＦ）またはアロニア抽出物−フコイダン複合体が、単独投与された実験群では腫瘍サイズが増加したが、ドキソルビシンとアロニア抽出物−フコイダン複合体Ｃｙａｐｌｅｘ−Ｆ８とが併用処理された実験群では、ドキソルビシンが単独処理された実験群と類似したレベルに腫瘍サイズが減少したことを確認することができた。
また、図１６の（Ｂ）及び図１６の（Ｃ）を参照すれば、ドキソルビシンが単独処理された実験群で２番目のドキソルビシン静脈投与後、実験動物の急激な体重減少が表われたが、ドキソルビシンとＣｙａｐｌｅｘ−Ｆ８とが併用処理された実験群では、ドキソルビシン単独処理群と比較して体重減少率が少なく、ドキソルビシン単独処理群よりも生存寿命が延長されたと確認された。
また、３７日目に血球分析結果である表１のように、ドキソルビシン単独投与群の場合、白血球数値が６．５７×１０３ｃｅｌｌｓ／μＬと表われた一方、ＤＯＸ＋Ｃｙａｐｌｅｘ−Ｆ８併用投与実験群では、９．５４×１０３ｃｅｌｌｓ／μＬと増加したことを確認することができた。
Figure 0006961100
＜実施例６＞アロニア抽出物−フコイダン複合体の免疫細胞活性の効果確認
以前実験で確認されたように、アロニア抽出物−フコイダン複合体が白血球数値を増加させると確認されることによって、アロニア抽出物−フコイダン複合体が免疫細胞に及ぼす影響を確認した。
Ｂａｌｂ／ｃ（ｎ＝５）マウスにドキソルビシン（ＤＯＸ）を実験１日目及び５日目に（総２回）１０ｍｇ／ｋｇずつ処理し、フコイダン（Ｆｕ）５００μl（１６０ｍｇ／ｍＬ）で１，６００ｍｇ／ｋｇ、アロニア（ＡＢＦ）５００μl（２０ｍｇ／ｍＬ）で２００ｍｇ／ｋｇ及びアロニア抽出物−フコイダン複合体（Ｃｙａｐｌｅｘ−Ｆ８）５００μl（Ｆｕ １６０ｍｇ、ＡＢＦ ２０ｍｇ／ｍＬ）でＦｕ １，６００ｍｇ及びＡＢＦ ２００ｍｇ／ｋｇをドキソルビシン処理日を除き、毎日経口投与した。
ドキソルビシン処理前、あらゆる実験群で血液２００μlを採取し、ＲＢＣ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ ５００μＬを処理した後、４℃で５分間反応させ、ＤＰＢＳを用いて１０倍希釈して、１，５００ｒｐｍ、３分間遠心分離した後、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ８を用いて血中細胞毒性Ｔ細胞のレベルを確認し、抗ＣＤ４９ｂ（ＤＸ５）を用いて血中ＮＫ細胞の流細胞分析（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を行った。
また、実験最終日である１４日目に実験動物の脾臓を摘出して、脾臓重量／体重（Ｓｐｌｅｅｎ ｗｅｉｇｈｔ／Ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ）を確認した。
その結果、図１７のように、ドキソルビシン投与後、あらゆる実験群で免疫細胞が減少したが、アロニア抽出物−フコイダン複合体が処理された実験群では、アロニア抽出物（ＡＢＦ）とフコイダンとが単独処理された実験群よりも優れた免疫細胞（ＣＤ８ Ｔ細胞及びＮＫ細胞）回復力を示し、図１８のように、ドキソルビシンとアロニア抽出物−フコイダン複合体とが併用処理された実験群で減少した体重が最も優れているように回復される効果が確認された。
前記結果から、ドキソルビシン処理によって減少した体重をアロニア抽出物−フコイダン複合体が併用処理を通じて回復させることが確認された。
以上、本発明の内容の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者において、このような具体的な記述は、単に望ましい実施形態であり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではない点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、下記の特許請求の範囲とそれらの等価物とによって定義される。

Claims (6)

  1. アロニア抽出物及びフコイダンからなり、前記アロニア抽出物のうち、シアニジンの陽イオンと前記フコイダンの陰イオンとのイオン結合が形成され、シアニジン分子間のπ−π結合が形成されたことを特徴とするアロニア抽出物−フコイダン複合体を有効成分として含有する免疫増強剤。
  2. 前記アロニア抽出物−フコイダン複合体は、免疫因子の発現を誘導して免疫細胞の活性を増加させることを特徴とする請求項１に記載の免疫増強剤。
  3. アロニア抽出物及びフコイダンからなり、前記アロニア抽出物のうち、シアニジンの陽イオンと前記フコイダンの陰イオンとのイオン結合が形成され、シアニジン分子間のπ−π結合が形成されたことを特徴とするアロニア抽出物−フコイダン複合体を有効成分として含有する免疫抗ガン剤。
  4. 前記アロニア抽出物−フコイダン複合体は、免疫因子の発現を誘導して免疫細胞の活性を増加させて、癌細胞を死滅させることを特徴とする請求項３に記載の免疫抗ガン剤。
  5. 前記癌細胞は、固形癌の癌細胞であることを特徴とする請求項４に記載の免疫抗ガン剤。
  6. アロニア抽出物及びフコイダンからなり、前記アロニア抽出物のうち、シアニジンの陽イオンと前記フコイダンの陰イオンとのイオン結合が形成され、シアニジン分子間のπ−π結合が形成され、抗ガン剤投与による体重または免疫因子の減少及び悪液質からなる群から選択される副作用を緩和させることを特徴とするアロニア抽出物−フコイダン複合体を有効成分として含有する抗ガン補助剤。

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