KR20220067765A - 템시로리무스를 유효성분으로 포함하는 면역증진제 - Google Patents
템시로리무스를 유효성분으로 포함하는 면역증진제 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 템시로리무스를 유효성분으로 포함하는 면역증진제에 관한 것으로, 템시로리무스가 암세포에서 PD-L1, Flotillin-1, TSG101, CD63, 및 Alix의 발현을 억제하고, mTOR 신호 전달을 억제하고, 엑소좀의 분비를 억제하며, 세포 내 및 엑소좀의 PD-L1 발현을 억제함으로써 암의 진행을 억제하는 효과가 있다는 것을 확인하였고, T 세포의 세포 사멸능을 증진함으로써 면역 항암 활성을 향상시키므로써, 암의 예방 또는 치료를 위한 면역증진제 또는 면역항암제로 제공된다.
Description
본 발명은 템시로리무스를 유효성분으로 포함하는 면역증진제에 관한 것이다.
암은 비정상적인 세포의 과잉으로 인하여 발생하는 비제어적이고 무질서한 세포 증식의 산물로서, 분자생물학적인 관점에서 볼 때 유전자의 변이에 의하여 발생하는 질환이라고 할 수 있다. 대부분의 암은 초기에 증상이 없으며, 증상이 있다고 하더라도 경미하여 대부분의 사람들이 이를 간과하기 쉽고, 이는 암의 사망률을 높이는 원인이 되고 있다. 암의 치료를 위해서 수술 요법, 화학 요법, 방사선 요법 등이 사용되고 있으나 많은 연구에도 불구하고 암 환자 전체의 50% 이상이 결국 치유되지 못하고 사망하는 것으로 보고된다. 그 이유는 항암제에 대한 암세포의 사멸이 유도되지 않거나 초기에는 반응을 보여 종양이 줄어드는 듯 보이지만 치료도중이나 치료가 끝난 후 항암제에 대한 내성이 생긴 암세포들이 급격히 증가하기 때문이다.
암세포가 항암제에 대한 내성을 갖는 방법 중 하나는 면역계 회피능을 갖는 것이다. 이들은 프로그램 된 사멸 1(PD-1)과 통신하는 프로그램 된 사멸-리간드 1(PD-L1)의 표면 발현을 유도함으로써 항암제 또는 체내 면역 세포로부터의 공격을 회피한다. 특히 엑소좀 PD-L1(Exosomal PD-L1)은 PD-1과 상호 작용할 수 있고 T 세포의 활성화를 억제하여 암 생존을 도울 수 있다. 그러나 종양 유래 엑소좀 PD-L1(Exosomal PD-L1)의 분비 조절 인자에 관한 연구는 명확하지 않다. 따라서 최근에는 암 자체를 공격하는 기존의 항암제와는 다르게 효과적으로 암을 치료하기 위해 암의 면역 회피를 제어하면서 면역체계가 암세포만을 공격하도록 유도할 수 있는 새로운 면역항암제에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.
한편, 엑소좀은 지질, 대사 산물, RNA, DNA, 및 단백질 등의 다양한 생체 분자를 포함하는 50 ~ 150nm 크기의 소포이다. 엑소좀은 세포에서 분비되어 전신을 순화하다가 수용체 세포로 전달된다. 암세포에서 분비되는 엑소좀은 암의 전이를 유도하거나 암의 악성화를 위한 미세 환경을 유도하는 역할을 한다. 따라서 면역항암제의 개발에 암 세포에서 유래되는 엑소좀의 기능을 이해하고 이의 역할을 억제하는 방법에 대한 연구가 지속되고 있다.
본 발명은 템시로리무스를 유효성분으로 포함하는 면역증진제에 관한 것으로, 템시로리무스가 암세포에서 PD-L1, Flotillin-1, TSG101, CD63, 및 Alix의 발현을 억제하고, mTOR 신호 전달을 억제하고, 엑소좀의 분비를 억제하며, 세포 내 및 엑소좀의 PD-L1 발현을 억제함으로써 암의 진행을 억제하는 효과가 있다는 것을 확인하였고, T 세포의 세포 사멸능을 증진함으로써 면역 항암 활성을 향상시키므로써, 암의 예방 또는 치료를 위한 면역증진제 또는 면역항암제로 제공하는 것이다.
본 발명은 템시로리무스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역증진제를 제공한다.
또한, 본 발명은 템시로리무스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역항암용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 템시로리무스 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역증진용 건강기능 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 템시로리무스가 암세포에서 PD-L1, Flotillin-1, TSG101, CD63, 및 Alix의 발현을 억제하고, mTOR 신호 전달을 억제하고, 엑소좀의 분비를 억제하며, 세포 내 및 엑소좀의 PD-L1 발현을 억제함으로써 암의 진행을 억제하는 효과가 있다는 것을 확인하였고, T 세포의 세포 사멸능을 증진함으로써 면역 항암 활성을 향상시키므로써, 암의 예방 또는 치료를 위한 면역증진제 또는 면역항암제로 제공될 수 있다.
도 1은 암세포의 종류에 따라 엑소좀에 발현된 PD-L1 수준(a) 및 세포에 발현된 PD-L1 수준(b)을 조사한 결과이다.
도 2는 암세포에서 라파마이신 유사 약물이 세포 생존율(a), 세포 수(b), mTOR 신호 경로(c)에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 3은 암세포에서 라파마이신 유사 약물이 엑소좀 분비(a), 엑소좀 마커 단백질 및 PD-L1 단백질 수준(b), 엑소좀 단백질 수준(c), 및 나노입자 추적 분석(NTA)에 의한 엑소좀 분비(d)에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 4는 암세포에서 템시로리무스가 PD-L1 단백질 수준(a), PD-L1 및 엑소좀 마커 단백질의 발현 수준(b), 및 엑소좀 단백질 수준(c)에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 5는 마우스 유방암 세포에서 템시로리무스가 세포독성(a), 엑소좀 분비(b), PD-L1 및 엑소좀 마커 단백질의 발현(c), 및 엑소좀 단백질 발현(d)에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 6은 템시로리무스가 T 세포에 대한 세포독성(a), T 세포의 세포 독성 능력(b), T 세포 매개 암세포 사멸능(c, d, e)에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 7은 암세포에서 템시로리무스가 Alix, CD63, 및 RAB 계열 단백질의 발현에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 8은 이종 이식 종양 동물모델에서 템시로리무스가 종양 크기(a), PD-L1 단백질의 발현(b, c)에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 9는 동물 모델에서 템시로리무스와 항 PD-L1의 시너지 효과를 확인하기 위해 종양의 부피 변화(a) 및 종양의 성장 곡선(b)를 평가한 결과이다.
도 2는 암세포에서 라파마이신 유사 약물이 세포 생존율(a), 세포 수(b), mTOR 신호 경로(c)에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 3은 암세포에서 라파마이신 유사 약물이 엑소좀 분비(a), 엑소좀 마커 단백질 및 PD-L1 단백질 수준(b), 엑소좀 단백질 수준(c), 및 나노입자 추적 분석(NTA)에 의한 엑소좀 분비(d)에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 4는 암세포에서 템시로리무스가 PD-L1 단백질 수준(a), PD-L1 및 엑소좀 마커 단백질의 발현 수준(b), 및 엑소좀 단백질 수준(c)에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 5는 마우스 유방암 세포에서 템시로리무스가 세포독성(a), 엑소좀 분비(b), PD-L1 및 엑소좀 마커 단백질의 발현(c), 및 엑소좀 단백질 발현(d)에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 6은 템시로리무스가 T 세포에 대한 세포독성(a), T 세포의 세포 독성 능력(b), T 세포 매개 암세포 사멸능(c, d, e)에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 7은 암세포에서 템시로리무스가 Alix, CD63, 및 RAB 계열 단백질의 발현에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 8은 이종 이식 종양 동물모델에서 템시로리무스가 종양 크기(a), PD-L1 단백질의 발현(b, c)에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 9는 동물 모델에서 템시로리무스와 항 PD-L1의 시너지 효과를 확인하기 위해 종양의 부피 변화(a) 및 종양의 성장 곡선(b)를 평가한 결과이다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 템시로리무스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역증진제를 제공한다.
상기 템시로리무스는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물이다.
[화학식 1]
상기 템시로리무스는 암세포에서 PD-L1, Flotillin-1, TSG101, CD63, 및 Alix의 발현을 억제하는 활성을 갖고, 암세포에서 mTOR 신호 전달을 억제하고, 엑소좀의 분비를 억제하는 활성을 갖고, 세포 내 및 엑소좀의 PD-L1 발현을 억제하는 활성을 갖는다. 또한, 상기 템시로리무스는 T 세포의 세포 사멸능을 증진시키는 활성을 갖는다.
따라서 템시로리무스를 유효성분으로 포함하는 조성물은 암의 진행을 억제할 뿐만 아니라 면역 세포인 T 세포의 활성을 증진시킴으로써 면역증진제 또는 면역항암제로 제공될 수 있다.
또한, 본 발명은 템시로리무스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료를 위한 면역항암용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 약학적 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 외용제 형태로 제형화될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 제형화를 위해 추가로 있는 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제는 전분, 당, 및 만니톨과 같은 부형제, 칼슘 포스페이트 등과 같은 충전제 및 증량제, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등과 같은 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 알긴산염, 및 폴리비닐 피롤리돈 등과 같은 결합제, 활석, 스테아린산 칼슘, 수소화 피마자유 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제, 포비돈, 크로스포비돈과 같은 붕해제, 폴리소르베이트, 세틸알코올, 및 글리세롤 등과 같은 계면활성제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제는 대상체에게 생물학적 및 생리학적으로 친화적인 것일 수 있다. 희석제의 예로는 염수, 수용성 완충액, 용매 및/또는 분산제(dispersion media)를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여된다. 또한 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 대상체의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 면역항암용 약학적 조성물은 암의 예방 또는 치료를 위해 면역체크포인트억제제와 병용 투여될 수 있다. 상기 면역체크포인트억제제는 CTLA4 억제제, PD-1 억제제, 또는 PD-L1 억제제이며, 구체적으로 CTLA4 억제제는 여보이 주(Yervoy®, 성분명: ipilimumab)일 수 있고, PD-1 억제제는 키트루다 주(Keytrudaⓡ, 성분명: pembrolizumab), 옵디보 주(Opdivoⓡ, 성분명: nivolumab)일 수 있고, PD-L1 억제제는 티쎈트릭 주(Tecentriqⓡ, 성분명: atezolizumab) 또는 임핀지 주(Imfinziⓡ, 성분명: durvalumab)일 수 있다.
또한, 본 발명은 템시로리무스 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역증진용 건강기능 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 통상적으로 이용되는 식품으로써 일반적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품으로서 사용될 수 있다. 상기 "건강기능 식품"이라 함은 건강기능 식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 "식품 첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품 첨가물 공전"에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
예를 들어, 캡슐 형태의 건강기능 식품 중 경질캡슐제는 통상의 경질캡슐에 본 발명에 따른 조성물을 부형제 등의 첨가제와 혼합 및 충진하여 제조할 수 있으며, 연질캡슐제는 본 발명에 따른 조성물으 부형제 등의 첨가제와 혼합하고 젤라틴 등 캡슐기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질캡슐제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명에서 용어 “예방”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여로 질환의 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다. 본 발명에서 용어 “치료”는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.
또한, 본 발명은 템시로리무스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물을 치료학적으로 유효한 양으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 면역 증진 방법을 제공한다.
상기 대상체는 인간을 포함하는 포유류일 수 있으며, 구체적으로 인간, 원숭이, 소, 말, 개, 고양이, 토끼, 레트, 마우스 등의 포유류를 포함한다.
상기 치료학적으로 유효한 양은 암의 치료에 유효한 양으로, 예컨대 치료하고자 하는 대상에게 투여되는 조성물의 양으로, 림프종의 발생 또는 재발을 예방하거나, 증상을 완화시키거나, 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저해시키거나, 전이를 예방하거나, 진행 속도를 감소시키거나, 상태를 경감 또는 일시적 완화시키거나, 예후를 개선시키는 조성물의 양을 모두 포함할 수 있다. 즉, 상기 치료학적 유효한 양은 상기 조성물에 의해 림프종의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 용량을 포괄하는 것으로 해석될 수 있다.
또한, 본 발명은 템시로리무스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역증진용 시약 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실험예 및 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실험예 및 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실험예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실험예 및 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험예> 실험 재료 및 방법
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 세포주 및 세포 배양
유방암 세포주인 MDA-MB231 세포 및 4T1 세포를 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 분양받았으며, 권장 배양배지를 사용하여 5% CO2, 37℃ 가습 조건에서 배양되었다. MDA-MB231 세포 및 4T1 세포는 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% 항생제를 포함하는 DMED(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) 배지에서 배양되었다. 세포는 30일 마다 변경하였다.
2. MTT 세포 독성 분석
MDA-MB231 세포 및 4T1 세포를 10,000 세포/웰 농도로 24 웰 세포 배양판에 접종하고, 24 시간 동안 배양하였다. 여러 농도의 mTOR 억제제를 포함하는 무혈청 배지로 교환하고 48 시간 동안 배양하였다. 그 후, 0.5 mg/ml MMT 용액을 추가하고, 5% CO2, 37℃ 가습 조건에서 2 시간 동안 배양하고, MMT 용액과 배지를 제거하였다. 이소프로판올을 첨가하고, 상온에서 흔들면서 염료를 추출하였다. 혼합물을 96 웰 플레이트로 옮기고 595 nm 흡광도로 측정하였다.
3. 미세소포 및 엑소좀 분리
세포를 3 X 106 농도로 15 cm 플레이트에 접종하였다. 배양 후, MDA-MB231 세포 및 4T1 세포 각각의 배양으로부터 배지를 수집하였다. 수집된 배지를 3분 동안 300 xg에서 원심분리하고, 20분 동안 2,500 xg에서 원심분리하였다. 이후 0.8 μm 주사기 필터로 여과한 후, 30분 동안 10,000 xg에서 원심분리하였다. 펠렛을 1 ml PBS에 재현탁하고, 나노 입자 추적 분석(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)으로 검사하였다. 엑소좀을 분리하기 위해, 개별 배지 샘플을 순차적으로 3분 동안 300 xg에서, 20분 동안 2,500 xg에서, 30분 동안 10,000 xg에서 원심분리하였다. 상등액은 0.2 μm 주사기 필터로 여과한 후, 90분 동안 120,000 xg에서 원심분리하였다. 엑소좀을 추가적으로 분석하기 위해 PBS 또는 1 X RIPA 버퍼에 재현탁하였다.
4. 나노 입자 추적 분석(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)
미세소포 및 엑소좀을 포함하는 세포 배양 상등액은 NanoSight LM10 장치(NanoSight, Malvern)를 사용하여 분석되었다. 405nm 단색 레이저를 사용하여 나노 입자를 분석하였다. 30초 동영상은 30 프레임/s, 카메라 레벨 9로 촬영되었다. 엑소좀 운동은 NTA software version 2.0 (NanoSight)을 사용하여 분석하였다. 약 30~100개의 입자를 분석하였다. 녹화된 비디오는 입자 크기 및 농도를 측정하기 위해 분석되었다.
5. 엑소좀 단백질 농도 분석
엑소좀 단백질 농도는 BCA 분석법으로 측정하였다. 분리된 엑소좀 단백질은 제조사의 지시에 따라 1 X RIPA 버퍼(#50-188; Merch Millipore)로 추출되고, BCA 분석에 사용되었다.
6. 웨스턴 블롯
엑소좀, 미세소낭 및 세포 단백질은 SDS(sodium dodecyl sulfate) 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 분리하고, 나이트로셀룰로오스 막에 옮겨 1차 항체와 결합하고, HRP(horseradish peroxidase)-연결 이차 항체와 배양하였다. 이미지는 ECL(enhanced chemiluminescence) 검출 시약(#34580 Thermo scientific) 및 ECL 하이퍼필름(AGFA, Morstel)을 사용하여 분석하였다. 1차 항체는 Alix (ab56932, 1:1000; Abcam), CD63 (ab68418, 1:1000; Abcam), TSG101 (ab56932, 1:1000; abcam), β-actin (#112620, 1:20000; cell signaling technology), Rab27a (ab55667, 1:1000; abcam), Rab11 (ab18211, 1:1000; abcam), Rab7 (ab50533, 1:1000; abcam), nSMase2 (ab6735, 1:1000; abcam), 및 PD-L1 (#13684, 1:1000; cell signaling Technology)을 사용하였다.
7. T 세포 매개 종양 세포 사멸 분석
1 X 103 농도의 4T1 루시퍼라제 (+) 세포를 유방 CD8+ 비장 T 세포, 약물 및 엑소좀과 배양하였다. 48 시간 후, 암세포를 두 번 세척하고, PBS로 희석된 2 mg/ml 루시퍼린을 처리하였다. 발광은 Enspire Alpha 2300 장치를 사용하여 측정하였다.
8. FACS
정제 CD8+ T 세포를 PBS에서 CFSE로 염색하고, 4T1 유방암 세포 유래 엑소좀 및 CD8+ T 세포 사이의 물리적 상호작용을 분석하였다. 자극 또는 비자극 비장 CD8+ T 세포를 1 X 105 세포/웰 농도로 96-웰 플레이트에 접종하고, 4T1 엑소좀을 48 시간 동안 처리하였다. 이후, 고정 버퍼(Invitrogen, 2106527) 및 투과 버퍼(Invitrogen, 2097135)를 처리하고, 그랜자임 B(Invitrogen, 652406)로 염색하였다.
9. 동물실험
모든 동물 실험은 경북대학교 동물실험윤리위원회(Kyungpook National University Institutional Animal Care and Use Committee, KNU-IACUCs)에서 승인한 지침에 다라 수행되었다.
50 μl PBS이 첨부된 50 μl 매트리겔에 MDA-MB231 세포를 5 X 106 세포 농도로 5 주령 암컷 BALB/C 누드 마우스의 왼쪽 지방 패드에 주입하였다. 10 또는 20 mg kg-1 day-1 용량의 템시로리무스(TEM)를 14일 동안 복강 내(IP)로 투여하였다.
50 μl PBS이 첨부된 50 μl 매트리겔에 4T1 세포를 5 X 104 세포 농도로 5 주령 암컷 BALB/C 야생형 마우스의 왼쪽 지방 패드에 주입하였다. 종양 보유 마우스에 5 mg/kg 템시로리무스(TEM) 및 100 μl 항-PD-L1을 14일 동안 매일 복강 내(IP)로 투여하였다. 종양의 부피는 3일마다 디지털 캘리퍼(digital caliper)를 사용하여 측정하고, “(폭)2 X 길이/2” 공식을 사용하여 종양의 부피를 계산하였다. 마우스를 치사하고 종양의 무계를 측정하였다. 종양 조직을 분쇄하고, 1 X RIPA 완충액을 처리하여 웨스턴 블롯하였다. 마우스 혈액은 심장에서 수집하고, 엑소좀은 차등 초원심분리로 정제하였다.
10. 통계분석
두 데이터 세트를 비교하기 위해 짝을 이루지 않은 양측 학색 t-검정(Unpaired two-tailed students t-test)을 사용하였다. 그래픽 데이터의 기호 및 오류막대는 평균 ± 표준 편차로 나타냈다. 모든 시험관 내 실험은 달리 명시하지 않는 한 세 번 수행하였다. 0.05 미만의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. p-값이 <0.05이면 *, <0.005이면 **, <0.001이면 ***로 나타냈다. 데이터는 PRISM 6 소프트웨어(GraphPad Software, Inc.)를 사용하여 분석되었다.
실시예 1. 암세포에서 PD-L1의 수준 평가
유방암 또는 흑생종 세포주인 MCF10A 세포, MCF7 세포, MDA-MB231 세포, SK-MEL-28 세포, 및 A375 세포에서 세포내 또는 엑소좀에 존재하는 PD-L1 수준을 측정하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 유방암 세포인 MDA-MB231 세포에서 세포내 또는 엑소좀에 존재하는 PD-L1 수준이 매우 높게 발현되는 것으로 나타났다.
실시예 2. 라파마이신 유사 약물이 세포 독성 및 mTOR 신호에 미치는 영향 평가
템시로리무스와 같이 라파마이신 유사 약물에 세포 독성이 있는지 평가하기 위해, MDA-MB231 세포에 각 약물을 처리하고 48 시간 후에 세포 생존 가능성을 MTT 방법으로 측정하고, 약물 노출 후의 최종 세포수를 계수하였다. 템시로리무스와 같이 라파마이신 유사 약물이 mTOR 신호 경로에 미치는 영향을 평가하기 위해, 약물 처리 후 phosphor-mTOR(p-mTOR) 및 mTOR의 발현 수준을 측정하였다.
도 2a 및 2b에 나타난 바와 같이, 템시로리무스와 같이 라파마이신 유사 약물인 시롤리무스(sirolimus) 및 에베로리무스(everolimus)에 세포 독성이 나타나지 않으며, 세포 수에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다. 도 2c에 나타난 바와 같이, 템시로리무스, 시롤리무스(sirolimus) 및 에베로리무스(everolimus)를 MDA-MB231 세포에 처리함에 따라 phosphor-mTOR(p-mTOR)의 수준이 감소하는 것으로 나타났다.
상기 결과는 템시로리무스와 같이 라파마이신 유사 약물이 세포 독성을 나타내지 않고, 세포 증식에도 영향을 주지 않지만, mTOR 신호 전달을 억제하는 활성을 나타낸다는 것을 입증한다.
실시예 3. 라파마이신 유사 약물이 엑소좀 및 미세소낭 분비에 미치는 영향 평가
템시로리무스와 같이 라파마이신 유사 약물이 엑소좀 및 미세소낭 분비에 미치는 영향을 평가하기 위해, MDA-MB231 세포에 각 약물을 처리하고 미세소낭 분비 정도를 측정하였다. 또한, 세포에 약물을 처리함에 따라 PD-L1, Flotillin-1, TSG101, CD63, Alix 등과 같은 미세소낭 분비 단백질 및 엑소좀 마커 단백질의 발현의 변화를 측정하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, MDA-MB231 세포에서 라파마이신 유사 약물은 용량 의존적으로 엑소좀 분비를 억제하였으며, 특히, 템시로리무스는 다른 약물에 비해 낮은 농도에서도 암세포의 엑소좀 분비를 유의하게 억제하는 것으로 나타났다. 또한, 라파마이신 유사 약물을 처리함에 따라 MDA-MB231 세포에서 미세소낭 분비 단백질 및 엑소좀 마커 단백질의 발현이 억제되었으며, 특히 템시로리무스는 다른 약물에 비해 미세소낭 분비 단백질 및 엑소좀 마커 단백질의 발현을 현저하게 억제하였다.
실시예 4. 템시로리무스가 PD-L1 수준에 미치는 영향 평가
템시로리무스가 세포 및 엑소좀의 PD-L1 수준에 미치는 영향을 평가하기 위해, MDA-MB231 세포에 템시로리무스를 처리하고 세포 및 엑소좀의 PD-L1 수준을 측정하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, 유방암 세포인 MDA-MB231 세포에서 템시로리무스는 용량 의존적으로 세포 및 엑소좀의 PD-L1 수준을 감소시켰으며, 동일한 수의 세포에서 유래된 엑소좀 PD-L1의 수준을 평가한 경우에도, 템시로리무스를 처리한 세포에서 PD-L1 및 엑소좀 마커 단백질의 발현 수준이 감소하는 것으로 나타났다.
상기 결과는 템시로리무스가 엑소좀 분비 및 PD-L1 발현을 억제함으로써, 암세포의 면역 회피 기작을 억제하는 활성이 있다는 것을 시사한다.
실시예 5. 템시로리무스가 엑소좀 분비 및 PD-L1 발현에 미치는 영향 평가
템시로리무스가 항 PD-L1 치료 및 T 세포 활성에 시너지 효과를 유도하는지 확인하기 위해, 마우스 유방암 세포에서 엑소좀 분비, PD-L1 및 엑소좀 마커 단백질의 발현, 및 엑소좀 단백질 발현에 미치는 영향을 평가하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, 템시로리무스는 마우스 유방암 세포인 4T1 세포에서 세포독성을 나타내지 않았지만, 엑소좀 분비를 억제하였다. 또한, PD-L1 및 엑소좀 마커 단백질의 발현 수준을 억제하였고, 엑소좀 단백질에서 유래된 PD-L1의 수준도 현저하게 억제하는 것으로 나타났다.
상기 결과는 템시로리무스가 엑소좀의 분비를 억제할 뿐만 아니라 엑소좀 PD-L1의 수준도 억제한다는 것을 입증한다.
실시예 6. 템시로리무스가 T 세포 활성에 미치는 영향 평가
템시로리무스가 엑소좀 PD-L1의 분비를 억제함으로써 T 세포 활성에 미치는 영향을 평가하기 위해, 템시로리무스를 T 세포에 처리하고 CD8+ T 세포에 대한 세포 독성, T 세포 매개 종양세포 사멸능 변화, 4T1 암세포의 생존율을 측정하였다.
CD8+ T 세포에 템시로리무스(TEM)을 처리하고 48 시간 후에 T 세포의 생존율을 MTT로 측정하여 세포 독성을 평가하였다. T 세포 매개 종양세포 사멸능 평가는 템시로리무스(TEM)를 48 시간 동안 처리하거나 처리하지 않은 T 세포를 암세포에 5배 또는 10배 처리하고 사멸되는 정도를 측정하였다. 또한 암세포 증식은 4T1 암세포에 엑소좀, 엑소좀 차단 항PD-L1 및 CD8+ T 세포를 처리하고 암세포의 생존율을 측정하였다.
T 세포 매개 암세포 사멸능 평가를 위해, 4T1 세포에 템시로리무스, 엑소좀, 및 엑소좀 차단 항 PD-L1과 함께 T 세포와 공동 배양하고, 48 시간 후에 암세포의 생존율을 alpha-LISA로 측정하여 엑소좀이 4T1 세포에 미치는 영향을 평가하였다. 또한, CD3/CD28 항체로 자극된 유방 비장 CD8+ T 세포를 4T1 엑소좀, 엑소좀 차단 항 PD-L1, 및 엑소좀과 함께 템시로리무스(TEM)로 처리하고 CFSE 염색으로 T 세포 증식을 측정하였다. 측정은 FASS에 의해 대표 히스토그램으로 표시하였다.
도 6a, 6b에 나타난 바와 같이, 템시로리무스(TEM)는 T 세포에 대해 세포독성을 나타내지 않았으며, 4T1 암세포와 T 세포를 1:5 또는 1:10 비율로 공배양하여 T 세포의 세포 사멸능을 확인한 결과, 템시로리무스(TEM)로 전처리된 T 세포의 경우 4T1 암세포가 사멸되는 정도가 상당히 증가하는 것으로 나타났다.
또한, 도 6c에 나타난 바와 같이, 4T1 암세포 및 CD8+ T 세포를 4T1 암세포 유래 엑소좀과 함께 배양한 결과, 엑소좀이 암세포의 증식을 유도하였으나, 항-PD-L1로 차단된 엑소좀은 상대적으로 야생형 엑소좀에 비해 암세포의 증식 효과가 억제되는 것으로 나타났다.
또한, 도 6d에 나타난 바와 같이, T 세포 매개 암세포 사멸능을 평가한 결과, 템시로리무스(TEM)가 T 세포 매개 암세포 사멸을 유의하게 유도하고, 항-PD-L1를 템시로리무스(TEM)와 함께 처리시 암세포 사멸에 시너지 효과가 나타났다. 엑소좀을 처리하면 암세포 증식이 유도되었지만, 항-PD-L1로 처리된 엑소좀은 암세포의 증식이 억제되는 것으로 나타났다.
또한, 도 6e에 나타난 바와 같이, T 세포의 활성이 엑소좀 분비 억제에 의해 증가되는지 확인하기 위해, 엑소좀을 CD8+ T 세포와 함께 배양한 결과, 엑소좀이 CD8+ T 세포에서 그랜자임 B(Granzyme B)의 발현을 감소키지만, 항-PD-L1로 처리된 엑소좀 또는 템시로리무스(TEM)로 처리된 엑소좀은 CD8+ T 세포의 그랜자임 B(Granzyme B)의 발현을 회복시키는 것으로 나타났다.
상기 결과는 템시로리무스(TEM)가 엑소좀 PD-L1의 분비를 억제하고 항-PD-L1과 상승작용하며, T 세포에서 그랜자임 B(Granzyme B)의 발현을 유지하여 T 세포 매개 암세포 사멸을 유지시키는 메커니즘을 입증한다.
실시예 7. 템시로리무스가 엑소좀 분비를 억제하는 메커니즘 평가
템시로리무스가 엑소좀 분비를 억제하는 메커니즘을 분석하기 위해, MDA-MB231 세포에 템시로리무스(TEM)를 처리하고, MVB(Multivesicular body) 마커인 Alix 및 CD63의 발현 변화를 측정하고, RAB 계열의 단백질인 RAB 11 및 RAB 7의 발현 변화를 측정하였다.
도 7에 나타난 바와 같이, MVB 마커 단백질과 RAB 11 단백질의 발현은 템시로리무스(TEM)의 처리 용량 및 처리 시간이 증가함에 따라 감소하는 것으로 나타났다. 또한, 템시로리무스(TEM)의 처리 용량 및 처리 시간이 증가함에 따라 자가 포식과 관련된 RAB 7의 발현 수준이 증가하는 것으로 나타났다.
상기 결과는 템시로리무스(TEM)가 암세포에서 MVB 마커 단백질과 RAB 11 단백질의 발현을 억제하여 엑소좀 분비를 억제하고, RAB 7의 발현을 유도하여 자가 포식의 성숙을 촉진하는 것을 입증한다.
실시예 8. 동물 모델에서 템시로리무스가 종양의 진행에 미치는 영향 평가
템시로리무스가 이종 이식 종양 동물모델에서 종양의 진행 및 PD-L1의 수준에 미치는 영향을 평가하였다. BALB/C 누드 마우스 모델에 MDA-MB231- 루시페라제 세포를 이식하여 종양을 유도하였다. 종양의 질량은 캘리퍼스로 측정하였으며, 종양은 3일마다 측정하였다.
도 8a에 나타난 바와 같이, 이종 이식 종양이 유도된 동물모델에 템시로리무스를 투여한 결과, 대조군에 비해 종양의 부피가 현저하게 감소하는 것으로 나타났다.
도 8b 및 8c에 나타난 바와 같이, 동물 모델의 혈장에 존재하는 엑소좀 PD-L1의 수준은 템시로리무스를 투여하자 현저하게 감소하였고, 종양 조직에서 유래된 PD-L1의 수준도 템시로리무스를 투여하자 현저하게 감소하였다.
상기 결과는 템시로리무스가 종양 조직 및 엑소좀의 PD-L1의 수준을 모두 억제하고, 종야의 부피를 감소시키는 효과가 있음을 입증한다.
실시예 9. 동물 모델에서 템시로리무스가 항-PD-L1 치료와 시너지 효과 평가
템시로리무스가 동물 모델에서 항 PD-L1과 시너지 효과를 나타내는지 확인하기 위해, BALB/C 야생형 마우스에 템시로리무스(TEM) 및/또는 항 PD-L1를 처리하여 종양의 질량 변화 및 종양 부피 변화를 측정하였다.
도 9에 나타난 바와 같이, 템시로리무스(TEM) 또는 항 PD-L1를 각각 처리하는 경우 보다 템시로리무스(TEM)와 항 PD-L1을 병용 투여한 경우 종양의 질량 및 부피가 현저히 감소하는 것으로 나타났다.
상기 결과는 템시로리무스(TEM)가 항암 활성을 나타내며, 항 PD-L1와 병용 투여시 시너지 효과가 나타난다는 것을 입증한다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.
Claims (12)
- 템시로리무스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역증진제.
- 제1항에 있어서, 상기 템시로리무스는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 면역증진제.
[화학식 1]
- 제1항에 있어서, 상기 템시로리무스는 암세포에서 PD-L1, Flotillin-1, TSG101, CD63, 및 Alix의 발현을 억제하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 면역증진제.
- 제1항에 있어서, 상기 템시로리무스는 암세포에서 mTOR 신호 전달을 억제하고, 엑소좀의 분비를 억제하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 면역증진제.
- 제1항에 있어서, 상기 템시로리무스는 암세포에서 세포 내 및 엑소좀의 PD-L1 발현을 억제하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 면역증진제.
- 제1항에 있어서, 상기 템시로리무스는 T 세포의 세포 사멸능을 증진시키는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 면역증진제.
- 템시로리무스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료를 위한 면역항암용 약학적 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 면역항암용 약학적 조성물은 암의 예방 또는 치료를 위해 면역체크포인트억제제와 병용 투여되는 것을 특징으로 하는 면역항암용 약학적 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 면역체크포인트억제제는 CTLA4 억제제, PD-1 억제제, 또는 PD-L1 억제제인 것을 특징으로 하는 면역항암용 약학적 조성물.
- 템시로리무스 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역증진용 건강기능 식품 조성물.
- 템시로리무스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물을 치료학적으로 유효한 양으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 면역 증진 방법.
- 템시로리무스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역증진용 시약 조성물.
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| KR20220067765A true KR20220067765A (ko) | 2022-05-25 |
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|---|---|---|---|---|
| KR102134307B1 (ko) | 2017-10-27 | 2020-07-15 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 안토시아닌-후코이단 복합체를 유효성분으로 함유하는 면역증강제, 면역항암제 및 항암제 부작용 완화제 |
-
2020
- 2020-11-18 KR KR1020200154356A patent/KR20220067765A/ko not_active Application Discontinuation
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