KR20190047626A - 안토시아닌-후코이단 복합체를 유효성분으로 함유하는 면역증강제, 면역항암제 및 항암제 부작용 완화제 - Google Patents

안토시아닌-후코이단 복합체를 유효성분으로 함유하는 면역증강제, 면역항암제 및 항암제 부작용 완화제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 안토시아닌과 후코이단의 이온결합에 의해 형성되는 안토시아닌-후코이단 복합체를 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 기술로, 보다 상세하게 생체적합성 및 생분해성이 높은 천연추출물인 후코이단의 음이온을 안토시아닌의 양이온과 이온결합시킨 안토시아닌-후코이단 복합체는 생체 내 산성 조건에서도 안토시아닌의 안정성과 용해도를 향상시킴으로써, 안토시아닌의 생체 내 면역활성을 증가시키는 효과를 확인함에 따라, 상기 안토시아닌-후코이단 복합체를 면역증강제, 면역항암제 및 항암제 부작용 완화용 항암보조제로 제공하고자 한다.

Description

안토시아닌-후코이단 복합체를 유효성분으로 함유하는 면역증강제, 면역항암제 및 항암제 부작용 완화제{Adjuvants, anticancer immuno-therapeutic agents and mitigation of chemo-therapeutic agents comprising anthoyanin-fucoidan complex}
본 발명은 안토시아닌과 후코이단의 이온결합에 의해 형성되는 안토시아닌-후코이단 복합체(anthoyanin-fucoidan complex)를 유효성분으로 함유하는 면역 증강제 및 항암제 부작용 완화용 항암보조제 조성물에 관한 것이다.
암 정복을 목표로 세계적으로 차세대 염기서열 (NGS) 기반 암 유전체 분석과 환경 등 여러 요인들을 기반으로 한 환자 맞춤형 정밀 의료를 위해 광범위한 연구가 추진되고 있지만 암질환은 여전히 치료가 어렵고 사망에 이를 수 있는 두려운 질병으로 인식되고 있으며, 항암제에 의해 치료가 되었다고 해도 위암의 경우 재발률은 55%, 대장암 20~50%, 폐암 20%~50%, 자궁암 5%~20% 그리고 유방암의 경우 10~15%인 것으로 보고(국립암센터)되어 졌다.
면역반응은 자기와 비자기를 확인하고, 비자기를 제거하기 위한 세포성, 체액성 반응을 말하며 면역력이 감소 되면 본래의 기능을 수행하지 못 하게 되고 결국 우리 몸은 외부물질의 공격에 쉽게 감염된다. 암의 경우, 감소된 면역활성에 의해 면역에 관여하는 면역세포들이 암세포를 공격할 수 없어 암이 제거되지 않는다.
안토시아닌은 주로 식물의 꽃이나 과실 등에 주로 포함되어 있는 천연색소배당체로, 블랙커런트, 블루베리, 아로니아, 체리, 흑미, 포도, 적양배추와 같은 식물에 많이 함유되어 있다. 주로 강력한 햇빛 자외선, 가혹한 추위와 높은 습도의 환경에서 고농도의 안토시아닌이 발견되는데, 그 이유는 강렬한 햇빛 자외선이 식물 세포핵의 DNA를 파괴시켜 식물체의 생명에 영향을 주기 때문에 식물 표면이나 중간층에 자외선 흡수물질인 안토시아닌을 생성시켜 보호하기 때문이다.
이러한 안토시아닌은 천연물로부터 추출이 용이하여 대량생산이 가능하고, 노화, 면역반응, 당뇨, 박테리아 감염증, 신경계 질환, 암 등에 약리활성이 우수한 물질로 알려져있다. 이에 따라 안토시아닌에 대한 사람들의 관심이 증가하고, 세계적인 웰빙 (well-being) 열풍으로 인해 안토시아닌을 함유한 제품들의 시장 규모가 점차 커지고 있다.
안토시아닌은 음식으로 섭취했을 때 가장 큰 효과가 나타나지만 위장관에서 머무르는 시간, 낮은 장관 벽 투과성, 낮은 용해도, 상업화를 위한 공정상에서의 불안정성이나 온도, 주변의 산소와 빛, 소화관 내의 pH 및 효소 또는 다른 영양분에 의해 생체 내에서는 5% 이하의 낮은 활성을 나타낸다.
이에 따라, 아로니아와 같은 식물체에서 추출된 천연물인 안토시아닌의 생체 내 안정성을 개선시켜 면역기능을 증진시킴으로써 효과적인 항암치료제로 사용할 수 있는 연구 개발이 필요한 실정이다.
대한민국공개특허 제10-2000-0065692호 (2000. 11. 15. 공개)
본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위해, 천연추출물인 후코이단을 안토시아닌과 이온결합시킴으로써, 안정성과 용해도를 향상시킨 안토시아닌 복합체를 면역증강제, 면역항암제 및 항암제 부작용 완화용 항암보조제 조성물로 제공하고자 한다.
본 발명은 안토시아닌과 후코이단으로 이루어진 복합체로서, 상기 안토시아닌 용액의 양이온과 상기 후코이단 용액의 음이온 간 이온결합이 형성되며, 안토시아닌 분자 간의 π-π 결합이 형성된 것을 특징으로 하는 안토시아닌-후코이단 복합체를 제공한다.
본 발명은 안토시아닌과 후코이단으로 이루어진 복합체로서, 상기 안토시아닌 용액의 양이온과 상기 후코이단 용액의 음이온 간 이온결합이 형성되며, 안토시아닌 분자 간의 π-π 결합이 형성된 것을 특징으로 하는 안토시아닌-후코이단 복합체를 유효성분으로 함유하는 면역증강제를 제공한다.
본 발명은 안토시아닌과 후코이단으로 이루어진 복합체로서, 상기 안토시아닌 용액의 양이온과 상기 후코이단 용액의 음이온 간 이온결합이 형성되며, 안토시아닌 분자 간의 π-π 결합이 형성된 것을 특징으로 하는 안토시아닌-후코이단 복합체를 유효성분으로 함유하는 면역항암제를 제공한다.
본 발명은 안토시아닌과 후코이단으로 이루어진 복합체로서, 상기 안토시아닌 용액의 양이온과 상기 후코이단 용액의 음이온 간 이온결합이 형성되며, 안토시아닌 분자 간의 π-π 결합이 형성된 것을 특징으로 하는 안토시아닌-후코이단 복합체를 유효성분으로 함유하는 항암용 건강식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 안토시아닌과 후코이단으로 이루어진 복합체로서, 상기 안토시아닌 용액의 양이온과 상기 후코이단 용액의 음이온 간 이온결합이 형성되며, 안토시아닌 분자 간의 π-π 결합이 형성된 것을 특징으로 하는 안토시아닌-후코이단 복합체를 유효성분으로 함유하는 항암보조제를 제공한다.
본 발명에 따르면, 생체적합성 및 생분해성이 높은 천연추출물인 후코이단의 음이온을 안토시아닌의 양이온과 이온결합시킨 안토시아닌-후코이단 복합체는 생체 내 산성 조건에서도 안토시아닌의 안정성과 용해도를 향상시킴으로써, 종양 동물모델의 면역활성을 증가시키고 항암제 처리에 의해 감소된 몸무게를 회복시킴으로써, 수명을 연장시키는 효과가 확인됨에 따라, 상기 안토시아닌-후코이단 복합체를 면역증강제, 면역항암제 및 항암제 부작용을 완화시키기 위한 항암보조제로 제공하고자 한다.
도 1은 시아니딘-후코이단 복합체(Cyaplex-F8)의 구조이다.
도 2는 시아니딘-후코이단 복합체의 흡광도 및 광학이미지를 확인한 결과이다.
도 3은 시아니딘-후코이단 복합체의 DLS 결과 (왼쪽) 및 시아니딘-후코이단 복합체의 주사전자현미경 분석 결과이다.
도 4는 시아니딘과 시아니딘-후코이단 복합체의 시아니딘의 분해도 차이를 확인한 결과이다.
도 5는 시아니딘-후코이단 복합체의 항암효능 및 정상세포에 대한 사멸율을 확인한 결과로, (a) HCT-116, (b) Hep-G2, (c) NIH/3T3 및 (d) HUVEC에서 시아니딘-후코이단 함량에 따른 IC50을 확인한 결과이다.
도 6은 시아니딘-후코이단 복합체의 면역인자 분비를 통한 면역유도 수준을 확인한 결과이다.
도 7은 발암물질과 종양촉진제가 처리된 실험동물에 PBS, 후코이단(Fu), 아로니아추출물(Aronia Bio-active Fractions; ABF) 및 시아니딘-후코이단 복합체(Cyaplex-F8)를 22주간 매일 경구투여하고 종양 생성여부를 확인한 결과이다.
도 8은 발암물질과 종양촉진제가 처리된 실험동물에 PBS, 후코이단(Fu), 아로니아(ABF) 및 시아니딘-후코이단 복합체(Cyaplex-F8)를 22주간 매일 경구투여하고 실험 5주, 9주, 12주, 16주, 18주, 20주 및 22주째 종양 성장 억제효과를 확인한 결과이다.
도 9는 발암물질과 종양촉진제가 처리된 실험동물에 PBS, 후코이단(Fu), 아로니아추출물(ABF) 및 시아니딘-후코이단 복합체(Cyaplex-F8)를 22주간 매일 경구투여하고 실험 9주, 11주, 14주, 16주, 18주 및 22주째 종양 성장 억제효과를 확인한 결과이다.
도 10은 발암물질과 종양촉진제가 처리된 실험동물에 PBS, 후코이단(Fu), 아로니아추출물(ABF) 및 시아니딘-후코이단 복합체(Cyaplex-F8) 경구 투여 후 각 실험군에서 실험동물의 몸무게 및 생존율을 확인한 결과이다.
도 11은 발암물질과 종양촉진제가 처리된 실험동물에 PBS, 후코이단(Fu), 아로니아추출물(ABF) 및 시아니딘-후코이단 복합체(Cyaplex-F8) 경구 투여 후 종양 결정 수(Nodule counts) 및 종양 면적(Tumor area) 증가율을 확인한 결과이다.
도 12는 발암물질과 종양촉진제가 처리된 실험동물에 PBS, 후코이단(Fu), 아로니아추출물(ABF) 및 시아니딘-후코이단 복합체(Cyaplex-F8)가 경구투여된 실험동물의 주요 장기인 심장, 폐, 간, 신장 및 비장 조직을 헤모톡실린&에오신 염색한 결과이다.
도 13은 발암물질과 종양촉진제가 처리된 실험동물에 PBS, 후코이단(Fu), 아로니아추출물(ABF) 및 시아니딘-후코이단 복합체(Cyaplex-F8)가 경구투여된 실험동물의 종양 조직을 헤모톡실린&에오신 염색한 결과이다.
도 14는 발암물질과 종양촉진제가 처리된 실험동물에 PBS, 후코이단(Fu), 아로니아추출물(ABF) 및 시아니딘-후코이단 복합체(Cyaplex-F8)가 경구투여된 실험동물의 혈장 내 IFN-γ 수준을 확인한 결과이다.
도 15는 암세포 이식으로 종양 생성이 유도된 실험동물에 독소루비신 정맥주사 후 PBS, 후코이단(Fu), 아로니아추출물(ABF) 및 시아니딘-후코이단 복합체(Cyaplex-F8)를 경구투여 후 종양 성장 억제효과를 확인한 결과이다.
도 16은 암세포 이식으로 종양 생성이 유도된 실험동물에 독소루비신 정맥주사 후 PBS, 후코이단(Fu), 아로니아추출물(ABF) 및 시아니딘-후코이단 복합체(Cyaplex-F8)를 경구투여 후 종양 성장 억제효과(A), 체중변화(B) 및 생존율(C)을 확인한 결과이다.
도 17은 마우스 동물모델에 독소루비신을 실험 1일 및 5일째(총 2회) 정맥주사 후 PBS, 후코이단(Fu), 아로니아추출물(ABF) 및 시아니딘-후코이단 복합체(Cyaplex-F8)를 14일간 경구투여하고 실험 5일 및 14일째 혈중 CD8+ T 세포와 NK 세포 수준을 확인한 결과이다.
도 18은 마우스 동물모델에 독소루비신을 실험 1일 및 5일째(총 2회) 정맥주사 후 PBS, 후코이단(Fu), 아로니아추출물(ABF) 및 시아니딘-후코이단 복합체(Cyaplex-F8)를 14일간 경구투여하고 실험 마지막날인 14일째 동물모델의 비장을 적출하여 비장 무게를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명은 보다 상세하게 설명한다.
본 발명자들은 생체적합성을 갖는 후코이단의 음이온이 아로니아 유래 안토시아닌인 시아니딘의 양이온과 이온결합하여 복합체를 생성함으로써, 위, 소장 및 혈액에서도 시아니딘을 구조적으로 안정화시켜, 체내와 유사한 조건에서 면역활성을 향상시키고 생체이용율과 생리활성이 우수한 복합체로 제공될 수 있음을 확인함에 따라, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 안토시아닌과 후코이단으로 이루어진 복합체로서, 상기 안토시아닌 용액의 양이온과 상기 후코이단 용액의 음이온 간 이온결합이 형성되며, 안토시아닌 분자 간의 π-π 결합이 형성된 것을 특징으로 하는 안토시아닌-후코이단 복합체를 제공할 수 있다.
보다 상세하게는 상기 안토시아닌은 시아니딘(Cyanidine)일 수 있으며, 상기 시아니딘은 아로니아 추출물에서 분리 정제된 시아니딘-3-글루코사이드(Cyanidine-3-Glucoside; C3G)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 안토시아닌은 꽃이라는 의미의 안토스(Anthos)와 파란색을 뜻하는 시아노스(cyanos)라는 그리스어가 합쳐진 말로 주로 베리류의 열매, 꽃, 줄기가 외부자극으로부터 자기 자신을 보호하기 위해서 파이토케미칼의 한 종류인 안토시아닌 색소를 만들어낸다. 이러한 안토시아닌은 자연계에서 약 600종이 존재하며, 이중 시아니딘-3-글루코사이드(Cyanidine-3-Glucoside; C3G)의 활성이 가장 뛰어나고 특히, 항노화, 항산화, 항암, 항대사성질환 작용이 우수하다.
상기 복합체는 안토시아닌과 후코이단이 0.1:10 내지 10:0.1 중량비로 형성될 수 있다.
상기 복합체는 50nm 내지 500nm 범위의 평균 직경을 갖는 나노복합체일 수 있다.
본 발명은 안토시아닌과 후코이단으로 이루어진 복합체로서, 상기 안토시아닌 용액의 양이온과 상기 후코이단 용액의 음이온 간 이온결합이 형성되며, 안토시아닌 분자 간의 π-π 결합이 형성된 것을 특징으로 하는 안토시아닌-후코이단 복합체를 유효성분으로 함유하는 면역증강제를 제공할 수 있다.
상기 안토시아닌-후코이단 복합체는 면역인자의 발현을 유도하여 면역세포의 활성을 증가시키는 것 일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 아로니아추출물(ABF) 50㎍/㎖ 또는 후코이단 500 ㎍/㎖ 농도가 포함된 아로니아추출물(ABF) 용액 또는 후코이단 용액과 50㎍/㎖ 농도의 아로니아추출물(ABF) 및 500 ㎍/㎖ 농도의 후코이단 농도가 포함된 시아니딘-후코이단 복합체를 HCT-116 (인간 대장 세포), SKBR-3(인간 유방암 세포) 및 Hep-G2 (인간 간 세포)에 각각 처리한 결과, 도 6과 같이 IL-6가 아로니아추출물(ABF)과 후코이단을 단독으로 처리했을 때보다, 시아니딘-후코이단 복합체를 처리하였을 때 높게 분비되었으며, 아로니아추출물(ABF)과 후코이단이 처리된 세포에서 분비된 IL-6의 양을 합한 양보다 시아니딘-후코이단 복합체를 처리한 세포에서 분비된 IL-6의 양이 더 많은 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터 상기 시아니딘-후코이단 복합체는 생체 내 면역인자의 발현을 유도하여 면역세포의 활성을 증가시킬 수 있음이 확인되었다.
따라서, 본 발명은 안토시아닌과 후코이단으로 이루어진 복합체로서, 상기 안토시아닌 용액의 양이온과 상기 후코이단 용액의 음이온 간 이온결합이 형성되며, 안토시아닌 분자 간의 π-π 결합이 형성된 것을 특징으로 하는 안토시아닌-후코이단 복합체를 유효성분으로 함유하는 면역항암제를 제공할 수 있다.
상기 안토시아닌-후코이단 복합체는 면역인자의 발현을 유도하여 면역세포의 활성을 증가시켜 암세포를 사멸시키는 것일 수 있다.
상기 암세포는 고형암의 암세포일 수 있으며, 보다 상세하게 상기 고형암은 대장암, 유방암, 폐암, 위암, 상피성 난소암, 뇌암, 피부암 및 간암으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 안토시아닌과 복합체의 암세포에 대한 항암 효과와 정상조직세포에 대한 독성을 확인하기 위해, 아로니아추출물(ABF) 50 ㎍/㎖ 또는 후코이단 200 ㎍/㎖ 농도가 포함된 아로니아추출물(ABF) 용액 또는 후코이단 용액과 50 ㎍/㎖ 농도의 아로니아추출물(ABF) 및 200 ㎍/㎖ 농도의 후코이단 농도가 포함된 시아니딘-후코이단 복합체를 처음 농도에서 1/2로 희석하는 계단희석법을 사용하여 각각 8개의 시료를 제조한 후, HCT-116 (인간 대장 세포), NIH/3T3(쥐 배아 섬유아세포), HUVEC(내피 세포; ATCC) 및 Hep-G2 (인간 간 세포)에 각각 처리하여 상기 시료의 암세포 사멸 수준을 확인한 결과, 도 5와 같이 HCT-116 및 Hep-G2의 아로니아추출물(ABF)의 용액에 대한 IC50 값은 각각 27㎍/㎖ 및 17㎍/㎖으로 확인되었으며, 시아니딘-후코이단 복합체에 대한 IC50 값은 12 ㎍/㎖ 및 5.2 ㎍/㎖로 확인되었다. 또한, 정상조직세포인 NIH/3T3 및 HUVEC에서는 아로니아추출물(ABF) 용액에 대한 IC50 값이 각각 41㎍/㎖ 및 53㎍/㎖로 나타났으며, 시아니딘-후코이단 복합체에 대한 IC50 값은 38 ㎍/㎖ 및 38 ㎍/㎖인 것으로 확인되었다.
상기 결과로부터 암세포에 대한 시아니딘-후코이단 복합체의 IC50 값이 아로니아추출물(ABF) 용액보다 낮게 나타남에 따라, 상기 시아니딘-후코이단 복합체는 아로니아추출물(ABF)보다 더 적은 양으로 암세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있음이 확인되었으며, 정상조직세포에 대한 시아니딘-후코이단 복합체의 IC50 값이 암세포보다 더 높게 나타나는 것이 확인됨에 따라, 시아니딘-후코이단 복합체는 정상세포에 대한 세포 독성 없이 암세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있음이 확인되었다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 안토시아닌-후코이단 복합체를 유효성분으로 함유하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 안토시아닌-후코이단 복합체를 유효성분으로 함유하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.
상기 안토시아닌-후코이단 복합체의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 안토시아닌과 후코이단으로 이루어진 복합체로서, 상기 안토시아닌 용액의 양이온과 상기 후코이단 용액의 음이온 간 이온결합이 형성되며, 안토시아닌 분자 간의 π-π 결합이 형성된 것을 특징으로 하는 안토시아닌-후코이단 복합체를 유효성분으로 함유하는 항암용 건강식품을 제공할 수 있다.
상기 건강식품은 상기 안토시아닌-후코이단 복합체 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 건강식품에 함유된 화합물의 유효용량은 상기 치료제의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제등을 들 수 있다.
또한, 본 발명은 안토시아닌과 후코이단으로 이루어진 복합체로서, 상기 안토시아닌 용액의 양이온과 상기 후코이단 용액의 음이온 간 이온결합이 형성되며, 안토시아닌 분자 간의 π-π 결합이 형성된 것을 특징으로 하는 안토시아닌-후코이단 복합체를 유효성분으로 함유하는 항암보조제를 제공할 수 있다.
상기 항암보조제는 항암제 투여에 의한 부작용을 완화시킬 수 있으며, 상기 항암제 투여에 의한 부작용은 체중 또는 면역 인자의 감소 및 악액질(cachexia)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 1> 시아니딘 - 후코이단 복합체 제조
아로니아추출물(ABF) [(주)제이비케이랩] 20mg을 인산 완충액(Phosphate buffer) pH 3(PB 3) 수용액 20 ㎖에 침전물이 보이지 않도록 용해시켰으며, 후코이단 [(주) 해원바이오] 200 mg을 증류수 20 ㎖에 침전물이 보이지 않도록 용해시킨 후 후코이단 용액에 시아니딘 용액을 첨가하고 실온에서 72시간 동안 교반시켜 시아니딘-후코이단 복합체(Cyaplex-F8)를 제조하였다.
한편, 아로니아추출물(ABF)과 후코이단을 상기 복합체 제조에 사용된 동량으로 용해시켜 비교예로 사용하였다.
< 실시예 2> 시아니딘 - 후코이단 복합체의 특성 확인
1. 시아니딘 - 후코이단 복합체 형성 확인
첫날부터 여섯째 날까지 아로니아추출물(ABF) 용액과 시아니딘-후코이단 복합체 샘플을 얻고, 상기 샘플들을 1/10로 희석한 후 분광광도계 (UV-1601, Shimadzu, JAPAN)로 광학 밀도를 측정하여 결과를 얻었다. 또한, 아로니아추출물(ABF) 용액과 시아니딘-후코이단 복합체 원액으로 광학 사진을 얻었다.
그 결과, 도 2와 같이 시아니딘-후코이단 복합체는 시아니딘의 양이온성과 후코이단의 음이온성이 만나 형성하는 이온결합으로 복합체가 형성되었으며, 복합체를 형성하는데 시아니딘 분자들끼리의 π-π 상호작용도 기여하는 것으로 확인되었다. 또한, 시아니딘-후코이단이 복합체를 형성하면서 π-π 상호작용에 의해 시아니딘이 가지고 있던 최대 흡광도가 도 2와 같이 레드 쉬프트 하는 것을 확인하였으며, 광학사진에서 복합체를 형성한 샘플은 아로니아추출물(ABF) 용액보다 보라색을 띠게 되는 것이 확인되었다.
2. 시아니딘 - 후코이단 복합체의 사이즈 확인
완성된 복합체 2㎖를 폴리스타이렌 큐벳 (DTS0012)에 넣은 후, 제타전위 & 나노입도분석기 (Zetasizer nano ZS, Malvern Instruments Ltd., England)를 이용하여 복합체의 사이즈를 확인하였다. 또한, 완성된 복합체 10 ㎕를 커버글라스에 올려 60℃ 오븐에서 밤새 건조시키고 주사전자현미경 (S-4800, HITACHI, Ltd., U.S.A)으로 이미지를 얻었다.
제타전위 & 나노입도분석기 분석 결과인 도 3의 왼쪽 사진을 참고하면, 복합체는 약 380 nm 정도의 나노 사이즈로 확인되었다. 또한, 도 3의 오른쪽 사진인 주사전자현미경 이미지에서는 사이즈가 약 85 nm인 것으로 확인되었다.
3. 다양한 pH 조건하에서 시아니딘의 구조적 안정성 증진 효과 확인
상기 시아니딘-후코이단 복합체 제조 방법으로 만들어진 복합체 40 ㎖을 13000 rpm, 30분 동안 원심분리한 후 상층액은 제거하고 남아 있는 침전물은 PB 3 (pH 3)과 phosphate buffer saline (pH 7)로 재분산시킨 후 시간에 따라 분광광도계로 안토시아닌 용액과 함께 측정하여 구조적 안정성 증진 효과를 확인하였다.
그 결과, 도 4와 같이 아로니아추출물(ABF)은 pH가 낮은 환경(pH 3)에서 안정하며, pH가 높아질수록 분해가 일어났다.
보다 상세하게 아로니아추출물(ABF)이 인체에 처리된다면 인체가 가지는 pH 7.4에 노출될 것이고, 결국 분해가 일어날 것으로 예상될 수 있으며, 실제로 도 4와 같이 안토시아닌은 시간 경과에 따라서 분해가 나타났으나, 시아니딘-후코이단 복합체는 시간 경과에 따라서 어느 정도 일정하게 흡광도 값을 유지하는 것을 확인할 수 있다.
상기 결과로부터 시아니딘-후코이단 복합체는 생체 내 산성 조건에서도 우수한 안정성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
< 실시예 3> 시아니딘 - 후코이단 복합체의 시험관 내 세포독성 및 사이토카인 분비 확인
1. 시아니딘 - 후코이단 나노입자의 시험관 내 세포독성 확인
시아니딘과 후코이단 복합체의 암세포에 대한 항암 효과와 정상조직세포에 대한 독성을 확인하였다.
먼저, 아로니아추출물(ABF) 50 ㎍/㎖ 또는 후코이단 200 ㎍/㎖ 농도가 포함된 아로니아추출물(ABF) 용액 또는 후코이단 용액과 50 ㎍/㎖ 농도의 아로니아추출물(ABF) 및 200 ㎍/㎖ 농도의 후코이단 농도가 포함된 시아니딘-후코이단 복합체 시료를 준비하고, 나머지 샘플들은 앞에서 언급한 처음 농도에서 1/2로 희석하는 계단희석법을 사용하여 각각 8개씩 샘플을 제조하였다.
실험 세포인 HCT-116 (인간 대장 세포 암종; 한국 세포주 은행) 및 HUVEC (내피 세포; ATCC)을 페니실린 및 스트렙토마이신과 10% FBS가 첨가된 RPMI 1640 (Wellgene) 배지에서 배양하였으며, Hep-G2 (인간 간 세포 암종; 한국 세포주 은행) 및 NIH/3T3 (쥐 배아 섬유아세포; 한국 세포주 은행)을 페니실린 및 스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지에서 배양하였다.
24-웰 플레이트 상에 상기 세포주를 각각 웰 당 5×104 세포로 시딩(seeding)하고 밤새 배양하였다. 이후 세포를 DMEM과 FBS가 무첨가된 RPMI 및 여러 농도의 샘플과 함께 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 FBS가 첨가된 DMEM, RPMI 배지 및 10%의 세포 계수 키트-8 (CCK-8) 용액 (CCK-8 키트, Enzo Life Sciences, Inc., KOREA)에 노출시켜 37℃에서 4시간 동안 배양한 후 450 nm에서의 광학 밀도에서 세포 독성을 확인하였다.
그 결과 도 5와 같이 HCT-116 및 Hep-G2의 아로니아추출물(ABF)의 용액에 대한 IC50값은 각각 27㎍/㎖ 및 17㎍/㎖으로 확인되었으며, 시아니딘-후코이단 복합체에 대한 IC50 값은 12 ㎍/㎖ 및 5.2 ㎍/㎖로 확인되었다. 또한, 정상조직세포인 NIH/3T3 및 HUVEC에서는 아로니아추출물(ABF) 용액에 대한 IC50 값이 각각 41㎍/㎖ 및 53㎍/㎖로 나타났으며, 시아니딘-후코이단 복합체에 대한 IC50 값은 38 ㎍/㎖ 및 38 ㎍/㎖ 인 것으로 확인되었다.
상기 결과로부터 암세포에 대한 시아니딘-후코이단 복합체의 IC50 값이 아로니아추출물(ABF) 용액보다 낮게 나타나는 것이 확인됨에 따라, 상기 복합체는 아로니아추출물(ABF) 단독 용액보다 더 적은 양으로 암세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있음이 확인되었다. 또한, 정상조직세포에 대한 시아니딘-후코이단 복합체의 IC50 값이 암세포보다 더 높게 나타나는 것이 확인됨에 따라, 시아니딘-후코이단 복합체는 아로니아추출물(ABF) 용액을 단독으로 사용하였을 때보다 항암 효과가 높으며, 정상조직세포에 대한 세포 독성은 낮은 것으로 확인되었다.
2. 시아니딘 - 후코이단 나노입자에 의해 사멸된 세포에서 분비된 사이토카인 확인
아로니아추출물(ABF) 50㎍/㎖ 또는 후코이단 500 ㎍/㎖ 농도가 포함된 아로니아추출물(ABF) 용액 또는 후코이단 용액과 50㎍/㎖ 농도의 아로니아추출물(ABF) 및 500 ㎍/㎖ 농도의 후코이단 농도가 포함된 시아니딘-후코이단 복합체 시료를 준비하였다.
실험 세포인 HCT-116 (인간 대장 세포 암종; 한국 세포주 은행) 및 SKBR-3 (인간 유방암 세포; 한국 세포주 은행)을 페니실린 및 스트렙토마이신과 10% FBS가 첨가된 RPMI 1640 (Wellgene) 배지에서 배양하였으며, Hep-G2 (인간 간 세포 암종; 한국 세포주 은행)는 페니실린 및 스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지에서 배양하였다.
6-웰 플레이트 상에 배양된 각 세포주를 웰 당 3×105 세포로 시딩(seeding)하고 밤새 배양하였다. 그 후 여러 농도의 샘플이 포함된 2㎖의 DMEM 및 FBS 무첨가 RPMI 배지에서 37℃, 24시간 동안 배양하고, 배양 배지를 회수한 후 회수된 배지에서 IL-6, IL-1β 및 TNF-α 사이토카인 수준을 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, Enzo Life Sciences, Inc., KOREA)로 확인하였다.
그 결과, 도 6과 같이 상기 3개의 세포주 모두에서 IL-1β 및 TNF-α의 사이토카인은 분비되지 않았으며, IL-6는 아로니아추출물(ABF)과 후코이단을 단독으로 처리했을 때 보다, 시아니딘-후코이단 복합체를 처리하였을 때 높게 분비되었다. 또한, 아로니아추출물(ABF)과 후코이단이 단독 처리된 세포에서 분비된 IL-6의 양을 합한 양보다 시아니딘-후코이단 복합체를 처리한 세포에서 분비된 IL-6의 양이 더 많은 것을 확인할 수 있었다.
< 실시예 4> 시아니딘 - 후코이단 복합체의 종양 생성 억제 효과 확인
발암물질과 종양촉진제가 처리된 실험동물에서 시아니딘-후코이단 복합체의 발암억제 효과를 확인하였다.
Balb/c (n=5) 마우스의 등 부분을 제모한 후 발암물질인 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) 200 nmol/acetone 200 μL를 등 부분에 도포하고 동일한 부위에 종양 촉진제인 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) 4 μg/acetone 200 μL을 22주간 주 2회 처리하였다.
상기 실험동물을 PBS, 아로니아 추출물(Aronia Bio-active Fractions, ABF), 후코이단(Fu) 및 시아니딘-후코이단 복합체 (Cyaplex-F8) 실험군으로 구분하고, 각 실험군에 적합하게 후코이단(Fu) 200 ㎕ (80 mg/mL)을 800 mg/kg, 아로니아 추출물 200 ㎕ (10 mg/mL)을 100 mg/kg, Cyaplex-F8 200 ㎕ (Fu 80 mg, ABF 10 mg/mL)를 Fu 800 mg, ABF 100 mg/kg으로 22주간 매일 경구투여하였으며, 매주 1회 실험동물의 무게, 생존율 및 유도된 종양 결절 개수 및 넓이를 확인하였다.
그 결과, 도 7 내지 도 9와 같이 발암물질 및 종양촉진제 도포 및 약물투여 9주차부터 PBS 실험군에서 종양 결절이 나타났으며, 그 이후로 종양의 개수와 넓이가 증가하였으나, 도 11과 같이 Fu 또는 ABF가 투여된 실험군에서 발암 억제 효과가 확인되었으며, 특히 Cyaplex-F8 실험군의 발암 억제 효능이 우수한 것을 확인할 수 있었다.
또한, 실험 마지막 주인 22주차에 각 실험군의 실험동물들의 주요장기인 심장, 폐, 간 및 비장 조직을 적출하여 헤마톡실린 & 에오신 염색(H&E staining)을 수행하였다.
그 결과, 도 12와 같이 각 실험군별 주요장기의 특이한 차이점은 확인되지 않았으나, 도 13과 같이 등에 유도된 종양 조직의 경우, PBS 실험군이 가장 넓은 면적으로 종양이 유도된 것을 확인할 수 있었으며, Cyaplex-F8 실험군의 종양 유도 면적인 가장 적은 것을 확인할 수 있었다.
한편, 약물투여 11주차부터 안와채혈 방법으로 각 실험동물의 혈액 200 ㎕을 채취한 후 13,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 혈장을 분리하고, ELISA kit (485-MI-100, R&D Systems, Inc, U.S.A.)를 이용하여 혈장 내 존재하는 IFN-γ를 정량분석하였다.
그 결과, 도 14와 같이 11주차부터 22주차까지 모든 실험군에서 큰 차이 없이 체내 면역기능의 항상성을 유지하고 있음을 확인할 수 있었다.
< 실시예 5> 시아니딘 - 후코이단 복합체와 항암제 병용 투여 효과 확인
시아니딘-후코이단 복합체와 항암제의 병용투여에 따른 항암 효과를 확인하였다.
Balb/c (n=5) 마우스에 각각 SK-BR-3 (human breast cancer)를 1×105 cells/mice를 이식하고, 이식 1주일 후 독소루비신(Doxorubicin; DOX) 10 mg/kg를 2주간 주 1회 정맥 투여하였으며, 독소루비신 투여일을 제외하고 모든 실험군에 각각 후코이단(Fu) 200 ㎕ (160 mg/mL)을 800 mg/kg, 아로니아 추출물 200 ㎕ (ABF; 20 mg/mL)을 100 mg/kg, Cyaplex-F8 200 ㎕ (Fu 160 mg, ABF 20 mg/mL)를 Fu 1600 mg 및 ABF 200 mg/kg씩 1일 2회 매일 2주간 경구투여하였다.
그 결과, 도 15 및 도 16A와 같이 후코이단, 아로니아 추출물(ABF) 또는 시아니딘-후코이단 복합체가 단독 투여된 실험군에서는 종양 크기가 증가하였으나, 독소루비신과 시아니딘-후코이단 복합체 Cyaplex-F8가 병용처리된 실험군에서는 독소루비신이 단독 처리된 실험군과 유사한 수준으로 종양크기가 감소된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 16B 및 도 16C를 참고하면 독소루비신이 단독 처리된 실험군에서 2번째 독소루비신 정맥 투여 후 실험동물의 급격한 몸무게 감소가 나타났으나, 독소루비신과 Cyaplex-F8가 병용처리된 실험군에서는 독소루비신 단독 처리군과 비교하여 몸무게 감소율이 적었으며, 독소루비신 단독 처리군보다 생존 수명이 연장된 것으로 확인되었다.
또한, 37일 차 혈구분석 결과인 표 1과 같이 독소루비신 단독 투여군의 경우 백혈구 수치가 6.57×103 cells/μL로 나타난 반면, DOX + Cyaplex-F8 병용투여 실험군에서는 9.54×103 cells/μL로 증가된 것을 확인할 수 있었다.
37 day WBC
(×103
cells/μL)		 RBC
(×106
cells/μL)		 HGB
(g/dL)		 HCT
(%)		 MCV
(fL)		 MCH
(pg)		 MCHC
(g/dL)		 PLT
(×103
cells/μL)		 NEUT
(%)		 LYM
(%)		 MONO
(%)		 EOS
(%)		 BASO
(%)
PBS 20.36 9.8 12.6 42.2 18.2 43 12.8 504 69.7 12.1 6.4 4.2 2.6
Fu 18.41 9.14 10.9 39.8 21.3 43.5 12 1242 67.9 14.3 4.6 6.1 1.5
ABF 14.82 10.81 14.3 39.8 21.3 43.5 12 1740 61.4 20.9 5.4 1.5 1.9
Cyaplex-F8 17.01 10.47 12.7 47.8 17.3 44.2 13.3 2029 70.2 17.4 2.6 1. 0.5
DOX 6.57 10.99 16.5 52.6 14.8 47.9 15 1954 33.9 53.7 4.3 3 3.2
DOX+
Cyaplex-F8		 9.54 10.09 14.4 48.1 17.1 47.6 14.3 2600 46.4 36.7 5.1 3.4 2
< 실시예 6> 시아니딘 - 후코이단 복합체의 면역세포 활성 효과 확인
앞선 실험에서 확인된 바와 같이 시아니딘-후코이단 복합체가 백혈구 수치를 증가시키는 것으로 확인됨에 따라, 시아니딘-후코이단 복합체가 면역세포에 미치는 영향을 확인하였다.
Balb/c (n=5) 마우스에 독소루비신(DOX)을 실험 1일째 및 5일째에(총 2회) 10 mg/kg씩 처리하고, 후코이단(Fu) 500 ㎕ (160 mg/mL)로 1,600 mg/kg, 아로니아 (ABF) 500 ㎕ (20 mg/mL)로 200 mg/kg 및 시아니딘-후코이단 복합체 (Cyaplex-F8) 500 ㎕ (Fu 160 mg, ABF 20 mg/mL)로 Fu 1,600 mg 및 ABF 200 mg/kg를 독소루비신 처리일을 제외하고 매일 경구투여하였다.
독소루비신 처리 전 모든 실험군에서 혈액 200㎕를 채취하고 RBC lysis buffer 500 μL를 처리한 후 4℃에서 5분간 반응시키고, DPBS를 이용해 10배 희석하여 1,500 rpm, 3분간 원심분리한 후 항-CD3 및 항-CD8을 이용하여 혈중 세포독성 T 세포의 수준을 확인하였으며, 항-CD49b(DX5)를 이용하여 혈중 NK 세포의 유세포 분석(Flow cytometry)을 수행하였다.
또한, 실험 마지막날인 14일째에 실험동물의 비장을 적출하여 Spleen/Body weight을 확인하였다.
그 결과, 도 17과 같이 독소루비신 투여 후 모든 실험군에서 면역세포가 감소하였으나, 시아니딘-후코이단 복합체가 처리된 실험군에서는 아로니아추출물(ABF)과 후코이단이 단독 처리된 실험군보다 우수한 면역세포(CD8 T 세포 및 NK 세포) 회복력을 나타내었으며, 도 18과 같이 독소루비신과 시아니딘-후코이단 복합체가 병용처리된 실험군에서 감소된 몸무게가 가장 우수하게 회복되는 효과가 확인되었다.
상기 결과로부터 독소루비신 처리에 의해 감소된 몸무게를 시아니딘-후코이단 복합체가 병용처리를 통하여 회복시키는 것이 확인되었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (12)

  1. 안토시아닌과 후코이단으로 이루어진 복합체로서, 상기 안토시아닌 용액의 양이온과 상기 후코이단 용액의 음이온 간 이온결합이 형성되며, 안토시아닌 분자 간의 π-π 결합이 형성된 것을 특징으로 하는 안토시아닌-후코이단 복합체.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 복합체는 안토시아닌과 후코이단이 0.1:10 내지 10:0.1 중량비로 형성되는 것을 특징으로 하는 안토시아닌-후코이단 복합체.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 복합체는 50nm 내지 500nm 범위의 평균 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 안토시아닌-후코이단 복합체.
  4. 안토시아닌과 후코이단으로 이루어진 복합체로서, 상기 안토시아닌 용액의 양이온과 상기 후코이단 용액의 음이온 간 이온결합이 형성되며, 안토시아닌 분자 간의 π-π 결합이 형성된 것을 특징으로 하는 안토시아닌-후코이단 복합체를 유효성분으로 함유하는 면역증강제.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 안토시아닌-후코이단 복합체는 면역인자의 발현을 유도하여 면역세포의 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 면역증강제.
  6. 안토시아닌과 후코이단으로 이루어진 복합체로서, 상기 안토시아닌 용액의 양이온과 상기 후코이단 용액의 음이온 간 이온결합이 형성되며, 안토시아닌 분자 간의 π-π 결합이 형성된 것을 특징으로 하는 안토시아닌-후코이단 복합체를 유효성분으로 함유하는 면역항암제.
  7. 청구항 6항에 있어서, 상기 안토시아닌-후코이단 복합체는 면역인자의 발현을 유도하여 면역세포의 활성을 증가시켜 암세포를 사멸시키는 것을 특징으로 하는 면역항암제.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 암세포는 고형암의 암세포인 것을 특징으로 하는 면역항암제.
  9. 안토시아닌과 후코이단으로 이루어진 복합체로서, 상기 안토시아닌 용액의 양이온과 상기 후코이단 용액의 음이온 간 이온결합이 형성되며, 안토시아닌 분자 간의 π-π 결합이 형성된 것을 특징으로 하는 안토시아닌-후코이단 복합체를 유효성분으로 함유하는 항암용 건강식품.
  10. 안토시아닌과 후코이단으로 이루어진 복합체로서, 상기 안토시아닌 용액의 양이온과 상기 후코이단 용액의 음이온 간 이온결합이 형성되며, 안토시아닌 분자 간의 π-π 결합이 형성된 것을 특징으로 하는 안토시아닌-후코이단 복합체를 유효성분으로 함유하는 항암보조제.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 항암보조제는 항암제 투여에 의한 부작용을 완화시키는 것을 특징으로 하는 항암보조제.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 항암제 투여에 의한 부작용은 체중 또는 면역 인자의 감소 및 악액질(cachexia)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 안토시아닌-후코이단 복합체를 유효성분으로 함유하는 항암보조제.
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