CN1237450A

CN1237450A - 仙鹤草素作为诱导肿瘤细胞凋亡的药物

Info

Publication number: CN1237450A
Application number: CN 99116051
Authority: CN
Inventors: 徐安龙; 彭文烈; 马靖; 梁东
Original assignee: SUIJIN BIOLOGICAL TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd GUANGZHOU
Current assignee: SUIJIN BIOLOGICAL TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd GUANGZHOU
Priority date: 1999-02-05
Filing date: 1999-02-05
Publication date: 1999-12-08

Abstract

本发明公开了中药仙鹤草天然提取物仙鹤草素的诱导人体肿瘤细胞凋亡的特性，尤其是能够诱导恶性肿瘤细胞的凋亡，而对正常的人体组织细胞无不良影响。仙鹤草素可作为抗癌药物的先导化合物，也可以直接开发成抗癌新药或与其它药物配伍成抗癌新药。仙鹤草素作为抗癌药物，具有效果明显、毒副作用小、易于人体吸收等特点。

Description

仙鹤草素作为诱导肿瘤细胞凋亡的药物

本发明涉及中药仙鹤草提取物仙鹤草素的新用途。

仙鹤草(《伪药条辨》)，又名龙芽草(《救荒本草》)，为蔷微科植物。我国大部分地区均有分布，夏秋间枝叶茂盛未开花时采集全草，去泥晾干。据《中药大辞典》(江苏新医学院编，上海科学技术出版社)记载，仙鹤草具有止血、抗炎、抗菌、抗寄生虫等作用。民间长期煎汤内服、捣敷外用于止血，治疗咯血、吐血、尿血、便血、跌打创伤出血等，但是目前文献尚未发现关于仙鹤草提取物诱导人体肿瘤细胞凋亡的报道。恶性肿瘤严重威胁着人类的生命，世界卫生组织报告指出，全世界每年死于恶性肿瘤的病人约500万，到2000年将增加至800万。药物治疗是治疗恶性肿瘤的三大疗法之一，但目前的治疗药物大多是西药，在治疗恶性肿瘤细胞的同时，对正常的人体组织细胞或多或少地产生副作用。

本发明的目的是提供中药仙鹤草提取物仙鹤草素作为诱导人体肿瘤细胞凋亡的一种新用途。

本发明采用多种人体肿瘤细胞株进行细胞培养，通过细胞形态学检测和流式细胞术分析，可发现仙鹤草素诱导人体肿瘤细胞凋亡的特性，其作用浓度小于1.0mg/ml，其余为水、二甲亚砜等溶剂和/或其它辅剂。仙鹤草素可作为抗癌药物的先导化合物，也可以直接开发成抗癌新药或与其它药物配伍成为抗癌新药。它可以与任何药用溶剂和/或辅剂混合制成片剂、冲剂、针剂等剂型。

中药仙鹤草天然提取物仙鹤草素能诱导人体肿瘤细胞的凋亡，尤其是能够诱导恶性肿瘤细胞的凋亡，而对正常的人体组织细胞无不良反应。仙鹤草素作为抗癌药物，具有效果明显、毒副作用小、易于人体吸收等特点。

下面结合附图及具体的生物学实验详细说明本发明。本发明实验所用仙鹤草素(代号A1)是运用水-乙醇混合溶剂浸提，取清液，经真空浓缩和真空干燥，得到的一种浅棕褐色粉末。运用高效液相液色谱仪对其成分进行分析，其主要成分为酚类物质，还含有少量有机酸、鞣质和甙类等。

图1为样品对Hepg2细胞的作用在光学显微镜下的观察图；

图2为样品对Hela细胞的作用在光学显微镜下的观察图；

图3为样品对Mgc细胞的作用在光学显微镜下的观察图；

图4为样品对Mcf-7细胞的作用在光学显微镜下的观察图；

图5为样品对Lcc7402细胞的作用在光学显微镜下的观察图；

图6为样品对Nsclc细胞的作用在光学显微镜下的观察图；

图7至图10为流式细胞仪检测结果图。

实验一，细胞形态学检测

一、原理

本实验从细胞形态学上证实仙鹤草素的抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡的特性。有效的抗癌成分对体外培养的肿瘤细胞有特定的生物学效应，能使体外肿瘤细胞产生形态学上的变化，抑制肿瘤细胞的生长，促使肿瘤细胞凋亡。在光学显微镜下，凋亡细胞表现出：细胞核固缩，染色体断裂，断片沿核膜浓聚成多形性高密度颗粒区；核膜皱缩，崩解后包裹染色体弥散于细胞浆中；细胞全面皱缩，细胞膜皱缩外突，但细胞膜的结构和功能仍保持完整，内容物无溢出；最后，细胞膜包裹细胞器或核片段形成比细胞小的凋亡小体。体外培养的贴壁细胞发生凋亡时，细胞变小变圆，失去粘附力从附着处脱落下来。

二、材料、仪器和方法

(一)材料和仪器

1、细胞：Hepg2、Hela、Mgc、Mcf-7、Lcc7402、Nsclc。

2、RPMI-1640完全培养基，含青链霉素100单位/ml，小牛血清10％。

3、0.25％胰蛋白酶消化液。

4、CO₂培养箱，37℃,5％CO₂。

5、倒置光学显微镜。

(二)方法

1、细胞的复苏。从液氮中取出冻存管后，立刻置37℃温水中水浴解冻，解冻后吸出转到离心管中，加8ml培养基，摇匀，2000rpm离心5分钟。吸走上清，加进培养基吹散转入培养瓶中置CO₂培养箱中培养。

2、细胞悬液的制备。把培养瓶中贴壁细胞的培养基吸掉，加进1～2ml的0.25％胰蛋白酶消化液，消化1～2分钟后加入约8ml的培养基，摇匀，2000rpm离心5分钟，收集细胞，加入新鲜培养基，通过血球计数板配成80000～100000个/ml的细胞悬液。

3、把细胞转到96孔板上培养。每孔加入80000～100000个/ml的细胞悬液100ul，预培养24～36小时。

4、样品的配制。样品为粉末状，用三蒸水配成2mg/ml、0.4mg/ml、0.2mg/ml的水溶液，水溶液加10％的DMSO。

5、加入样品。每种样品每个浓度梯度加入20ul。此外，加20ul含10％DMSO三蒸水的孔作为空白对照、不加任何样品和三蒸水的孔作为阴性对照。

6、每隔10～20小时用倒置光学显微镜对细胞的形态进行观察。

三、结果

结果如图1至图6所示，结果分析：仙鹤草素(A1)对Hepg2、Hela、Mgc、Mcf-7、Lcc7402、Nsclc细胞在形态学上有明显的作用。A1能使细胞丧失贴壁的粘附能力，变圆皱缩，使细胞成团、色泽暗黑、停止分裂。

实验二，酶标仪检测

一、原理

显色剂噻唑蓝(MTT)能被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死亡细胞无此现象。二甲亚砜(DMSO)能溶解细胞中的蓝紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数量范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。本方法灵敏度高，重复性好，操作简便、经济、实惠，易自动化，无放射性污染。

二、材料、仪器和方法

(一)材料和仪器

(1)PRMI 1640(GIBCO)

(2)MTT(噻唑蓝)

(3)DMSO(二甲亚砜)

(4)酶联免疫检测仪(ELX800,BIO-TEK INSTRUMENT,INC.)

(二)方法

(1)将细胞悬液100ul以适当密度接种于96孔板(留3个孔作为空白对照孔)，等细胞生长至对数增殖期；

(2)每孔加20ul样品(样品呈梯度浓度，每个浓度至少3个孔)，再补加80ul培养基，继续培养2天；

(3)每孔加入5mg/ml MTT 20ul，在37摄氏度下培养4小时；

(4)小心吸取上清液，加入150ul DMSO，振荡10分钟，使沉淀溶解；

(5)采用酶联免疫检测仪在波长490nM下检测；三、结果

细胞系	MGC	HEPG2	MCF-7	3T3
细胞系	MGC	HEPG2	MCF-7	3T3	IC₅₀(ug/ml)	300	390	360	＞800

从实验结果可以看出，几种瘤株对A1较为敏感，说明A1对其专一性大，而正常纤维母细胞3T3对A1不敏感，说明A1对正常细胞毒性小。

实验三，流式细胞术分析

一、原理

利用特异性荧光探针标记待测的生物靶点，根据荧光信号强弱反映检测目标的变化。用结合性荧光染料对细胞DNA染色，利用各时期细胞DNA含量差异，获得不同强度的荧光信号进行细胞周期分析。

细胞发生凋亡时，内源性核酸内切酶激活使DNA广泛降解、断裂，DNA结构发生剧变；随着凋亡的进展，DNA断裂产生的小分子量DNA(单、寡聚核小体)溢出胞外，细胞内总DNA量降低。流式细胞术可以检测凋亡DNA的这种结构及量的变化。用DNA结合性荧光探针可直接对细胞DNA染色后进行分析，凋亡细胞因为总DNA量降低，于正常G0/G1细胞群前出现一个DNA低染细胞群，称为A0细胞群或亚G1细胞群，即凋亡细胞群。

二、材料和方法

(一)材料：

(1)PBS(0.01M,pH7.2)

(2)RNaseA Calbiochem

(3)PI Sigma

(4)Triton X-100 Sigma

(5)生理盐水

(6)70％乙醇

(二)方法：

(1)细胞分瓶，生长至对数增殖期；

(2)加药物诱导，作用一定时间后，用胰酶消化将其制成单细胞悬液；

(3)离心5分钟(2000rpm)，用PBS洗两次，去上清，剩余少许PBS，振荡，使细胞分散均匀，加预冷70％乙醇约2ml,4℃过液；

(4)离心，去掉固定液，用PBS洗两次，再离心，去掉上清，加入5mg/ml的RnaseA 50ul和100ug/ml的PI染液450ul，混匀，在4℃下，放置30分钟；

(5)在流式细胞仪上检测；

三、结果

结果如图7至图10所示，结果分析：从流式细胞仪检测结果图可看出仙鹤草素在体外能诱导MGC、Lcc7402细胞凋亡，在G1峰前出现亚G1峰，凋亡率分别为25.96％和8.46％。

Claims

1、中药仙鹤草天然提取物仙鹤草素，其特征在于作为诱导人体肿瘤细胞凋亡的药物。

2、如权利要求1所述的中药仙鹤草天然提取物仙鹤草素，其特征在于作为抗癌药物的先导化合物。

3、如权利要求1所述的中药仙鹤草天然提取物仙鹤草素，其特征在于与其它药物配伍作为抗癌新药。