CN1171850C - 一种二萜化合物及其制法和用途 - Google Patents
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Abstract
一种二萜化合物，它是16-α-乙酰氧基-内-贝壳杉-17，19-二酸二甲酯，它可以从光叶番荔枝茎中提取得到，有明显抑制癌细胞生长的作用，可用于制备抗癌药物。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种二萜化合物，及它的抗癌作用。
二、背景技术
本发明人研究了光叶番荔枝(又称圆滑番荔枝，Annona glabra Lim)，发现光叶番荔枝茎叶的浸膏对癌症，如肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌，有明显的抗癌作用(见中国专利申请号01108285.2)。本发明人进一步研究，发现其抗癌的活性成份主要是本发明的二萜化合物。
三、发明内容
一种二萜化合物，它是16-α-乙酰氧基-内-贝壳杉-17，19-二酸二甲酯，有如下结构：
一种制备16-α-乙酰氧基-内-贝壳杉-17，19-二酸二甲酯的方法，它包括下列步骤：
A、将风干的光叶番荔枝茎粉碎后，用乙醇加热提取，然后将提取液浓缩，得浸膏：
B、用石油醚提取浸膏，弃去石油醚提取液，再用氯仿提取，得氯仿提取液；
C、将氯仿提取液浓缩后进行硅胶(100～200目)柱层析，石油醚-氯仿为洗脱剂洗脱，首先洗脱得到的为Fr1部分；
D、将步骤C中所得的Fr1部分再进行硅胶(200～300目)柱层析，石油醚-乙酸乙酯(100∶1)为洗脱剂，得到M-2，M-3，，M-4和M-5四个二萜化合物，其中化合物M-2即为本发明的16-α-乙酰氧基-内-贝壳杉-17，19-二酸二甲酯。它可以用乙酸乙酯重结晶纯化。
根据本发明人的研究，16-α-乙酰氧基-内-贝壳杉-17，19-二酸二甲酯在0.25×10-7mol/L浓度以上，对食管癌细胞生长有明显的抑制作用。并且它在终浓度为1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL的情况下，对SMMC-7721细胞的抑制率分别为9.8％，18.8％，33.9％，49.7％，75.2％。因此，16-α-乙酰氧基-内-贝壳杉-17，19-二酸二甲酯可以用于制备抗食管癌或抗肝癌药物。
本发明的16-α-乙酰氧基-内-贝壳杉-17，19-二酸二甲酯是从植物光叶番荔枝提取的，因此毒副作用小，而对癌细胞有很明显的抑制作用。
四、具体实施方式
实施例1：提取方法：
光叶番荔枝植物样品采自海南，经自然风干后粉碎，粉碎的光叶番荔枝茎3.5kg，用95％工业酒精回流提取，浓缩得浸膏300g，浸膏然后用石油醚提取，弃去石油醚提取液，再用氯仿提取，得到氯仿提取液。
光叶番荔枝氯仿提取液，经硅胶(100～200目，2Kg)进行柱层析，以3000mL石油醚-氯仿(7∶3)为洗脱剂，得到Fr.1部分。Fr.1部分再用硅胶(200～300目)300g进行柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(100∶1)洗脱，每50mL洗脱液为一个单位分别接收，将洗脱液分别作硅胶薄板层析，薄板喷香草醛硫酸溶液后在105℃加热3分钟显色，合并相同的洗脱液，最先洗脱下的化合物M-2为本发明的16-α-乙酰氧基-内-贝壳杉-17，19-二酸二甲酯。
实施例2：化合物M-2结构鉴定：
化合物M-2为无色针晶，易溶于氯仿、乙酸乙酯等有机溶剂，熔点225-227℃(CHCI3)，[α]D 24-112°(c 0.15，CHCI3)。Liebrmann-Burchard反应阳性。
IR(
cm-1)：2973，2954，2928，1750，1731，显示分子中有羰基，无苯环存在。1HNMR(CDCI3)中氢质子信号集中在高场区，0.81ppm和1.17ppm分别为三个氢的单峰，这是贝壳杉烷型二萜角甲基的特征吸收峰，并且19位为羰基取代。2.05ppm有三个氢的单峰，为-COCH3的甲基信号；2.38ppm为一个氢的宽单峰，是H-13信号；2.77ppm和2.72ppm处的dd峰，J为15.6Hz，2.0Hz，为15位质子的特征吸收；3.70ppm和3.64ppm分别为三个氢的单峰，为两个甲氧基信号。13CNMR(CDCI3)共出现24个碳信号，除去两个甲氧基和一个乙酰基，剩下20个碳信息，则化合物M-2可能为二萜化合物。
HRMS显示分子式为C24H36O6(精确分子量为420.2533)。EIMS中分子离子蜂为421，360为[M-COOCH3]或[M-OAc]，328为[360-OCH3]，300为[M-COOCH3-OAc]，121，91，43。化合物M-2与已知化合物16α-acetoxy-ent-kauran-19-oic acid-17-methyl ester的碳谱数据见表1：
表1 13CNMR Chemical Shifts Values for M-2 and known kaurane
diterpenoids(300MHz，CDCI3，δ，ppm)
carbon M-2 已知物 carbon M-2 已知物
1 41.7 41.6 11 17.0 17.0
2 19.0 18.9 12 26.3 26.3
3 37.7 37.7 13 46.1 46.1
4 43.8 43.7 14 40.4 40.4
5 56.6 56.5 15 51.1 51.1
6 22.0 21.9 16 89.1 89.1
7 37.9 37.8 17 170.5 170.5
8 44.8 44.8 18 28.7 28.8
9 55.2 55.2 19 181.1 184.0
10 39.3 39.6 20 15.3 15.4
OCOCH3 171.0 171.0 OCOCH3 21.1 21.1
COOCH3 52.1 52.2
COOCH3 51.1
由表1可以看出，除了多一个δ51.1甲氧基的峰外，其它碳谱数据与已知化合物基本相同，结合氢谱中亦多一个δ3.64三个氢的单峰，质谱中分子量多14，则化合物M-2鉴定为：16-α-乙酰氧基-内-贝壳杉-17，19-二酸二甲酯，分子式为C24H36O6，结构式如下：
实施例3：M-2的抗食管癌作用
1、细胞培养与单体化合物
食管癌细胞株(Eca-109)由南京中医药大学微生物教研室提供。细胞培养于199培养液中，内加10％小牛血清，培育在37℃、5％CO2培养箱内。单体化合物是经化学结构鉴定的光叶番荔枝二萜新化合物M-2，即16-α-乙酰氧基-内-贝壳杉-17，19-二酸二甲酯。
2、实验方法
采用MTT法测定光叶番荔枝二萜新化合物M-2、(用无水乙醇配制)对食管癌细胞生长抑制作用。取对数生长期的食管癌细胞调整至1×106/mL，0.2mL接种于96孔板上，置37℃、5％CO2培养24h后弃原培养液，加入含不同浓度光叶番荔枝二萜化合物M-2培养液各0.2mL(设7个浓度)，每个浓度设9个复孔(分3次重复)，并设无药物(含配制药物的乙醇)培养液和空白对照孔(同时作3个板)。
作用24h后倾去上清液，各孔加入MTT0.1mL，37℃4h后吸去上清液，加入DMSO 0.1mL于各孔，30min后上酶标仪570nm处测OD值。抑制率(％)＝[(对照孔OD值-实验组OD值)/对照孔OD值]×100％。
3、实验结果
结果如表2显示，随光叶番荔枝二萜化合物M-2浓度的升高，对食管癌细胞的抑制率也升高，化合物M-2在0.25×10-4mol/L以上剂量对食管癌细胞生长有明显抑制作用。
表2光叶番荔枝二萜化合物M-2对食管癌细胞生长抑制作用(n＝9)
药物 浓度(mol/L) OD值(A±S) 抑制率(％)
0 0.339±0.010 0.0
M-2 1×10-7 0.129±0.009** 61.95
0.5×10-7 0.185±0.007* 45.43
0.25×10-7 0.227±0.008* 33.04
0 0.339±0.010 0.0
*P＜0.05，**P＜0.01与对照组比较
实施例4：M-2的抗肝癌作用(1)
1、细胞培养与化合物：
将人肝癌细胞株SMMC-7721常规培养于含10％灭活小牛血清、100U/mL青霉素和100ug/mL链霉素的RPML1640培养液中，置饱和湿度、37℃的5％CO2温箱培养。单体化合物是经化学结构鉴定的光叶番荔枝二萜新化合物M-2。
2、实验方法：
采用常规IVITT法。取对数生长期SMMC-7721细胞，用完全培养液调整细胞浓度为5×105/mL，接种细胞于96孔板(5×104/孔)，24h后加入化合物M-2终浓度为1ug/mL、2ug/mL、5ug/mL、10ug/mL、20ug/mL，另设空白对照组(加细胞而不加药)及调零组(只加培养液)，每组4个复孔。加药后将96孔板置于CO2温箱37℃培养。加药培养72h后，每孔加入5mg/mL MTT试剂10ul，继续培养4h，再加入DMSO100ul，放震荡器震荡15min，用酶标仪(λ570nm)测每孔OD值，根据相对抑制率判断化合物的细胞毒作用，相对抑制率＝[(对照孔平均OD值-加药孔平均OD值)÷对照孔平均OD值]×100％。
3、实验结果：
化合物对SMMC-7721细胞的细胞毒作用MTT检测结果显示，不同浓度的化合物M-2处理细胞3d后，细胞增殖不同程度地被抑制，且随化合物浓度的增加，细胞毒性明显增加。化合物M-2 1ug/mL、2ug/mL、5ug/mL、10ug/mL、20ug/mL的抑制率分别为9.8％、18.8％、33.9％、49.7％、75.2％。
实施例5：M-2的抗肝癌作用(2)
1、细胞培养与化合物：
将人肝癌细胞株SMMC-7721常规培养于含10％灭活小牛血清、100U/mL青霉素和100ug/mL链霉素的RPML1640培养液中，置饱和湿度、37℃的5％CO2温箱培养。单体化合物是经化学结构鉴定的光叶番荔枝二萜新化合物M-2。
2、实验方法：
取对数生长期的SMMC-7721细胞，以细胞浓度5×105/mL，接种于25mL细胞培养瓶中，24h后随机分2组(化合物M-2组和对照组)，每组各6瓶，化合物M-2组加入含10ug/mL化合物的培养液，对照组加入不含化合物M-2的完全培养液，置CO2温箱培养。药物处理4d后，胰酶消化收集细胞，进行以下指标检测。
(1)细胞生长测定 加药后逐日取药物处理组及对照组细胞，苔盼蓝染色，光镜下计数活细胞总数，连续4d，计算细胞生长抑制率。
(2)流式细胞仪检测 收集细胞并计数，70％乙醇固定待用。采用溴化乙锭(EB，10ug/mL)一步法插入DNA定量染色，FACS-420型流式细胞仪进行细胞周期分析，以增殖指数(proliferation index，PI)表示药物对细胞增殖的影响。
3、实验结果：
(1)化合物M-2对细胞生长的影响
经化合物M-2处理后，细胞生长明显被抑制，且随化合物作用时间的延长，其抑制率增加。加药M-2后1-4d的抑制率分为7.8％、16.8％、33.8％和45.3％。
(2)化合物M-2对细胞周期的影响
流式细胞仪检测显示，经化合物M-2处理4d后，细胞被阻止于Co/G1，而S期细胞减少，增殖指数降低，细胞增殖被明显抑制(见表3)。
表3化合物M-2对SMMC-7721细胞周期影响(化合物M-2处理4d)
细胞周期分布(％) PI值
组别 Co/Gl S C2/M (％)
对照组 70.1 10.8 19.1 29.9
M-2组 80.3 6.0 13.7 19.7*
注：*与阴性对照组比较(P＜0.01)
Claims (3)
1.一种二萜化合物，其特征是它是16-α-乙酰氧基-内-贝壳杉-17，19-二酸二甲酯，有结构为
的二萜化合物。
2.一种制备权利要求1所述的16-α-乙酰氧基-内-贝壳杉-17，19-二酸二甲酯的方法，其特征是包括下列步骤：
A、将风干的光叶番荔枝茎粉碎后用乙醇加热提取，然后将提取液浓缩，得浸膏；
B、用石油醚提取浸膏，弃去石油醚提取液，再用氯仿提取，得氯仿提取液；
C、将氯仿提取液进行100～200目硅胶柱层析，比例为7∶3的石油醚-氯仿为洗脱剂，得到Fr1部分；
D、将步骤C中所得的Fr1部分再进行200～300目硅胶柱层析，比例为100∶1的石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂，得到首先洗脱下的化合物M-2，化合物M-2即为本发明的16-α-乙酰氧基-内-贝壳杉-17，19-二酸二甲酯。
3.权利要求1所述的16-α-乙酰氧基-内-贝壳杉-17，19-二酸二甲酯在制备抗食管癌或抗肝癌药物中的应用。
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