CN1171851C - 二萜化合物及其制法和用途 - Google Patents
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Abstract
一种二萜化合物，它是16-β-氢-内-贝壳杉-17-酸-16′-α-羟基-内-贝壳杉-17′-醇酯，它可以从光叶番荔枝茎中提取得到，有明显抑制癌细胞生长的作用，可用于制备抗癌药物。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种二萜化合物，及它的抗癌作用。
二、背景技术
本发明人研究了光叶番荔枝(又称圆滑番荔枝，Annona glabra Lim)，发现光叶番荔枝茎叶的浸膏对癌症，如肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌，有明显的抗癌作用(见中国专利申请号01108285.2)。本发明人进一步研究，发现其抗癌的活性成份主要是本发明的二萜化合物。
三、发明内容
一种二萜化合物，它是16-β-氢-内-贝壳杉-17-酸-16′-α-羟基-内-贝壳杉-17′-醇酯，有如下结构：
一种制备16-β-氢-内-贝壳杉-17-酸-16′-α-羟基-内-贝壳杉-17′-醇酯的方法，它包括下列步骤：
A、将风干的光叶番荔枝茎粉碎后，用乙醇加热提取，然后将提取液浓缩，得浸膏；
B、用石油醚提取浸膏，弃去石油醚提取液，再用氯仿提取，得氯仿提取液；
C、将氯仿提取液浓缩后进行硅胶(100～200目)柱层析，石油醚-氯仿为洗脱剂洗脱，首先洗脱得到的为Fr1部分：
D、将步骤C中所得的Fr1部分再进行硅胶(200～300目)柱层析，石油醚-乙酸乙酯(100∶1)为洗脱剂，先后得到M-2，M-3，，M-4和M-5四个二萜化合物，其中化合物M-3即为本发明的16-β-氢-内-贝壳杉-17-酸-16-′α-羟基-内-贝壳杉-17-′醇酯。它可以用乙酸乙酯重结晶纯化。
根据本发明人的研究，16-β-氢-内-贝壳杉-17-酸-16-′α-羟基-内-贝壳杉-17-′醇酯在0.25×10-7mol/L浓度以上，对食管癌细胞生长有明显的抑制作用。并且它在终浓度为1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL的情况下，对SMMC-7721细胞的抑制率分别为8.1％，17.5％，32.0％，47.8％，73.9％。因此，16-β-氢-内-贝壳杉-17-酸-16′-α-羟基-内-贝壳杉-17-′醇酯可以用于制备抗食管癌或抗肝癌药物。
本发明的16-β-氢-内-贝壳杉-17-酸-16′-α-羟基-内-贝壳杉-17′-醇酯是从植物光叶番荔枝提取的，因此毒副作用小，而对癌细胞有很明显的抑制作用。
四、具体实施方式
实施例1：提取方法：
光叶番荔枝植物样品采自海南，经自然风干后粉碎，粉碎的光叶番荔枝茎3.5kg，用95％工业酒精回流提取，浓缩得浸膏300g，浸膏然后用石油醚提取，弃去石油醚提取液，再用氯仿提取，得到氯仿提取液。
光叶番荔枝氯仿提取液，经硅胶(100～200目，2Kg)进行柱层析，以3000mL石油醚-氯仿(7∶3)为洗脱剂，得到Fr.1部分。Fr.1部分再用硅胶(200～300目)300g进行柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(100∶1)洗脱，每50mL洗脱液为一个单位分别接收，将洗脱液分别作硅胶薄板层析，薄板喷香草醛硫酸溶液后在105℃加热3分钟显色，合并相同的洗脱液，第二个洗脱下的为化合物M-3为本发明的16-β-氢-内-贝壳杉-17-酸-16′-α-羟基-内-贝壳杉-17′-醇酯。
实施例2：化合物M-3结构鉴定：
M-3为无色针晶，易溶于氯仿、乙酸乙酯等有机溶剂，不易溶于甲醇和丙醇，熔点275-277℃(EtOAc)，[α]D 24-50°(c0.25，CHCI3)。
IR图谱中3396cm-1和1718cm-1分别为羟基和羰基的特征吸收，无苯环的特征信息。根据FAB-MS给出m/z 615[M+Na]+，可知M-3分子量为592。EIMS显示有575[(M+H)-H2O]+，275，257，123等的碎片离子峰。
1HNMR中δ0.80(3H×2，s)，0.84(3H×2，s)，0.99(3H，s)，1.01(3H，s)提示M-3有六个角甲基信号。δ4.02和3.86(各1H，d，J＝11.2Hz)为-CH2O-单元中两个质子的信号。对照已知化合物氢谱，其中δ0.80，0.84，1.01，4.02，3.86分别与化合物ent-kauran-16α，17-diol的三个角甲基和-CH2OH中的CH2信号一致，δ0.80，0.84，0.99与化合物16-β-hydro-ent-kauran-17-oic acid的角甲基信号相似。由于13CNMR中高场区有39个碳信号，低场区有一羰基信号，故推测M-3可能为贝壳杉烷型二萜化合物的二聚合物，将该化合物和己知化合物I(ent-16-β-hydroxy-kauran-17-yl-ent-kaur-15-en-17-oate)和II(fritillebin A)的波谱数据相比较发现，它们的氢谱和碳谱数据十分相似，见表1，表2：
表1 1HNMR Chemical Shifts Values for M-3 and known kaurane
diterpenoids(300MHz，CDCl3，δ，ppm)
化合物 M-3 已知物I 已知物II
0.80 0.80 0.80
tert-CH3 0.80 0.80 0.84
(s) 0.84 0.84 0.84
0.84 0.85 0.85
0.99 1.00 1.01
1.01 1.05 1.02
C-CH2-O 3.86 4.15 4.19
4.02 4.27 4.23
表2 13CNMR Chemical Shifts Values for M-3 and known
kayrane diterpenoids(300MHz，CDCl3，δ，ppm)
C M-3 I II C M-3 I II
1 41.6 41.8 38.3 1′ 41.8 42.0 40.3
2 18.6 18.5 23.6 2′ 18.6 18.2 18.2
3 42.0 43.1 80.9 3′ 42.0 42.0 41.8
4 33.2 33.2 37.7 4′ 33.2 33.4 33.2
5 56.0 56.1 55.2 5′ 56.2 56.0 56.1
6 20.7 20.5 20.4 6′ 20.0 20.5 20.4
7 38.3 37.2 40.8 7′ 38.2 38.3 42.0
8 45.6 50.5 44.9 8′ 43.7 44.6 44.6
9 57.0 46.7 55.7 9′ 57.0 56.7 56.6
10 39.3 39.4 38.9 10′ 39.2 39.4 39.4
11 18.4 18.3 18.5 11′ 18.4 18.4 18.6
12 26.7 25.6 31.2 12′ 26.8 26.3 26.4
13 45.1 40.3 41.3 13′ 52.6 45.5 46.2
14 40.4 40.4 38.1 14′ 40.4 40.3 37.1
15 45.0 137.5 44.8 15′ 56.0 53.4 53.1
16 56.1 153.8 45.6 16′ 78.8 81.6 80.2
17 177.8 165.1 177.4 17′ 71.0 66.2 68.4
18 33.5 33.4 28.3 18′ 33.6 33.5 33.6
19 21.6 21.5 16.6 19′ 21.5 21.5 21.5
20 17.4 17.7 17.5 20′ 17.5 17.7 17.1
OAc 170.9
由以上数据可以看出，化合物M-3和已知物I和II的结构应该相似。根据质谱数据显示M-3比化合物I的分子量多2，即多出两个H：比化合物II的分子量少58，恰好相当于化合物II的C3上失去一个乙酰基片段，则鉴定化合物M-3为annonebinide A(ent-16-α-hydroxy-kauran-17-yl ent-16-β-kauran-17-oate)，分子式为C40H64O3，结构式如下：
为了进一步确证该化合物的结构，我们作了以下化学反应。将10mgM-3置于50ml圆底烧瓶中，加5ml甲醇溶解，滴入1ml5％NaOH溶液，水浴加热回流8小时，用稀盐酸进行酸化，蒸干溶剂，进行薄层制备，得到3个化合物。通过熔点和红外光谱对照判断，其中一个为未反应完全的化合物M-3，一个为化合物M-12，另外一个与化合物M-5红外图谱相似，但是其熔点相差8℃，可能为M-5的异构体，即16位的羧基取代方向不同。根据16位氢质子的化学位移在δ2.83，判断化合物M-3的16位为α-COOH取代。从而进一步确定了化合物M-3的结构。
实施例3：M-3的抗食管癌作用
1、细胞培养与单体化合物
食管癌细胞株(Eca-109)由南京中医药大学微生物教研室提供。细胞培养于199培养液中，内加10％小牛血清，培育在37℃、5％CO2培养箱内。单体化合物是经化学结构鉴定的光叶番荔枝二萜新化合物M-3，即16-β-氢-内-贝壳杉-17-酸-16′-α-羟基-内-贝壳杉-17′-醇酯。
2、实验方法
采用MTT法测定光叶番荔枝二萜新化合物M-3、(用无水乙醇配制)对食管癌细胞生长抑制作用。取对数生长期的食管癌细胞调整至1×106/mL，0.2mL接种于96孔板上，置37℃、5％CO2培养24h后弃原培养液，加入含不同浓度光叶番荔枝二萜化合物M-3培养液各0.2mL(设7个浓度)，每个浓度设9个复孔(分3次重复)，并设无药物(含配制药物的乙醇)培养液和空白对照孔(同时作3个板)。
作用24h后倾去上清液，各孔加入MTT0.1mL，37℃4h后吸去上清液，加入DMSO 0.1mL于各孔，30min后上酶标仪570nm处测OD值。抑制率(％)＝[(对照孔OD值-实验组OD值)/对照孔OD值]×100％。
3、实验结果
结果如表2显示，随光叶番荔枝二萜化合物M-3浓度的升高，对食管癌细胞的抑制率也升高，化合物M-3在1.0×10-7mol/L以上剂量对食管癌细胞生长有明显抑制作用。
表3光叶番荔枝二萜化合物M-3对食管癌细胞生长抑制作用(n＝9)
药物 浓度(mol/L) OD值(A±S) 抑制率(％)
0 0.339±0.010 0.0
M-3 1×10-7 0.136±0.006** 59.89
0.5×10-7 0.230±0.008* 32.15
0.25×10-7 0.293±0.009 13.57
*P＜0.05，**P＜0.01与对照组比较
实施例4：M-3的抗肝癌作用(1)
1、细胞培养与化合物：
将人肝癌细胞株SMMC-7721常规培养于含10％灭活小牛血清、100U/mL青霉素和100ug/mL链霉素的RPML1640培养液中，置饱和湿度、37℃的5％CO2温箱培养。单体化合物是经化学结构鉴定的光叶番荔枝二萜新化合物M-3。
2、实验方法：
采用常规IVITT法。取对数生长期SMMC-7721细胞，用完全培养液调整细胞浓度为5×105/mL，接种细胞于96孔板(5×104/孔)，24h后加入化合物M-3终浓度为1ug/mL、2ug/mL、5ug/mL、10ug/mL、20ug/mL，另设空白对照组(加细胞而不加药)及调零组(只加培养液)，每组4个复孔。加药后将96孔板置于CO2温箱37℃培养。加药培养72h后，每孔加入5mg/mL MTT试剂10ul，继续培养4h，再加入DMSO100ul，放震荡器震荡15min，用酶标仪(λ570nm)测每孔OD值，根据相对抑制率判断化合物的细胞毒作用，相对抑制率＝[(对照孔平均OD值-加药孔平均OD值)÷对照孔平均OD值]×100％。
3、实验结果：
化合物对SMMC-7721细胞的细胞毒作用 MTI′检测结果显示，不同浓度的化合物M-3处理细胞3d后，细胞增殖不同程度地被抑制，且随化合物浓度的增加，细胞毒性明显增加。化合物M-3 1ug/mL、2ug/mL、5ug/mL、10ug/mL、20ug/mL的抑制率分别为8.1％、17.5％、32.0％、47.8％、73.9％。
实施例5：M-3的抗肝癌作用(2)
1、细胞培养与化合物：
将人肝癌细胞株SMMC-7721常规培养于含10％灭活小牛血清、100U/mL青霉素和100ug/mL链霉素的RPML1640培养液中，置饱和湿度、37℃的5％CO2温箱培养。单体化合物是经化学结构鉴定的光叶番荔枝二萜新化合物M-3。
2、实验方法：
取对数生长期的SMMC-7721细胞，以细胞浓度5×105/mL，接种于25mL细胞培养瓶中，24h后随机分2组(化合物M-3组和对照组)，每组各6瓶，化合物M-3组加入含10ug/mL化合物的培养液，对照组加入不含化合物M-3的完全培养液，置CO2温箱培养。药物处理4d后，胰酶消化收集细胞，进行以下指标检测。
(1)细胞生长测定 加药后逐日取药物处理组及对照组细胞，苔盼蓝染色，光镜下计数活细胞总数，连续4d，计算细胞生长抑制率。
(2)流式细胞仪检测 收集细胞并计数，70％乙醇固定待用。采用溴化乙锭(EB，10ug/mL)一步法插入DNA定量染色，FACS-420型流式细胞仪进行细胞周期分析，以增殖指数(proliferation index，PI)表示药物对细胞增殖的影响。
3、实验结果：
(1)化合物M-3对细胞生长的影响
经化合物M-3处理后，细胞生长明显被抑制，且随化合物作用时间的延长，其抑制率增加。加药M-3后1-4d的抑制率分为7.6％、15.0％、32.5％和43.7％。
(2)化合物M-3对细胞周期的影响
流式细胞仪检测显示，经化合物M-3处理4d后，细胞被阻止于Co/G1，而S期细胞减少，增殖指数降低，细胞增殖被明显抑制(见表3)。
表3化合物M-3对SMMC-7721细胞周期影响(化合物M-3处理4d)
细胞周期分布(％) PI值
组别 Co/G1 S C2/M (％)
对照组 70.1 10.8 19.1 29.9
M-3组 78.9 6.8 14.3 21.1*
注：*与阴性对照组比较(P＜0.01)
Claims (3)
1.一种二萜化合物，其特征是它是16-β-氢-内-贝壳杉-17-酸-16′-α-羟基-内-贝壳杉-17′-醇酯，有结构为
的二萜化合物。
2.一种制备权利要求1所述的16-β-氢-内-贝壳杉-17-酸-16′-α-羟基-内-贝壳杉-17-醇酯的方法，其特征是包括下列步骤：
A、将风干的光叶番荔枝茎粉碎后用乙醇加热提取，然后将提取液浓缩，得浸膏；
B、用石油醚提取浸膏，弃去石油醚提取液，再用氯仿提取，得氯仿提取液；
C、将氯仿提取液进行100～200目硅胶柱层析，比例为7∶3的石油醚-氯仿为洗脱剂，得到Fr1部分；
D、将步骤C中所得的Fr1部分再进行200～300目硅胶柱层析，比例为100∶1的石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂，得到第二个洗脱下的化合物M-3，化合物M-3即为本发明的16-β-氢-内-贝壳杉-17-酸-16′-α-羟基-内-贝壳杉-17′-醇酯。
3.权利要求1所述的16-β-氢-内-贝壳杉-17-酸-16′-α-羟基-内-贝壳杉-17′-醇酯在制备抗食管癌或抗肝癌药物中的应用。
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