CN111184713A - 桉烷型倍半萜内酯差向异构体在制备抗乳腺癌药物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一对桉烷型倍半萜内酯差向异构体(1S,4S,5S,6S,7S,8S,9R,10S)‑1,9‑二乙酰氧基‑4‑羟基‑6‑异丁酰氧基卤地菊内酯、(1S,4S,5R,6S,7S,8S,9R,10S)‑1,9‑二乙酰氧基‑4‑羟基‑6‑异丁酰氧基卤地菊内酯及其可药用盐或溶剂化物以及由此组成的药物组合物的药效活性,主要涉及其诱导乳腺癌细胞MCF‑7细胞形态回缩变圆和胞内活性氧(ROS)水平的升高而表现出肿瘤细胞毒活性的医药用途。
Description
技术领域
本发明属于化学领域,涉及一对桉烷型倍半萜内酯差向异构体及其可药用盐或溶剂化物以及由此组成的药物组合物的药效活性,尤其涉及其诱导乳腺癌细胞MCF-7细胞形态回缩变圆和胞内活性氧(ROS)水平的升高而表现出细胞毒活性的医药用途。
背景技术
乳腺癌是女性最常见的癌症,主要包括导管癌和小叶癌。乳腺癌发病率居女性恶性肿瘤的首位,致死率列第二位,2018年我国乳腺癌数据报告显示,我国女性乳腺癌发病例数和死亡例数分别占全球发病和死亡的11.2%和9.2%,在世界范围位居前列,女性乳腺癌发病和死亡分别位居我国女性恶性肿瘤发病和死亡的第1位和第5位。2019年数据显示,美国有超过380万名有乳腺癌史的女性,有41760名女性将死于这种疾病,全球的乳腺癌发病率正在逐年增长。其中,MCF-7乳腺癌细胞作为人源性低转移乳腺癌细胞,常用于乳腺癌原位生长、血管生成等乳腺癌的体内外研究。
天然产物一直是抗肿瘤药物的重要来源之一,如紫杉醇,长春新碱等。南美蟛蜞菊(Wedelia trilobata)又称三裂(叶)蟛蜞菊,为菊科(Compositae)蟛蜞菊属(Wedelia)多年生草本植物。其原产热带美洲中南部,植物的叶子或地上部分在加勒比海地区和中美洲的传统医药中用于治疗背痛、肌肉痉挛、风湿病、顽固伤口、溃疡、肿胀、关节痛使用。在19世纪70年代被首次引入香港用于替代传统中药蟛蜞菊,主要用于治疗白喉、百日咳、痢疾、痔疮、跌打损伤。与此同时,由于其常常过度生长成茂密地被,排挤且阻止其它植物的再生,破坏所处生态系统平衡及地区物种的多样性,被列为“世界100种危害最大的外来入侵物种”之一。基于“变废为宝”的科学理念,从中寻找具有重要抗肿瘤活性的功能成分,可有效促进该植物资源的综合开发利用。
张玉虎等人在“三裂蟛蜞菊中的倍半萜内酯成分及其化感作用,热带亚热带植物学报,2004,12(6):533-537”中报道从植物全株乙醇提取物的氯仿萃取部位分离得到该对差向异构体,并发现他们对萝卜、小白菜和西红柿的幼苗生长具有较强的抑制活性。黄雪松等人在“Trilobolide-6-O-isobutyrate,a eudesmanolide from Wedelia trilobata,Acta Cryst.(2003).E59,o771-o772”中报道了从三裂蟛蜞菊中获取一个倍半萜内酯Trilobolide-6-O-isobutyrate的单晶结构,但也仅仅解决相对构型。Ragasa等人在“Neweudesmanolide sesquiterpenes from a philippines collection of wedeliaprostata.Journal of Natural Products,1993,56(3):386-393”中报道了研究团队从采自菲律宾的卤地菊叶中也分离得到差向异构体,也仅通过核磁共振技术完成相对构型的确定。武美兰等人在“三裂蟛蜞菊花的化学成分研究,亚太传统医药,2009,5(8):41-42”和“三裂蟛蜞菊化学成分的研究,中草药,2010,41(5):681-685.”中报道,无论是从三裂蟛蜞菊花还是地上部分,均分离得到差向异构体之一:6-异丁酰基三裂蟛蜞菊内酯。李亚婷等人在“Eudesmanolides from Wedelia trilobata(L.)Hitchc.as Potential Inducers ofPlant Systemic Acquired Resistance J Agric Food Chem,2013,61(16):3884-3890”中报告了研究团队从采自我国云南的三裂蟛蜞菊植物全株中,也分离得到倍半萜内酯差向异构体,并发现它们具有很好的抗烟草花叶病毒活性,并以此形成中国专利CN103109812B“三裂蟛蜞菊中的倍半萜内酯在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用”。但是都是均未解决差向异构体绝对构型的确定,以及尚未见有关抗肿瘤活性方面的报道。
发明内容
本发明的目的是提供了一种桉烷型倍半萜内酯差向异构体及其可药用盐或溶剂化物以及由此组成的药物组合物的药效活性,具体地说是其在诱导乳腺癌细胞MCF-7细胞形态回缩变圆和胞内活性氧(ROS)水平的升高而表现出细胞毒活性的医药用途。
为了实现上述目的,本发明的技术方案为:提供下列化合物单体或适当比例组合物:
化合物1:(1S,4S,5S,6S,7S,8S,9R,10S)-1,9-二乙酰氧基-4-羟基-6-异丁酰氧基卤地菊内酯
化合物2:(1S,4S,5R,6S,7S,8S,9R,10S)-1,9-二乙酰氧基-4-羟基-6-异丁酰氧基卤地菊内酯
桉烷型倍半萜内酯差向异构体在制备抗乳腺癌MCF-7药物中的应用,其中:抗乳腺癌药物主要在于诱导乳腺癌细胞MCF-7形态回缩变圆和胞内活性氧ROS水平的升高而表现出细胞毒活性的医药用途。
桉烷型倍半萜内酯差向异构体化合物与药物赋形剂或辅料组合成药物组合物;其制剂形式为片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、贴片剂、口服液、软膏剂或采用药学上可接受的控释或缓释剂或纳米制剂。
本发明所涉及这对桉烷型倍半萜内酯差向异构体仅从蟛蜞菊属中分离得到,且主要是从三裂蟛蜞菊中分离得到。
附图说明
图1:倒置显微镜下观察化合物1、2对乳腺癌细胞MCF-7形态学的影响。
图2.倒置荧光显微镜下观察乳腺癌MCF-7细胞内活性氧ROS水平检测;其中A:对照组(左:荧光图片;右:明场照片);B:化合物1组(10μg/ml;左:荧光图片;右:明场照片);C:化合物2组(10μg/ml;左:荧光图片;右:明场照片)。
具体实施方式
本发明桉烷型倍半萜内酯差向异构体的制备方法:
1)将粉碎后的南美蟛蜞菊花药材(过20~80目筛)中加入85~95%的乙醇或甲醇水溶液,室温浸泡、加热或超声提取,提取时间为60分钟至7天,料液比为1:1~1:10;
2)将南美蟛蜞菊花药材提取液过滤、减压回收得到总提取物,加水混悬,加水混悬,依次用石油醚和乙酸乙酯萃取,减压回收分别得到石油醚部分、乙酸乙酯部分和水溶解部分;
3)乙酸乙酯部分经硅胶柱色谱,采用氯仿/乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱,溶剂混合比例优选(20:1,15:1,10:1,8:1,6:1,4:1,2:1,0:1),其中氯仿:乙酸乙酯8:1部位即是目标化合物倍半萜内酯差向异构体所在部份,该部份可经硅胶柱色谱,洗脱溶剂为氯仿/乙酸乙酯或者丙酮,或者葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析(氯仿:甲醇=1:1,v/v)即可分离得到。化合物平面结构及相对构型可以通过1D和2D NMR得以确认,最后结合x-ray单晶衍射实验确定绝对构型。
根据上述方法制备这对差向异构体,分离纯化得到的化合物经光谱波谱技术与上述记载数据相符,化合物平面结构及相对构型得以确认,最后结合x-ray单晶衍射实验确定绝对构型。以下列出部分数据:
化合物1:(1S,4S,5S,6S,7S,8S,9R,10S)-1,9-二乙酰氧基-4-羟基-6-异丁酰氧基卤地菊内酯,C23H32O9,M=450.47。晶体数据信息orthorhombic,space groupP212121.Flack parameter=0.06(11)。
表1化合物1的13C NMR数据
化合物2:(1S,4S,5S,6S,7S,8S,9R,10S)-1,9-二乙酰氧基-4-羟基-6-异丁酰氧基卤地菊内酯,C23H32O9,M=450.47。晶体数据信息hexagonal,space group P61.Flackparameter=0.03(16)。
表2化合物2的13C NMR数据
下面结合实施例对本发明作详细说明。
实例一桉烷型倍半萜内酯差向异构体抗乳腺癌细胞MCF-7活性测试
1.实验方法:将乳腺肿瘤细胞株MCF-7,用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基,在37℃、5%CO2培养箱中培养。采用MTT法进行细胞增殖抑制试验,主要操作为取对数生长期的肿瘤细胞株,用0.25%的胰蛋白酶消化,10%新生小牛血清的RPMI-1640培养液调制成5×104个/ml-1的细胞悬液,接种于96孔板中,每孔接种180μL。在37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养8-10h,待其贴壁,每个孔加入用PBS配制的样品液,使得样品终浓度分别为1,10和100μg/mL。每个浓度平行3孔,继续培养44h后,每孔加入50μL MTT(1mg/mL-1,PBS配制),在37℃、5%CO2条件下继续温育4h,吸弃孔内培养上清液,每孔加入150μL DMSO,在微型振荡器上摇匀15min,结晶溶解后,在酶联免疫检测仪上选择570nm,测定各孔的吸光值,同时设置空白组(仅加入含细胞的培养液)和对照组(以培养液替代药物),计算细胞增殖抑制率。抑制率(%)=(1-实验组3孔OD值平均值/对照组3孔OD值平均值)×100%。
IC50值的测定:根据MTT实验初步筛选结果,选择浓度为100μg/mL时抑制率>50%的样品,进一步测定其半数抑制浓度IC50。以同一样品浓度对数值为横坐标,以抑制率作纵坐标,作回归曲线,计算出样品IC50值。采用SPSS13.0统计软件包进行数据处理及统计分析。
2.实验结果(见表3)
由实施例1得到的桉烷型倍半萜内酯差向异构体对乳腺癌肿瘤细胞株MCF-7显示不同程度的增殖抑制活性。
表3桉烷型倍半萜内酯差向异构体抗乳腺癌细胞MCF-7活性
实施例二倒置显微镜下观察倍半萜内酯差向异构体诱导乳腺癌细胞MCF-7细胞形态变化
1.实验方法:取对数生长期的乳腺癌细胞MCF-7按1×106个/mL接种于6孔培养板中。待测样品溶于0.1%DMSO中配成储存液。各给药组分别添加相同浓度(10μg/ml)的化合物1、2,溶媒对照组加入等体积含0.1%DMSO的培养液。培养24h后,在倒置显微镜下观察细胞形态变化并拍照。如图1所示,倒置显微镜下观察化合物1、2对乳腺癌细胞MCF-7形态学的影响。
2.实验结果说明:加药处理24h后,化合物2作用组较化合物1作用组可将更多细胞形态回缩变圆。
实施例三乳腺癌MCF7细胞内活性氧ROS水平检测
在六孔板中加入每孔3×105个对数生长的MCF-7细胞,培养24h后,分别加入10μg/mL待测样浓度的培养基培养36h,之后利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧ROS的检测。每孔加入1mL稀释好的DCFH-DA,37℃细胞培养箱孵育20min,基础培养基洗涤三次,倒置荧光显微镜下通过荧光强度来测定ROS水平。或将细胞消化下来,悬浮于终浓度为10μmol/L的DCFH-DA溶液中,37℃细胞培养箱孵育20min,洗涤三次。流式细胞仪检测ROS含量,激发波长为502nm,发射波长为530nm,并用FlowJo软件进行数据分析。实验重复三次。如图2中所示,倒置荧光显微镜下观察乳腺癌MCF-7细胞内活性氧ROS水平检测;其中A:对照组(左:荧光图片;右:明场照片);B:化合物1组(10μg/ml;左:荧光图片;右:明场照片);C:化合物2组(10μg/ml;左:荧光图片;右:明场照片)。
实验结果说明:加药处理后,细胞内的荧光强度增加,说明两种药物均能引起细胞内的活性氧(ROS)水平的升高,其中化合物2作用组引起的ROS升高更明显,因而对肿瘤细胞MCF-7表现出更好的抑制活性。
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已,当然不能以此来限定本发明之权利范围,因此依本发明权利要求所作的等同变化,仍属于本发明所涵盖的范围。
Claims (4)
1.桉烷型倍半萜内酯差向异构体在制备抗乳腺癌药物的应用,其特征在于,一对桉烷型倍半萜内酯差向异构体化合物如下:(1S,4S,5S,6S,7S,8S,9R,10S)-1,9-二乙酰氧基-4-羟基-6-异丁酰氧基卤地菊内酯;(1S,4S,5R,6S,7S,8S,9R,10S)-1,9-二乙酰氧基-4-羟基-6-异丁酰氧基卤地菊内酯。
2.权利要求1所述的桉烷型倍半萜内酯差向异构体在制备抗乳腺癌MCF-7药物的应用。
3.根据权利要求2所述的桉烷型倍半萜内酯差向异构体在制备抗乳腺癌MCF-7药物的应用,其特征在于:抗乳腺癌药物主要在于诱导乳腺癌细胞MCF-7形态回缩变圆和胞内活性氧ROS水平的升高而表现出细胞毒活性的医药用途。
4.根据权利要求2所述的桉烷型倍半萜内酯差向异构体在制备抗乳腺癌MCF-7药物的应用,其特征在于:化合物与药物赋形剂或辅料组合成药物组合物;其制剂形式为片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、贴片剂、口服液、软膏剂或采用药学上可接受的控释或缓释剂或纳米制剂。
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