CN116041168B - 一种金丝桃素的处理方法及获得的金丝桃素碳点和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种金丝桃素的处理方法及获得的金丝桃素碳点和应用。其中该金丝桃素的处理方法,包括:将金丝桃素与水混合,得到混合液;将混合液进行水热反应,收集反应产物,得到金丝桃素碳点。本发明通过对金丝桃素进行水热处理,所获得的金丝桃素碳点在610 nm红光激发下对乳腺肿瘤细胞具有显著的杀伤效果,可作为光动力治疗过程中的光敏剂,或者作为光敏剂的原料,应用于较大较深的乳腺肿瘤的光动力治疗中。
Description
技术领域
本发明涉及一种金丝桃素的处理方法及获得的金丝桃素碳点和应用,属于生物医药技术领域与纳米材料科学技术领域。
背景技术
乳腺癌是女性最常见的癌症,具有死亡率高、预后差的特点。手术切除是治疗乳腺癌最常见的方式,其次是放疗和化疗。然而,传统手术切除疗法对人体创伤大,术后并发症多且易引起肿瘤细胞的转移。放射疗法对人体有明显的生理毒性,而化学疗法则对人体正常细胞产生较大伤害。
光动力疗法是一种新兴的肿瘤治疗方法,作用机理是将光敏剂注入人体后,待光敏剂在恶性肿瘤内特异积聚和储留,使用特定波长的光照激发瘤体内的光敏剂,使光敏剂产生活性氧物质如单线态氧,通过非细胞凋亡途径或直接高效诱导凋亡或导致肿瘤组织坏死杀伤肿瘤细胞。因具有创伤小、毒副作用低、选择性好、适用性好等优点,因此光动力疗法在恶性肿瘤中得到了越来越多的应用。光动力治疗的核心要素是光敏剂,但是现有的许多光敏剂由于激发波长较短,多处于蓝光响应区,因此肿瘤治疗深度较浅,对于大而深的乳腺肿瘤的治疗效果则非常有限。
金丝桃素是从金丝桃素属植物中分离出的一种二蒽酮类化合物,广泛存在于贯叶连翘及其同属植物中,是一种非常有潜力的新型抗癌药物。并且金丝桃素光敏活化期短,能够产生较多的毒性单线态氧,是光敏剂的潜在材料。但是有研究表明,金丝桃素在590nm的黄光激发下才有较为显著的体外杀伤效应,在其它波长光源下的作用不显著。对于较大、较深的肿瘤,黄光的穿透强度有限,使得金丝桃素的光动力抗肿瘤效果难以达到预期。因此,如何对金丝桃素进行处理,以改善其对较大较深的肿瘤的治疗效果,特别是对于较大较深的乳腺肿瘤的治疗效果,仍旧是业内面临的难题。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供一种金丝桃素的处理方法,通过对金丝桃素进行水热处理,所获得的金丝桃素碳点在610 nm红光激发下对乳腺肿瘤细胞具有显著的杀伤效果。本发明还提供采用上述处理方法获得的金丝桃素碳点,以及该金丝桃素碳点的应用。
为实现上述目的,本发明第一方面提供一种金丝桃素的处理方法,包括如下步骤:
将金丝桃素与水混合,得到混合液;
将混合液进行水热反应,收集反应产物,得到金丝桃素碳点。
如前述,在光动力疗法中,由于光敏剂的激发波长多处于蓝光响应区,组织穿透能力有限,因此对于大而深的乳腺肿瘤的治疗效果不理想。发明人从大量中药中筛选出了可用于肿瘤治疗的中药进行研究和试验,意外发现金丝桃素在制成碳点后,除了水溶性明显改善外,其吸收波长明显增长,具体表现为:金丝桃素的最大吸收波长在590 nm附近,但是通过一步简单的水热合成法将金丝桃素制成金丝桃素碳点后,该金丝桃素碳点在610 nm附近存在一个较为明显的吸收峰。相较于590 nm的黄光,显然红光的穿透深度增大,更利于临床应用,尤其是应用于光动力治疗中。而试验的其它中药(含单体和饮片)则不具有上述特点,也未见有相关文献报道。经进一步试验,结果表明,金丝桃素碳点在610 nm红光激发下对乳腺肿瘤细胞具有非常显著的杀伤效果。鉴于上述意外发现和研究结果,提出本发明。
金丝桃素(Mycoporphyrin)属于二蒽酮类化合物,是贯叶连翘中最具生物活性的物质。本发明对于作为原料的金丝桃素的来源不做特别限定,可以按照现有技术从贯叶连翘中提取获得,也可以商购获得。
金丝桃素几乎不溶于水,因此将其与水混合得到的混合液,实际上是一种悬浮液。在具体实施过程中,可在搅拌条件下,将金丝桃素加入到37~50℃的温水中,得到均匀分散的悬浮液。其中金丝桃素与水之间的比例可以为(2~5):(20,000~30,000)。比如对于2~5mg的金丝桃素,水的用量可以是20~30 mL。
随后,将悬浮液转移到反应釜中,并将反应釜置于真空干燥箱中进行水热反应。其中水热反应的温度具体可以是120~200℃,反应时间不低于4小时,通常为4~12小时,使得水热反应充分。
水热反应完成后,待反应釜冷却至室温,取出反应釜中的反应产物,收集其中的金丝桃素碳点。具体的,可以先对反应产物进行离心处理,收集上清液;然后对上清液进行过滤,收集滤液;随后对滤液进行透析,收集保留液;最后对保留液进行干燥,得到金丝桃素碳点。
其中,上述离心处理,可以在10000~12000 g的离心力下进行,离心时间可根据反应产物的量调整,通常不低于10分钟;收集上清液,然后用0.22 μm滤膜过滤,收集滤液;随后对滤液进行透析,采用MW:1000 Da透析袋,透析时间可控制在24小时或者更长,并且在透析过程中,每隔6~8小时换一次水;最后对收集的保留液进行干燥,比如可以采取冷冻干燥的方式,控制温度在零下40℃~零下60℃,冷冻时间为36~72小时,最终得到颗粒均匀的金丝桃素碳点。
本发明第二方面提供一种采用上述第一方面所述的处理方法所获得的金丝桃素碳点。
在高分辨透射电镜下观察本发明所提供的金丝桃素碳点,呈现为颗粒均匀的圆球状,粒径为3~7 nm,晶格间距为0.276 nm。
该金丝桃素碳点具有一般碳点材料的特点,如形貌为类球形或球形、颗粒尺寸小于10 nm、荧光激发依赖特性等,更为突出且重要的特点在于,其在610 nm附近存在吸收峰,并在610 nm红光激发下对乳腺肿瘤细胞具有非常显著的杀伤效果。
本发明第三方面提供上述第二方面所述金丝桃素碳点的应用。
碳点是一种新型的纳米颗粒,具有良好的水溶性、低毒性及优秀的光学性能,在生物成像、生物检测及药物递送等医学领域表现出巨大的应用潜力。本发明中的金丝桃素碳点,除了具有上述碳点材料的用途外,由于其在610 nm红光激发下对乳腺肿瘤细胞具有非常显著的杀伤效果,因此能够作为光动力治疗过程中的光敏剂,或者用于制备光动力治疗过程中的光敏剂,应用于较大较深的乳腺肿瘤的光动力治疗中。
本发明提供的金丝桃素的处理方法,通过一步简单的水热合成法将金丝桃素制成碳点,该金丝桃素碳点较金丝桃素的吸收峰波长向长波方向移动,在610 nm附近出现了吸收峰,并且在610 nm光照条件下对乳腺肿瘤细胞具有非常显著的杀伤效果,因此使其能够作为光动力治疗中的光敏剂或作为制备光敏剂的原料,应用于较大较深的乳腺肿瘤的光动力治疗中,且治疗效果较金丝桃素有明显改善。并且,该处理方法简单可行,非常利于实际推广和应用。
本发明提供的金丝桃素碳点,除了可以用于生物成像等领域外,还可以作为光敏剂或作为制备光敏剂的原料,应用于较大较深的乳腺肿瘤的光动力治疗中,从而改善金丝桃素对于乳腺肿瘤的治疗效果。
附图说明
图1为本发明实施例1制得的金丝桃素碳点的高分辨透射电子显微镜图;
图2为本发明实施例1制得的金丝桃素碳点的红外光谱图;
图3为本发明实施例1制得的金丝桃素碳点的荧光光谱图;
图4为本发明实施例1制得的金丝桃素碳点的紫外可见吸收光谱图;
图5为本发明实施例1制得的金丝桃素碳点的细胞荧光成像图;
图6为4T1细胞在不同浓度金丝桃素碳点溶液中的存活情况图(a:无光照;b:610nm光照;c:两种条件对比图);
图7为DPBF在610 nm光照下不同时间的吸收光谱图。
具体实施方式
针对在光动力治疗中,金丝桃素对于较大、较深的乳腺肿瘤治疗效果有限的问题,本发明实施例以金丝桃素为原料,采用一步水热合成法将金丝桃素制成金丝桃素碳点,包括如下步骤:
1)将2~5 mg金丝桃素在37~50℃搅拌的条件下加入到20~30 mL水中,得到均匀分散的悬浮液;
2)将悬浮液转移到50 mL反应釜中,将反应釜置于真空干燥箱中,反应温度为120~200 ℃,反应时间为4~12 h;
3)待反应釜冷却至室温后,取出反应产物于10000~12000 g 下离心30 min;收集上清液并用0.22 μm滤膜过滤,过滤后的液体于MW:1000 Da透析袋中透析24 h,每隔6~8 h换一次水;将透析后的液体置于冷冻干燥机内干燥,温度为-60℃,时间为36~72 h。
下面进一步列举实施例以详细说明本发明。应理解,以下实施例只用于对本发明进行进一步说明,不能理解为对本发明保护范围的限制。下述实施例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例,而并非要限定于下文实施例的具体数据。
实施例一
1)将2 mg金丝桃素在40℃搅拌的条件下加入到30 mL水中,得到均匀分散的悬浮液;
2)将悬浮液转移到50 mL反应釜中,将反应釜置于真空干燥箱中,反应温度为160℃,反应时间为6 h;
3)待反应釜冷却至室温后,取出反应产物于12000 g 下离心30 min;收集上清液并用0.22 μm滤膜过滤,过滤后的液体于MW:1000 Da透析袋中透析24 h,每隔8 h换一次水;将透析后的液体置于冷冻干燥机内干燥,温度为-60℃,时间为72 h,获得金丝桃素碳点。
试验例1
在高分辨透射电子显微镜下观察实施例1制得的金丝桃素碳点的形貌,如图1所述,该金丝桃素碳点为圆球形,颗粒非常均匀且具有良好的分散性,平均直径为3~7 nm,晶格间距为0.276 nm。
试验例2
采用傅利叶红外光谱仪分析实施例1制备的金丝桃素碳点的表面结构,图2中3200-3500 cm-1处的特征峰归因于O-H,在2925cm-1和 2858cm-1处的特征峰可能是-CH2的反对称和对称伸缩吸收峰,在1731cm-1处的特征峰是-C=O的伸缩吸收峰,在1641cm-1处的特征峰对应碳点结构中的C=C双键,在1461cm-1和1100 cm-1处的特征峰分别归因为-CH2和C−O−C。由此红外光谱图可知,该金丝桃素碳点的表面存在羟基、羰基、醚键等特征官能团。
试验例3
将实施例1制备的金丝桃素碳点配制成碳点溶液,置于荧光光谱仪中,用480-600nm的不同波长的光激发,如图3所示,随着激发波长的增加,溶液体系的荧光发射峰位发生变化,说明金丝桃素碳点具有荧光激发依赖特性。
试验例4
将实施例1制备的金丝桃素碳点配制成碳点溶液,置于紫外可见分光光度计中扫描,如图4所示,该碳点溶液在610 nm附近存在一个较为明显的吸收峰,说明该金丝桃素碳点可用于体内荧光成像及较深层肿瘤的光动力治疗。
金丝桃素碳点在可见光下呈浅灰色,见图4中的插图I;金丝桃素碳点在365 nm紫外光下发出蓝绿色荧光,见图4中的插图II。
试验例5
取实施例1制备的金丝桃素碳点与小鼠乳腺肿瘤细胞4T1共孵育进行活细胞成像。具体操作为:待细胞贴壁后,在培养基中加入2 mg/mL的碳点溶液2μL,使碳点最终的浓度为2μg/mL,于37℃条件下与细胞共孵育,6小时后使用共聚焦显微镜下进行细胞成像,如图5所示,观察到细胞在488 nm激发波长下呈绿色荧光,在552 nm激发波长下呈红色荧光。
试验例6
取实施例1制备的金丝桃素碳点配制成不同浓度的碳点溶液,与小鼠乳腺肿瘤细胞4T1共孵育48 小时后,用CCK-8试剂(Cell Counting Kit-8,细胞计数试剂)检测金丝桃素碳点对4T1细胞的杀伤作用。如图6a所示,金丝桃素碳点在无光照条件下的IC50为19.43μg/mL。
试验例7
取实施例1制备的金丝桃素碳点配制成不同浓度的碳点溶液,与小鼠乳腺肿瘤细胞4T1共孵育42小时后,用610 nm光照30 min后再孵育6h,用CCK-8试剂检测金丝桃素碳点在光照条件下对4T1细胞的毒性。如图6b所示,金丝桃素碳点在610 nm光照条件下的IC50为0.21 μg/mL,显著低于金丝桃素碳点在无光照条件下的IC50,如图6c所示,说明金丝桃素碳点在610 nm红光激发下对乳腺肿瘤细胞具有显著的杀伤效果。
试验例8
取实施例1制备的金丝桃素碳点配制成浓度为2 mg/mL的碳点溶液;在比色皿中加入DMSO(二甲基亚砜)3mL、适量的DPBF(1,3-二苯基-异苯并呋喃)母液、碳点溶液,用波长为610 nm的光照射混合体系,测试其在不同时间段的吸收光谱。如图7所示,随着光照时间的增加,DPBF的吸收峰强度不断降低,说明金丝桃素碳点在610 nm光照条件下产生了单线态氧。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (5)
1.一种金丝桃素的处理方法,其特征在于,包括:
将金丝桃素与水按照(2~5):(20,000~30,000)的质量比混合,得到混合液;
将所述混合液进行水热反应,水热反应的温度为120~200℃,时间不低于4小时,收集反应产物,得到金丝桃素碳点;
其中,所述收集反应产物,包括:
对反应产物进行离心处理,离心力为10000~12000 g,离心时间不低于10分钟,收集上清液;
采用0.22 μm的滤膜对上清液进行过滤,收集滤液;
采用截留分子量为1000 Da的透析袋对滤液进行透析,透析时间不低于24小时,且每隔6~8小时换一次水,收集保留液;
对保留液进行干燥,干燥温度为零下40℃~零下60℃,时间为36~72小时,得到所述金丝桃素碳点。
2.权利要求1所述处理方法获得的金丝桃素碳点。
3.根据权利要求2所述的金丝桃素碳点,其特征在于,所述金丝桃素碳点能够被波长为610 nm的光激发。
4.根据权利要求2或3所述的金丝桃素碳点,其特征在于,所述金丝桃素碳点的直径为3~7 nm。
5.权利要求2-4任一项所述的金丝桃素碳点在生物成像、制备抗肿瘤光敏剂中的应用。
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