CN108186608A

CN108186608A - 一种纳米类囊体的应用

Info

Publication number: CN108186608A
Application number: CN201810165420.3A
Authority: CN
Inventors: 刘又年; 欧阳江; 陈万松; 徐群芳
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2018-02-28
Filing date: 2018-02-28
Publication date: 2018-06-22
Anticipated expiration: 2038-02-28
Also published as: CN108186608B

Abstract

本发明公开了一种纳米类囊体应用于制备抗肿瘤的药物，发明人研究发现，纳米类囊体既能促使肿瘤区域积累的过氧化氢分解为氧气从而克服肿瘤缺氧，同时又具有光敏特性可用作光敏剂，可以进行光动力抗肿瘤从而实现了双重功能相结合的效果，相较于单一的PDT纳米材料来说纳米类囊体的PDT治疗效果显著提升。

Description

一种纳米类囊体的应用

技术领域

本发明属于生物医药材料领域；具体涉及一种纳米类囊体的应用。

背景技术

癌症是过去几十年人类死亡的主要杀手，目前癌症治疗的有效性由于复杂的肿瘤微环境而严重被限制。其中，缺氧是实体肿瘤固有的特性，它大大增加了肿瘤治疗的抵抗性，使得药物治疗以及依赖于氧气的光动力治疗的效果降低。另外，缺氧实体瘤中过氧化氢(H₂O₂)会大量积累达到100μM，而正常组织中的浓度只有20nM。基于肿瘤区域这些特殊的特征，许多调节肿瘤微环境来达到肿瘤治疗效果的药物试剂被开发出来，但是其生物安全性以及临床实际效果却有待商榷。另外，光动力治疗(PDT)由于生物安全性高以及极小的副作用而在肿瘤治疗中引起了广泛的关注，然而PDT的效率依赖于氧气的浓度，因此其在肿瘤治疗中的应用也受到了限制。

发明内容

为了克服肿瘤缺氧，提高肿瘤治疗效率，解决现有抗肿瘤的纳米材料制备复杂，生物安全性差，副作用大等问题，本发明提供了一种纳米类囊体用于制备抗肿瘤药物中的应用；旨在克服肿瘤缺氧，提高抗肿瘤效果和生物安全性以及减小副作用。

一种纳米类囊体的应用，用于制备抗肿瘤的药物。

作为优选，用于制备抗实体肿瘤的药物。

作为优选，用于制备抗实体肿瘤的静脉注射药物。

利用光动力治疗(PDT)的抗肿瘤药物，由于在治疗过程中PDT的效率依赖于氧气的浓度，然而缺氧是实体肿瘤固有的特性，因此其在肿瘤治疗中的应用也受到了限制。

基于此，发明人设想制备一种可调节肿瘤微环境以提升肿瘤区域氧气含量从而提高PDT效率的药物。

发明人通过大量实验发现，将纳米类囊体用于制备抗实体肿瘤的药物，其具有提升肿瘤区域氧气含量的功能。

发明人首创的将纳米类囊体用于制备抗实体肿瘤的药物，发明人研究发现，纳米类囊体既能促使肿瘤区域积累的过氧化氢分解为氧气从而克服肿瘤缺氧，同时又具有光敏特性可用作光敏剂，可以进行光动力抗肿瘤从而实现了双重功能相结合的效果，相较于单一的PDT纳米材料来说纳米类囊体的PDT治疗效果显著提升。

发明人发现，纳米类囊体的粒径对后续光动力学治疗肿瘤的效果具有一定的影响。

作为优选，所述的纳米类囊体的粒径为50～300nm，进一步优选为50～100nm。

发明人发现，小于50nm时绝大多数的纳米类囊体会被截留，会导致产量下降，另外小于50nm的纳米粒子经过EPR效应进入体内时，由于机体的自我保护功能，小粒径的纳米粒子会被机体自我保护系统清除掉，在进行体内实验时，到达病灶部位的有效的药物浓度会降低导致治疗效果降低。

作为优选，所述纳米类囊体由类囊体经直径为50～300nm的挤出器挤出获得。

作为优选，所述纳米类囊体的制备方法为，将类囊体经超声分散于水中获得类囊体分散液，类囊体分散液经直径为50～300nm的挤出器挤出即获得粒径为 50～300nm的纳米类囊体。作一步优选，所述超声分散时，超声的频率为20～40 kHz，超声功率为150～300W。作为更进一步的优选，所述超声分散时，超声的频率为30～40kHz，超声的功率为200～300W。

发明人发现，类囊体分散液的pH以及挤出器的直径对纳米类囊体的性能具有一定的影响。

作为优选，所述类囊体分散液的pH为6.0～8.0，作为进一步的优选，所述类囊体分散液的pH为7.0～8.0，更进一步优选的pH为7.0～7.4。

作为优选，所述挤出器的直径为50～100nm，进一步优选为80～100nm。

本发明所述的制备方法中，作为优选，将制得的类囊体分散在所述pH的二次水中以获得类囊体分散液，其中在配取类囊体分散液的过程中，对分散液的体积无需精准计量，只需保证类囊体可以获得充分分散即可，例如类囊体在分散液中的体积浓度，可为1mg/mL。

作为优选，所述类囊体提取于含有叶绿体的植物。

在本发明中，所述的纳米类囊体由类囊体挤出获得，而类囊体提取于含有叶绿体的植物，其具有良好的生物相容性使得其在光动力治疗过程中体现出良好的生物安全性。

作为进一步的优选，所述类囊体提取于绿色植物叶子；绿色叶子中富含的叶绿素含量相对于别色叶子含量更高，光动力效果会更好。

在本发明中，所述的绿色植物叶子可为本领域技术人员所熟知的绿色蔬菜叶子、树叶、草叶中的至少一种；作为优选，所述绿色植物叶子为绿色蔬菜叶子。作为进一步的优选为菠菜叶子。

优选的菠菜叶子叶绿素含量远高于其他植物，提取出来的类囊体上富含的叶绿素含量也很高，有利于充分发挥光动力治疗效率，提高肿瘤治疗效果。

作为优选，所述类囊体的制备方法为：将绿色植物叶子研磨后，加入pH值为6～8的均相缓冲液匀浆，匀浆液过滤，所得滤液经第一次离心分离获得叶绿体，再将叶绿体分散于裂解缓冲液中进行裂解，裂解完成后第二次离心分离移除细胞质基质液，所得沉淀A分散于水中，经超声处理后第三次离心分离除去上清液，获得沉淀B即为类囊体。

在所述类囊体的制备方法中，所述均相缓冲液为本领域技术人员所熟知的用于提取叶绿体的缓冲液即可。

作为进一步的优选，本发明中所采用的均相缓冲液的组成为：20mM三甲基甘氨酸，0.4M蔗糖，2mM抗坏血酸，2mM氯化镁，40mM氯化钠，0.2％牛血清蛋白。本发明均相缓冲液的组成中，牛血清蛋白按质量百分比计，其余组成按浓度计。

作为优选，所述裂解缓冲液为(羟乙基哌嗪乙硫磺酸，HEPES)缓冲液，所述 HEPES缓冲液的浓度为10mM。

在本发明中，对于均相缓冲液的加入量及裂解缓冲液的加入量无需精准计量，只需均相缓冲液可以浸没绿色植物叶子，而裂解缓冲液可以浸没叶绿体即可。

本发明中，绿色植物叶子经过研磨，渗透裂解，过滤，离心分离，超声破碎后获得类囊体。其中，超声处理时，超声的频率20～40kHz，超声的功率为150～300 W。作为优选，所述超声的频率为30～40kHz，超声的功率为200～300W。

作为优选，所述沉淀A经HEPES缓冲液洗涤后分散于二次水中，并置于冰浴中。

本发明人发现，在制备类囊体的过程中，均相缓冲液的pH，离心转速和时间，裂解缓冲液的pH及时间，超声的频率，功率以及超声时间，对最终获得的类囊体的品质具有一定的影响。

本发明所述类囊体的制备方法中所述均相缓冲液的pH优选为7.0～8.0，进一步优选均相缓冲液的pH为7.0～7.8。

本发明所述类囊体的制备方法中所述第一次和第二次离心的转速优选为 4000～10000rpm，时间优选为5～60min，进一步优选转速为8000～10000rpm，时间为10～60min；更进一步优选的转速为8000～9000rpm，时间为10～20min。

第三次离心的转速优选为≥16000rpm，时间为≥15min，进一步优选转速为16000～20000rpm，时间为15～30min。

本发明所述类囊体的制备方法中获得的原始叶绿体分散在裂解缓冲液中，其中裂解缓冲液的pH优选为6.8～8.5，裂解时间优选为0.5～5h，裂解的温度优选为4℃～37℃。进一步优选裂解缓冲液的pH为7.4～8.5，裂解的时间为2～5h，裂解的温度为4℃～25℃；更进一步优选裂解缓冲液的pH为7.4～8.0。

作为优选，在所述的超声频率及功率下，超声处理的时间为1～10min，进一步优选超声处理的时间为5～10min。更进一步优选超声处理时间为8～10min。

采用本发明上述优选参数下所得的类囊体所制备的纳米类囊体，分散均匀，粒径均一，性能更为优异。

采用本发明所提供的纳米类囊体作为抗肿瘤材料克服肿瘤缺氧并光疗杀死癌细胞的方法例如为：(1)将肿瘤细胞(例如4T1细胞)按8000个每孔的密度种植在96孔板中，12h后，将分散在DMEM培养基中的纳米类囊体替换掉原来的培养液，并向其中加入终浓度为3×10^-5M的缺氧剂甲磺酸去铁胺来诱导细胞缺氧，随后向每孔中加入100μL石蜡油形成液封防止外部空气进去(甲磺酸去铁胺以及石蜡油可以构建模拟肿瘤缺氧模型)，4h后加入终浓度为10μL [Ru(dpp)₃]²⁺Cl₂使其终浓度为30μM，30min后成像来验证纳米类囊体可以克服肿瘤缺氧。(2)将肿瘤细胞(例如4T1细胞)按8000个每孔的密度种植在96孔板中， 12h后，将分散在DMEM培养基中的纳米类囊体替换掉原来的培养液，再与癌细胞共培养12h，让癌细胞充分吸收纳米类囊体。再对细胞进行光照(660nm激光)处理，光照时间为10min，随后加入用培养基稀释后的CCK-8(细胞凋亡试剂盒)溶液，继续培育1h后，通过酶标仪测试其OD值计算癌细胞的存活率。

本发明中，采用本发明制备方法所得纳米类囊体通过一系列处理后的到粒径均一，生物安全性高，副作用小，且具有良好的克服肿瘤缺氧以及光动力抗肿瘤的双重性能。

相对现有技术，本发明的技术方案的特色：

(1)本发明从原理上和实践上提供了一种以绿色植物叶为原料分离提取纳米类囊体用于肿瘤治疗的方法。实现了克服肿瘤缺氧和光动力治疗相结合的抗肿瘤途径，大大提高了抗肿瘤效果。

(2)发明人首创的将纳米类囊体用于制备抗实体肿瘤的药物，发明人研究发现，纳米类囊体既能促使肿瘤区域积累的过氧化氢分解为氧气从而克服肿瘤缺氧，同时又具有光敏特性可用作光敏剂，可以进行光动力抗肿瘤从而实现了双重功能相结合的效果，相较于单一的PDT纳米材料来说纳米类囊体的PDT治疗效果显著提升。

(3)本发明中所用纳米类囊体的制备方法简单，取材方便安全，反应条件温和、成本低，应用前景大，可进行大规模的制备。

附图说明

图1为实施例1步骤1制得的纳米类囊体的TEM图，粒径分布图，以及紫外吸收图。其中(a)为TEM图，标尺：50nm，插图为放大后的纳米类囊体的膜结构图，(b)为粒径分布图，(c)为紫外吸收图。

图2为实施例1步骤1中纳米类囊体催化过氧化氢分解的测试图，其中(a) 为重复四次加入过氧化氢后混合溶液残留过氧化氢量的百分比图，其中(b)为纳米类囊体与过氧化氢混合后产生氧气的量。

图3为实施例1步骤1纳米类囊体在660nm激光照射下产生单线态氧的测试图，其中(a)为单线态氧绿色传感器(SOSG)与纳米类囊体混合后经过660nm激光光照后的荧光光谱，(b)为纳米类囊体与叶绿素负载的纳米脂质体在正常氧气与缺氧条件下单线态氧产生的效率比较图。

图4为实施例1步骤1和2制得的纳米类囊体以及叶绿素负载的纳米脂质体与小鼠乳腺癌细胞(4T1细胞)处理后，在常氧与缺氧条件下胞内氧气的含量以及相应条件下的胞内单线态氧的产生效率，此外不同的浓度下的纳米类囊体与4T1 细胞共培养后，并以660nm激光照射10min后肿瘤细胞的存活率。其中(a)为纳米类囊体以及叶绿素负载的纳米脂质体在常氧与缺氧条件下胞内氧气的含量测定图(以氧气探针[Ru(dpp)₃]²⁺Cl₂荧光强度为基准，氧气含量越高荧光越弱)，(b) 为纳米类囊体以及叶绿素负载的纳米脂质体在常氧与缺氧条件下胞内单线态氧的含量测定图(以单线态氧探针SOSG荧光强度为基准，单线态氧产生越多荧光越强)，(c)不同浓度下纳米类囊体在660nm激光照射10min后肿瘤细胞的存活率。由图4可见，(a)和(b)中常氧和缺氧分别为蓝色(标记为1)和红色(标记为2) 柱，(c)中黑色(标记为1)，蓝色(标记为2)，红色(标记为3)和橙色(标记为4)柱型分别代表空白，仅660nm激光处理，仅纳米类囊体处理以及不同浓度的纳米类囊体加660nm激光处理。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作进一步说明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，基于本发明的原理对本发明所做出的各种改动或修改同样落入本发明权利要求书所限定。

在以下实施例中，均采用如下组成的缓冲液：20mM三甲基甘氨酸，0.4M 蔗糖，2mM抗坏血酸，2mM氯化镁，40mM氯化钠，0.2％牛血清蛋白。

实施例1：

步骤(1)纳米类囊体的制备：

采用渗透裂解法制备纳米类囊体。具体做法如下：称取100g新鲜的菠菜叶子置入研钵中研磨成均一碎片后，向研钵中加入300mL pH为7.8的均相缓冲液，

混匀后，用十层纱布过滤收集滤液。随后收集滤液，并将滤液通过8000rpm 转速离心10min收集沉淀得到原始的叶绿体。将得到的原始的叶绿体重新分散在浓度为10mM的HEPES(pH 8.0)的裂解缓冲液中并保持在4℃冰箱中2h，然后再将裂解后的溶液以8000rpm的转速离心10min分离移除上层细胞质基质液，收集沉淀。再将沉淀用上述HEPES缓冲液洗涤两次后重新分散在pH为7.4二次水中，并在冰浴中超声(超声的频率30kHz，超声功率为200W)处理5min，随后再以16000rpm转速离心15min分离除去上清液，得到的沉淀再超声分散 ((超声的频率30kHz，超声功率为200W)在pH为7.4的二次水中，将分散液通过100nm的挤出器挤压得到粒径均一的纳米类囊体(以NTs代替)。

图1可见步骤1制备得到的纳米类囊体。

步骤(2)叶绿素负载的纳米脂质体的制备：

具体做法如下：将步骤(1)通过十层纱布过滤得到的滤液收集起来后，加入乙酸乙酯萃取得到叶绿素，并将萃取得到的叶绿素放置到-20℃备用。将溶于乙酸乙酯中的叶绿素与溶解在甲醇中的鸡蛋磷脂酰胆碱(EPC)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG₂₀₀₀)按重量比9.1:85.9:5的比例混合，4℃下放置 2h后，真空悬干溶剂得到液体混合物，随后加入二次水水解并超声处理3min。然后将得到的溶液经100nm挤出器挤压得到与纳米类囊体粒径相当的叶绿素负载的纳米脂质体。叶绿素负载的纳米脂质体(以LPs代替)的制备是作为纳米类囊体的对比制备的，因此没有进行表征。

步骤(3)纳米类囊体催化分解过氧化氢产生氧气性能的测试：

过程如下：先配制0.1mg/mL的步骤(1)的纳米类囊体溶液1mL，再向其中加入10μL10mM的过氧化氢，反应两分钟后用过氧化氢试剂盒定量剩余的过氧化氢的量。过氧化氢可以重复再加入四次来验证纳米类囊体作为催化剂的稳定性。在此过程中可以使用溶氧计量笔来计量氧气产生的量。

图2(a)为重复四次加入过氧化氢后混合溶液残留过氧化氢量的百分比，由图 2(a)可见类囊体具有良好的催化过氧化氢的稳定性。图2(b)为纳米类囊体与过氧化氢混合后产生氧气的量，由图2(b)可见纳米类囊体能催化过氧化氢产生氧气。

步骤(4)纳米类囊体光照下产生单线态氧性能的测试：

过程如下：向步骤(3)中制备的纳米类囊体溶液中加入1μL 2.5mM的 SOSG(溶于甲醇)，随后混合溶液在660nm激光(1W cm^-2，以NIR代替)下照射 5min，然后光照的溶液在不同光照时间下的荧光发射通过荧光光谱记录下来。人工模拟缺氧条件下(1％O₂条件下加入100μM H₂O₂)重复进行上述实验。另外 NaN₃溶液加入到上述混合液中使其终浓度为1mg/mL来抑制单线态氧的产生以证明产生的为单线态氧。

图3(a)SOSG与纳米类囊体混合后经过660nm激光光照后的荧光光谱，由图3(a)可见纳米类囊体经过660nm激光光照后确实能产生单线态氧促使SOSG 产生荧光，另外叠氮化钠(NaN₃)溶液可以抑制纳米类囊体单线态氧的产生，证明经过光照后纳米类囊体产生的确实是单线态氧，证明了纳米类囊体是良好的光敏剂。图3(b)为比较了纳米类囊体与叶绿素负载的纳米脂质体在正常氧气与缺氧条件下单线态氧产生的效率，由图3(b)可见纳米类囊体在常氧与缺氧条件下均能很好的产生单线态氧，具有很高的效率，而叶绿素负载的纳米脂质体在常氧条件下展现了与纳米类囊体相当的单线态氧产生效率，而在缺氧条件下其单线态氧产生效率大幅度降低，证明了纳米类囊体可以克服肿瘤缺氧提高PDT效率。

步骤(5)克服肿瘤缺氧以及抗肿瘤效果的测试：

以4T1细胞为模型肿瘤细胞，采用本发明所提供的纳米类囊体作为克服肿瘤缺氧以及抗肿瘤材料，具体方法为：将4T1细胞按10000个每孔的密度种植在96孔板中，12h后将分散在培养基中的纳米类囊体(浓度为0.1mg/mL)替换掉原来的培养液，并向其中加入5μL缺氧剂甲磺酸去铁胺终浓度为3×10^-5M来诱导肿瘤细胞缺氧，随后向每孔中加入100μL石蜡油形成液封防止外部空气进去，孵育4h后加入终浓度为10μL[Ru(dpp)₃]²⁺Cl₂使其终浓度为30μM，30min 后成像来验证纳米类囊体可以克服肿瘤缺氧。(2)取96孔板，将4T1细胞按每孔大约10000个细胞的密度种满96孔板，每孔加入约100μL培养基，培育12h。将分散在培养基中不同浓度的纳米类囊体(0.02，0.05，0.1mg/mL)分别替换掉原来的培养液，再与癌细胞共培养12h，让癌细胞充分吸收纳米类囊体。再对细胞进行光照(660nm激光)处理，光照时间为10min，随后加入用培养基稀释后的CCK-8溶液，继续培育1h后，通过酶标仪测试其OD值计算癌细胞的存活率。

图4为实施例1步骤1和2制得的纳米类囊体以及叶绿素负载的纳米脂质体与小鼠乳腺癌细胞(4T1细胞)处理后，在常氧与缺氧条件下胞内氧气的含量以及相应条件下的胞内单线态氧的产生效率，此外不同的浓度下的纳米类囊体与4T1 细胞共培养后，并以660nm激光照射10min后肿瘤细胞的存活率。其中(a)为纳米类囊体以及叶绿素负载的纳米脂质体在常氧与缺氧条件下胞内氧气的含量测定图(以氧气探针[Ru(dpp)₃]²⁺Cl₂荧光强度为基准，氧气含量越高荧光越弱)，(b) 为纳米类囊体以及叶绿素负载的纳米脂质体在常氧与缺氧条件下胞内单线态氧的含量测定图(以单线态氧探针SOSG荧光强度为基准，单线态氧产生越多荧光越强)，(c)不同浓度下纳米类囊体在660nm激光照射10min后肿瘤细胞的存活率。由图4可见，(a)和(b)中常氧和缺氧分别为蓝色(标记为1)和红色(标记为2) 柱，(c)中黑色(标记为1)，蓝色(标记为2)，红色(标记为3)和橙色(标记为4)柱型分别代表空白，仅660nm激光处理，仅纳米类囊体处理以及不同浓度的纳米类囊体加660nm激光处理。从图4中可以看到，空白组和叶绿素负载的纳米脂质体组在常氧条件下其氧气探针的相对荧光强度分别为2.15和2.25，而在缺氧条件下其对应的相对荧光强度分别为1和1.2，纳米类囊体在常氧条件下的相对荧光强度约为0.16，在缺氧条件下其相对荧光强度约为0.35。说明纳米类囊体可以催化缺氧条件下积累的过氧化氢改善肿瘤缺氧，提升肿瘤氧气水平，叶绿素负载的纳米脂质体没有这类功能。另外在空白组和叶绿素负载的纳米脂质体组经660 nm激光处理后，在常氧条件下其单线态氧探针的荧光强度分别为2和78，而在缺氧条件下其对应的相对荧光强度分别为1和22，说明在缺氧条件下叶绿素负载的纳米脂质体的PDT效率大幅度降低，而纳米类囊体在常氧条件下的单线态氧探针荧光强度约为99，在缺氧条件下的荧光强度约为89，没有发生大幅度的下降。说明纳米类囊体可以催化缺氧条件下积累的过氧化氢提升肿瘤区域的氧气含量来提升PDT效率。此外，在没有光照处理时，纳米类囊体对4T1细胞基本是没有毒性的，说明了纳米类囊体具有良好的生物相容性，另外当用660nm激光照射后，随着纳米类囊体浓度的增加，4T1细胞的死亡率也越来越大，例如，当纳米类囊体的浓度为0.1mg/mL时，经660nm激光处理后的细胞存活率为 18％，证明了纳米类囊体具有良好的PDT效果，同时也具有良好的抗肿瘤效果。

实施例2

纳米类囊体的制备：

采用渗透裂解法制备纳米类囊体。具体做法如下：称取100g新鲜的菠菜叶子置入研钵中研磨成均一碎片后，向研钵中加入300mL pH为8.0的均相缓冲液，混匀后，用十层纱布过滤收集滤液。随后收集滤液，并将滤液通过10000rpm转速离心60min收集沉淀得到原始的叶绿体。将得到的原始的叶绿体重新分散在浓度为10mM的HEPES(pH8.5)的裂解缓冲液中并保持在37℃水浴中5h，然后再将裂解后的溶液以10000rpm的转速离心60min分离移除上层细胞质基质液，收集沉淀。再将沉淀用上述HEPES缓冲液洗涤两次后重新分散在pH为8.0二次水中，并在冰浴中超声(超声的频率40kHz，超声功率为300W)处理10min，随后再以25000rpm转速离心30min分离除去上清液，得到的沉淀再超声分散(超声的频率40kHz，超声功率为300W)在pH为8.0的二次水中，将分散液通过 300nm的挤出器挤压得到粒径均一的纳米类囊体(以NTs代替)。

抗肿瘤效果的测试：同实施例1的步骤(5)，其在缺氧条件下催化胞内过氧化氢提升胞内的氧气含量的能力略微下降；其在缺氧条件下胞内单线态氧的产生的含量下降不明显；当制得类囊体的浓度为0.1mg/mL时，660nm激光处理后的细胞存活率为21.5％，其对肿瘤细胞的杀伤能力与实施例1中制备的纳米类囊体有略微的差别。

实施例3

纳米类囊体的制备：

采用渗透裂解法制备纳米类囊体。具体做法如下：称取100g新鲜的菠菜叶叶子置入研钵中研磨成均一碎片后，向研钵中加入300mL pH为6.0的均相缓冲液，混匀后，用十层纱布过滤收集滤液。随后收集滤液，并将滤液通过4000rpm 转速离心5min收集沉淀得到原始的叶绿体。将得到的原始的叶绿体重新分散在浓度为10mM的HEPES(pH6.8)的裂解缓冲液中并保持在4℃冰箱中0.5h，然后再将裂解后的溶液以4000rpm的转速离心5min分离移除上层细胞质基质液，收集沉淀。再将沉淀用上述HEPES缓冲液洗涤两次后重新分散在pH为6.0二次水中，并在冰浴中超声(超声的频率20kHz，超声功率为150W)处理2min，随后再以16000rpm转速离心30min分离除去上清液，得到的沉淀再超声分散(超声的频率20kHz，超声功率为150W)在pH为6.0的二次水中，将分散液通过 50nm的挤出器挤压得到粒径均一的纳米类囊体(以NTs代替)。

抗肿瘤效果的测试：同实施例1的步骤(5)，在缺氧条件下，其催化胞内过氧化氢的能力有轻微下降；其在胞内产生单线态氧的能力与实施例一相差不大；当制得类囊体的浓度为0.1mg/mL时，660nm激光处理后的细胞存活率为24％，其对肿瘤细胞的杀伤能力与实施例1中制备的纳米类囊体相差不大。

实施例4

纳米类囊体的制备：

采用渗透裂解法制备纳米类囊体。具体做法如下：称取100g新鲜的菠菜置入研钵中研磨成均一碎片后，向研钵中加入300mL pH为7.0的均相缓冲液，混匀后，用十层纱布过滤收集滤液。随后收集滤液，并将滤液通过9000rpm转速离心20min收集沉淀得到原始的叶绿体。将得到的原始的叶绿体重新分散在浓度为10mM的HEPES(pH7.4)的裂解缓冲液中并保持在25℃水浴中2h，然后再将裂解后的溶液以9000rpm的转速离心20min分离移除上层细胞质基质液，收集沉淀。再将沉淀用上述HEPES缓冲液洗涤两次后重新分散在pH为7.0二次水中，并在冰浴中超声(超声的频率30kHz，超声功率为200W)处理8min，随后再以20000rpm转速离心30min分离除去上清液，得到的沉淀再超声分散在pH为 7.0的二次水中，将分散液通过80nm的挤出器挤压得到粒径均一的纳米类囊体 (以NTs代替)。

抗肿瘤效果的测试：同实施例1的步骤(5)，在缺氧条件下，其催化胞内过氧化氢的能力与实施例一中基本一致；其在胞内产生单线态氧的能力与实施例一也差不多；当制得类囊体的浓度为0.1mg/mL时，660nm激光处理后的细胞存活率为19％，其对肿瘤细胞的杀伤能力与实施例1中制备的纳米类囊体相差不大。

实施例5

纳米类囊体的制备：同实施例1的步骤(1)，只是将其中的菠菜换成了浮萍

抗肿瘤效果的测试：同实施例1的步骤(5)，尽管在缺氧条件下，其催化胞内过氧化氢提升胞内氧气含量的能力与实施例一中相差不大；其在缺氧条件下胞内产生单线态氧的能力却不及实施例一中制备的纳米类囊体，可能是由于浮萍类植物中叶绿素含量相对较少，类胡萝卜素等别的色素含量比较高从而相对稀释了叶绿素的含量，导致其产生单线态氧的能力下降；当制得类囊体的浓度为0.1 mg/mL时，660nm激光处理后的细胞存活率为29％，其对肿瘤细胞的杀伤能力虽不及实施例1中制备的纳米类囊体，但是其也具备较好的杀伤肿瘤细胞的能力。

对比例1：

步骤(1)纳米类囊体的制备：同实施例1的步骤(1)，只是将其中的均相缓冲液的pH调节为≥8.5。

步骤(2)叶绿素负载的纳米脂质体的制备：同实施例1的步骤(2)

步骤(3)纳米类囊体催化分解过氧化氢产生氧气性能的测试：同实施例1的步骤(3)，测试结果纳米类囊体无法催化肿瘤区域的过氧化氢分解为氧气，失去了克服肿瘤缺氧提高肿瘤区域PDT效率的优势。

步骤(4)纳米类囊体光照下产生单线态氧性能的测试：同实施例1的步骤(4)，其在常氧和缺氧条件下产生单线态氧的能力基本下降到与叶绿素负载的纳米脂质体持平。

步骤(5)克服肿瘤缺氧以及抗肿瘤效果的测试：同实施例1的步骤(5)，其在缺氧条件下没有了催化胞内过氧化氢提升胞内的氧气含量的能力；其在缺氧条件下胞内单线态氧的产生的含量也大幅度下降；当制得类囊体的浓度为0.1mg/mL 时，660nm激光处理后的细胞存活率为73.4％，其对肿瘤细胞的杀伤能力也远不及实施例1中制备的纳米类囊体。

对比例2：

步骤(1)纳米类囊体的制备：同实施例1的步骤(1)，只是将其中的HEPES 裂解缓冲液的pH调节为≥8.5。

步骤(2)叶绿素负载的纳米脂质体的制备：同实施例1的步骤(2)

步骤(3)纳米类囊体催化分解过氧化氢产生氧气性能的测试：同实施例1的步骤(3)，测试结果与实施例2中结果相同，原理也相同。

步骤(5)克服肿瘤缺氧以及抗肿瘤效果的测试：同实施例1的步骤(5)，其在缺氧条件下没有了催化胞内过氧化氢提升胞内的氧气含量的能力；其在缺氧条件下胞内单线态氧的产生的含量也大幅度下降；当制得的类囊体的浓度为0.1 mg/mL时，660nm激光处理后的细胞存活率为75％，其对肿瘤细胞的杀伤能力也远不及实施例1中制备的纳米类囊体，

对比例3：

步骤(1)纳米类囊体的制备：同实施例1的步骤(1)，只是将制备过程中的超声时间延长到30min。

步骤(2)叶绿素负载的纳米脂质体的制备：同实施例1的步骤(2)

步骤(3)纳米类囊体催化分解过氧化氢产生氧气性能的测试：同实施例1的步骤(3)，测试结果发现纳米类囊体催化过氧化氢分解的能力下降了，减弱了克服肿瘤缺氧提高肿瘤区域PDT效率的优势。证明超声时间的长短对其性能的影响较大。

步骤(4)纳米类囊体光照下产生单线态氧性能的测试：同实施例1的步骤(4)，其在常氧条件下的产生单线态氧的能力基本没变，缺氧条件下产生单线态氧的能力降低幅度较大。

步骤(5)克服肿瘤缺氧以及抗肿瘤效果的测试：同实施例1的步骤(5)，其在缺氧条件下催化胞内过氧化氢提升胞内的氧气含量的能力下降幅度较大；其在缺氧条件下胞内单线态氧的产生能力也有大幅度下降；其对肿瘤细胞的杀伤能力也逊于实施例1中制备的纳米类囊体。

对比例4：

步骤(1)叶绿素负载的纳米脂质体的制备：同实施例1的步骤(2)，将实施例1 中步骤(1)制备的纳米类囊体与步骤(2)中制备的负载叶绿素的纳米脂质体作性能对比。

步骤(2)纳米类囊体催化分解过氧化氢产生氧气性能的测试：同实施例1的步骤(3)，发现负载叶绿素的纳米脂质体没有催化过氧化氢分解的能力。

步骤(3)纳米类囊体光照下产生单线态氧性能的测试：同实施例1的步骤(4)，发现负载叶绿素的纳米脂质体在缺氧条件下的单线态氧产生效率远低于纳米类囊体，如图3(b)。

步骤(4)克服肿瘤缺氧以及抗肿瘤效果的测试：同实施例1的步骤(5)，发现负载叶绿素的纳米脂质体在缺氧条件下不能催化胞内积累的过氧化氢提升胞内的氧气含量，如图4(a)；负载叶绿素的纳米脂质体在缺氧条件下胞内单线态氧的产生效率也大幅度下降，如图4(b)；负载叶绿素的纳米脂质体杀伤肿瘤细胞的能力也远不及纳米类囊体。

对比例5：

纳米类囊体的制备：其余条件与实施例1的步骤(1)相同，只是将采用500nm 的挤出器挤压粒径为500nm的纳米类囊体。

抗肿瘤效果的测试：同实施例1的步骤(5)，发现在同等量的条件下，尽管在体外纳米类囊体保持着良好的效果，但是当进行细胞实验时，发现绝大多数的纳米类囊体由于粒径太大没有被细胞内吞而遗留在细胞外面，导致其抗肿瘤效果降低，经660nm激光处理后，大约有60％的细胞存活，对肿瘤细胞的杀伤力远不及实施例一种的效果。

对比例6：

纳米类囊体的制备：其余条件与实施例1的步骤(1)相同，只是将采用30nm 的挤出器挤压粒径为30nm的纳米类囊体。

抗肿瘤效果的测试：同实施例1的步骤(5)，发现在同等量的条件下，此粒径的纳米类囊体在体外保持着良好的性能甚至性能要好过实施例1，但是把此粒径类囊体与细胞进行培养后，由于粒径太小，细胞自身的机体保护功能清除了绝大多数的类囊体，导致胞内浓缩的类囊体浓度很小，从而导致其抗肿瘤效果降低，经660nm激光处理后，大约有49％的细胞存活，对肿瘤细胞的杀伤力远不及实施例一种的效果。

Claims

1.一种纳米类囊体的应用，其特征在于，用于制备抗肿瘤的药物。

2.如权利要求1所述的一种纳米类囊体的应用，其特征在于，用于制备抗实体肿瘤的药物。

3.如权利要求2所述的一种纳米类囊体的应用，其特征在于，所述的纳米类囊体的粒径为50～300nm。

4.如权利要求3所述的一种纳米类囊体的应用，其特征在于，所述纳米类囊体的制备方法为，将类囊体经超声分散于水中获得类囊体分散液，类囊体分散液经直径为50～300nm的挤出器挤出即获得纳米类囊体。

5.如权利要求4所述的一种纳米类囊体的应用，其特征在于，所述类囊体分散液的pH为6.0～8.0，所述挤出器的直径为50～100nm。

6.如权利要求5所述的一种纳米类囊体的应用，其特征在于，所述类囊体的制备方法为：将绿色植物叶子研磨后，加入pH值为6～8的均相缓冲液匀浆，匀浆液过滤，所得滤液经第一次离心分离获得叶绿体，再将叶绿体分散于裂解缓冲液中进行裂解，裂解完成后第二次离心分离，所得沉淀A分散于水中，经超声处理后第三次离心分离除去上清液，获得沉淀B即为类囊体。

7.如权利要求6所述的一种纳米类囊体的应用，其特征在于，所述均相缓冲液的组成为：20mM三甲基甘氨酸，0.4M蔗糖，2mM抗坏血酸，2mM氯化镁，40mM氯化钠，0.2％牛血清蛋白；

所述裂解缓冲液为HEPES缓冲液，所述裂解缓冲液的浓度为10mM。

所述均相缓冲液的pH为7.0～8.0；

所述裂解缓冲液的pH为6.8～8.5，裂解时间为0.5～5h，裂解的温度为4℃～37℃。

8.如权利要求7所述的一种纳米类囊体的应用，其特征在于，

所述均相缓冲液的pH为7.0～7.8；

所述裂解缓冲液的pH为7.4～8.5，裂解的时间为2～5h；裂解的温度为4℃～25℃。

9.如权利要求6所述的一种纳米类囊体的应用，其特征在于，所述第一次和第二次离心的转速为4000～10000rpm，时间为5～60min，第三次的离心转速≥16000rpm，时间≥15min；

所述超声的频率20～40kHz，超声功率为150～300W；超声处理时间为1～10min。

10.如权利要求9所述的一种纳米类囊体的应用，其特征在于，所述第一次和第二次离心的转速为8000～10000rpm，时间为10～60min；第三次的离心的转速为16000～20000rpm，时间为15～30min；

所述超声处理时，超声的频率为30～40kHz，超声的功率为200～300W，超声处理的时间为5～10min。