CN114984258B - 一种高效抑制产毒黄曲霉菌孢子生长的绿色方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及霉菌防控领域,具体公开了一种磁性可见光催化复合材料高效抑制产毒黄曲霉菌孢子生长的绿色方法。采材料具有强磁性,便于回收,重复利用性能稳定。在可见光照射下,复合材料表现出良好地抑制产毒黄曲霉菌孢子生长的性能,抑制率达90%以上,该高效抑制真菌的方法可用于农产品储藏、运输等环节控制产毒黄曲霉菌孢子传播和生长,应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及霉菌防控领域,具体公开了一种磁性光催化复合材料高效抑制产毒黄曲霉菌孢子生长的绿色方法。
背景技术
黄曲霉菌(Aspergillus flavus)是一种常见的病原真菌,其孢子在环境中分布广泛,在空气、土壤及水体中均存在。黄曲霉菌污染可造成农作物如花生等产量与质量下降,制约产业高质量发展,并会产生强毒性、强致癌的次生代谢产物即黄曲霉毒素,严重威胁人类和动物生命健康。近几十年,大量化学农药等杀菌剂被广泛用于防治病原真菌,虽然防控效果好,但也带来了环境污染、真菌耐药性等问题。目前缺乏高效、可持续和绿色的黄曲霉菌防控技术,因此,探寻高效、稳定产毒黄曲霉菌孢子的绿色方法,减少产毒黄曲霉菌及其毒素污染,对保障消费安全和推动产业高质量发展都具有重要意义。
发明内容
本发明针对现有技术缺乏高效、可持续和绿色的黄曲霉菌防控技术的问题,提出一种基于可见光催化技术的高效抑制产毒黄曲霉菌孢子生长的绿色方法,减少产毒黄曲霉菌及其毒素污染,保障农产品消费安全和产业发展。
为达到上述发明目的,本发明采用的技术方案如下:
提供一种高效抑制产毒黄曲霉菌孢子生长的绿色方法,磁性g-C3N4/NiFe2O4复合材料在可见光照射下抑制产毒黄曲霉菌孢子生长,所述的磁性g-C3N4/NiFe2O4纳米复合材料为NiFe2O4菱形纳米片与g-C3N4纳米片复合物。
按上述方案,所述的磁性g-C3N4/NiFe2O4复合材料中g-C3N4纳米片的大小为10±5nm,菱形NiFe2O4纳米片的长度为60~120nm。
按上述方案,所述的氮化碳纳米片具有非晶态结构,均匀负载于菱形铁酸镍纳米片表面。
按上述方案,所述氮化碳与铁酸镍的质量比为0.1~0.4:1。
按上述方案,所述的g-C3N4/NiFe2O4纳米复合材料的饱和磁化强度为43emu g-1,便于回收利用。
按上述方案,所述的可见光辐照时间为30~90min。
按上述方案,产毒黄曲霉菌孢子生长的抑制率为60%以上,优选为70%以上,更进一步为80%以上,更优选为90%以上。
按上述方案,所述的磁性g-C3N4/NiFe2O4纳米复合材料的使用形式为粉末、悬浮液或磁性g-C3N4/NiFe2O4纳米复合材料制成的抑菌膜网等。所述的抑菌膜网为磁性g-C3N4/NiFe2O4纳米复合材料制成悬浮体,将悬浮体滴至基底如不锈钢薄膜等上自然流延成膜,在惰性气体保护下,300~350℃煅烧固定烧结,以使复合膜结合更紧密,制成。
按上述方案,所述的光源包括自然光光源或氙灯光源等。采用氙灯光源时,氙灯功率为150~300W,光照波长范围为420~700nm;样品与氙灯光源距离为20~25cm。
提供一种高效抑制产毒黄曲霉菌孢子生长的磁性g-C3N4/NiFe2O4纳米复合材料,所述的磁性g-C3N4/NiFe2O4纳米复合材料为NiFe2O4菱形纳米片与g-C3N4纳米片复合物。
按上述方案,所述的磁性g-C3N4/NiFe2O4复合材料中g-C3N4纳米片的大小为10±5nm,菱形NiFe2O4纳米片的长度为60~120nm。
按上述方案,所述的氮化碳纳米片具有非晶态结构,均匀负载于菱形铁酸镍纳米片表面。
按上述方案,所述氮化碳与铁酸镍的质量比为0.1~0.4:1,优选为0.15~0.25:1。
按上述方案,所述的g-C3N4纳米片的厚度为2-4nm;所述的g-C3N4/NiFe2O4纳米复合材料的饱和磁化强度为43emu g-1以上,便于回收利用。
提供磁性g-C3N4/NiFe2O4纳米复合材料的制备方法:将尺寸为纳米级的g-C3N4纳米片配成悬浮液,然后将可溶性的三价铁前驱物和二价镍前驱物的溶液缓慢加入g-C3N4悬浮液中,搅拌,调整体系pH至11~12.5,转入反应釜中在150~170℃条件下水热反应8~12h,得到g-C3N4纳米片。
按上述方案,所述的g-C3N4纳米片的厚度为2-4nm。
按上述方案,所述尺寸为纳米级的g-C3N4纳米片可采用以下制备方法获得:将碳氮化合物煅烧热分解获得氮化碳,然后超声剥离,得到悬浮液,静置一段时间,离心,取上清液真空冷冻干燥,研磨得到尺寸为纳米级的g-C3N4纳米片。其中,作为可选方案,所述的碳氮化合物为三聚氰胺,煅烧为550~580℃马弗炉中热解4~5h;超声剥离时间为4~6h;静置12~16h,所述的离心为10000~12000rpm离心15~20min。
按上述方案,所述的二价镍源物质为六水合氯化镍,三价铁源物质为六水合氯化铁,反应完成后自然冷却,将所得固体离心、洗涤、干燥过夜得复合材料。
一种抑制生物样品产毒黄曲霉菌生长的绿色方法,在待处理的生物样品体系中,加入磁性g-C3N4/NiFe2O4纳米复合材料,进行可见光光照处理,抑制产毒黄曲霉菌生长,降低黄曲霉毒素污染。如在花生等样品储藏间,加入磁性g-C3N4/NiFe2O4纳米复合材料,或与花生等样品直接接触。
按上述方案,所述的生物样品为农产品,所述的农产品为花生、玉米。
按上述方案,所述的可见光辐照时间为30~90min。
本发明方法应用在生物样品产毒黄曲霉菌孢子防治中能高效抑制霉菌孢子生长,降低黄曲霉毒素污染风险,保障花生等农产品质量安全。
本发明提供的磁性g-C3N4/NiFe2O4纳米复合材料,g-C3N4与NiFe2O4均为片状,结构均一,g-C3N4纳米片与NiFe2O4菱形纳米片面与面能充分接触,进而促进光生电子和空穴的传递,且能带结构能呈现Z-型电荷传递机制,高效利用可见光,产生大量羟基和超氧自由基,进攻破坏孢子细胞结构,极大程度提高光催化抑制黄曲霉菌孢子的性能。进一步的通过调控氮化碳和铁酸镍的比例的调控,可达到更佳的黄曲霉菌抑菌活性,纳米复合材料的抑菌效率可高达90%以上,远优于单一g-C3N4或NiFe2O4的抑菌效率。适当比例的氮化碳和铁酸镍可以促进电荷转移,抑制电子-空穴对的重组,且可保证入射光的照射;避免过多的氮化碳与铁酸镍结合会阻挡入射光照射到铁酸镍表面,可能导致的性能下降问题。
本发明制备方法中先使用尺寸为纳米级的氮化碳纳米片,与铁镍前驱物混合,调控体系pH,进行水热反应,制得g-C3N4纳米片与菱形NiFe2O4纳米片磁性复合材料,制备工艺简单。制备的磁性g-C3N4/NiFe2O4纳米复合材料面与面间的良好接触,能促进光生电子和空穴的传递,具有Z-型电荷传递机制,拥有优良的氧化还原能力。铁酸镍和氮化碳均产生光生电子和空穴,铁酸镍导带上的电子与氮化碳价带上的空穴结合,促进光生电荷的有效分离,保证了复合材料良好的氧化还原能力。经光催化氧化还原反应,氮化碳导带上的电子将氧气还原成超氧自由基(·O2 -),铁酸镍价带上的空穴将水氧化为羟基自由基(·OH),产生大量的羟基和超氧自由基,两种活性自由基高效攻击破坏孢子细胞结构,使细胞变形萎缩、细胞膜和细胞壁损坏,进而导致细胞内容物泄漏,真菌孢子细胞死亡。且具有强磁性,便于回收,重复利用性能稳定,能极大程度提高光催化活性。该高效抑制真菌的方法可用于农产品储藏、运输等环节控制产毒黄曲霉菌孢子传播和生长,应用前景广阔。
本发明技术方案的优点:
1.本发明制备的磁性复合材料制备方法简单,成本较低,性能及结构稳定。
2.本发明制备的磁性复合材料具备优异的抑制黄曲霉菌生长性能。在可见光照射下,复合材料表现出良好地抑制产毒黄曲霉菌孢子生长的性能,抑制率达90%以上。
3.本发明制备的磁性复合材料具有强磁性,有利于回收利用,节约成本。
附图说明
图1是本发明制备的磁性纳米复合材料实物照片(a)及其磁化曲线(b)图。
图2是本发明制备的氮化碳纳米片透射电镜(a),原子力显微镜(b)和纳米片厚度分布图(c),纳米复合材料透射电镜(d,e,f)。
图3是本发明采用氢氧化钠调控pH为7(a)和10(b)合成复合材料的透射电镜。
图4是本发明制备的磁性纳米复合材料的X射线衍射图谱。
图5是本发明制备的磁性纳米复合材料的X射线光电子能谱图。
图6是本发明制备的磁性纳米复合材料的Z-型电荷传递机制图。
图7是本发明制备的磁性纳米复合材料黑暗条件下对产毒黄曲霉菌抑制效果图(a),光照下不同材料对产毒黄曲霉菌抑制效果图(b,c)和氮化碳与铁酸镍质量比0.2:1的复合材料抑制产毒黄曲霉菌效果图(d,e),孢子初始浓度为1×105CFU mL-1。
图8是本发明回收5轮磁性纳米复合材料抑制产毒黄曲霉菌重复试验。
图9是本发明制备的复合材料杀菌膜对产毒黄曲霉菌孢子抑制效果图。
图10是本发明制备的磁性纳米复合材料对黄曲霉菌孢子细胞结构的损坏作用图。
图11是本发明制备的磁性纳米复合材料对花生防霉效果(a)及相应黄曲霉毒素含量图(b)。
图12是本发明制备的磁性纳米复合材料黑暗条件下对产毒黄曲霉菌抑制效果图,孢子初始浓度为1×107CFU mL-1。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步详细的描述本发明,但不能将方案中所涉及的方法及技术参数理解为对本发明的限制。
实施例1
磁性纳米复合材料制备:
1)称取10g三聚氰胺于坩埚中,加盖,放置于550℃(5℃/min)马弗炉中热解4h。冷却至室温后,将所得固体分散于100mL去离子水中,超声处理4h。放置12h后,将上述悬浮液于10000rpm离心15min,取上清液,真空冷冻干燥10h得g-C3N4纳米片;2)称取一定质量上述g-C3N4分散于50mL去离子水中,搅拌30min成悬浮液;3)称取1.014g六水合氯化镍和2.306g六水合氯化铁溶解于50mL去离子水中,搅拌30min后缓慢加至g-C3N4悬浮液中,继续搅拌30min,缓慢滴加6M氢氧化钠溶液调整pH至12。转入聚四氟乙烯内胆的反应釜,在160℃条件下水热反应12h。自然冷却后,将所得固体用乙醇和去离子水洗涤3次,然后在80℃烘干,研磨后即得到g-C3N4/NiFe2O4复合材料。根据氮化碳:铁酸镍质量比为0.1:1,0.2:1和0.4:1,分别简写为0.1CN/NFO,0.2CN/NFO和0.4CN/NFO,经元素分析实际质量比例为0.095:1,0.193:和0.394:。
图1(a)为合成的g-C3N4/NiFe2O4复合材料的实物图。
图1(b)是本发明制备的磁性纳米复合材料的磁化曲线图,由图可知该纳米材料具有较强的磁信号,饱和磁化强度为43emu g-1,具备强磁性,方便材料回收利用,节约成本。图2(a)为氮化碳纳米片电镜图,由图可知,其大小为10±5nm,由原子力显微镜可知,其厚度约为3.10nm,由图d,e,f可知NiFe2O4为菱形纳米片,氮化碳纳米片均匀负载于长度为60~120nm的菱形铁酸镍纳米片表面。
图3(a,b)分别为pH为7和10合成的复合材料,由图可知,相比pH=12条件下,在pH为7和10条件下,合成的菱形铁酸镍形貌不均一。
图4是本发明制备的磁性纳米复合材料的X射线衍射图谱,由图谱可知,制备的纳米材料衍射峰与标准卡片JCPDS No.10-0325一致,所制备的复合材料中无其他衍射峰,说明复合材料仅由g-C3N4和NiFe2O4构成,氮化碳为非晶态。
图5是本发明制备的磁性纳米复合材料的X射线光电子能谱图,由图可知,制备的纳米材料主要由铁、氧、镍、碳、氮等5种元素组成。
图6是本发明制备的磁性纳米复合材料的Z-型电荷传递机制图,由图可知,受光激发后,铁酸镍和氮化碳均产生光生电子和空穴,铁酸镍导带上的电子与氮化碳价带上空穴复合,从促进光生电荷的有效分离,保存了能量高的氮化碳上光生电子和铁酸镍上光生空穴。经光催化氧化还原,氮化碳导带上的电子将氧气还原成超氧自由基(·O2 -),铁酸镍价带上的空穴将水氧化为羟基自由基(·OH),两种活性自由基再攻击破坏孢子细胞。
实施例2
光催化复合材料杀菌膜制备:
称取1.0~2.0g实施例1中制备的复合材料0.1CN/NFO,0.2CN/NFO和0.4CN/NFO,分散至20~30mL蒸馏水中,超声30min,缓慢滴加3~5mL二甲基甲酰胺或甲醇后,将该混合物充分研磨至均一、粘稠的悬浮体。将悬浮体滴至基底上自然流延成膜,在惰性气体保护下,300~350℃煅烧固定烧结,使复合膜结合更紧密,制成光催化复合材料薄膜。
实施例3
孢子悬浮液制备:
将产毒黄曲霉菌(Aspergillus flavus 3.4408,购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)孢子液接种于无菌曲霉素琼脂基础(AFPA)培养基,于霉菌培养箱(28℃,90%RH)培养3d左右,至黄曲霉菌的底部呈橘黄色。用无菌牙签挑取黄曲霉菌丝接种于无菌氯硝胺甘油(DG 18)琼脂培养基上,于霉菌培养箱(28℃,90%RH)培养7d左右。用无菌吐温-80(0.1%)收集黄曲霉菌孢子,孢子浓度为1×107CFU mL-1于光学显微镜下用血球计数板计数,置于冰箱保存备用。
实施例4
产毒黄曲霉菌孢子生长的抑制效果评价:
取10mL上述孢子悬浮液和0.02g制备的催化剂粉末充分混合后,将该混合液搅拌均匀并置于可见光下进行光催化处理。每隔一定时间取1.0mL悬浮液用无菌水稀释后,均匀涂布于麦芽提取物琼脂(MEA)培养基上,于28℃培养24-28h后观察记录菌落数,抑菌率R=(N0-Nt)/N0%,其中N0为处理0min时黄曲霉存活菌落数,Nt为处理t min的存活菌落数。结果见图12。结果可看出:单一的氮化碳和铁酸镍抑菌率菌小于20%,而复合材料的抑菌率均超过55%,其中0.2CN/NFO抑菌率达到85%左右,说明单一材料复合后,能明显提升光催化活性。
分别取100μL上述孢子悬浮液和0.02g制备的催化剂粉末分散至9.9mL无菌水中,将该混合液搅拌均匀并置于可见光下进行光催化处理。每隔一定时间取1.0mL悬浮液用无菌水稀释后,均匀涂布于麦芽提取物琼脂(MEA)培养基上,于28℃培养24-28h后观察记录菌落数,抑菌率R=(N0-Nt)/N0%,其中N0为处理0min时黄曲霉存活菌落数,Nt为处理t min的存活菌落数。
如图7a和7b所示,在黑暗或仅可见光照射无催化剂条件下,黄曲霉菌落数无明显减少,说明可见光和催化剂是光催化抑菌过程中必不可少的条件。在可见光照射下,制备的催化剂抑菌效率不同(图7c),光催化处理90min后,抑菌率达到60%以上,抑菌效果优异,其中:0.2CN/NFO对黄曲霉菌的抑制率达到90%以上(图7d和7e)。
重复性和稳定性实验:
为了证明该光催化纳米材料的抑菌稳定性和结构稳定性,本研究进行了五次循环实验。在光催化抑菌实验后,将0.2CN/NFO用磁铁回收,用去离子水和乙醇洗涤,在80℃下烘干3h后再次用于光催化抑菌实验,重复5次,结果如图8。在循环使用5次后,0.2CN/NFO抑菌率均保持在85%左右,表明该复合材料抑菌性能稳定,且回收方便。
实施例5
光催化复合材料薄膜抑菌效果评价:
分别取100μL上述孢子悬浮液和实施例2中0.2CN/NFO制备的光催化复合杀菌膜至9.9mL无菌水中,于可见光下进行光催化处理。每隔一定时间取1.0mL悬浮液用无菌水稀释后,均匀涂布于麦芽提取物琼脂(MEA)培养基上,于28℃培养24-28h后观察记录菌落数,抑菌率R=(N0-Nt)/N0%,其中N0为处理0min时黄曲霉存活菌落数,Nt为处理t min的存活菌落数。
图9是制备的光催化复合膜对黄曲霉菌的抑制效率,由图可知光催化处理90min后,制备的复合材料薄膜对黄曲霉菌的抑制率大于90%,具有较好的应用潜力。
实施例6
黄曲霉菌孢子扫描电子显微镜观察:
收集光催化处理前后的孢子悬浮液,离心洗涤三次后,用2.5%戊二醛固定。将样品用乙醇脱水固定,冻干后喷金,用扫描电子显微镜观察。
如图10a所示,光催化处理前黄曲霉孢子细胞结构完整、规则。经过90min光催化处理后,孢子细胞明显皱缩变形(图10b)。为了进一步证实黄曲霉孢子细胞结构损伤,采用分光光度法测定细胞外DNA和蛋白质含量。如图10e所示,与其他对照组相比,光催化处理后的黄曲霉菌孢子细胞外的DNA和蛋白质浓度分别增加了45.7ngμL-1和0.039mg mL-1,这可能是由于活性自由基破坏了孢子细胞的细胞壁或细胞膜,导致细胞内的DNA和蛋白质泄漏。
黄曲霉菌孢子的荧光染色:
收集光催化处理前后的孢子悬浮液,经PI(1μg mL-1)和SYTO 9(6μg mL-1)染色后,用激光共聚焦采集图像。
如图10c和图10d所示,光催化处理黄曲霉菌孢子后,大量孢子细胞呈红色,说明黄曲霉菌细胞膜严重损坏或死亡,进而证明所制备光催化纳米材料高效抗黄曲霉菌作用。
实施例7
磁性纳米复合材料花生产毒黄曲霉菌的抑制实验:
收集均匀完整的花生样品进行灭菌处理,然后将黄曲霉菌孢子悬浮液接种于花生表面,自然干燥后,取100mg 0.2CN/NFO粉末均匀撒于花生表面,光处理一定时间后,将花生与材料分离。将花生样品置于28℃培养7d,观察菌落生长情况。
如图11a所示,随着光催化处理时间的延长,花生表面的黄曲霉菌落数逐渐减少,证明该方法可以有效抑制花生黄曲霉菌污染。
将培养1周的花生收集并灭菌(121℃,30min),于烘箱中干燥(80℃,60min)。将干燥后的花生样品粉碎,称取1.00g上述花生粉末用甲醇提取,然后用免疫亲和柱富集,采用高效液相色谱(HPLC)法测定上述花生样品中黄曲霉毒素含量(AFTs,AFB1+AFB2+AFG1+AFG2)及黄曲霉毒素B1(AFB1)的含量。如图11b所示,黄曲霉毒素含量由410.75μg kg-1下降到29.55μg kg-1,并且AFB1的含量从315.21μg kg-1下降到18μg kg-1。以上结果表明,在可见光照射下,制备的g-C3N4/NiFe2O4不仅能高效抑制黄曲霉菌生长,还能有效降低黄曲霉毒素污染,有助于保障花生等农产品质量安全。
Claims (9)
1.一种高效抑制产毒黄曲霉菌孢子生长的绿色方法,其特征在于:磁性g-C3N4/NiFe2O4复合材料在可见光照射下抑制产毒黄曲霉菌孢子生长,所述的磁性g-C3N4/NiFe2O4纳米复合材料为NiFe2O4菱形纳米片与g-C3N4纳米片复合物,所述的氮化碳纳米片具有非晶态结构,均匀负载于菱形铁酸镍纳米片表面,所述氮化碳与铁酸镍的质量比为0.1~0.4:1。
2.根据权利要求1所述的绿色方法,其特征在于:所述的磁性g-C3N4/NiFe2O4纳米复合材料中g-C3N4纳米片的大小为10±5 nm,菱形NiFe2O4纳米片的长度为60~120 nm。
3.根据权利要求1所述的绿色方法,其特征在于:所述的可见光辐照时间为30~90 min。
4.根据权利要求1所述的绿色方法,其特征在于:所述的磁性g-C3N4/NiFe2O4纳米复合材料的使用形式为粉末、悬浮液或磁性g-C3N4/NiFe2O4纳米复合材料制成的抑菌膜网;所述的可见光光源包括自然光光源或氙灯光源,采用氙灯光源时,氙灯功率为150~300 W,光照波长范围为420~700 nm;样品与氙灯光源距离为20~25 cm。
5.一种磁性g-C3N4/NiFe2O4纳米复合材料,其特征在于:所述的磁性g-C3N4/NiFe2O4纳米复合材料为NiFe2O4菱形纳米片与g-C3N4纳米片复合物,所述的氮化碳纳米片具有非晶态结构,均匀负载于菱形铁酸镍纳米片表面,所述氮化碳与铁酸镍的质量比为0.1~0.4:1。
6.根据权利要求5所述的复合材料,其特征在于:所述氮化碳与铁酸镍的质量比为0.15~0.25:1。
7.根据权利要求5所述的复合材料,其特征在于:所述的磁性g-C3N4/NiFe2O4复合材料中g-C3N4纳米片的大小为10±5 nm,菱形NiFe2O4纳米片的长度为60~120 nm;所述的g-C3N4纳米片的厚度为2-4nm;所述的g-C3N4/NiFe2O4纳米复合材料的饱和磁化强度为43 emu g-1以上。
8.权利要求5所述的磁性g-C3N4/NiFe2O4纳米复合材料的制备方法,其特征在于:将尺寸为纳米级的g-C3N4纳米片配成悬浮液,然后将可溶性的三价铁前驱物和二价镍前驱物的溶液缓慢加入g-C3N4悬浮液中,搅拌,调整体系pH至11~12.5,转入反应釜中在150~170oC条件下水热反应8~12 h,得到g-C3N4纳米片。
9.一种抑制生物样品产毒黄曲霉菌生长的绿色方法,其特征在于:在待处理的生物样品体系中加入权利要求5所述的磁性g-C3N4/NiFe2O4纳米复合材料,进行可见光光照处理,抑制产毒黄曲霉菌生长,降低黄曲霉毒素污染。
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