CN116004435A - 一种巨大芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种巨大芽孢杆菌及其应用，涉及微生物技术。该菌株命名为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，株号为Tu27，保藏号为CCTCC NO：M 20221115。该菌株对峙培养对水稻病原真菌生长具有抑制效果；该菌株可合成具有抗菌、杀菌活性的纳米银。该菌株合成的纳米银的粒径为15±6nm，尺寸较小，而且对稻瘟病菌的生长具有明显的抑制作用。因此，该菌株是一株极具开发研究价值的纳米银的制备菌株。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术，具体涉及一种巨大芽孢杆菌及其应用。
背景技术
纳米银(AgNPs)具有很多特性，在生物医学、纳米医药、生物感知等领域具有广泛应用前景。纳米银的合成方法多种多样，主要有物理法、化学法和生物法。物理合成法对仪器设备要求高，生产费用昂贵，且耗能高；化学合成法最大的优点之一是可以在短时间内合成大量的纳米粒子，但通常依赖于有毒、价格昂贵的化学试剂，会产生不环保的副产品，从而限制了其在食品检测、生物医学等领域的应用。生物法由于成本低廉、具可持续性、反应条件温和、产物稳定，且过程中不使用毒性化学试剂，环境友好而备受关注。在过去十年里，通过植物抽提物或者微生物合成纳米银具有低成本和环境友好的优势，因而被广泛研究。同时比传统的物理和化学合成途径更安全。
在生物法中，用于合成AgNPs的材料主要包括三类“成员”，即植物、细菌及真菌。与真菌材料相比，细菌可以分泌大量合成纳米颗粒相关的胞外酶、多肽类物质及次级代谢产物等，合成的纳米颗粒产量高、易与细菌分离，因此在下游过程中节省了相当大的成本。与植物材料相比，细菌具有更强的抗压能力，为金属盐与金属纳米颗粒的转化提供了很大的表面积，更适合于大规模合成。
纳米银具有高表面积体积比，通过接触，激活活性氧和释放阴离子等机制抑制微生物生长，因而被期望取代传统的合成杀菌剂。近期越来越多的研究表明纳米银可以显著抑制植物微生物病原的菌丝生长。随着细菌优势的突出，合成AgNPs的报道也逐渐增多。其中研究报道Bacillus属细菌多个种可合成AgNPs，同时Bacillus属细菌对植物病原菌具有广泛的抑菌活性。比如，授权号为CN108060170B的专利申请提供了一种基于宏基因组技术挖掘的角蛋白酶及其应用方法，属于工业生物技术领域。该角蛋白酶基因全长1，149bp，编码382个氨基酸；以枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600为例，成功实现了该角蛋白酶基因的异源表达。该角蛋白酶基因的获取方法方便可行，将该基因进行重组表达，构建的重组菌株可以实现重组角蛋白酶的分泌表达，重组角蛋白酶对金属离子和表面活性剂表现出较好的耐受性，酶稳定性较好。重组菌发酵周期短，适合于工业化大规模的生产。另外，该酶具有良好的还原能力，能应用于生物法制备纳米银粒子的研究中，制备得到的纳米银粒子具有良好的形态，并且具有较好的抑菌活性。
因此，筛选和鉴定Bacillus属中广谱抑菌的菌株并分析其在生物合成纳米银中的作用，对水稻病原真菌尤其是稻瘟病菌和稻曲病菌的防治具有潜在的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种巨大芽孢杆菌及其应用。
本发明解决其技术问题所采用的的技术方案是：
一种巨大芽孢杆菌，其特征在于，命名为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，株号为Tu27，保藏号为CCTCC NO：M 20221115。
本发明还提供了所述的巨大芽孢杆菌在抑制水稻病原真菌生长中的应用。
优选的，所述水稻病原真菌为稻瘟病菌、稻曲病菌或胡麻病菌。
本发明提供了所述的巨大芽孢杆菌在合成纳米银中的应用。
本发明提供了一种合成纳米银的方法，使用所述的巨大芽孢杆菌与硝酸银混合培养，合成得到纳米银。
一种合成纳米银的方法，包括以下步骤：
(1)巨大芽孢杆菌发酵：将巨大芽孢杆菌发酵培养，得到发酵上清液；
(2)将步骤(1)中的发酵上清液加入硝酸银溶液混合后培养，即获得纳米银。
优选的，步骤(1)中所述培养条件为30℃条件下培养2d；步骤(2)中培养条件为在30℃条件下避光培养。
优选的，步骤(2)中发酵上清液和硝酸银溶液的体积比为1：9，硝酸银溶液的浓度为3mM。
进一步地，所述纳米银的粒径为15±6nm。
本发明提供了所述的方法合成得到的纳米银。
本发明提供了所述的纳米银在抑制稻瘟病菌生长中的应用。
本技术方案与现有技术相比，具有的有益效果：
本发明提供了一种巨大芽孢杆菌。该菌株对峙培养对水稻病原真菌生长具有抑制效果；该菌株可合成具有抗菌、杀菌活性的纳米银，合成方法的成本低，具有绿色合成，对环境友好的有益效果。该菌株合成的纳米银的粒径为15±6nm，尺寸较小，而且对稻瘟病菌的生长具有明显的抑制作用。因此，该菌株是一株极具开发研究价值的纳米银的制备菌株。
附图说明
图1为菌株Tu27的不同菌落形态图；其中，A为正常拍照的菌落形态图；B为显微观察Tu27菌体形态图，标尺为10μm。
图2为Tu27菌株对水稻多种病原真菌抑制作用图。
图3为利用Tu27菌株培养液合成的纳米银AgNPs紫外光-可视光广谱吸收峰图。
图4为扫描电镜和透射电镜下观察纳米银颗粒的形态图；其中，A为扫描电镜下观察纳米银颗粒的形态图；B为透射电镜下观察纳米银颗粒的形态图。
图5为不同浓度下的纳米银溶液对稻瘟病菌抑制效果图；其中，A为不同浓度下的纳米银溶液对稻瘟病菌生长抑制效果图；B为不同浓度下的纳米银溶液对稻瘟病菌生长抑制率图；C为不同浓度下的纳米银溶液对稻瘟病菌生长状况数据图。
图6为纳米银溶液对抑制稻瘟病菌的分生孢子萌发和致病力的影响图；其中，A为纳米银溶液对抑制稻瘟病菌的分生孢子萌发图；B为纳米银溶液对抑制稻瘟病菌的致病力图。
具体实施方式
实施例1：菌种分离和分子鉴定
取浙江省杭州市富阳区水稻田中水稻苗根基土壤0.1g，用1mL无菌水重悬，稀释后涂LB固体平板，三天后平板上挑单菌落划线与稻瘟病菌(新加坡淡马锡生命科学研究所Naqvi教授惠赠)对峙培养，筛选具有明显抑制作用的菌株，其中一株具有显著抑菌效果的菌株编号Tu27，菌落平板划线观察菌落形态为黄色，边缘白色，显微观察菌体短棒状(如图1所示)。使用引物63F：CAGGCCTAACACATGCAAGTC和13897R：GGGCGGTGATGTACAAGGC，经PCR扩增16S rRNA基因片段(序列如SEQ ID No.1所示)，送公司测序结果经NCBI数据库BLAST比对鉴定为Bacillus megaterium，序列一致性达到100％，表明菌株Tu27属于Bacillusmegaterium。
将该新筛选的菌株命名为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，株号为Tu27，于2022年7月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 20221115。
实施例2：对峙培养
将实施例中筛选得到的Tu27菌株与其他田间病样分离获得水稻病原真菌稻曲病菌、胡麻病菌、恶苗病菌、穗腐病菌和纹枯病菌在PDA平板上25℃对峙培养发现，除了对稻瘟病菌具有抑制作用外，对稻曲病菌和胡麻病菌生长也具有很好的抑菌效果(如图2所示)，对稻瘟病菌、稻曲病菌和胡麻病菌的抑制率如表1所示。
表1
| 病原真菌 | 抑制率(％) |
| 稻瘟病菌 | 76.9±1.5 |
| 稻曲病菌 | 59.1±9.2 |
| 胡麻病菌 | 32.8±1.8 |
实施例3
利用细菌合成纳米银是纳米银绿色生物合成的前沿手段，我们检测了菌株Tu27在纳米银合成中的作用。在LB平板上培养菌株Tu27，挑取单个细菌菌落到20mL NA液体培养基(10g/L胰蛋白胨，3g/L牛肉膏，2.5g/L葡萄糖，pH 7.0)在30℃条件下摇培2天。细菌培养液用0.22μm滤器过滤两遍，取10mL无细胞培养液与90mL 3mM的硝酸银(AgNO3)溶液混合，加入到250mL的三角瓶中，30℃摇床中黑暗诱导纳米银颗粒形成。四天后，溶液由浅黄色变为暗褐色，通过紫外可视光谱检测纳米应颗粒的形成，最大吸收峰在440nm(如图3所示)。
通过10000g 20min离心收集溶液中的纳米银颗粒，并将沉淀用无菌水洗三遍。冻干后的纳米银颗粒称重后，用无菌水重选，配成纳米银颗粒母液(0.2g/mL)。通过扫描电镜和透射电镜观察纳米银颗粒的形态，结果表明合成的溶液中含有纳米银颗粒，直径平均为15±6nm(如图4所示)。
实施例4
将合成的纳米银按照一定的比例(0μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL)添加到CM固体培养基中，用于培养稻瘟病菌，7天后测量菌落直径和菌落中的分生孢子数目，结果表明随着添加纳米银的浓度增加，生长速率逐渐受到抑制，产孢则呈现出先减少再增加的趋势(如图5所示)。
将20μL的纳米银溶液(0.2g/mL)与稻瘟病菌分生孢子溶液混合后接种水稻稻瘟病菌感病品种CO39，接种5天后观察发病情况发现，添加菌株Tu27合成的纳米银后病斑数量和病斑面积均显著减少，同时单独施加相同浓度的纳米银则对水稻苗没有明显影响。显微观察发现，添加Tu27合成的纳米银后，分生孢子经过4小时和24小时孵育后均不萌发(如图6所示)。说明菌株Tu27合成的纳米银对水稻稻瘟病菌有明显的抑制作用。
Claims (10)
1.一种巨大芽孢杆菌，其特征在于，命名为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，株号为Tu27，保藏号为CCTCC NO：M 20221115。
2.如权利要求1所述的巨大芽孢杆菌在抑制水稻病原真菌生长中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述水稻病原真菌为稻瘟病菌、稻曲病菌或胡麻病菌。
4.如权利要求1所述的巨大芽孢杆菌在合成纳米银中的应用。
5.一种合成纳米银的方法，其特征在于，使用权利要求1所述的巨大芽孢杆菌与硝酸银混合培养，合成得到纳米银。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)巨大芽孢杆菌发酵：将巨大芽孢杆菌发酵培养，得到发酵上清液；
(2)将步骤(1)中的发酵上清液加入硝酸银溶液混合后培养，即获得纳米银。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述培养条件为30℃条件下培养2d；步骤(2)中培养条件为在30℃条件下避光培养。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中发酵上清液和硝酸银溶液的体积比为1∶9，硝酸银溶液的浓度为3mM；所述纳米银的粒径为15±6nm。
9.如权利要求5～8任一所述的方法合成得到的纳米银。
10.如权利要求8所述的纳米银在抑制稻瘟病菌生长中的应用。
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Cited By (1)
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| CN108504603A (zh) * | 2018-04-17 | 2018-09-07 | 沈阳农业大学 | 一种诱导水稻抗稻瘟病的生防菌株及筛选方法和应用 |
| CN112940979A (zh) * | 2021-03-18 | 2021-06-11 | 深圳大学 | 细菌菌株、提取物、纳米农药及其应用与制备方法 |
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2022
- 2022-09-30 CN CN202211232141.7A patent/CN116004435B/zh active Active
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| CN116970517B (zh) * | 2023-05-26 | 2024-04-16 | 中国水稻研究所 | 一株巨大普里斯特氏菌及其在缓解镉对水稻影响中的应用 |
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