CN116970517A - 一株巨大普里斯特氏菌及其在缓解镉对水稻影响中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株巨大普里斯特氏菌及其在缓解镉对水稻影响中的应用，所述巨大普里斯特氏菌为巨大普里斯特氏菌(Priestiamegaterium)WSH002，且保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCM2023293，保藏日期为2023年3月13日。所述巨大普里斯特氏菌通过向外释放有机酸来络合环境中对植物具有毒害作用的镉离子，因此可以缓解镉毒对水稻生长产生的不良影响。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一株巨大普里斯特氏菌及其在缓解镉对水稻影响中的应用。
背景技术
水稻是我国最重要的粮食作物，在人民的日常生活和整个国民经济中发挥着十分重要的作用。重金属镉污染不但会影响水稻的生长发育以及稻米的品质，而且还可以通过食物链传递而最终危害人类的生命健康。
在幼穗分化之前，镉毒害主要抑制水稻叶绿素生成导致叶片失绿黄化，从而降低光合生产力；在幼穗分化至抽穗期，镉毒害主要抑制水稻幼穗的分化与发育；在抽穗之后，镉毒害主要抑制碳水化合物的合成和N、P养分在穗部迁移转化，最终导致水稻减产。
然而，现有技术多集中在镉富集植物的研究上，对如何通过微生物提高镉污染土壤中水稻的生长性能和降低稻米中镉的含量积累尚无深入研究。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了一株巨大普里斯特氏菌(Priestiamegaterium)WSH002，其可以降低水稻对外界镉离子的吸收，降低水稻体内镉的富集，因此可以缓解镉毒对水稻生长产生的不良影响。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一方面，提供了一株巨大普里斯特氏菌，所述巨大普里斯特氏菌为巨大普里斯特氏菌(Priestia megaterium)WSH002，且保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为：CCTCC M 2023293，保藏日期为2023年3月13日。
还提供一种上述巨大普里斯特氏菌WSH002在降低植物根和/或茎和/或叶镉含量中的应用。
还提供一种上述巨大普里斯特氏菌WSH002在提高植物叶片叶绿素含量中的应用。
还提供一种上述巨大普里斯特氏菌WSH002在提高植物光合作用指标中的应用。
优选的，所述光合作用指标包括净光合速率、胞间二氧化碳浓度、气孔导度和蒸腾速率中的一种或几种。
上述植物包含水稻。
还提供一种上述巨大普里斯特氏菌WSH002在增加水稻分蘖数中的应用。
还提供一种上述巨大普里斯特氏菌WSH002在提高水稻产量中的应用。
还提供一种上述巨大普里斯特氏菌WSH002在降低水稻糙米镉含量中的应用。
还提供一种上述巨大普里斯特氏菌WSH002在提高水稻叶片磷含量中的应用。
还提供一种添加上述巨大普里斯特氏菌WSH002的水稻种植基质。
优选的，每kg水稻种植基质中添加30-100mL巨大普里斯特氏菌WSH002的重悬液。
本发明至少具备以下有益效果：
本发明中的WSH002菌株通过向外释放有机酸来络合环境中对植物具有毒害作用的镉离子，降低水稻对外界镉离子的吸收，降低水稻体内镉的富集，由此改善叶绿素含量、光合效率、生长性能等指标，因此可以缓解镉毒对水稻生长产生的不良影响。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的巨大普里斯特氏菌WSH002的菌落形态；
图2为本发明的巨大普里斯特氏菌WSH002的生长曲线；
图3为未添加Cd以及添加Cd后，巨大普里斯特氏菌WSH002的菌落形态；
图4为本发明的巨大普里斯特氏菌WSH002所分泌的有机酸类型鉴定结果；
图5a为对照组CK、对照组Cd、实验组CK+WSH002以及实验组Cd+WSH002的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素以及总叶绿素的含量；
图5b为对照组CK、对照组Cd、实验组CK+WSH002以及实验组Cd+WSH002的根际土有效磷含量以及水稻叶片磷含量；
图6a为对照组CK、对照组Cd、实验组CK+WSH002以及实验组Cd+WSH002的净光合效率、胞间二氧化碳、气孔导度以及蒸腾效率；
图6b为对照组CK、对照组Cd、实验组CK+WSH002以及实验组Cd+WSH002的根、茎、叶镉含量；
图7为对照组CK、对照组Cd、实验组CK+WSH002以及实验组Cd+WSH002的水稻株高、地上部干重、叶面积以及分蘖数。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：
本实施例提供了一株巨大普里斯特氏菌(Priestia megaterium)WSH002(以下简称为“WSH002”)，且保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为：CCTCC M 2023293，保藏日期为2023年3月13日。
上述菌株信息如下：
1、菌株来源
上述WSH002菌株分离自水稻根际土，具体分离过程包括如下步骤：
S1、按照土水比1:10(质量比)，用灭菌超纯水对水稻根际土进行重悬，然后稀释10倍，以得到稀释液；
S2、将稀释液分别涂布于含不同浓度镉的固体筛选培养基上，将培养基上生长的菌落用LB液体培养基进行扩繁，连续传代3次；
S3、挑选扩繁后的菌种，运用16s rRNA通用引物27f和1492r进行菌液PCR，获得的产物进行测序，以获取如SEQ NO.1所示的测序结果；
S4、将测序结果在NCBI数据库进行比对，结果显示，其与PriestiamegateriumWSH-002的序列同源性为99.54％(登录号NC_017139.1)。由此得到一株巨大普里斯特氏菌(Priestiamegaterium)(以下简称为“WSH002”)。
2、形态学特征
将WSH002菌株接种于LB固体培养基上，于30℃条件下培养24h，然后观察菌落形态。如图1所示，该菌落较小，呈淡黄色、圆型，且菌落不透明、较湿润，周围无突起，中间具有白点。
3、生长曲线
将WSH002菌株接种于LB液体培养基中，在30℃、180rpm条件下进行震荡培养，每隔1h取样一次，并测定菌液OD值，绘制生长曲线。如图2所示，通过生长曲线发现该菌株延缓期较长，约12小时，12h后进入对数期，17h后进入稳定期。
4、缓解镉毒特性
按照6mg/100ml的比例将溴甲酚紫(以体积ml计)加入到LB固体培养基(以重量mg计)中，不添加镉(Cd)，并接种WSH002菌株，作为对照组(CK)；
按照6mg/100ml和0.1mg/100ml的比例分别将溴甲酚紫(以体积ml计)和镉(CdSO4·8/3H2O)(以重量mg计)加入到LB固体培养基(以重量mg计)中，并接种WSH002菌株，作为实验组(CK+Cd)；
对照组(CK)和实验组(CK+Cd)均置于30℃下培养24h，然后观察WSH002菌株的产酸能力。
溴甲酚紫作为酸碱指示剂，其pH指示范围为5.2(黄色)～6.8(紫色)，因此，若细菌产酸，则菌落周围培养基的pH下降，从而将添加有溴甲酚紫的培养基从紫色变成黄色，且黄色区域越大，产酸能力越强。如图3所示，对照组(CK)中，WSH002细菌周围有一圈黄色区域(即图3中的Y)，说明产酸能力较强，在实验组(CK+Cd)中，黄色区域明显变大，说明在镉毒条件下，WSH002菌株分泌有机酸的能力变强，且产生的有机酸与Cd进行络合，形成不易被吸收的络合态镉，从而缓解镉毒。
6、分泌有机酸种类鉴定
在LB液体培养基中不添加镉(Cd)，并接种WSH002菌株，作为对照组(CK)；
以0.1mg/100ml的比例将镉(CdSO4·8/3H2O)(以重量mg计)加入到LB液体培养基(以体积ml计)中，并接种WSH002菌株，作为实验组(Cd)；
对照组(CK)和实验组(Cd)均置于30℃、180rpm条件下培养24h，然后提取液体培养基样品，于13400r/min条件下离心10min，然后取上清液，将上清液用0.22μm滤膜过滤，然后采用高效液相色谱HPLC测定上清液中有机酸的种类和含量，以空白培养基为对照。如图4所示，实验组(Cd)中，酒石酸、莽草酸、柠檬酸和琥珀酸的含量显著高于对照组(CK)，说明WSH002菌株主要通过分泌以上几种有机酸来和镉进行络合，生成络合态镉。
实施例2：
本实施例提供了实施例1中所述WSH002菌株在水稻种植中的应用。
准备若干花盆，且每一花盆中添加相同重量(如4kg)、相同性质(如黄土)的基质(如土壤)；
再在每一花盆的基质中添加相同重量、相同种类的基肥；
再将花盆分为对照组CK、对照组Cd、实验组CK+WSH002以及实验组Cd+WSH002，其中，对照组CK的基质不做任何处理；对照组Cd的基质(以重量kg计)中按照10mg/kg的比例添加CdSO4·8/3H2O(以重量mg计)，不做其他处理；实验组CK+WSH002的基质(以重量kg计)中按照30-100mL/1kg(优选为50-80mL/1kg，特别优选为60mL/1kg)的比例接种WSH002菌种悬液(以体积mL计，此时每ml悬液中的菌含量为5*108CFU)，并混合均匀，不做其他处理；实验组Cd+WSH002的基质(以重量kg计)中按照10mg/kg的比例添加CdSO4·8/3H2O(以重量mg计)以及按照60mL/1kg的比例接种WSH002菌种重悬液(以体积mL计，此时每ml悬液中的菌含量为5*108CFU)，并混合均匀，不做其他处理；上述每个处理重复3次；
每个花盆中移栽3株生长至两叶一心的水稻幼苗，本实施例中，水稻品种为日本晴。
叶绿素含量测定
水稻生长30天后取样(取完全展开的倒二叶)，并进行叶绿素检测。称取质量0.5g的叶片置于50mL离心管中，加入95％乙醇(分析纯)，将叶片样品避光处理，直至叶片变为白色后取出，处理过程中采用旋涡震荡仪6-10次，以充分提取叶绿素，取浸提液在酶标仪上进行比色，在三个波长(665nm、649nm、470nm)条件下，通过下列公式分别计算出总叶绿素、叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的含量：
叶绿素含量＝色素浓度C*提取液体积/样品鲜重(mg/g)
Chla浓度Ca＝1395*A665-6.88*A649
Chlb浓度Cb＝2496*A649-7.32*A665
类胡萝卜素浓度＝1000*A470-2.05Ca-114.8Cb/245；
检测结果如图5a所示，在水稻生长30天后，相比未添加Cd而言(即对照组CK、实验组CK+WSH002)，添加Cd后(即对照组Cd、实验组Cd+WSH002)，水稻叶片中的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和总叶绿素含量显著降低。而在外源添加WSH002菌株后，其可以显著缓解因镉毒引起的叶绿素下降问题。
并且即使均未添加Cd，实验组CK+WSH002中的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和总叶绿素含量也显著高于对照组CK，主要原因是WSH002菌株可提高水稻根际土壤中结合态磷的释放，增加了水稻根际土的有效磷含量，从而提高水稻对磷元素的吸收，增加了叶片磷含量(图5b所示)。而磷是脂膜的主要成分之一，其不仅直接影响水稻生长，还影响水稻叶片对叶绿素的合成和光合作用。因此，WSH002菌株通过提高水稻对磷的吸收来提高叶绿素的合成效率。
光合效率测定
水稻生长30天后对完全展开的倒二叶用LI-6400XT光合仪进行光合效率检测。
检测结果如图6a所示，相比未添加Cd而言(即对照组CK、实验组CK+WSH002)，添加Cd后(即对照组Cd、实验组Cd+WSH002)，水稻的净光合速率、胞间二氧化碳浓度、气孔导度和蒸腾速率同样显著下降。而添加WSH002菌株后，细菌通过络合环境中的镉离子，使水稻根系降低对外界镉离子的吸收，同时降低了水稻根系、茎和叶中的镉含量(图6b)，从而缓解镉毒害对水稻光合的抑制作用。
生长性能测定
水稻生长30天后，取样，并进行水株高、地上部干重和叶面积测定。
检测结果如图7所示，相比未添加Cd而言(即对照组CK、实验组CK+WSH002)，镉毒显著降低水稻株高、地上部干重和叶面积，同时抑制水稻的分蘖速率，而添加WSH002菌株后，其可以显著缓解因镉毒引起的生长抑制问题，以增加水稻的分蘖数。
产量以及镉含量测定
水稻生长100天后到达成熟期，采集稻穗，测定每株穗数、每穗粒数、结实率、千粒重和产量。同时将稻谷加工成糙米后研成粉末，利用硫酸-双氧水法进行消煮后稀释至适宜浓度，利用ICP-MS测定糙米镉含量。
检测结果如表1所示，对水稻考种后发现，在Cd的作用下，水稻的每株穗数和每穗粒数均显著下降，导致水稻产量降低，而添加WSH002菌株则可以显著提高水稻的每株穗数和每穗粒数，从而提高水稻产量，同时显著降低了水稻糙米中的镉含量。
表1每株穗数、每穗粒数、结实率、千粒重、产量和糙米镉含量
综上所述，由于Cd能明显破坏水稻种苗叶绿素合成，导致叶绿素a/b比值改变，抑制PSI、PSⅡ、捕光色素—蛋白质复合体的形成，或造成上述物质的解体，降低光系统的中间电子传递系统—细胞色素b6/f复合体的含量，从而影响光合链上的电子传递，进而直接影响光合作用，因此其对水稻的叶绿素含量、光合效率、生长性能等产生不良影响，而本申请中，在土壤基质中添加WSH002菌种，其可以通过向外释放有机酸，络合环境中对植物具有毒害作用的镉离子，降低水稻对外界镉离子的吸收，降低水稻体内镉的富集，由此改善叶绿素含量、光合效率、生长性能等指标，因此可以缓解镉毒产生的不良影响。
上述实施例1-3中的技术特征可进行任意组合，且组合而成的技术方案均属于本申请的保护范围。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (10)
1.一株巨大普里斯特氏菌，其特征在于，所述巨大普里斯特氏菌为巨大普里斯特氏菌(Priestiamegaterium)WSH002，且保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCM2023293，保藏日期为2023年3月13日。
2.如权利要求1所述的巨大普里斯特氏菌WSH002在降低植物根和/或茎和/或叶镉含量中的应用。
3.如权利要求1所述的巨大普里斯特氏菌WSH002在提高植物叶片叶绿素含量中的应用。
4.如权利要求1所述的巨大普里斯特氏菌WSH002在提高植物光合效率指标中的应用。
5.如权利要求1所述的巨大普里斯特氏菌WSH002在增加水稻分蘖数中的应用。
6.如权利要求1所述的巨大普里斯特氏菌WSH002在提高水稻产量中的应用。
7.如权利要求1所述的巨大普里斯特氏菌WSH002在降低水稻糙米镉含量中的应用。
8.如权利要求1所述的巨大普里斯特氏菌WSH002在提高水稻叶片磷含量中的应用。
9.一种添加权利要求1所述巨大普里斯特氏菌WSH002的水稻种植基质。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，每kg水稻种植基质中添加30-100mL的巨大普里斯特氏菌WSH002悬液。
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