CN1869193A

CN1869193A - 除草剂咪唑乙烟酸高效降解菌剂的制备方法

Info

Publication number: CN1869193A
Application number: CN 200610010044
Authority: CN
Inventors: 陶波; 滕春红; 栾凤侠; 刘辉; 金萍
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2006-05-17
Filing date: 2006-05-17
Publication date: 2006-11-29

Abstract

本发明提供的是一种除草剂咪唑乙烟酸高效降解菌剂的制备方法。取田间多年施用咪唑乙烟酸的土壤为处理对象，制得土壤悬浊液；在蛋白胨培养基中添加咪唑乙烟酸的浓度为100mgL^－1，该培养基灭菌冷却后，接种土壤悬浊液，接种量10％，摇瓶培养5天，将培养液按10％接种量接种于咪唑乙烟酸的浓度为200mgL^－1的蛋白胨培养基中，然后摇瓶培养5天，依次类推10次接种，按咪唑乙烟酸100mgL^－1的浓度梯度增长，使最终蛋白胨培养基的咪唑乙烟酸的浓度在接种前达1000mgL^－1，得到富集降解菌株培养物种子；富集降解菌株培养物种子经过斜面培养、一级扩大培养、二级扩大培养后加入降解菌株培养基、发酵、包装制成产品。本发明的方法得到的产品可以有效解决咪唑乙烟酸对后茬敏感作物的伤害问题。

Description

除草剂咪唑乙烟酸高效降解菌剂的制备方法

(一)技术领域

本发明涉及的是一种生物降解剂的制备方法，具体地说是一种可以降解除草剂咪唑乙烟酸的生物降解剂的制备方法。

(二)背景技术

咪唑乙烟酸(imazethapyr)属于咪唑啉酮类除草剂，是80年代德国巴斯夫公司开发的一种高效、低毒、广谱的大豆田除草剂。自90年代大面积使用以来，由于其杀草谱广、超高活性、高选择性、使用方法灵活等特点，一直是大豆田化学除草的主要品种。据初步统计，2005年黑龙江省大豆种植面积5050万亩，咪唑乙烟酸的销售量(制剂)达4000吨以上。咪唑啉酮类除草剂不挥发，不水解，在土壤中主要通过微生物降解而消失，残留期比较长，易对后茬敏感作物造成伤害，使用普施特后36个月内，不能种植甜菜、油菜、谷子、亚麻、西瓜、蔬菜等作物，严重影响了作物轮作换茬及作物结构调整，也限制了其应用。由于土壤残留，打乱了正常的作物轮作，造成大豆长期连作的局面，北部地区有的农民大豆已经重茬8-10年，造成严重减产。因此，如何消除咪唑乙烟酸的残留毒性一直受到各国科学工作者的关注。寻找有效的农药降解方式，解决农药残留问题是科学家需要面对、亟待解决的重要课题。

目前，国内外学者对解决除草剂残留药害问题采取了许多措施，但效果都不明显。美国等西方国家主要是通过降低此类除草剂使用剂量及限制使用此类除草剂来解决此类问题，但残留药害的问题仍然存在。许多学者在实验室内研究化学解毒剂来解决农药的残留问题，但只保护了作物，而对土壤中残留的农药没有起到降解的作用，从根本上解决不了农药的残留问题。大量研究证明，自然环境中存在的多种微生物在农药降解方面起着重要的作用，科研工作者通过富集培养、分离筛选等技术已从土壤、污泥、污水、天然水体、垃圾场和厩肥中分离到降解有机磷类农药、拟除虫菊酯类农药的微生物、除草剂中的阿特拉津在国内外使用最广泛，其降解菌的研究报道相对较多，但能够有效降解咪唑乙烟酸的微生物尚未见报道。农药的微生物降解目前虽已得到了很大的发展，各种降解农药的微生物的微生物菌株(包括细菌、真菌等)也相继被分离和鉴定，但是应用微生物进行生物修复的实际应用却往往由于其较低的降解率而受到影响。生物降解是解决农药残留的发展方向，虽然该方法绿色环保，但由于其较低的降解率而影响了该项技术的发展。因此筛选出能够高效降解土壤中残留的咪唑乙烟酸的微生物具有极其重要的社会价值和经济价值。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一种对除草剂咪唑乙烟酸有良好的降解效果的除草剂咪唑乙烟酸高效降解菌剂的制备方法。

本发明的目的是这样实现的：

取田间多年施用咪唑乙烟酸的土壤为处理对象，用无菌生理盐水溶解制成土壤悬浊液；

在蛋白胨培养基中添加咪唑乙烟酸的浓度为100mg·L^-1，在121℃、20分钟灭菌冷却后，接种土壤悬浊液，接种量10％，在30℃下摇瓶培养5天，将培养液按10％接种量接种于咪唑乙烟酸的浓度为200mg·L^-1的培养基中，然后在30℃下摇瓶培养5天，依次类推10次接种，按咪唑乙烟酸100mg·L^-1的浓度梯度增长，使最终培养基的咪唑乙烟酸的浓度在接种前达1000mg·L^-1，制得富集降解菌株培养物种子；

将富集降解菌株培养物种子按照10％的接种量接种到pH＝7.0的马铃薯培养基中进行一级扩大培养，再按照10％的接种量接种到pH＝7.0的马铃薯培养基中进行二级扩大培养，然后分别接种马铃薯培养基或麸皮稻壳培养在28℃-30℃温度下发酵30-36小时，包装制成液体或固体形式的产品。

本发明还可以包括这样一些结构特征：

1、所述的降解菌株培养基为：取去皮马铃薯200克，切成小块，加水1升，煮沸10分钟，纱布过滤，加20克蔗糖，0.1％ KH₂PO₄，0.05％MgSO₄ 7H₂O，再加热使融化，最后用自来水定容至1升。

2、所述的降解菌株培养基是80％的麸皮和20％的稻壳。

3、所述的降解菌株培养基是80％的麸皮和20％的稻壳，并添加占麸皮和稻壳总重量1％ KH₂PO₄、0.5％ MgSO₄·7H₂O和2％的葡萄糖。

4、所述的发酵时间是30-36小时，所述的包装制成产品是将发酵液无菌灌装。

5、所述的发酵时间是30-36小时，所述的包装制成产品是将发酵物在50℃温度下进行通风干燥，粉碎后进行包装。

本发明中所涉及的百分比，除有注明之外均为重量百分比。

将10次富集后的培养物进行平板分离，经28℃-30℃培养24小时后，观察平板菌落生长情况，镜检结果发现所有生长旺盛的菌种微观形态一致，系青霉状真菌；经生理生化实验，结果相同。由此证明，通过咪唑乙烟酸浓度梯度逐渐增长的富集培养过程，土壤中仅有一种微生物适应高浓度咪唑乙烟酸而生存下来，故确定该微生物为本发明的出发菌株。

以玉米为指示作物进行生物测定，结果发现咪唑乙烟酸的降解半衰期由自然条件的75天降低到30天。

选取水稻为指示作物进一步验证该菌株的降解功效。

将本发明的方法得到的产品，喷洒在含咪唑乙烟酸的土壤中(咪唑乙烟酸浓度50μg·kg^-1)，经30℃、60天时间的降解后，处理咪唑乙烟酸的降解率为80％，而对照的降解率为45％，90天后处理降解率为98％，此残留浓度下对大多数作物的生长无不良影响，而对照降解率为60％，加菌处理在5个月内完全清除土壤中残留的咪唑乙烟酸。充分证明了使用此项生物技术可以有效解决咪唑乙烟酸对后茬敏感作物的伤害问题。

大豆是我国主要粮食和经济作物之一，种植面积占我国粮食种植面积10-20％，而咪唑乙烟酸的使用面积之大，其残留药害严重影响后茬作物的轮种，这是几十年来一直困绕我国乃至世界农业的最棘手的问题之一。本项发明采用生物技术，菌种取之于土壤而用之于土壤，适应环境能力极强，在条件适宜情况下，即可大量繁殖而作用于咪唑乙烟酸，从而消除咪唑乙烟酸对后茬作物的影响，为解决大豆田咪唑乙烟酸的残留药害问题提供了一条切实可行的途径。采用绿色降解技术在保护环境的同时减少农作物损失，可能会有肥料的作用，降低同等功效其它方法的生产成本，减轻农民负担，增加农民收入，保护生态环境，具有显著的社会效益。而且，降低土壤中残留农药对粮食污染，对绿色食品生产有极其重要的意义。

本发明具有极其重要的学术价值：(1)将微生物技术应用于农药降解，在农业领域中尚属首创。(2)通过驯化微生物使其服务于农业生产，在基础理论研究范畴中占有重要位置。(3)通过对微生物降解农药机理的研究，明确微生物修复技术在农业生产中的地位和作用，对研究现代化农业具有深远的指导意义。

(四)具体实施方式

下面举例对本发明作更详细的描述：

1、取田间多年施用咪唑乙烟酸的土壤为处理对象，用无菌生理盐水溶解后制得土壤悬浊液；

在蛋白胨培养基中添加咪唑乙烟酸的浓度为100mg·L^-1，该培养基在121℃、20分钟灭菌冷却后，接种土壤悬浊液，接种量10％，在30℃下摇瓶培养5天，将培养液按10％接种量接种于咪唑乙烟酸的浓度为200mg·L^-1的蛋白胨培养基中，然后在30℃下摇瓶培养5天，依次类推10次接种，按咪唑乙烟酸100mg·L^-1的浓度梯度增长，使最终蛋白胨培养基中的咪唑乙烟酸的浓度在接种前达1000mg·L^-1，得到富集降解菌株培养物种子；

富集降解菌株培养物种子经过斜面培养(马铃薯：20克，蔗糖：2克，0.1％ KH₂PO₄，0.05％ MgSO₄·7H₂O，水：100毫升和2％的琼脂斜面28℃培养36小时)、一级扩大培养和二级扩大培养后(扩大培养基均采用马铃薯：20克，蔗糖：2克，0.1％ KH₂PO₄，0.05％ MgSO₄·7H₂O，水：100毫升，28℃通风培养24小时)，按照10％的接种量加入由马铃薯：20克，蔗糖：2克，0.1％ KH₂PO₄，0.05％ MgSO₄·7H₂O，水：100毫升组成的降解菌株培养基中，在28℃温度下通风发酵36小时，发酵液无菌罐装，包装制成产品。

2、取田间多年施用咪唑乙烟酸的土壤为处理对象，用无菌生理盐水溶解后制得土壤悬浊液；

在蛋白胨培养基中添加咪唑乙烟酸的浓度为100mg·L^-1，该培养基在121℃、20分钟灭菌冷却后，接种土壤悬浊液，接种量10％，在28℃-30℃下摇瓶培养5天，将培养液按10％接种量接种于咪唑乙烟酸的浓度为200mg·L^-1的蛋白胨培养基中，然后在28℃-30℃下摇瓶培养5天，依次类推10次接种，按咪唑乙烟酸100mg·L^-1的浓度梯度增长，使最终蛋白胨培养基中的咪唑乙烟酸的浓度在接种前达1000mg·L^-1，得到富集降解菌株培养物种子；

富集降解菌株培养物种子经过斜面培养(马铃薯：20克，蔗糖：2克，0.1％ KH₂PO₄，0.05％ MgSO₄·7H₂O，水：100毫升和2％的琼脂斜面28℃培养36小时)、一级扩大培养和二级扩大培养后(扩大培养基均采用马铃薯：20克，蔗糖：2克，0.1％ KH₂PO₄，0.05％ MgSO₄·7H₂O，水：100毫升，28℃通风培养24小时)，按照10％的接种量加入由1％KH₂PO₄、0.5％ MgSO₄·7H₂O、2％葡萄糖、10％水和余量的麸皮组成的降解菌株培养基中，在28℃-30℃温度下通风发酵30-36小时，将发酵物在50℃温度下进行通风干燥，粉碎后进行包装，包装制成产品。

Claims

1、一种除草剂咪唑乙烟酸高效降解菌剂的制备方法，其特征是：

在蛋白胨培养基中添加咪唑乙烟酸的浓度为100mg·L^-1，在121℃、20分钟灭菌冷却后，接种土壤悬浊液，接种量10％，在28℃-30℃下摇瓶培养5天，将培养液按10％接种量接种于咪唑乙烟酸的浓度为200mg·L^-1的培养基中，然后在28℃-30℃下摇瓶培养5天，依次类推10次接种，按咪唑乙烟酸100mg·L^-1的浓度梯度增长，使最终培养基的咪唑乙烟酸的浓度在接种前达1000mg·L^-1，制得富集降解菌株培养物种子；

2、根据权利要求1所述的除草剂咪唑乙烟酸高效降解菌剂的制备方法，其特征是：所述的降解菌株培养基是马铃薯培养基，其制取方法为：取去皮马铃薯200克，切成小块，加水1升，煮沸10分钟，纱布过滤，滤液加20克蔗糖，0.1％KH₂PO₄，0.05％MgSO₄·7H₂O，再加热使融化，最后用自来水定容至1升；生产菌种培养基按此比例扩大。

3、根据权利要求1所述的除草剂咪唑乙烟酸高效降解菌剂的制备方法，其特征是：所述的降解菌株培养基是麸皮稻壳培养，其组成为：80％的麸皮和20％的稻壳。

4、根据权利要求3所述的除草剂咪唑乙烟酸高效降解菌剂的制备方法，其特征是：添加占麸皮和稻壳总重量1％KH₂PO₄、0.5％MgSO₄·7H₂O和2％的葡萄糖。

5、根据权利要求2所述的除草剂咪唑乙烟酸高效降解菌剂的制备方法，其特征是：所述的发酵时间是30-36小时，所述的包装制成产品是将发酵液无菌罐装。

6、根据权利要求3和4所述的除草剂咪唑乙烟酸高效降解菌剂的制备方法，其特征是：所述的发酵时间是30-36小时，所述的包装制成产品是将发酵物在50℃温度下进行通风干燥，粉碎后进行包装。