CN115851507B - 一种埃吉类芽孢杆菌、菌剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种埃吉类芽孢杆菌、菌剂及其应用，涉及微生物技术领域。本发明的埃吉类芽孢杆菌命名为埃吉类芽孢杆菌(Paenibacillus elgii)KY1086，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.62646。本发明首次筛选得到具有高效杀藻能力的埃吉类芽孢杆菌(Paenibacillus elgii)KY1086，同时该菌株对棉花枯萎病和黄萎病具有防治效果，还具有广谱杀植物病害病原菌的功效，该菌株还可与农药进行复配用于防治棉花枯萎病和黄萎病，具有良好的市场应用价值。

Description

一种埃吉类芽孢杆菌、菌剂及其应用

技术领域

本发明涉及技术领域，尤其是涉及一种埃吉类芽孢杆菌、菌剂及其应用。

背景技术

棉花价格低廉，是纺织品重要原材料。棉花产业是基础性支撑产业，棉花产业发展关系着国家经济的发展。然而，棉花种植业的发展一直受到棉花枯萎病和棉花黄萎病的制约。棉花枯萎病是由尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)引起的维管束病害，可以通过土壤传播，防治难度较大，一旦发生，轻者致使棉花产量下降、纤维品质变劣，重者可造成绝产(张海军等，2012)。棉花黄萎病是由棉花黄萎病病原菌(黑白轮枝菌和大丽轮枝菌)引起并发生在棉花的病害。棉花黄萎病表现出严重的叶面症状，包括叶脉间萎黄或坏死以及在凉爽和潮湿的条件下过早落叶，其主要通过阻碍水分和养分输送、减少光合作用和落叶来降低棉花的生长和产量(Liu Xiaoxiao等，2021)。棉花枯萎病、黄萎病主要通过土壤传播，也能够通过带菌的棉籽、病株残体、棉籽壳、棉籽饼、浇水、肥料和工具等途径进行机械传播。一般情况下，棉花枯萎病菌、黄萎病菌可以在土壤中寄存，当外界的温度和湿度等条件适宜时，这些病菌孢子或微菌核就会萌发出菌丝，然后入侵棉花根系伤口或根毛，经过表皮细胞在皮下组织生长，再进入木质部导管开始繁殖成小孢子，这样通过输送小孢子可以达到棉株的各个部位。由于菌丝和孢子的大量繁殖，可以促使薄壁细胞产生大量的胶状物质进而堵塞导管，并且病原菌还可以产生大量毒素，进而造成棉花枝叶枯萎或脱落，甚至整株萎蔫枯死(钱尚帅，2021)。防治棉花枯萎病和棉花黄萎病已经成为促进棉花种植业发展的重要措施。

目前，针对棉花枯萎病主要通过培育抗性品种、耕作管理、化学杀真菌剂的应用、生物防治等措施进行防治。但是，棉花新品种的培育较为费时，而且由于病原体的变异性和适应寄主抗性的能力，常会导致丧失抗性(ZHANG Z等，2019)。化学药剂重复使用会使病原体产生抗药性，且对某些有益生物产生负面影响(LANG J等，2012)。应用有益微生物作为生物防治剂是控制植物病害的重要方法，也是减少化学农药影响环境的有效手段。因此，现阶段生物防治被认为是控制植物病害的一种可持续的防治方法(周京龙等，2021)。此外，棉花黄萎病的防治一直都尚未找到根治的有效防治方法，大多采取“预防为主，综合防治”的植保策略，主要通过种植抗病、耐病品种以及结合轮作、深翻等措施控制棉花黄萎病蔓延(郝海婷等，2020)。但是，目前我国绝大部分棉花品种的抗病性尤其是抗黄萎病性仅能达到耐病水平(张忠波等，2020)。轮作的种植方式因会增加种植户的压力和市场需求的制约，在实际栽培中无法进行大规模推广；且在棉花中鲜有适合防治黄萎病的选择性杀菌剂(Zabihullah等，2021)。生物防治既符合对绿色环保的需求，又可为农业可持续发展提供保障，同时可以与其他方法形成联合防治提供更好的防治效果，现已成为防治植物病害的研究热点(郝海婷等，2020)。

在生物防治方面，前人研究发现棉花枯萎病的拮抗微生物有很多，其中细菌包括解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(柳自清等，2020)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)(李海薇等，2018)等，真菌包括木霉属真菌(Trichoderma spp.)、丛枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhize)等，以及细黄链霉菌(Streptomyces microflavus)等放线菌，其中木霉在生产中应用较多，而芽孢杆菌的应用相对较少(李玉洋等，2017)。另外，针对棉花黄萎病的生物防治，青霉菌、球毛壳菌、细黄链霉菌(王春艳，2020)等被报道可对棉花黄萎病有较好的防治效果。同时，目前国内研究得较为透彻并已经规模化生产的一个例子是枯草芽孢杆菌制剂，但是在生产应用中也存在枯草芽孢杆菌剂在不同年份效果不是很稳定的问题(金利容等，2020)。综上，开发出一株可以同时对棉花枯萎病和黄萎病具有防治效果且可与农药进行复配的广谱杀植物病害病原菌的多功能微生物菌株对农业生产具有重要意义。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供埃吉类芽孢杆菌、菌剂及其应用，本发明首次筛选得到具有高效杀藻能力的埃吉类芽孢杆菌(Paenibacillus elgii)KY1086，该菌株同时对棉花枯萎病、黄萎病及其他植物病害具有防治效果且可与农药进行复配使用，是一株既可以杀藻又可以广谱杀植物病害病原菌的多功能微生物KY1086。

本发明提供的技术方案如下：

在一个方面，本发明提供了一种埃吉类芽孢杆菌，所述埃吉类芽孢杆菌命名为埃吉类芽孢杆菌(Paenibacillus elgii)KY1086，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO.62646。

本发明首次筛选得到一株综合性能优异的埃吉类芽孢杆菌，其同时具有杀藻、防治棉花枯萎病和黄萎病以及其他植物病害的功能，并且可以农药复配协同使用，可与农药实现功能互补。

埃吉类芽孢杆菌(Paenibacillus elgii)KY1086菌株在R2A培养基上培养生长2d，菌落形态菌落呈菌落呈圆形、凸起、表面光滑、有光泽、半透明。

在本发明中，本发明的埃吉类芽孢杆菌涵盖埃吉类芽孢杆菌(Paenibacilluselgii)KY1086的突变菌株，也即与埃吉类芽孢杆菌(Paenibacillus elgii)KY1086基因组高度类似的菌株也应该在本发明的内容中。所述突变菌株可通过与埃吉类芽孢杆菌(Paenibacillus elgii)KY1086菌株的16S rDNA同源性≥99％(例如99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％的同源性。本发明菌株的16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。

在本发明中，本发明的埃吉类芽孢杆菌还涵盖对埃吉类芽孢杆菌(Paenibacilluselgii)KY1086菌株进行遗传改良后得到的工程菌。

在另一个方面，本发明提供了一种菌剂，所述菌剂的活性成分包含前述的埃吉类芽孢杆菌或其发酵产物。

本发明的菌株可经过扩大培养制备成不同的菌剂形式以方便应用。

所述菌剂的剂型为以包括可湿性粉剂、水分散粒剂、水悬浮剂或可分散油悬浮剂。所述菌剂中还可包括农药学上可接受的辅料，所述农药学上可接受的辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂和填料中的一种或多种。本发明的菌剂中可以任选地使用任何载体，包括固体载体或液体载体，只要其是农业上和园艺上的常用的载体且在生物学上是惰性的即可。所述菌剂中埃吉类芽孢杆菌(Paenibacillus elgii)KY1086菌株的数量可以为10⁷～¹²cfu·mL^-1或10⁷～¹²cfu·g^-1。例如包括但不限于10⁸cfu·mL^-1/cfu·g^-1、10⁹cfu·mL^-1/cfu·g^-1、10¹⁰cfu·mL^-1/cfu·g^-1、10¹¹cfu·mL^-1/cfu·g^-1。

所述菌剂也可以作为微生物菌肥的一部分进行使用。

在另一个方面，本发明提供了前述的埃吉类芽孢杆菌或前述的菌剂的应用，所述应用包括以下一种或多种：

(a)杀藻或制备溶藻产品或水体净化；

(b)防治棉花枯萎病；

(c)防治棉花黄萎病；

(d)在拮抗植物病原菌或防治植物病害的应用。

在一个实施方案中，所述藻包括蓝绿藻。

在一个实施方案中，所述蓝绿藻包括铜绿微囊藻、水华微囊藻、小球藻和鱼腥藻中的一种或多种。

本发明的菌株或其发酵液、上清液、发酵活性成分或含有其的菌剂可以用于抑制或降解藻类，特别是铜绿微囊藻。进而可以用于解决和改善水体富营养化的问题。

在一个实施方案中，所述植物病害包括真菌性病害和细菌性病害，所述真菌性病害包括西瓜枯萎病、香蕉枯萎病三个专化型、根腐病、水稻纹枯病、小麦纹枯病、灰霉病、番茄早疫病、梨黑斑病、苹果斑点落叶病中的一种或多种；所述细菌性病害包括细菌青枯病、白叶枯病、软腐病的一种或多种。

其中，所述棉花黄萎病为由棉花黄萎病的两个专化型Vd991和OD08047的病原菌引起的棉花黄萎病。其中，香蕉枯萎病三个专化型包括香蕉枯萎病专化型1、香蕉枯萎病专化型2和香蕉枯萎病专化型3。

在另一个方面，本发明提供了一种抑制藻类生长的方法，所述方法包括使用前述埃吉类芽孢杆菌或者前述的菌剂处理藻体。

鉴于本发明菌株的高效杀藻功效，本发明菌株及含有其的菌剂可用于防治水华和赤潮或者用于治理水产养殖的水体环境。例如利用菌株及含有其的菌剂控制蓝藻水华的方法，包括发酵所述的菌株，提取发酵产物后用于控制蓝藻水华。利用本发明菌株的溶藻能力，可将其作为杀藻剂使用。

在另一个方面，本发明提供了一种微生物农药组合物，所述微生物农药组合物包含前述的埃吉类芽孢杆菌或前述的菌剂。本发明菌剂与农药共用，可以发挥化学农药和微生物制剂各自的优势，综合抑制多种植物病害发生，降低对环境的影响。

在一个实施方案中，所述微生物农药组合物中的农药包括敌磺钠、三氯乙腈尿酸、辛菌胺醋酸盐水剂、甲基硫菌灵中的一种或多种。本发明菌株对联合防治棉花枯萎病和黄萎病的农药敌磺钠、三氯乙腈尿酸、辛菌胺醋酸盐水剂、甲基硫菌灵的敏感性较低，具有与农药(敌磺钠、三氯乙腈尿酸、辛菌胺醋酸盐水剂、甲基硫菌灵)复配的潜力。

在另一个方面，本发明提供了所述的微生物农药组合物在防治棉花枯萎病和/或棉花黄萎病中的应用。

在本发明中，前述菌株、菌剂或微生物农药组合物可以适用于准备种植所述植物的环境或生长有所述植物的环境中，例如土壤、无土栽培基质和植物生长营养液中。

生物样品保藏信息：埃吉类芽孢杆菌(Paenibacillus elgii)KY1086，该菌株已于2022年7月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCC No.62646；保藏地址：中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所，邮编510070。

有益效果：

本研究通过高通量筛选，得到一株可杀藻的并且可与农药进行复配广谱杀植物病害病原菌的多功能微生物KY1086。该菌株是生态友好的微生物，具有巨大的开发潜力。

本发明得到埃吉类芽孢杆菌通过有效抑制多种病原细菌和病原真菌，防止多种植物病害的发生，尤其适用于棉花枯萎病和黄萎病，具有较高的农业应用价值和良好的市场前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的高通量筛选得到的具杀棉花枯萎病原菌功能的微生物示意图(方框中细菌菌产生的抑菌圈半径均≥1mm，其中A菌产生的抑菌圈半径为2mm)；

图2为本发明提供的菌株KY1086在显微镜下的形态(100倍油镜)；

图3为本发明提供的菌株KY1086与商业菌株的广谱杀菌活性测试结果(真菌性),依次为棉花枯萎病、棉花黄萎病专化型Vd991、棉花黄萎病专化型OD08047、西瓜枯萎病、香蕉枯萎病专化型1、香蕉枯萎病专化型2、香蕉枯萎病专化型3、根腐病、水稻纹枯病、灰霉病、小麦纹枯病、番茄早疫病、梨黑斑病和苹果落叶斑点病；

图4为本发明提供的菌株KY1086与商业菌株的广谱杀菌活性测试结果(细菌性)，依次为细菌青枯病、白叶枯病和软腐病；

图5为本发明提供的菌株KY1086与商业菌株的解藻能力测试结果；

图6为本发明提供的菌株KY1086在农药上的生长情况(依次为敌磺钠、福美双、三氯乙腈尿酸、辛菌胺醋酸盐水剂、甲基硫菌灵)。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

1.高通量筛选杀棉花枯萎病原菌的微生物

棉花枯萎病和棉花黄萎病是发生在棉花上的两大毁灭性病害。筛选对这两种病害有生防效果的微生物具有重大意义。其中，棉花枯萎病病原菌的生长速度较棉花黄萎病病原菌快，可以帮助快速判断微生物是否具有生物防治作用，更适合作为高通量筛选的指示菌。因此，本研究将棉花枯萎病的病原菌作为第一步初筛的指示菌。具体的方法与结果如下：

1.1土样采集

从全国各地共采集70个土样样品，包括黑土、黏土、红土等多种土样，分别来源于森林、草地、小麦地、水稻田等。这些土样样品均标明采集地(省、市、县)、采集时间、采集来源(森林、草地、小麦地、水稻田等)。

1.2高通量筛选具杀棉花枯萎病病原菌功能的微生物

(1)取五个土壤样品(每个土壤样品各取0.2g)混合并置于50mL灭菌水中，摇匀后吸取少量液体分别稀释10倍、100倍、1000倍，各取100μL均匀涂布于R2A固体培养基上，在30℃下培养2-4天。

(2)将上述培养皿中菌落挑取至装有R2A固体培养基的96孔板中，在30℃下培养2天。(固体R2A培养基配制方法如下：0.25g蛋白胨、0.25g酵母、0.25g胰蛋白胨、0.25g葡萄糖、0.25g可溶性淀粉、0.15g丙酮酸钠、0.15g磷酸二氢钾、0.025g硫酸镁、500mL H₂O、7.5g琼脂，121.0℃高压灭菌30min。)

(3)刮取棉花枯萎病病原菌的菌丝置于灭菌水中，摇匀后制成菌悬液；再吸取少量菌悬液均匀涂布于R2A固体培养基上制成选择性培养基A待用。

(4)用灭菌后的微孔板复制器(96孔)蘸取96孔微孔板中的微生物并影印至选择性培养基A，在30℃下培养2-3天，观察微生物生长情况及抑菌圈形成情况。若菌落周围产生抑菌圈，表明该微生物具有明显杀真菌活性，具体现象如图1所示。选取产生抑菌圈半径≥1mm的微生物在R2A固体培养基上划线培养纯化，得到具有杀棉花枯萎病病原菌功能的微生物菌株。

1.3重复验证

将所得具有棉花枯萎病病原菌功能的微生物菌株再次接种在选择性培养基A上，排除不能在特定培养基上产生抑菌圈的假阳性微生物，最终得到具有杀棉花枯萎病病原菌功能的微生物。

1.4结果

70个土壤样品(近2.8万株微生物)通过高通量筛选和棉花枯萎病病原菌功能测试，共得到975株具有杀棉花枯萎病病原菌功能的微生物。这些功能微生物的分类如表1所示：

表1.具有棉花枯萎病病原菌功能的微生物统计表(单位：mm)

(注：“2＞r≥1”表示该微生物具有杀棉花枯萎病病原菌的能力，但杀菌能力一般；“r≥2”表示该微生物具有杀棉花枯萎病病原菌的能力且杀菌能力较好。)

2.筛选可杀棉花黄萎病专化型Vd991和OD08047病原菌的微生物

现阶段人们并没有研制出一种针对棉花黄萎病的特效药。因此，针对棉花黄萎病的防治的研究显得尤为重要。为了获得可以有效防治由各种病原菌引起的棉花黄萎病，本研究针对棉花黄萎病的两个专化型(Vd991和OD08047)的病原菌，对上述267株对棉花枯萎病病原菌具有较好的杀菌能力的菌株进行杀菌活性测试。具体方法与结果如下：

2.1获取对棉花黄萎病的两个专化型具有杀菌活性的微生物

将上述具有杀棉花枯萎病病原菌功能的微生物与棉花黄萎病专化型Vd991、棉花黄萎病专化型OD08047的病原菌分别同时接种于R2A固体培养基上，30℃下培养10d。观察菌株对植物病原菌产生拮抗的强弱，测量杀菌圈和测试菌株的菌落半径，计算杀菌强度。其中，杀菌强度大于0的菌株被认为具有杀棉花黄萎病的两个专化型(Vd991和OD08047)的病原菌的能力。

2.2结果

将上述267株具有良好杀棉花枯萎病病原菌能力的微生物通过杀菌活性测试(针对棉花黄萎病的两个专化型(Vd991和OD08047))，得到113株(42.3％)微生物的杀菌强度大于0，表明这113株微生物具有杀棉花黄萎病病原菌能力。综上所述，以上试验所得到的113株微生物具有杀棉花枯萎病和棉花黄萎病病原菌能力，可作为测试菌株进行后续筛选。

3.获取具有更广谱杀植物病原菌活性的微生物

在农业生产过程中，枯萎病不仅会发生在棉花上，还会发生在西瓜、香蕉等作物上。同时，农作物常见的病害还包括发生在根部的病害(根腐病)、发生在叶茎部的病害(真菌性病害：水稻纹枯病、小麦纹枯病、灰霉病、番茄早疫病、梨黑斑病、苹果斑点落叶病，细菌性病害：白枯叶病、软腐病)。因此，为开发具有更广的应用场景的微生物，本发明对上述113株可杀棉花枯萎病和棉花黄萎病病原菌的微生物进行广谱杀植物病害病原菌测试(包括真菌性病害：西瓜枯萎病、香蕉枯萎病三个专化型、根腐病、水稻纹枯病、小麦纹枯病、灰霉病、番茄早疫病、梨黑斑病、苹果斑点落叶病，细菌性病害：细菌青枯病、白叶枯病、软腐病)。具体的方法与结果如下：

3.1获取更广谱杀真菌性病害病原菌的微生物

设置西瓜枯萎病、香蕉枯萎病三个专化型、根腐病、水稻纹枯病、小麦纹枯病、灰霉病、番茄早疫病、梨黑斑病、苹果斑点落叶病的病原菌为指示菌株，“2.2”中113株可杀棉花枯萎病和棉花黄萎病病原菌的微生物为测试菌株，进行广谱杀真菌性病害病原菌测试，具体步骤参照“2.1”。30℃下培养6d，观察菌株对植物病原菌产生拮抗的强弱，测量杀菌圈和菌落半径，计算杀菌强度。

3.2获取更广谱杀细菌性病害病原菌的微生物

设置细菌青枯病、白枯病、软腐病的病原菌为指示菌株，“2.2”中113株可杀棉花枯萎病和棉花黄萎病病原菌的微生物为测试菌株，进行广谱杀细菌性病害病原菌测试，具体步骤如下：(1)活化细菌青枯病、白叶枯病或软腐病病原菌；(2)将上步得到的细菌青枯病、白叶枯病或软腐病病原菌制成菌悬液，接种到R2A固体培养基并使其OD≈0.01，得到选择性培养基B、C或D；(3)将上述具有杀棉花枯萎病和棉花黄萎病病原菌功能的微生物点在选择性培养基B、C或D上，在30℃下培养2d，观察杀菌圈大小，测量杀菌圈和菌落半径，计算杀菌强度。

3.3结果

将113株可杀棉花枯萎病病原菌和棉花黄萎病两个专化型病原菌的微生物进行广谱杀植物病害病原菌测试，发现6株表现优秀的微生物，命名为KY1086、K6、831①-17、Z28、831①-14、T156-3。这6株微生物广谱杀植物病害病原菌测试的结果如表2所示。由表2可得，KY1086是6个测试菌株中唯一一株对所测试的14个植物病害病原菌均具有杀菌活性。

表2.广谱杀菌活性测试中6株微生物的杀菌强度

与此同时，将表2的数据进行对比后，发现KY1086对所测试的14个植物病害病原菌均具有杀菌活性且对大部分植物病害病原菌的杀菌强度大于其他测试菌株。综上所述，本发明将菌株KY1086作为研究对象，对其进行菌株鉴定及进一步研究。

4.鉴定菌株KY1086

4.1 DNA模板的制备

挑取纯化的单菌落至EP管底部，加入200μL的5％(w/v)的BT-chelex 100(蒸馏水配置，121℃灭菌30min)。沸水浴煮15min,迅速置于-20℃或-80℃速冻，然后室温解冻，6000r/min离心3min,取上清2μL作为模板。按照16S扩增体系进行16S基因的扩增。

16S PCR扩增体系(25μL)：Green taqMix，12.5μL；DDH₂O，9.5μL；27F，0.5μL；1492R，0.5μL；DNA模板，2.0μL；总计：25μL；

PCR扩增程序：第一步：95℃，5min；第二步：94℃，1min；55℃，1min；72℃，1.5min，35个循环；第三步：72℃，10min；4℃forever。

4.2 KY1086的16sDNA序列测定结果

根据获得KY1086的16S rDNA序列(SEQ ID No.1)在GenBank搜索同源序列并进行同源序列分析对比，同时与国际细菌学委员会认可的16sRNA数据库(Chun’slab)进行序列比对并结合文献分析，来确定目标微生物的分类地位(Yoon,S.H.,Ha,S.M.,Kwon,S.,Lim,J.,Kim,Y.,Seo,H.and Chun,J.(2017).Introducing EzBioCloud:A taxonomicallyunited database of 16S rRNA and whole genome assemblies.Int J Syst EvolMicrobiol.67:1613-1617)。结果表明，该菌株的1375碱基序列与菌株Paenibacilluselgii具有99.85的高度同源，确定KY1086为Paenibacillus elgii。

菌株KY1086的16S rDNA序列测定结果(SEQ ID No.1)如下：

TCGAGCGGACCCTTCGGGGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTACCGGAAACGGTAGCTAAGACCGGATAAGTGATTCTCTCGCATGAGAGGATCAAGAAACACGGGGCAACCTGTGGCTTACAGATGGGCCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGCAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGCCAGGGAAGAACGTCGTGGAGAGTAACTGCTCTGCGAATGACGGTACCTGAGAAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCCGCTTAAGTCTGGTGTTTAAGCCCGAGGCTCAACCTCGGTTCGCACTGGAAACTGGGTGGCTTGAGTGCAGGAGAGGAAAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTCTGGCCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTAGGGGTTTCGATACCCTTGGTGCCGAAGTAAACACAATAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCAGTGGAGTATGTGGtTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCTCTGAATAtCCTAGAGATAGGGTAGGCCTTCGGGACAGAGGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTCAAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGAACTTAGTTGCCAGCATTGAGTTGGGCACTCTAAGTTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTACTACAATGGCCGGTACAACGGGAAGCGAAGTCGCGAGATGGAGCCAATCCTAAGAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGTCGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTACAACACCCGAAGTCGGTGGGG。

5.菌株形态观察

5.1操作

将筛选的菌株接种到R2A平板上，30℃培养2d，观察菌落的大小、形状、颜色、光泽度、黏稠度、隆起形状、透明度、边缘特征及有无芽孢等。

5.2菌株形态观察结果

经观察菌株KY1086(Paenibacillus elgii，埃吉类芽孢杆菌)在R2A培养基上培养生长2d，菌落形态菌落呈菌落呈圆形、凸起、表面光滑、有光泽、半透明。经显微镜测定其菌体长度约6～7.5μm(如图2)。

6.KY1086与商业菌株的比较

通过前面的试验，KY1086已经被验证具有广谱杀植物病害病原菌的能力。为了更好的了解KY1086的功能及应用场景，现设置商业菌株92068(枯草芽孢杆菌，市面上常用于促进植物生长、防病、解钾和解磷)和商业菌株DSM7(解淀粉芽孢杆菌，市面上用于防病)为对照，进行广谱杀植物病害病原菌活性和多功能(杀藻能力)的比较。

6.1比较KY1086与商业菌株广谱杀植物病害病原菌活性

6.1.1比较KY1086与商业菌株广谱杀真菌性植物病害病原菌活性

设置棉花枯萎病、棉花黄萎病两个专化型、西瓜枯萎病、香蕉枯萎病专化型1、香蕉枯萎病专化型2、香蕉枯萎病专化型3、根腐病、水稻纹枯病、小麦纹枯病、灰霉病、番茄早疫病、梨黑斑病、苹果斑点落叶病的病原菌指示菌，KY1086为测试菌株，92068、DSM7为对照菌株，进行广谱杀真菌性病害病原菌测试，具体步骤参照“2.1”。30℃下培养6d，观察菌株对植物病原菌产生拮抗的强弱，测量杀菌圈和菌落半径，计算杀菌强度，填入表3。

6.1.2比较KY1086与商业菌株对细菌性植物病原菌的杀菌活性

设置细菌青枯病、白叶枯病和软腐病的病原菌指示菌，KY1086为测试菌株，92068、DSM7为对照菌株，进行广谱杀细菌性病害病原菌测试，具体步骤参照“3.2”。在30℃下培养2d，观察杀菌圈大小，测量杀菌圈和菌落半径，计算杀菌强度，填入表3。

表3.KY1086、92068、DSM7广谱杀植物病害病原菌的比较结果

(注：表中显示的杀菌强度越大表示该菌株对相应病害的病原菌杀菌活性越强；“0”表示该菌株对相应病害的病原菌不具有杀菌活性)。

由表3、图3、图4可得，与目前广泛应用于市场的生防微生物：枯草芽孢杆菌92068及解淀粉芽孢杆菌DSM7进行比较，KY1086表现优秀。KY1086对包括棉花枯萎病、棉花黄萎病在内的17种植物病害病原菌表现出强效杀菌活性。

6.2 KY1086与商业菌株杀藻能力的比较

(1)菌株活化

从-80℃冰箱中取出适量KY1086、92068、DSM7，分别接种在固体R2A培养基上，室温下培养2d。其中，KY1086为试验菌株，92068和DSM7为对照菌株。

取出适量铜绿微囊藻接种在固体BG11培养基上，置于光照培养箱中培养15d。BG11培养基成分包括有：硝酸钠1.5g；三水磷酸氢二钾0.04g；七水流酸镁0.075g；二水氯化钙0.036g；柠檬酸0.006g；柠檬酸铁氨0.006g；EDTA0.001 g；碳酸钠0.02g；硼酸0.00286g；一水氯化锰0.00181g；七水硫酸锌0.000222g；五水硫酸铜0.000079g；二水钼酸钠0.00039g；六水硝酸钴0.000049g；1000mL水；pH＝7.1。

(2)含藻固体培养基配制

将BG11固体培养基和R2A固体培养基以1:1的体积比混合，121.0℃高压灭菌30min。再将铜绿微囊藻置于灭菌水中制成均匀的藻液，均匀涂布在上述培养基上制成含藻固体培养基。

(3)接种

将“(1)”中微生物接种于“(2)”所述含藻固体培养基中，28℃培养6d，取出观察，测量产生的透明杀藻圈。

6.3结果

由表4、图5可得，在含藻培养基上，KY1086菌落附近可形成明显的透明杀藻圈，90268和DSM7菌落附近没有产生透明的杀藻圈。由此判断，KY1086具有杀藻的能力。

表4.KY1086、92068、DSM7的杀藻圈半径

	KY1086	92068	DSM7
				杀藻圈半径(mm)	9	0	0

(注：表中显示的杀藻圈半径越大表示该菌株的杀藻活性越强；“0”表示该菌株不具有杀藻活性。)

7.KY1086在农药上的生长情况

根据文献报道，针对棉花枯萎病和黄萎病的防治，联合防治表现出的效果更佳。目前，敌磺钠、福美双、三氯乙腈尿酸、辛菌胺醋酸盐水剂、甲基硫菌灵被广泛应用于棉花枯萎病和黄萎病的防治，它们的用量分别为：每100kg种子加入400-500g 40％的敌磺钠、1m²加入10-15g 50％的福美双、每亩加入10-42g 85％的三氯乙腈尿酸、每亩加入416-694mL1.8％的辛菌胺醋酸盐水剂的80-100倍液、70％甲基硫菌灵的800-1000倍液。因此，本研究对KY1086与上述农药的协同作用进行考察，对KY1086进行农药敏感性试验。具体的步骤及结果如下：

7.1 KY1086对农药敏感性的试验

(1)设置KY1086为测试菌株，敌磺钠、福美双、三氯乙腈尿酸、辛菌胺醋酸盐水剂、甲基硫菌灵的上述浓度为处理组。

(2)将所述农药的均匀溶液涂布于固体R2A上并最终使平板上的药物浓度与上述农药的应用浓度保持一致。

(3)将KY1086接种于“7.1(2)”中的培养基中，采用“三线法”划线，30℃下培养2d，取出观察KY1086的生长情况并记录在表4。若KY1086能长出单菌落即表示KY1086对该农药的敏感性较低，具有与该农药复配的潜力；若KY1086不能长出单菌落即表示KY1086对该农药的较敏感性高，不具有与该农药复配的潜力。

7.2 KY1086对农药敏感性的试验结果

通过KY1086对农药的敏感性测试，可得KY1086可在敌磺钠(每100kg种子加入400-500g 40％的敌磺钠)、三氯乙腈尿酸(每亩加入10-42g 85％的三氯乙腈尿酸)、辛菌胺醋酸盐水剂(每亩加入416-694mL 1.8％的辛菌胺醋酸盐水剂的80-100倍液)、甲基硫菌灵(70％甲基硫菌灵的800-1000倍液)存在的情况下长出单菌落，而不能在福美双(1m²加入10-15g50％的福美双)存在的情况下生长，如图6所示。因此，KY1086具有与农药(敌磺钠、三氯乙腈尿酸、辛菌胺醋酸盐水剂、甲基硫菌灵)复配的潜力。

本发明通过采用高通量筛选方法从全国各地采集的土壤中分离到了一株具有可杀棉花枯萎病、棉花黄萎病及藻类的微生物(KY1086)。同时，菌株KY1086还具有广谱杀植物病害病原菌的能力和与农药复配的潜力。该菌株的16s rDNA的序列测定结果表明，该菌株与Paenibacillus elgii具有高度同源。经过与商业菌株92068(枯草芽孢杆菌，常用于促进植物生长、防病、解钾和解磷)、DSM7(解淀粉芽孢杆菌，市面上用于防病)对比，菌株KY1086对于17种植物病害的病原菌表现出优秀的杀菌活性和强效的杀藻活性。在对农药敏感性的测试中，发现KY1086可在部分农药存在的情况下生长，具有与农药复配的潜力。由此可见，KY1086是一株具有广谱杀植物病害病原菌、高效杀藻能力且可与农药复配的功能微生物，在农业生产和生物防治上具有巨大的应用前景。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (7)

1.一种埃吉类芽孢杆菌，其特征在于，所述埃吉类芽孢杆菌命名为埃吉类芽孢杆菌（Paenibacillus elgii）KY1086，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo. 62646。

2.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成分包含权利要求1所述的埃吉类芽孢杆菌或其发酵产物。

3.权利要求1所述的埃吉类芽孢杆菌或权利要求2所述的菌剂的应用，其特征在于，所述应用为以下一种或多种：

（a）杀藻或制备溶藻产品或水体净化；

（b）防治棉花枯萎病；

（c）防治棉花黄萎病；

（d）在拮抗植物病原菌或防治植物病害的应用；

所述藻为铜绿微囊藻；

所述植物病害为真菌性病害和细菌性病害，所述真菌性病害为西瓜枯萎病、香蕉枯萎病三个专化型、根腐病、水稻纹枯病、小麦纹枯病、灰霉病、番茄早疫病、梨黑斑病、苹果斑点落叶病中的一种或多种；所述细菌性病害为细菌青枯病、白叶枯病、软腐病的一种或多种。

4.一种抑制藻类生长的方法，其特征在于，所述方法包括使用如权利要求1所述的埃吉类芽孢杆菌或者如权利要求2所述的菌剂处理藻体；所述藻为铜绿微囊藻。

5.一种微生物农药组合物，其特征在于，所述微生物农药组合物包含根据权利要求1所述的埃吉类芽孢杆菌或根据权利要求2所述的菌剂。

6.根据权利要求5所述的微生物农药组合物，其特征在于，所述微生物农药组合物中的农药为敌磺钠、三氯乙腈尿酸、辛菌胺醋酸盐水剂、甲基硫菌灵中的一种或多种。

7.权利要求5或6所述的微生物农药组合物在防治棉花枯萎病和/或棉花黄萎病中的应用。

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