CN110035742A - 干细胞仿生微粒 - Google Patents

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Abstract

提供了干细胞仿生微粒，所述干细胞仿生微粒包含包埋在聚合物核心颗粒中的至少一种干细胞来源的旁分泌多肽或生长因子，所述干细胞仿生微粒还包含置于核心颗粒上的干细胞的至少一个细胞膜片段的外层。聚合物核心可以由任何生物相容的和生物可降解的聚合物或共聚物或其组合构成，所述生物相容的和生物可降解的聚合物或共聚物或其组合允许旁分泌因子的包埋和它们从所述核心的延长释放。核心并因此微粒可以是生物可降解的，允许最终从受体动物或人类受试者中消除。核心颗粒被定制尺寸以允许通过血管运输和从血管外渗到周围组织中。核心颗粒还可以包含至少一种多肽或肽生长因子以诱导干细胞群的生成和增殖。

Description

干细胞仿生微粒
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年9月29日提交的题为“STEM CELL BIOMIMETICMICROPARTICLES”的美国临时专利申请序列第62/401,272号和于2016年10月7日提交的题为“STEM CELL BIOMIMETIC MICROPARTICLES”的美国临时专利申请序列第62/405,411号的优先权，这两个申请通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开内容总体上涉及干细胞仿生微粒。本公开内容总体上还涉及干细胞仿生微粒的制造方法和干细胞仿生微粒用于组织修复的用途。
关于联邦资助研究或开发的声明
本发明根据由美国国立卫生研究院(the National Institutes of Health)授予的基金第HL123920号在政府资助下完成。政府享有本发明的某些权利。
背景
多种类型的成体干细胞，诸如间充质干细胞、心脏干细胞和内皮祖细胞，已经在世界范围内进入临床研究(Makkar等人,(2012)Lancet379:895-904；Bolli等人,(2011)Lancet 378:1847-1857；Malliaras等人,(2014)J.Am.Coll.Cardiol.63:110-122；Chen等人,(2004)Am.J.Cardiol.94:92-95；Cheng等人,(2014)J.Am.Heart.Assoc.3:e001260；Katritsis等人,(2005)Catheter Cardiovasc.Interv.65:321-329)。已经报道了被注射的细胞向宿主组织的分化。然而，这些偶发事件不能解释在动物模型和人体试验中观察到的治疗益处(Bai等人,(2010)Eur.Heart J.31:489-501；Forrester等人,(2003)Circulation108:1139-1145)。后来，本领域认识到一个重要的治疗作用模式是通过被注射的干细胞分泌旁分泌因子，其像“微型药物泵”一样起作用以促进内源性修复(Avolio等人,(2014)StemCells 32:2373-2385；Li等人,(2012)J.Am.Coll.Cardiol.59:942-953)。此外，干细胞膜在修复过程中并非无价值：与被注射的干细胞接触触发宿主细胞中的细胞内保护/再生途径(Xie等人,(2014)Stem Cells 32:2397-2406；Ho等人(2016)Stem Cells 34:445-455)。
概述
因此，简而言之，本公开内容的一个方面包括干细胞仿生微粒的实施方案，所述干细胞仿生微粒包含包埋在生物相容的聚合物核心微粒中的至少一种干细胞旁分泌因子和置于所述聚合物核心微粒上的干细胞的至少一个细胞膜片段(fragment)的外层。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，微粒的生物相容的聚合物核心可以由单一种类的聚合物、多于一个(a plurality of)聚合物种类、嵌段共聚物或多于一个聚合物种类组成，并且其中聚合物核心的一种或更多种聚合物可以被交联。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，微粒的生物相容的聚合物核心可以是生物可降解的。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，生物相容的聚合物核心包含聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，至少一种干细胞旁分泌因子和一个或更多个细胞膜片段可以来自相同种类的干细胞。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，至少一种干细胞旁分泌因子和一个或更多个细胞膜片段可以来源于心脏干细胞。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，至少一种干细胞旁分泌因子和一个或更多个细胞膜片段可以来自不同种类的干细胞。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，至少一种干细胞旁分泌因子可以来自干细胞条件培养基(stem cell-conditioned culture medium)。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，至少一种干细胞旁分泌因子可以是分离的旁分泌因子。
本公开内容的另一方面包括干细胞仿生微粒组合物的实施方案，所述干细胞仿生微粒组合物包含本公开内容的干细胞仿生微粒和药学上可接受的载体。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，组合物可以被配制成用于直接递送到受试动物或人类的靶组织中，或者用于向受试动物或人类的局部或全身性施用。
本公开内容的另一方面包括生成仿生微粒的方法的实施方案，所述方法包括以下步骤：(a)将包含至少一种干细胞旁分泌因子的水溶液(aqueous solution)与具有可聚合单体溶解在其中的有机相混合；(b)将来自步骤(a)的混合物乳化；和(c)将来自步骤(b)的乳液与水溶液混合，并允许有机相蒸发(evaporate)，从而生成具有至少一种干细胞旁分泌因子包埋在其中的生物相容的聚合物微粒。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，方法还可以包括以下步骤：(i)获得分离的干细胞膜或其片段；和(ii)通过将来自步骤(c)的生物相容的聚合物微粒与分离的干细胞膜或其片段的悬浮液混合，生成干细胞膜包被的仿生微粒。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，包含至少一种干细胞旁分泌因子的水溶液可以是干细胞条件培养基或至少一种分离的干细胞旁分泌因子的水溶液。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，包含至少一种干细胞旁分泌因子的水溶液可以是心脏干细胞条件培养基，并且其中细胞膜片段从心脏干细胞分离。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，可聚合单体的聚合物可以是聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，步骤(c)还可以包括将生物相容的聚合物微粒冻干。
本公开内容的又另一方面包括一种在有相应需要的患者中进行组织修复的方法的实施方案，所述方法通过向所述患者递送包含干细胞仿生微粒的药学上可接受的组合物来进行，其中所述干细胞仿生微粒可以包含包埋在生物相容的聚合物核心微粒中的至少一种干细胞旁分泌因子和置于生物相容的聚合物核心微粒上的干细胞的至少一个细胞膜片段的外层。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，微粒的生物相容的聚合物核心可以由单一种类的聚合物、多于一个聚合物种类、嵌段共聚物或多于一个聚合物种类组成，并且其中聚合物核心的聚合物可以任选地被交联。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，微粒的生物相容的聚合物核心可以是生物可降解的。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，生物相容的聚合物核心可以包含聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，至少一种干细胞旁分泌因子和一个或更多个细胞膜片段可以来自相同种类的干细胞。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，至少一种干细胞旁分泌因子和一个或更多个细胞膜片段可以来源于心脏干细胞。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，至少一种干细胞旁分泌因子和一个或更多个细胞膜片段可以来自不同种类的干细胞。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，至少一种干细胞旁分泌因子可以来自干细胞条件培养基。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，至少一种干细胞旁分泌因子可以是分离的旁分泌因子。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，药学上可接受的组合物可以被配制成用于直接递送到受试动物或人类的靶组织中，或者用于向受试动物或人类的局部或全身性施用。
附图简述
本公开内容的另外的方面当结合附图审阅以下描述的本公开内容的各种实施方案的详述后，将更容易地被理解。
图1A-1L图示了细胞模拟微粒(cell-mimicking microparticle；CMMP)的物理化学和生物学特性。
图1A示意性地图示了本公开内容的CMMP的实施方案的生化设计和研究模型。微粒(MP，即对照MP1)由聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)和人类心脏干细胞(CSC)的条件培养基制造；然后将MP用CSC的膜片段包裹(cloak)，以形成细胞模拟微粒(CMMP)。对照MP2通过用CSC膜包裹空的PLGA颗粒来制造。CMMP的治疗潜力在心肌梗塞的小鼠模型中测试。
图1B和1C图示了德克萨斯红琥珀酰亚胺酯标记的MP(图1B，左)被绿色荧光DiO标记的CSC的膜片段(图1B，右)包裹，以形成CMMP(图1C，具有包被物的颗粒)。比例尺，20μm。
图1D和1E图示了扫描电子显微术(SEM)图像，揭示了CSC膜片段在CMMP上(图1E)，但不在对照MP1(未经包裹的MP)上(图1D)。比例尺，10μm。
图1F和1G图示了示出主要人类CSC标志物CD105(图1F)和CD90(图1G)在CMMP和对照MP2上是阳性的，但在未经包裹的对照MP1上则不是阳性的一对图，表明膜包裹在CMMP上。
图1H是示出了CMMP、对照MP1和对照MP2具有与CSC的尺寸相似的尺寸的条形图。对于每组，n＝3。
图1I图示了示出CMMP和对照MP2与CSC携带相似的表面抗原的一对条形图。对于每组，n＝5。
图1J-1L图示了示出在CMMP和对照MP1中观察到的CSC因子(血管内皮生长因子(VEGF)(图1J)、胰岛素样生长因子(IGF)-1(图1K)和肝细胞生长因子(HGF)(图1L))的相似释放谱的图，表明膜包裹不影响CSC因子从CMMP和对照MP1中释放。对于每个时间点，n＝3。所有数据都是平均值±s.d.。任何两组之间的比较使用双尾非配对学生t检验进行。多于两组之间的比较使用单因素方差分析、随后是事后Bonferroni检验进行。
图2A和2B图示了细胞模拟微粒(CMMP)和心脏干细胞(CSC)上CD105和CD90表达的荧光密度。对于每组，n＝6。所有数据是平均值±s.d.。*表示当与CMMP组相比时，P<0.05。比较通过双尾非配对学生t检验进行。
图2A图示了用CD105-PE缀合的抗体标记的CSC(左图)和CMMP(右图)的荧光图像，以及CSC和CMMP的荧光强度的定量分析。
图2B图示了用CD90-FITC缀合的抗体标记的CSC(左图)和CMMP(右图)的荧光图像，以及CSC和CMMP的荧光强度的定量分析。
图3A-3H图示了细胞模拟微粒(CMMP)对体外新生大鼠心肌细胞(NRCM)功能的影响。
图3A图示了与对照MP1、对照MP2、CMMP或CSC共培养的对α横纹肌肌动蛋白染色的心肌细胞的代表性图像。比例尺，200μm。
图3B图示了示出定量分析的图，该定量分析反映了与来自对照MP2或单独NRCM培养物的数量相比，对照MP1增加了NRCM的数量，但是最大NRCM数量在与CMMP和真正的(genuine)CSC共培养的那些NRCM中观察到。对于每组，n＝5。
图3C图示了示出与用对照MP1(红色条)培养的那些NRCM相比，在用CMMP和CSC培养的那些NRCM中观察到的更高的NRCM收缩力(contractility)的图。对于每组，n＝5。
图3D图示了用对照MP1、对照MP2、CMMP或CSC处理的对α横纹肌肌动蛋白和增殖标志物Ki67染色的NRCM的代表性图像和定量分析。对于每组，n＝5。比例尺，50μm。
图3E图示了结合至NRCM的CMMP或对照MP1、对照MP2的代表性图像和定量分析。对于每组，n＝3。比例尺，50μm。
图3F图示了与相邻的跳动的心肌细胞同步运动的对照MP1和CMMP的代表性影片屏幕快照和定量。对于每组，n＝3。比例尺，50μm。
图3G和3H图示了揭示CMMP在附着的心肌细胞上滚动(图3G)和行进(图3H)的延时图像。箭头指示滚动或移动方向。比例尺，20μm。所有数据是平均值±s.d.。*表示当与对照组相比时，P<0.05；#表示当与对照MP1组相比时，P<0.05；&表示当与对照MP2相比时，P<0.05。任何两组之间的比较使用双尾非配对学生t检验进行。多于两组之间的比较使用单因素方差分析、随后是事后Bonferroni检验进行。
图4A-4K图示了细胞模拟微粒(CMMP)在心脏病发作的小鼠模型中改善心室功能障碍并促进心脏修复。
图4A示意性地图示了在心肌梗塞的小鼠模型中测试CMMP的治疗益处的动物实验的设计。
图4B图示了对照MP1或CMMP注射后第3天，小鼠心脏的代表性离体荧光成像和荧光强度的定量分析。n＝3只动物/组。*表示当与对照MP1组相比时，P<0.05。
图4C图示了小鼠心脏(注射对照MP1或CMMP后3天，对α横纹肌肌动蛋白染色的肌细胞(myocyte))的代表性显微图像和定量分析。n＝3只动物/组。比例尺，50μm。*表示当与对照MP1组相比时，P<0.05。
图4D图示了示出在第7天在CMMP处理的心脏中TUNEL+凋亡细胞的存在的代表性荧光显微图像和定量分析。n＝3只动物/组。比例尺，50μm。*表示P<0.05。
图4E图示了示出在第7天在用或不用CMMP(红色)处理的心脏中CD45+细胞(绿色)的存在的代表性荧光显微图像。n＝3只动物/组。比例尺，50μm。NS表示P>0.05。
图4F图示了用对照PBS、对照MP1、CMMP或CSC处理4周后的代表性马松三色染色的(Masson’s trichrome-stained)心肌切片。快照＝红框区域的高放大倍数图像。
图4G-4I是图示了来自马松三色图像的存活心肌(图4G)、梗塞厚度(图4H)和瘢痕尺寸(图4I)的定量分析的一系列条形图。n＝5只动物/组。
图4J和4K图示了在基线时(MI后4小时)和4周后在对照PBS、对照MP1、CMMP和CSC组中通过超声心动描记术(echocardiography)测量的左心室射血分数(LVEF)。n＝7只动物/组。*表示当与对照组相比时，P<0.05；#表示当与对照MP1组相比时，P<0.05；NS表示P>0.05。所有数据是平均值±s.d.。任何两组之间的比较使用双尾非配对学生t检验进行。多于两组之间的比较使用单因素方差分析、随后是事后Bonferroni检验进行。
图5A-5D图示了细胞模拟微粒(CMMP)的注射促进再肌化(remuscularization)、肌细胞增殖和血管发生。
图5A图示了示出在4周时在对照PBS、对照MP1或CMMP处理的心脏中α横纹肌肌动蛋白(αSA)阳性的心肌细胞细胞核的代表性图像。αSA阳性细胞核的数量被定量。n＝3只动物/组。比例尺，100μm。
图5B图示了示出在4周时在对照PBS、对照MP1或CMMP处理的心脏中Ki67阳性心肌细胞细胞核的代表性图像。Ki67阳性细胞核的数量被定量。n＝3只动物/组。比例尺，20μm。
图5C图示了示出在4周时在对照PBS和对照MP1或CMMP处理的心脏中凝集素标记的血管的代表性图像。凝集素荧光强度被定量。n＝3只动物/组。比例尺，100μm。
图5D图示了示出在4周时在对照PBS、对照MP1或CMMP处理的心脏中对α平滑肌肌动蛋白(αSMA)染色的小动脉的代表性图像。αSMA阳性血管的数量被定量。n＝3只动物/组。比例尺，50μm。*表示当与CMMP组相比时，P<0.05。所有数据是平均值±s.d.。多于两组之间的比较使用单因素方差分析、随后是事后Bonferroni检验进行。
图6A-6G图示了细胞模拟微粒(CMMP)注射不刺激免疫活性小鼠中的局部T细胞免疫应答。
图6A示意性地图示了评估由人类心脏干细胞(CSC)或来源于人类CSC的CMMP诱导的局部T细胞免疫反应的动物研究设计。
图6B和6C图示了示出在第7天在注射CSC(图6B)或CMMP(图6C)的心脏中浸润的CD3+T细胞的存在的代表性荧光图像。比例尺，10μm。
图6D和6E图示了示出在第7天在注射CSC(图6D)或CMMP(图6E)的心脏中浸润的CD8+T细胞的存在的代表性荧光图像。比例尺，10μm。
图6F和6G图示了在第7天在注射CSC或CMMP的心脏中CD3+和CD8+T细胞的定量分析。n＝3只动物/组。所有数据是平均值±s.d.。任何两组之间的比较使用双尾非配对学生t检验进行。*表示当与CSC组相比时，P<0.05。
图7示意性图示了使用心球(cardiosphere)系统获得心脏干细胞群的方法。
图8图示了揭示在与细胞膜共培养30分钟后在德克萨斯红琥珀酰亚胺酯标记的MP(对照MP1)上没有特异性DiO外层荧光的荧光成像。
图9A-9C图示了在CMMP和CSC中观察到的CSC因子(血管内皮生长因子(VEGF)(图9A)、胰岛素样生长因子(IGF)-1(图9B)和肝细胞生长因子(HGF)(图9C))的释放谱，表明膜包裹不影响CSC因子从CMMP和CSC中释放。对于每个时间点，n＝3。所有数据是平均值±s.d.。
图10A-10F图示了在-80℃快速冷冻和在水中融化不影响CMMP的膜包被(图10A)、尺寸(图10B和10C)或表面抗原表达(图10D-10F)。
图11是图示离体荧光成像的一系列数字图像，示出了注射后大多数CMMP保留在心脏中，而“被洗掉(washed away)”的CMMP信号可见于肺和肝脏中。
图12图示了CMMP的明显的体内降解，因为在第28天仅有可忽略不计的量的颗粒保留在心脏中。
图13A图示了在受精后48小时(hpf)将德克萨斯红荧光MP或CMMP静脉注射到在其血管中过表达绿色荧光蛋白(GFP)的fli1a:egfp斑马鱼胚胎中后，CMMP通过主动血管排出(active vascular explusion)外渗。
图13B图示了使用用于观察颗粒外渗的光片显微术(light sheet microscopy)进行数字成像的尾部节间血管。
图13C图示了未包被的MP保留在血管中，并且在观察期间没有外渗(上图)，而观察到CMMP通过多步主动血管排出过程外渗(下图)。
图13D图示了与MP不能(0％)外渗相比，CMMP的总体外渗效率为约40％。
图14A-14G图示了合成间充质干细胞(synMSC)的制造和表征。
图14A是synMSC的制造过程的示意图。
图14B图示了MP和synMSC的结构的扫描电子显微术图像(左)和荧光图像(右)。比例尺，10μm。
图14C和14D图示了对MP、synMSC和MSC的直径以及MP、synMSC和MSC中MSC标志物的表达的定量分析。
图14E-14G图示了对血管内皮生长因子(VEGF)、基质细胞衍生因子-1(SDF-1)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)从synMSC中的释放的定量分析。对于每组，n＝3。所有数据是平均值±SD。
图15A-15I图示了合成间充质干细胞(synMSC)的体外效力和稳定性。
图15A图示了对横纹肌肌动蛋白染色的并与微粒(MP)、synMSC和MSC共培养的新生大鼠心肌细胞(NRCM)的荧光图像。比例尺，100μm。
图15B和15C图示了当与MP、synMSC和MSC共培养时NRCM数量和收缩力的定量分析。图15D图示了对结合至NRCM的MP和synMSC的数量的定量分析。
图15E图示了冷冻/融化之前和之后，synMSC形态学和聚集的荧光图像(上)和白光显微术图像(下)。比例尺，上，10μm；下，100μm。
图15F和15G图示了冷冻/融化之前和之后，对synMSC的尺寸和表面抗原表达的定量分析。
图15H图示了示出在将冷冻/融化的MSC和synMSC注射到小鼠心脏后的巨噬细胞吸引的代表性的荧光图像和图示。比例尺，100μm。
图15I图示了在注射了冷冻/融化的MSC或synMSC的小鼠心脏中CD68+巨噬细胞的定量分析。对于每组，N＝4。所有数据是平均值±SD。
图16A至16E图示了在具有心肌梗塞的小鼠中注射合成间充质干细胞(synMSC)的益处。
图16A图示了在心肌梗塞(MI)后使用或不使用synMSC治疗的情况下在基线和小鼠的终点处获得的代表性正电子发射断层扫描术/计算机断层扫描术(PET/CT)图像和单光子发射计算机断层扫描术(SPECT)/CT图像。
图16B图示了在对照和synMSC治疗的小鼠中改变的梗塞面积和左心室(LV)容积(终点对基线)的百分比的定量分析。
图16C图示了在MI后2周，对照、synMSC和MSC治疗的小鼠的梗塞心脏的心底(base)、中间乳突(midpapillary)和心尖(apical)区域的马松三色染色图像。
图16D和16E图示了在对照、synMSC和MSC治疗的小鼠中LV的梗塞壁厚度(图16D)和梗塞尺寸(图16E)的定量分析。对于每组，n＝8。所有数据是平均值±SD。*当与对照相比时，P<0.05。
图17A-17F图示了合成间充质干细胞(synMSC)的注射促进梗塞心脏中的内源性修复。
图17A-17CF图示了示出在对照、synMSC或MSC治疗后梗塞的心脏中c-kit阳性、CD34阳性和ki67阳性细胞的代表性荧光图像。箭头表示阳性染色的细胞。比例尺：图17A和17C，20μm；图17B，50μm。
图17D-17F图示了示出在对照、synMSC或MSC治疗后对梗塞的心脏中c-kit阳性细胞、CD34阳性细胞和ki67阳性细胞的定量分析。对于每组，n＝6。所有数据是平均值±SD。*当与对照相比时，P<0.05。
详述
在更详细地描述本公开内容之前，应当理解本公开内容不局限于所描述的特定实施方案，并且当然本身可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，且并非旨在限制，因为本公开内容的范围将仅通过所附的权利要求书限制。
在提供值的范围的情况下，应理解，除非上下文另外清楚地规定，否则该范围的上限和下限之间的每个中间值，至下限的单位的十分之一，以及在该陈述的范围中的任何其他陈述的值或中间的值被包括在本公开内容内。这些较小的范围的上限和下限可以独立地包括于该较小的范围中，并且还被包括于本公开内容内，隶属于陈述的范围的任何特定的排除性限制。在陈述的范围包括限值之一或两者的情况下，排除那些包括的限值中的任一个或两者的范围也被包括在本公开内容中。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与由本公开内容所属的领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然在本公开内容的实践或测试中还可以使用与本文描述的那些类似或等效的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。
在本说明书中引用的所有出版物及专利均通过引用并入本文，其程度如同每一单独出版物或专利被具体地和单独地指明通过引用并入本文，并且在本说明书中引用的所有出版物及专利均通过引用并入本文以公开和描述与被引用的出版物有关的方法和/或材料。对任何出版物的引用是为了其在提交日之前的公开内容，并且不应被理解为承认本公开内容由于之前的公开内容而无权先于此类出版物。此外，提供的出版物的日期可能不同于实际出版日期，实际出版日期可能需要独立地确认。
如本领域技术人员阅读本公开内容之后将清楚的，本文描述并例证的每个单独的实施方案具有离散的组成部分和特征，其可容易地与其他若干实施方案中的任一个的特征分开或组合而不偏离本公开内容的范围或精神。任何所提及的方法可以以事件提及的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序来进行。
除非另有指示，本公开内容的实施方案将使用医学、有机化学、生物化学、分子生物学、药物学和类似的技术，其在本领域的技术内。此类技术在文献中被充分地解释。
虽然本文中已经描述和图示了本公开内容的几个实施方案，但是本领域普通技术人员将容易地设想用于如本文所述执行功能和/或获得结果和/或一个或更多个优点的各种其他工具和/或结构，并且这些变化和/或修改中的每一个都被认为在本公开的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易理解，本文描述的所有参数、尺寸、材料和配置都是示例性的，并且实际的参数、尺寸、材料和/或配置将取决于使用本公开内容教导的具体一个应用或更多个应用。本领域技术人员将认识到，或能够使用不超过常规的实验确定，本文描述的本公开内容的具体实施方案的许多等同物。因此，应当理解，前述实施方案仅作为示例给出，并且在所附权利要求及其等同物的范围内，本公开内容可以以不同于如具体描述和要求的方式实施。本公开内容针对本文描述的每个单独的特征、系统、物品、材料、套件和/或方法。此外，如果两个或更多个这样的特征、系统、物品、材料、套件和/或方法不是相互不一致的，则这两个或更多个这样的特征、系统、物品、材料、套件和/或方法的任何组合都包括在本公开内容的范围内。
相对于字典定义、通过引用并入的文档中的定义和/或所定义术语的普通含义，应理解为以本文中定义和使用的所有定义为准。
除非明确相反指示，否则说明书和权利要求中使用的不定冠词“一个/种(a)”和“一个/种(an)”应理解为意指“至少一个/种(at least one)”。
本文中说明书和权利要求中使用的短语“和/或”应该理解为是指如此结合的要素中的“任一或两者都(either or both)”，即在一些情况下结合地存在而在其他情况下分离地存在的要素。用“和/或”列出的多个要素应该以相同的方式解释，即“一个或更多个”如此结合的元素。除了由“和/或”分句(clause)具体标识的要素之外，可以任选地存在其他要素，无论与具体标识的那些要素相关还是无关。因此，作为非限制性示例，对“A和/或B”的引用，当与诸如“包括/包含(comprising)”的开放式语言结合使用时，在一个实施方案中，可以仅指A(任选地包括除B以外的要素)；在另一个实施方案中，仅指B(任选地包括除了A之外的要素)；在又一个实施方案中，指A和B(任选地包括其他要素)；等等。
如本文中说明书和权利要求书中所用，“或”应理解为具有与上文定义的“和/或”相同的含义。例如，当分离在列表中的项目时，“或”或“和/或”应被解释为包括性的，即包括多个要素或一列的要素中的至少一个，但也包括多于一个，以及任选地，另外未列出的项目。只有明确表示相反的术语，诸如“仅一个(only one of)”或“恰好一个(exactly oneof)”，或者，当在权利要求中使用时，“由…组成(consisting of)”将指包括多个要素或一列要素中的恰好一个要素。一般而言，当前面是排他性的术语时，例如“任一(either)”、“之一(one of)”、“仅一个(only one of)”或“恰好一个(exactly one of)”，本文使用的术语“或”仅应被解释为表示排他性的替代方案(即“一个或另一个但不是两者(one or theother but not both)”)。在权利要求中使用时，“主要由…组成(consisting essentiallyof)”，应具有专利法领域中使用的普通含义。
如本文中说明书和权利要求中所使用的，引用一个或更多个要素的列表的短语“至少一个(at least one)”应理解为意指从要素列表中的任何一个或更多个要素中选择的至少一个要素，但不一定包括要素列表中具体列出的每个要素中的至少一个，并且也不排除要素列表中的要素的任何组合。该定义也允许要素可以任选地存在于短语“至少一个”所指的要素列表中具体标识的要素之外，无论与那些具体标识的要素相关还是无关。因此，作为非限制性示例，“A和B中的至少一个”(或者等同地，“A或B中的至少一个”，或者等同地“A和/或B中的至少一个”)，在一个实施方案中可以指至少一个，可选地包括多于一个的A，不存在B(并且可选地包括除了B之外的要素)；在另一个实施方案中，涉及至少一个，任选地包括多于一个B，不存在A(并且任选地包括除A以外的要素)；在又一个实施方案中，涉及至少一个，可选地包括一个以上的A，以及至少一个，可选地包括一个以上的B(并且可选地包括其他要素)；等等。
还应该理解，除非明确指出相反的情况，否则在这里要求保护的包括多于一个步骤或动作的任何方法中，该方法的步骤或动作的顺序不一定限于该方法的步骤或动作被叙述的顺序。
在权利要求以及其上的说明书中，所有的连接词例如“包括/包含(comprising)”、“包括(including)”、“携带(carrying)”、“具有(having)”、“包含/含有(containing)”、“涉及(involving)”、“保持(holding)”、“包括(composed of)”和类似的短语将被理解为是开放的，即，意指包括但不限于。只有连接词“由...组成(consisting of)”和“主要由...组成”应当分别是封闭的或半封闭的连接词，如在美国专利局专利审查程序手册的2111.03中阐述的。
在描述多个实施方案之前，提供了以下定义并且应该被使用，除非另有指示。
缩写
CMMP，细胞模拟微粒；CSC，心脏干细胞；PLGA，聚(乳酸-共-乙醇酸)；PVA，聚乙烯醇；微粒，MP；对照MP1，由PLGA和人类CSC的条件培养基制造的对照微粒；对照MP2，由PLGA MP和CSC膜制造的对照微粒；SEM，扫描电子显微术；VEGF，血管内皮生长因子；IGF-1，胰岛素样生长因子；HGF，肝细胞生长因子；FITC，异硫氰酸荧光素；NRCM，新生大鼠心肌细胞；LVEF，左心室射血分数；PBS，磷酸盐缓冲盐水；αSMA，α平滑肌肌动蛋白；GFP，绿色荧光蛋白；MI，心肌梗塞；synMSC，合成间充质干细胞。
定义
本文使用的术语“施用(administration of)”和“施用(administering)”化合物或组合物是指向需要治疗的个体提供本公开内容的化合物或本公开内容的化合物的前药。本公开内容的化合物可以通过口服、胃肠外(例如，肌肉内、腹膜内、静脉内、ICV、颅内注射或输注、皮下注射或植入)、通过吸入喷雾、经鼻、阴道、直肠、舌下或局部施用途径被施用，并且可以单独或一起配制成适用于每种施用途径的常规的无毒药学上可接受的载体、佐剂和赋形剂的合适的剂量单位制剂。
本文使用的术语“生物相容的”是指在体内不引起任何不希望的局部或全身性影响的材料。
本文使用的术语“生物材料”和“生物组织”是指体内(例如受试者的细胞或组织)和体外(例如培养的细胞)的细胞或组织。
本文使用的术语“分泌组(secretome)”是指分泌到细胞外培养基中并从细胞外培养基收集的多肽。
本文使用的术语“生物可降解的”是指在生理条件下或在生物环境中随着时间的推移经历显著降解的聚合物或聚合物主链。换句话说，聚合物主链具有易于在生物环境(例如在受试者内或与生物材料诸如血液、组织等接触)中通过化学分解而被分解(即分子量降低)的分子结构，与物理降解不同。这样的化学分解通常是通过形成主链的分子结构的一部分的不稳定的(labile)或生物可降解的部分的水解进行。因此，这样的不稳定的或生物可降解的部分通常易于水解裂解。
生物可降解的和生物相容的聚合物已经被指定为包括不可水解的聚合物缀合物的长期和短期递送媒介物的可能载体。PEG和PEO是最常见的羟基端聚合物，具有宽范围的分子量，可以出于溶解性(易载体模式(easy carrier mode))、降解时间和易于缀合的目的进行选择。末端保护的甲氧基-PEG也将用作能够膨胀的直链载体，并从而减少蛋白在亚细胞转运期间被附着或粘附的机会。乙烯和乙酸乙烯酯的某些共聚物，即EVAc，本质上具有杰出的良好的生物相容性、低结晶度和疏水性是候选的。在最常见和推荐的生物可降解的聚合物中，可以使用乳酸和乙醇酸的聚合物。
本文使用的术语“仿生”是指被设计成与在动物或人类中呈天然状态被发现的细胞相似和/或以与在动物或人类中呈天然状态被发现的细胞相似的方式起作用的材料或结构。在本公开内容的实施方案中，本文公开的仿生组合物适合作为代替干细胞群(诸如但不限于心脏干细胞)的替代物。
本文使用的术语“旁分泌信号传导”是指细胞-细胞通信的一种形式，其中细胞产生诱导附近细胞的变化的信号，改变那些细胞的行为或分化。被称为旁分泌因子的信号分子在相对短的距离内扩散(局部作用)，这与内分泌因子(通过循环系统行进显著更长距离的激素)、近分泌相互作用和自分泌信号传导。产生旁分泌因子的细胞将它们分泌到直接的细胞外环境中。然后因子行进到附近的细胞，在那里接收到的因子梯度决定结果。
尽管旁分泌信号传导在被诱导的细胞中引起多种多样的应答，但大多数旁分泌因子利用相对狭窄的一组受体和途径。身体的不同器官，甚至不同物种之间，可以在差异性发育过程中利用相似的一组旁分泌因子。高度保守的受体和途径可以基于相似的结构分为四个主要家族：成纤维细胞生长因子(FGF)家族、Hedgehog家族、Wnt家族和TGF-β超家族。旁分泌因子与其各自受体的结合启动信号转导级联，引起不同的应答。
为了使旁分泌因子在接受细胞(receiving cell)中诱导应答，接受细胞必须在细胞膜上具有可用的适当的受体来接受信号，也被称为是感受态。此外，应答细胞必须还具有被机械诱导的能力。
本文使用的术语“细胞生长因子”(也被称为“旁分泌因子”)指能够刺激细胞生长、增殖和细胞分化的天然存在的物质。通常它是蛋白或类固醇激素，但是还可以包括任何分子，诸如但不限于由本公开内容的组合物的干细胞分泌，并且可以与紧密接近分泌细胞的细胞相互作用并影响紧密接近分泌细胞的细胞的生长或分化的核酸或小分子。生长因子对调控各种细胞过程是重要的。生长因子通常充当细胞之间的信号分子。实例是结合它们的靶细胞表面上的特定受体的细胞因子和激素。它们经常促进细胞分化和成熟，这在生长因子之间变化。例如，骨形态发生蛋白刺激骨细胞分化，而成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子刺激血管分化(血管发生)。虽然生长因子暗示对细胞分裂的积极作用，但是细胞因子是关于分子是否影响增殖的中性术语。一些细胞因子可以是生长因子，诸如G-CSF和GM-CSF。单独的生长因子蛋白倾向于作为结构和进化上相关的蛋质的较大家族的成员存在，诸如但不限于肾上腺髓质素(AM)、血管生成素(Ang-2)、自分泌运动因子、骨形态发生蛋白(BMP-2、BMP-4、BMP-6)、脑源性神经营养因子(BDNF)、表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(FGF-2(FGF-β)、FGF-4)、胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、生长分化因子-9(GDF-5、GDF-7、GDF-8、GDF9、GDF-11)、肝细胞生长因子(HGF)、肝癌衍生生长因子(HDGF)、胰岛素样生长因子(IGF-1、IGF-2)、迁移刺激因子、肌肉生长抑制素(GDF-8)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血小板生成素(TPO)、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和血管内皮生长因子(VEGF)。
本文中使用的术语“药学上可接受的载体、赋形剂或媒介物”是指不干扰活性成分的有效性或活性并且对其被施用的宿主无毒，并且其由联邦或州政府的监管机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出用于在动物并且尤其是人类中使用的介质。载体、赋形剂或媒介物包括稀释剂、粘合剂(binder)、粘合剂(adhesive)、润滑剂、崩解剂、填充剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂以及制备特定组合物可能需要的其他材料诸如吸收剂。载体等的实例包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其组合。对活性物质使用这样的介质和剂是本领域周知的。
本文使用的术语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”是指不是生物学上或其它方面不希望的材料，即该材料可以以制剂或组合物向个体施用，而不引起任何不希望的生物学效应或以有害的方式与包含它的组合物中的任何组分相互作用。
本文使用的术语“受试者”和“患者”包括人类、哺乳动物(例如猫、狗、马等)、活细胞和其他活的生物体。活的生物体可以像例如单个真核细胞一样简单，或像哺乳动物一样复杂。本公开内容的实施方案可以施用到的典型宿主将是哺乳动物，特别是灵长类动物，尤其是人类。对于兽医学应用，宽范围的受试者将是合适的，例如家畜，诸如牛(cattle)、羊、山羊、奶牛(cow)、猪等；家禽，诸如鸡、鸭、鹅、火鸡等；和家养动物，特别是宠物，诸如狗和猫。对于诊断或研究应用，宽范围的哺乳动物将是合适的受试者，包括啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠)、兔子、灵长类动物和猪，诸如近交猪等。在一些实施方案中，系统包括样品和受试者。术语“活宿主”是指上文提到的活的和未死亡的宿主或生物体。术语“活宿主”是指整个宿主或生物体，并且不仅仅是从活宿主上切除的部分(例如肝或其他器官)。
本文使用的术语“生物分子种类”是指可以是生物来源的和/或与接触的细胞相互作用的任何分子。在本公开内容的微粒中使用的生物分子种类可以是但不限于蛋白、多肽、肽、核酸分子、糖、多糖、细胞因子等，所述蛋白、多肽、肽、核酸分子、糖、多糖、细胞因子等可以但不限于增加或减少细胞或细胞系的增殖、可以维持细胞或细胞系的存活和/或增殖、或者可以引发细胞类型从干细胞类型、前体细胞类型或祖细胞类型的改变。
本文所用的术语“增殖状态”指的是细胞群(包括但不限于间充质干细胞或祖细胞或其亚群)是否正在分裂并因此数量增加、处于静止状态(quiescent state)、或者细胞是否没有增殖、死亡或经历凋亡。
本文使用的术语“调节增殖状态”或“调节增殖”是指化合物改变干细胞群或祖细胞群的增殖速率的能力。化合物可能是有毒的，其中细胞的增殖被减缓或停止，或者增殖可以例如通过向细胞添加细胞因子或生长因子被增强。
本文使用的术语“聚合物”是指包含可以是相同的重复亚单位或不同的重复亚单位的两个或更多个单体亚单位的分子。单体通常包括简单结构、含碳的低分子量分子。聚合物可以任选被取代。可以在本公开内容中使用的聚合物包括但不限于乙烯基、丙烯酰基、苯乙烯、碳水化合物衍生的聚合物、聚乙二醇(PEG)、聚氧乙烯、聚亚甲基二醇、聚三亚甲基二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚氧乙烯、聚氧丙烯嵌段聚合物及其共聚物、盐和衍生物。在本公开内容的多个方面，聚合物是聚(2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙磺酸)；聚(2-丙烯酰氨基-2-甲基)-1-丙磺酸-共聚丙烯腈、聚(2-丙烯酰氨基-2-甲基)-1-丙磺酸-共聚苯乙烯)、聚(乙烯基磺酸)；聚(4-苯乙烯磺酸钠)；和由其衍生的硫酸盐和磺酸盐/酯；聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)和聚乙烯醇。
本文使用的术语“生长因子”是指对细胞具有生长、增殖、分化或营养作用的蛋白、肽或其他分子。这样的因子可以用于诱导增殖或分化，并且可以包括例如允许细胞增殖的任何营养因子，包括结合细胞表面上的受体从而对细胞施加营养或生长诱导作用的任何分子。这样的因子包括由干细胞分泌并且可以诱导或维持紧密接近本公开内容的仿生微粒的细胞的增殖或分化的旁分泌因子。因子包括但不限于肾上腺髓质素(AM)；血管生成素(Ang)；自分泌运动因子；骨形态发生蛋白(BMP)；睫状神经营养因子家族；睫状神经营养因子(CNTF)；白血病抑制因子(LIF)；白细胞介素-6(IL-6)；集落刺激因子；巨噬细胞集落刺激因子(m-CSF)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；表皮生长因子(EGF)；肝配蛋白A1；肝配蛋白A2；肝配蛋白A3；肝配蛋白A4；肝配蛋白A5；肝配蛋白B1；肝配蛋白B2；肝配蛋白B3；促红细胞生成素(EPO)；成纤维细胞生长因子(FGF)；胎牛生长激素(FBS)；GDNF配体家族：胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)；神经秩蛋白(Neurturin)；Persephin；Artemin；生长分化因子-9(GDF9)；肝细胞生长因子(HGF)；肝癌衍生生长因子(HDGF)；胰岛素；胰岛素样生长因子-1(IGF-1)；胰岛素样生长因子-2(IGF-2)；白细胞介素类：IL-1；IL-2；IL-3；IL-4；IL-5；IL-6；IL-7；角质形成细胞生长因子(KGF)；迁移刺激因子(MSF)；巨噬细胞刺激蛋白(MSP)；肌生成抑制蛋白(GDF-8)；神经调节蛋白类；神经调节蛋白1(NRG1)；神经调节蛋白2(NRG2)；神经调节蛋白3(NRG3)；神经调节蛋白4(NRG4)；脑源性神经营养因子(BDNF)；神经生长因子(NGF)；神经营养蛋白-3(NT-3)；神经营养蛋白-4(NT-4)；胎盘生长因子(PGF)；血小板衍生生长因子(PDGF)；肾酶(Renalase)(RNLS)；T-细胞生长因子(TCGF)；血小板生成素(TPO)；转化生长因子；转化生长因子α(TGF-α)；转化生长因子β(TGF-β)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；血管内皮生长因子(VEGF)等。
本文中通过端点引用的数值范围包括归入该范围内的所有数字和分数(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.90、4和5)。还应该理解的是，所有数字及其分数都被假定为由术语“约”修饰。术语“约”是指所引用的数字的正或负0.1至50％、5-50％、或10-40％、优选10-20％、更优选10％或15％。
描述
干细胞疗法代表了再生医学中一个有前景的策略。然而，在使用前需要小心保存和处理细胞。此外，细胞移植具有免疫原性和/或致瘤性风险。越来越多的证据表明，干细胞主要通过分泌(再生因子)和与受损细胞的基于膜的细胞-细胞相互作用来发挥其有益作用。
基于这两个方面，提供了一种在再生过程中模拟干细胞生物相互作用(biointerfacing)的“核心-壳”治疗性微粒。这种微粒是一种细胞模拟微粒(CMMP)，在其聚合物核心中包含控制释放的干细胞因子，并且在表面被干细胞膜片段包裹。尽管不希望受任何一种理论约束，但是预期CMMP可以发挥与真正的心脏干细胞相似的再生效果，但是比后者更有利，因为它们在储存期间更稳定并且由于它们不是真正的细胞而不刺激T细胞免疫反应。
因此，提供了在组织修复期间模拟例如心脏干细胞功能的聚合物微粒的实施方案。在心肌梗塞的小鼠模型中，与心脏干细胞疗法类似，注射本公开内容的CMMP导致存活心肌的保持和心脏功能的增强。CMMP(来源于人类细胞)不刺激免疫活性小鼠的T细胞浸润，表明有利的安全性谱。尽管一种应用是靶向心脏的，但是本公开内容的CMMP代表了可以应用于多种干细胞类型和多种器官系统的修复的平台技术。
因此，本公开内容包括可用于在组织修复中重现(recapitulating)(模拟)干细胞功能的合成的细胞模拟微粒(CMMP)的实施方案。本公开内容的CMMP可以容纳和递送与真正的心脏干细胞的分泌蛋白和膜类似的分泌蛋白和膜。例如，已经表明，在心肌梗塞的小鼠模型中，与心脏干细胞疗法类似，注射CMMP将导致存活心肌的保持和心脏功能的增强。CMMP(来源于人类细胞)不刺激免疫活性小鼠的T细胞浸润。然而，本公开内容的微粒可以用于模拟可以有效用作治疗剂的宽范围的干细胞。因此，CMMP可以作为模拟治疗性心脏再生中天然干细胞的旁分泌和生物相互作用活性的“合成干细胞”起作用。
过去的十五年见证了针对多种疾病的可用干细胞疗法的扩展(Segers&Lee(2008)Nature 451:937-942；Lindvall&Kokaia(2006)Nature441:1094-1096；Fox等人,(2014)Science 345:1247391)。与干细胞通过直接细胞分化和组织替代发挥其治疗作用的最初观点不同，随着新兴的证据表明大多数成体干细胞类型通过旁分泌机制(可溶性因子)发挥其有益作用，该范式(paradigm)现已发生转变(Hodgkinson等人,(2016)Circ Res.118:95-107；Walter等人,(2014)Lancet Respir.Med.2:1016-1026；Lanzoni等人,(2013)StemCells 31:2047-2060)。此外，研究进一步表明，注射的细胞和宿主细胞之间的细胞-细胞接触在组织再生中发挥重要作用(Xie等人(2014)Stem Cells 32:2397-2406；Ho等人(2016)Stem Cells 34:445-455)。
CMMP代表用干细胞来源的膜和分泌组官能化的合成的微粒，结合了干细胞诱导的再生的两个主要组分。有利的是，CMMP克服了活的干细胞作为治疗剂的若干局限。首先，活的干细胞在它们可以被送往诊所之前需要被小心地冷冻保存和融化。作为活的生物体，细胞如何被制备和处理可极大地影响治疗结果。第二，干细胞移植带有某些风险(例如，如果使用同种异体(allogeneic)或异种(xenogeneic)细胞，则具有致瘤性和免疫原性)。
虽然预期本公开内容的CMMP可以通过直接肌肉注射通过心肌内递送，但是这样的注射通常需要开胸手术。然而，随着NOGA图谱系统(NOGA mapping systems)(&Dib(2011)Nat.Rev.Cardiol.8:393-404)的实施，经皮选项变得可用，尽管CMMP可以被直接递送到损伤部位并且从而通过angiopellosis机制促进外渗。此外，CMMP代表了一种可推广到其他干细胞类型和各种其他器官系统的修复的平台技术。
因此，本公开内容包括干细胞仿生微粒的实施方案，所述干细胞仿生微粒包含包埋在聚合物核心颗粒中的至少一种干细胞来源的旁分泌多肽或生长因子，其还包含置于核心颗粒上的干细胞的至少一个细胞膜片段的外层。聚合物核心本身由将允许包埋旁分泌因子和它们从核心中的延长释放的任何生物相容的和生物可降解的聚合物或共聚物、或聚合物或共聚物种类的组合构成。核心并因此微粒优选是生物可降解的，这将导致它们最终从受体动物或人类受试者中被消除。
核心颗粒被定制尺寸以允许通过血管运输和从血管外渗到周围组织中。核心颗粒的聚合物可以由组分单体的溶液形成，所述溶液还包括被选择以诱导干细胞群的生成和增殖的至少一种多肽或肽生长因子。最优选地，生长因子也已经被选择为通过靶向的干细胞群分泌。因此，用于掺入本公开内容的仿生微粒中的多肽的一个来源是已被用于培养和增加分离的干细胞群的条件培养基。
在细胞培养期间，已知它们生成并分泌旁分泌生长因子，所述旁分泌生长因子可以例如与相似的干细胞的表面上的受体相互作用以促进受体细胞的生长。因此，通过将培养基与聚合物前体的溶液混合，并随后形成聚合物，生长因子变成包埋入微粒的聚合物的基质中。在与聚合物前体混合之前，条件培养基的生长因子多肽可以被浓缩到这样的程度，即当被包埋在微粒中并被递送给受体动物或人类受试者时，它们将从微粒中分泌出来以提供在刺激靶组织中的细胞的生长和增殖方面有效的浓度。条件培养基的组分可以通过本领域技术人员熟知的方法进行浓缩，例如但不限于通过诸如冻干和在缩减的液体体积中重新悬浮以及通过超滤。
除了条件细胞培养基之外，本公开内容的微粒可以具有定义的生长因子多肽包埋在其中，所述定义的生长因子多肽已被鉴定为能够诱导和维持体内干细胞增殖。任何组合或数量的这些不同的生长因子可以被掺入到微粒中，该组合可以针对干细胞的类型和感兴趣的组织修复进行调节。因此，作为生长因子来源的条件培养基可以用分离的生长因子的生理学上可接受的溶液(例如容易地商购可得的那些生理学上可接受的溶液)代替。
本公开内容的组合物可以包括这样的组合物，所述组合物包含缓释或控释基质，所述基质包含其中包埋有干细胞来源的旁分泌因子的至少一种聚合物材料。本公开内容的实施方案可以与使用缓释制剂的其他疗法结合使用。如本文所用的，缓释微粒聚合物优选地可通过酶促或基于酸的水解或通过溶解而降解。插入到受体组织后，微粒可以被酶和体液作用。聚合物基质理想地选自生物相容的材料，诸如聚丙交酯(聚乳酸)、聚乙交酯(乙醇酸的聚合物)、聚丙交酯共乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)、聚酐、聚(原酸)酯、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅酮。示例性的生物可降解的基质包括聚丙交酯基质、聚乙交酯基质和聚丙交酯共乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)基质。
本公开内容的仿生微粒还包含设置在微粒的外表面上的外层，该层包含干细胞的细胞膜片段。虽然优选膜片段从用于提供包埋在微粒中的旁分泌因子的相同类型的干细胞中分离，但是认为可以提供其中旁分泌因子来源于一种干细胞并且膜来源于第二种干细胞的组合。最有利的是，干细胞膜是从培养的干细胞中分离出来的，所述培养的干细胞诸如但不限于心球(cardiosphere)，即体外培养的干细胞群且其形成干细胞子代(stem cellprogeny)的球形簇。
有利的是，在添加外细胞膜层之前，本公开内容的仿生微粒可以使用保持被包埋的生长因子的稳定性和形成微粒主体的聚合物基质的完整性的这样的技术被制备用于延长储存。这样的技术是本领域技术人员熟知的，并且包括但不限于冻干(冷冻干燥)、冷冻或在缓冲溶液中等。然后，保存的微粒可以在施用至受体动物或人类患者之前被重新悬浮在生理学上可接受的介质中并随后用分离的细胞膜片段包被。
通过将MSC细胞膜包被到装载有MSC分泌组的PLGA颗粒上，制备了被称为synMSC的颗粒。与真正的MSC相比，这种新型颗粒显示出相似的分泌组和表面抗原谱。synMSC促进心肌细胞功能，并在体外显示出冷冻保存和冻干稳定性。在急性MI的小鼠模型中，心肌内注射synMSC以与真正的MSC相当的水平减轻了左心室重塑(left ventricle remodeling)。
越来越多的证据表明，成体干细胞主要通过旁分泌作用而不是直接分化来发挥其治疗作用。为此，科学家已经开始考虑直接递送干细胞释放的可溶性因子作为干细胞移植的替代方法。然而，被注射的可溶性因子的短期效应(short-lived effect)阻碍了进展。心脏收缩可以迅速清洗掉注射的因子。允许可溶性因子的控释的方法是首要的，并且对于临床实施干细胞来源的因子以用于治疗性心脏再生是迫切需要的。尽管外泌体(exosome)在心脏修复中显示出巨大的潜力，并且可以克服与细胞移植相关的缺点，但是缺乏用于外泌体分离的标准化方案以及注射后外泌体的快速清除仍然是临床应用的挑战。synMSC被设计为将分泌组(包含可溶性因子和外泌体二者)和MSC膜结合。synMSC可以释放在体外与心肌细胞结合的可溶性因子，诸如血管内皮生长因子、基质细胞衍生因子-1和胰岛素样生长因子1。此外，MHC I类分子而不是MHC II类分子或共刺激分子在MSC细胞膜中的表达允许其逃避免疫系统的同种识别(allorecognition)，并可以调节宿主免疫应答。包被在PLGA颗粒上的MSC膜可以有效地保护synMSC免受宿主免疫细胞和炎性细胞的攻击。
MI诱导后，大量心肌细胞死亡。心肌细胞数量的恢复是基于细胞的疗法的一个重要目标。通过将synMSC与NRCM共培养，观察到与MSC相当的水平的NRCM数目和收缩力的显著增加，这可能与synMSC释放的生长因子有关。
synMSC上的MSC膜可以允许它们通过细胞-细胞相互作用紧密附着至心肌细胞。其次，已经报道了干细胞膜在再生过程中并非无价值：直接接触可能触发心肌细胞中的下游信号传导，以有利于存活和功能增强。
基于干细胞的疗法的一个主要挑战是细胞的冷冻保存稳定性。现已发现，在-80℃速冻和快速融化不会改变synMSC的结构、尺寸或表面抗原表达。此外，冷冻干燥不改变synMSC的特性。重要的是，当冷冻/融化的MSC(具有由于严酷的冷冻/融化导致的死亡MSC)被注射到小鼠心脏时，它们被巨噬细胞靶向(启动死亡MSC的吞噬作用)，而synMSC则不会如此，表明synMSC优于MSC的有益的冷冻保存稳定性。
目前，由于CT可以提供解剖结构的更多细节，正电子发射断层扫描术和单光子发射CT与CT的混合成像已被用于临床和小动物心血管疾病诊断。利用葡萄糖示踪剂类似物18F-FDG的正电子发射断层扫描术允许检测具有不同代谢活性的细胞，并且利用99mTc-替曲膦(99mTc-tetrofosmin)的门控单光子发射CT对心室容积进行精确评估。因此，通过18F-氟脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描术/CT和99mTc-替曲膦单光子发射CT/CT来评估小鼠心脏的心肌存活和左心室容积。
如梗塞面积的显著减少所示的，synMSC显著减轻左心室重塑，证实了synMSC的治疗潜力。此外，通过马松三色染色进行的左心室形态计量术(morphometry)评估揭示了synMSC以与MSC相当的水平表现出对心脏形态计量的保护。
已经报道MSC通过活化心脏干细胞、血管发生和细胞增殖的旁分泌作用提供心脏保护。与这些发现一致，在synMSC治疗的小鼠中发现c-kit阳性干细胞显著增加(与MSC治疗类似)，尽管难以区分这些c-kit阳性干细胞的来源(心脏来源或骨髓来源)。此外，在synMSC治疗的小鼠中发现了可为周围的心肌细胞提供足够的氧气和营养的大量血管。
综上所述，本公开内容的synMSC的成功制造及其在急性MI小鼠模型中被证明的治疗效果表明了这种方法在再生医学中的有利用途。此外，这种合成干细胞方法可以为治疗多种疾病提供组织工程。结果表明，合成干细胞为干细胞介导的再生疗法提供了一个替代选择。
因此，本公开内容的一个方面包括干细胞仿生微粒的实施方案，所述干细胞仿生微粒包含包埋在生物相容的聚合物核心微粒中的至少一种干细胞旁分泌因子和置于聚合物核心微粒上的干细胞的至少一个细胞膜片段的外层。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，微粒的生物相容的聚合物核心可以由单一种类的聚合物、多于一个聚合物种类、嵌段共聚物或多于一个聚合物种类组成，并且其中聚合物核心的一种或更多种聚合物可以被交联。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，微粒的生物相容的聚合物核心可以是生物可降解的。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，生物相容的聚合物核心包含聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，至少一种干细胞旁分泌因子和一个或更多个细胞膜片段可以来自相同种类的干细胞。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，至少一种干细胞旁分泌因子和一个或更多个细胞膜片段可以来源于心脏干细胞。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，至少一种干细胞旁分泌因子和一个或更多个细胞膜片段可以来自不同种类的干细胞。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，至少一种干细胞旁分泌因子可以来自干细胞条件培养基。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，至少一种干细胞旁分泌因子可以是分离的旁分泌因子。
本公开内容的另一方面包括干细胞仿生微粒组合物的实施方案，所述干细胞仿生微粒组合物包含本公开内容的干细胞仿生微粒和药学上可接受的载体。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，组合物可以被配制成用于直接递送到受试动物或人类的靶组织中，或者用于向受试动物或人类的局部或全身性施用。
本公开内容的另一方面包括生成仿生微粒的方法的实施方案，所述方法包括以下步骤：(a)将包含至少一种干细胞旁分泌因子的水溶液与具有可聚合单体溶解在其中的有机相混合；(b)将来自步骤(a)的混合物乳化；和(c)将来自步骤(b)的乳液与水溶液混合，并允许有机相蒸发，从而生成具有至少一种干细胞旁分泌因子包埋在其中的生物相容的聚合物微粒。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，该方法还可以包括以下步骤：(i)获得分离的干细胞膜或其片段；和(ii)通过将来自步骤(c)的生物相容的聚合物微粒与分离的干细胞膜或其片段的悬浮液混合，生成干细胞膜包被的仿生微粒。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，包含至少一种干细胞旁分泌因子的水溶液可以是干细胞条件培养基或至少一种分离的干细胞旁分泌因子的水溶液。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，包含至少一种干细胞旁分泌因子的水溶液可以是心脏干细胞条件培养基，并且其中细胞膜片段从心脏干细胞分离。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，可聚合单体的聚合物可以是聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，步骤(c)还可以包括将生物相容的聚合物微粒冻干。
本公开内容的又另一方面包括在有相应需要的患者中进行组织修复的方法的实施方案，所述方法通过向所述患者递送包含干细胞仿生微粒的药学上可接受的组合物来进行，其中所述干细胞仿生微粒可以包含包埋在生物相容的聚合物核心微粒中的至少一种干细胞旁分泌因子和置于生物相容的聚合物核心微粒上的干细胞的至少一个细胞膜片段的外层。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，微粒的生物相容的聚合物核心可以由单一种类的聚合物、多于一个聚合物种类、嵌段共聚物或多于一个聚合物种类组成，并且其中聚合物核心的聚合物可以任选地被交联。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，微粒的生物相容的聚合物核心可以是生物可降解的。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，生物相容的聚合物核心可以包含聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，至少一种干细胞旁分泌因子和一个或更多个细胞膜片段可以来自相同种类的干细胞。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，至少一种干细胞旁分泌因子和一个或更多个细胞膜片段可以来源于心脏干细胞。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，至少一种干细胞旁分泌因子和一个或更多个细胞膜片段可以来自不同种类的干细胞。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，至少一种干细胞旁分泌因子可以来自干细胞条件培养基。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，至少一种干细胞旁分泌因子可以是分离的旁分泌因子。
在本公开内容的这一方面的一些实施方案中，药学上可接受的组合物可以被配制成用于直接递送到受试动物或人类的靶组织中，或者用于向受试动物或人类的局部或全身性施用。
应该强调，本公开内容的实施方案，特别是任何“优选的”实施方案，仅是实施的可能示例，仅列出用于清楚理解本公开内容的原理。可对本公开内容的以上描述的实施方案进行许多变化和修改，而基本上不偏离本公开内容的精神和原则。所有这样的修改和变化意图在本文中被包括在本公开的范围内，并被所附权利要求保护。
下面的具体实施例将被解释为仅说明性的，并且不以任何方式限制本公开内容的其余部分。无需进一步详尽说明，认为本领域的技术人员能够基于本文的描述，利用本公开内容至其最大程度。本文中列举的所有出版物通过引用以其整体并入本文。
提出以下实施例，以便对本领域普通技术人员提供如何进行本文公开和保护的组合物和化合物的方法和用途的完整的公开内容和描述。已经做出努力以确保关于数字(例如量、温度等)的准确性，但应该考虑某些误差和偏差。除非另外指明，否则份数是重量份数，温度是以℃计，并且压力是在大气压或接近大气压。标准温度和压力定义为20℃和1个大气压。
应注意，在本文中，比率、浓度、量和其他数值数据可以以范围格式表示。应该理解，为方便和简洁，使用这样的范围格式，并且因此，应该以灵活的方式解释为不仅包括明确列举作为范围的限值的数值，而且还包括在该范围内包括的所有单独的数值或子范围，如同每个数值和子范围被明确地列举。为了说明，“约0.1％至约5％”的浓度范围应被解释为不仅包括约0.1％至约5％的明确列举的浓度，而且还包括在指示的范围内的单独的浓度(例如，1％、2％、3％、和4％)以及子范围(例如，0.5％、1.1％、2.2％、3.3％、和4.4％)。术语“约”可以包括被修饰的一个或更多个数值的±1％、±2％、±3％、±4％、±5％、±6％、±7％、±8％、±9％或±10％或更多。
实施例
实施例1
人类CSC的来源和培养：如前所述，人类干细胞来源于供体人类心脏(Cheng等人,(2014)J.Am.Heart Assoc.3:e001260；Cheng等人(2012)Biomaterials 33:5317-5324)。简而言之，心肌组织被切碎成约2mm3的小块，然后用PBS洗涤并用胶原酶溶液(Sigma,St.Louis,MO,USA)消化。将组织碎片在包被有0.5mg/ml纤连蛋白(Corning,Corning,NY,USA)的平板上，在补充有20％胎牛血清(FBS；Corning)、0.5％庆大霉素(Gibco，LifeTechnologies,California,USA)、0.1mM的2-巯基乙醇(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)和1％左旋谷氨酰胺(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)的Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM；Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中，培养为“心脏外植体(cardiac explant)”。在1至2周内，从心脏外植体出现了一层基质样扁平细胞和相亮的(phase-bright)圆形细胞，相亮细胞(phase bright cells)在上方。将这些心脏外植体来源的细胞使用TryPEL Select(Gibco)收获，并且随后以2×104细胞/ml的密度接种在超低吸附瓶(UltraLow Attachment flask)(Corning)中，用于心球形成。在约1周内，外植体来源的细胞自发地聚集成心球。通过将收集的心球接种在纤连蛋白包被的平板上生成心球衍生的心脏干细胞(CSC)。所有培养物在37℃于5％CO2中孵育。
实施例2
对照MP和CMMP的制造：装载CSC因子的聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)微球(对照MP1)采用水/油/水(w/o/w)乳化技术制备。简而言之，将具有聚乙烯醇(PVA)(0.1％w/v)的人类CSC条件培养基作为内部水相混合在作为油相的含有PLGA的二氯甲烷(DCM)中。然后在冰上将混合物用带有Microtip探头的声波仪(Misonix,XL2020,Farmingdale,NY,USA)进行声处理持续30秒。此后，立即将初级乳液(primary emulsion)引入到具有PVA(0.7％w/v)的水中，以产生w/o/w乳液。将次级乳液在高速均质机(homogenizer)上乳化持续5分钟。将w/o/w乳液在室温连续搅拌过夜，以促进溶剂蒸发。然后将固化的微粒，即对照MP1离心、用水洗涤三次、冻干并储存在-80℃。为了制备CMMP，使DiO(Invitrogen)标记的CSC经历了三个冷冻/融化循环。此后，将破裂的CSC与对照MP1一起在室温进行声处理持续约5分钟。之后，通过离心将颗粒在PBS中洗涤三次。对照MP2通过用CSC膜包裹空PLGA颗粒来制造。成功的膜包被使用荧光显微术确认。
实施例3
蛋白释放研究：微粒中的总蛋白含量使用以下方法确定。将约10mg冷冻干燥的微球溶解在1ml DCM中，持续60分钟。然后，向溶液中加入1ml PBS，随后搅拌持续10分钟，以将蛋白从DCM提取到PBS中。离心后，水相中蛋白的浓度通过BCA蛋白测定试剂盒(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA,USA)确定。对于释放研究，将微粒在37℃于PBS中孵育。在不同时间点收集上清液，并通过商购可得的ELISA试剂盒(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)确定蛋白的浓度。
实施例4
扫描电子显微术：微球的形态学通过扫描电子显微术(SEM,Philips XL30扫描显微镜,Philips,The Netherlands)研究。冷冻干燥的微球用双面胶带安装在铝桩上，并用薄的金层包被。然后，在显微镜下以15kV的加速电压扫描被包被的样本并进行拍照。
实施例5
流式细胞术：为了表征对照MP1、对照MP2、CMMP和CSC的表型，使用CytoFLEX流式细胞仪(Beckman Coulter,Brea,CA)进行流式细胞术，并使用FCS Express软件(De NovoSoftware,Los Angeles,CA)进行分析。简而言之，将细胞与来自BD公司(Franklin Lakes,NJ)的针对CD105(3μl/100μl样品，FAB 10971P，R&D Systems)、CD90(4μl/100μl样品，BD555595)、CD45(5μl/100μl样品，BD 555982)、CD34(5μl/100μl样品，BD 555821)和CD117(5μl/100μl样品，c-kit)(BD 550412)的FITC、PE或APC缀合的抗体一起孵育持续60分钟。来自BD公司的同种型相同抗体用作阴性对照(3μl/100μl样品)。
实施例6
免疫细胞化学：将对照MP1、对照MP2、CMMP和CSC用红色荧光的德克萨斯红琥珀酰亚胺酯(1mg/ml[Invitrogen,Carlsbad,California])预先标记。将NRCM或与预先标记的对照MP1、对照MP2、CMMP和CSC共培养的NRCM涂布在纤连蛋白包被的腔室载玻片(chamber slide)(BD Biosciences)上，并且随后用4％多聚甲醛(PFA)固定，然后进行免疫细胞化学(ICC)染色。将载玻片用针对α-SA(1:100，a7811，Sigma)或ki67(1:100，ab15580，Abcam)的抗体染色，并用FITC或德克萨斯红缀合的二抗(1:100)检测。细胞核用DAPI染色。用落射荧光显微镜(Olympus IX81)拍摄图像。
实施例7
心肌梗塞的小鼠模型：诱导小鼠心肌梗塞的方法是基于以前的研究(Andrade等人,(2015)PLoS One 10:e0143221)进行的。简而言之，将雄性CD1小鼠用3％异氟烷结合2％氧气吸入进行麻醉。在无菌条件下，通过微创左侧开胸术暴露心脏，并通过冠状动脉左前降支(left anterior descending coronary artery)的永久结扎产生急性心肌梗塞(AMI)。AMI诱导后，立即将心脏随机分为接受以下四个治疗分支(arm)中的一个：1)“对照(PBS)”组：AMI后立即将50μl PBS心肌内注射到心脏中；2)“对照MP1”组：AMI后立即将在50μl PBS中的1x105个对照MP1心肌内注射到心脏中；3)“CMMP”组：AMI后立即将在50μl PBS中的1x105个CMMP心肌内注射到心脏中；4)“CSC”组：AMI后立即将在50μl PBS中的1x105个CSC心肌内注射到心脏中。为了使动物群组(a cohort of animals)中的对照MP1或CMMP能够可视化，将对照MP1或CMMP用德克萨斯红-X琥珀酰亚胺酯(1mg/ml[Invitrogen,Carlsbad,California])预先标记。
实施例8
CMMP的生物分布的离体荧光成像：注射后7天，将接受CMMP的小鼠群组处死，用于收获心脏、肺、脾、肝和肾进行生物分布研究。离体荧光成像用IVIS Xenogen In VivoImager(Caliper Lifesciences,Waltham,MA)进行。
实施例9
心脏形态计量术：在4周时的超声心动描记术研究后，对所有动物实施安乐死，并且将心脏收获并在OCT化合物中冷冻。将样本以10μm厚度从心尖到结扎水平以100μm的间隔进行切片。马松三色染色如制造商说明书(HT15三色染色(马松)试剂盒；Sigma-Aldrich)描述地进行。图像用PathScan Enabler IV载玻片扫描仪(Advanced Imaging Concepts,Princeton,NJ)采集。根据马松三色染色的图像，使用NIH ImageJ软件在每个切片中测量形态计量参数，包括存活心肌、梗塞厚度和瘢痕尺寸。作为瘢痕面积(梗塞尺寸)的分数的存活心肌的百分比按描述的进行定量(Cheng等人,(2010)Circ.Res.106:1570-1581)。对于每只动物，对三个选定切片进行定量。
实施例10
心脏功能评估：所有动物在1.5％异氟烷-氧气混合物麻醉下，于4小时和4周时以仰卧位接受经胸超声心动描记术。该程序由对实验设计不知情的动物心脏病专家使用与L15高频探头偶联的Philips CX30超声系统进行。将心脏在最大LV直径的水平以长轴视图进行2D成像。EF通过使用式(LVEDV-LVESV/LVEDV)x 100％确定。
实施例11
组织学：对于免疫组织化学染色，将心脏冷冻切片用4％多聚甲醛固定，用含有0.1％皂苷(Sigma,St.Louis,MO)的蛋白封闭溶液(DAKO,Carpinteria,CA)透化和封闭，然后与以下抗体一起在4℃孵育过夜：小鼠抗α横纹肌肌动蛋白(1:100，a7811，Sigma)、兔抗CD45(1:100,ab10559,Abcam,Cambridge,United Kingdom)、小鼠抗肌动蛋白、α-平滑肌抗体(1:110，A5228，Sigma)，兔抗Ki67(1:100，ab15580,Abcam)，兔抗CD3(1:100,ab16669,Abcam)和小鼠抗CD8α(1:100,mca48r,abd Serotec,Raleigh,NC)。FITC-或德克萨斯红二抗(1:100)从Abcam公司获得，并用于与这些一抗结合。为了评估细胞凋亡，将心脏冷冻切片与TUNEL溶液(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)一起孵育，并用DAPI(LifeTechnology,NY,USA)复染。对于血管造影评估，将心脏冷冻切片与凝集素(FL-1171,Vectorlaboratories,Burlingame,CA,USA)一起孵育。图像通过Olympus落射荧光显微术系统拍摄。
实施例12
人类CSC和CMMP的免疫原性研究：将免疫活性的雄性CD1小鼠用3％异氟烷结合2％氧气吸入进行麻醉。在无菌条件下，通过微创左侧开胸术暴露心脏，并使心脏随机接受以下两种治疗之一：1)“CMMP”组：将在50μl PBS中的1x105个CMMP心肌内注射到心脏中；2)“CSC”组：将在50μl PBS中的1x105个人类CSC心肌内注射到心脏中。为了使CMMP或CMMP能够可视化，将它们用红色荧光团预先标记。
实施例13
统计分析：所有结果均表示为平均值±标准差(s.d.)。两组之间的比较用双尾学生t检验进行。任何两组之间的比较使用双尾非配对学生t-检验进行。多于两组之间的比较使用单因素方差分析、随后是事后Bonferroni检验进行。当P值<0.05时，差异被认为是统计上显著的。
实施例14
CMMP的物理化学和生物学特性：本公开内容的CMMP的生化设计和模型在图1A中概述。治疗性微粒(MP)，即对照MP1，由聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)和人类心脏干细胞(CSC)的条件培养基制造，所述人类心脏干细胞使用如之前描述的心球方法从人类心脏分离(Cheng等人,(2012)Biomaterials 33:5317-5324；Cheng等人,(2014)JACC Heart Fail.2:49-61)并在图7中示意性地示出。
条件培养基包含由CSC分泌的生长因子(Li等人,(2012)J.Am.Coll.Cardiol.59:942-953)。已经在I期/II期临床试验中测试并证明CSC是安全和有效的(Makkar等人,(2012)Lancet 379:895-904；Bolli等人,(2011)Lancet378:1847-1857；Malliaras等人,(2014)J.Am.Coll.Cardiol.63:110-122)。此后，将MP(德克萨斯红琥珀酰亚胺酯标记的)(图1B)用心脏干细胞的膜片段(绿色荧光DiO标记的)(图1B)包裹，以成为最终产物CMMP(图1C)。
如图8所示，荧光成像揭示了在共培养30分钟后，德克萨斯红琥珀酰亚胺酯标记的MP(对照MP1)上没有特定的DiO外层荧光。扫描电子显微术(SEM)揭示了CMMP上的有效的CSC膜包裹(图1E)，但在未包裹的MP(对照MP1)上没有有效的CSC膜包裹(图1D)。作为另一种对照颗粒，对照MP2通过用CSC膜包裹空PLGA颗粒来制造。CMMP、对照MP1和对照MP2被制造成具有与真正的CSC的尺寸相似的尺寸(图1H)。
作为成功的膜包裹的一个指标，流式细胞术分析证实了主要人类CSC标志物(例如CD105、CD90)在CMMP和对照MP2上的表达，但在对照MP1上不表达(图1F和1G；图2A和2B)。总的来说，CMMP和对照MP2都携带与CSC所携带的相似的表面抗原(图1I)。膜包裹不影响CSC因子(即血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)-1和肝细胞生长因子(HGF))从CMMP和对照MP1的释放(图1J-1L和9A-9C)。在-80℃快速冷冻并在水中融化不影响CMMP的膜包被(图10A)、尺寸(图10B和10C)或表面抗原表达(图10D-10F)。这些结果证实了CMMP重现了真正的CSC的分泌组和表面抗原谱。相比之下，对照MP1包含CSC分泌组，但不包含CSC的膜，而对照MP2成功地携带CSC的膜。
实施例15
CMMP在体外促进心肌细胞功能：CSC的一个重要的效力指标(potency indicator)是它们促进体外培养的心肌细胞的功能的能力。将CMMP、对照MP1、对照MP2或CSC(图3A)与新生大鼠心肌细胞(NRCM)(对α-横纹肌肌动蛋白染色，图3A)在普通Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)中共培养。单独NRCM的培养物被纳入作为阴性对照。
虽然与来自对照MP2或单独NRCM的培养物的NRCM数量相比，对照MP1(图3B)增加了NRCM的数量，但是最大NRCM数量在与CMMP和真正的CSC共培养的那些NRCM中观察到(蓝条，图3B)。此外，CMMP和对照MP1稳健地促进NRCM收缩力和增殖(如Ki67阳性细胞核所指示的，图3D)。CMMP和对照MP2二者可以像细胞一样牢固地结合心肌细胞，而大多数未包裹的对照MP1漂浮在培养基中(图3E)。这样的结合通过CMMP与相邻的跳动的心肌细胞的同步运动证实(图3F)。此外，延时成像揭示了CMMP在附着的心肌细胞上的滚动(图3G)和行进(图3H)，表明CMMP和心肌细胞之间的生物相互作用。在未经包裹的对照MP1中未观察到这样的动态活动。这些基于体外细胞的测定表明CMMP在心脏中的再生潜力。
实施例16
心脏病发作的小鼠模型中CMMP注射的治疗益处：为了测试CMMP的治疗潜力，使用了通过左前降支动脉(LAD)结扎的小鼠心肌梗塞(心脏病发作)模型(图4A)。LAD结扎后立即心肌内注射CMMP或对照MP1。阴性或阳性对照动物分别接受媒介物(PBS)或CSC注射。
第3天的离体荧光成像揭示了与对照MP1相比，注射后更多的CMMP保留在心脏中(图4B)。组织学进一步证实了这一点(图4C)。这与CMMP在体外对心肌细胞的更优的结合(如图3A-3H所示)相一致。此外，离体荧光成像表明，注射后大多数CMMP保留在心脏中，而如图11所示出的，“被洗掉”的CMMP信号可见于肺和肝脏中，这与针注射可以引起血管损伤和静脉引流将颗粒带到肺的观点一致(Al Kindi等人,(2008)Front.Biosci.13:2421-2434)。肝脏中的脱靶表达可能代表CMMP在注射期间泄漏到LV腔中。尽管如此，注射后大多数CMMP保留在心脏中。
如图12中示出的，CMMP的体内降解是明显的，因为在第28天只有可忽略不计的量的颗粒保留在心脏中。在第7天处死动物群组，用以评估CMMP治疗的动物中的心肌组织凋亡和巨噬细胞浸润。TUNEL染色揭示了CMMP的抗凋亡作用：在CMMP存在的区域中检测到较少的凋亡细胞核(图4D)。CMMP治疗不会引起炎症加重：在具有或没有CMMP的区域中，CD45阳性细胞的组织密度是不可区分的(图4E)。
治疗后4周的马松三色染色(图4F)揭示了与对照PBS注射相比，对照MP1治疗(图4G-4I)表现出一定程度的心脏形态学保护。然而，在用CMMP治疗的动物中观察到最大的保护作用。这样的保护作用与注射CSC的那些保护作用类似。
干细胞疗法的真正效力指标是通过超声心动描记术测量的随时间推移改善心室功能障碍甚至增强心脏功能的能力。左心室射血分数(LVEF)在基线(梗塞后4小时)和4周后测量。所有组的LVEF在基线处都不可区分(图4J)，表明初始心脏损伤的程度相似。
在4周期间内，对照(PBS或盐水)治疗的动物的LVEF持续恶化(图4K)，而对照MP1治疗的动物表现出LVEF增加的趋势但没有达到统计学显著性。CMMP治疗稳健地促进了心脏功能，在4周时具有最高的LVEF(图4K)。这样的治疗效果与用真正的CSC治疗的那些效果不可区分(图4K)。
组织学分析表明，通过CMMP治疗的这样的功能益处伴随着在MI后心脏中再肌化(图5A)、内源性心肌细胞增殖(图5B)、血流增加(图5C)和血管密度增加(图5D)。
实施例17
CMMP注射不促进T细胞浸润：为了评估对CMMP的局部T细胞免疫应答，免疫活性的CD1小鼠通过心肌内注射人类CSC或CMMP。将动物在注射后7天处死，以评估如通过CD3+和CD8+T细胞测量的心脏中的T细胞免疫排斥(图6A)。CMMP(红色)注射引起可忽略不计的T细胞排斥，因为在心脏中检测到很少的CD3+或CD8+T细胞(图6C和6E)。
相比之下，在用人类CSC治疗的小鼠心脏中检测到严重排斥：移植的CSC被CD3+或CD8+T细胞簇包围(图6B和6D)。定量分析也证实了，与通过人类CSC的严重T细胞刺激相比，CMMP刺激较少的局部T细胞浸润(图6F和6G)。
实施例18
表1概述了本公开内容的CMMP和干细胞之间的比较。
表1
实施例19
静脉递送的CMMP通过主动血管排出的外渗：心肌内注射干细胞通常涉及创伤性开胸手术，这限制了它向临床的转化。静脉注射代表了针对多种疾病递送治疗性干细胞的微创且安全的途径。为了使干细胞到达实质(parenchyma)进行修复，它们必须通过血细胞渗出或主动血管排出来穿过血管屏障(即外渗)。与活细胞不同，惰性聚合物MP不能外渗，限制了它们经静脉应用的潜力。为了测试CMMP可以通过主动血管排出外渗的这一假设，我们在受精后48小时(hpf)将德克萨斯红荧光MP或CMMP静脉注射到fli1a:egfp斑马鱼胚胎中。这种鱼品系在其血管中过表达绿色荧光蛋白(GFP)(图13A)。输注后，使用光片显微术对尾部节间血管成像(图13B)，用于观察颗粒外渗。结果，未经包被的MP保留在血管中，并且在观察期内没有外渗(图13C，上图)。相比之下，观察到CMMP通过多步主动血管排出过程外渗(图13C下图)：首先，它们变得滞留于(in-lodged)血管中，然后血管的内皮细胞延伸出包围细胞的突起(protrusion)。内皮突起主动将细胞从管腔(lumen)移至周围组织或附近的血管腔中。CMMP总体外渗效率为约40％(图13D)，而相比之下MP则不能外渗(0％)(图13D)。这样的外渗率与CSC的外渗率相似。
CMMP技术可推广到其他细胞类型。例如，我们已经证明了，我们可以由间充质干细胞(临床试验中常用的成体干细胞类型)制造CMMP。
实施例20
synMSC制造和生物学特性：synMSC制造的示意性设计总结在图14A中。简而言之，将MSC条件培养基掺入PLGA中以形成微粒，并且随后将微粒用MSC细胞膜包被以形成合成的MSC(synMSC)。扫描电子显微术和荧光成像(图14B)证实了微粒上的成功的MSC细胞膜包被。synMSC具有约20μm的尺寸，类似于微粒和真正的MSC的那些尺寸(图14C)。流式细胞术分析显示，与MSC相比，synMSC表现出相似的CD105、CD90、CD45、CD31和CD34的表达，而微粒没有表现出相似的CD105、CD90、CD45、CD31和CD34的表达(图14D)。此外，synMSC可以维持生长因子如血管内皮生长因子(图14E)、基质细胞衍生因子-1(图14F)和胰岛素样生长因子1(图14G)的释放。这些结果证明，synMSC和MSC在分泌组和表面抗原表达方面是相当的。
实施例21
synMSC在体外促进心肌细胞功能：为了测试synMSC在体外的心肌细胞保护能力，将新生大鼠心肌细胞(NRCM，对α-横纹肌肌动蛋白染色；图15A)与微粒、synMSC和MSC一起共培养(图15A)。单独NRCM的培养物被纳入作为阴性对照。synMSC显著增加NRCM数量(图15B)并促进NRCM收缩力(图15C)。这样的有益效果与来自MSC的有益效果相当。尽管最初将相同量的颗粒应用于NRCM，但synMSC对NRCM数量和收缩力的促进可能是因为其在NRCM中存在显著更高的数量(图15D)。这些结果表明，synMSC上的MSC膜允许它们与心肌细胞结合和相互作用。
实施例22
synMSC的冷冻保存和冻干稳定性：冷冻保存稳定性是细胞治疗产品的主要挑战之一。在这里，我们测试了快速冷冻和融化后synMSC的稳定性。荧光和白光显微术图像揭示了冷冻/融化处理不改变synMSC的结构(图15E)或尺寸(图15F)。流式细胞术分析示出了，冷冻前和冷冻后synMSC的表面抗原表达没有显著差异(图15G)。此外，我们测试了synMSC的冻干稳定性，并发现冻干过程不改变synMSC的结构、尺寸、表面抗原表达或持续的血管内皮生长因子释放。然而，MSC未能经历严酷的冷冻/融化过程而不诱导细胞死亡。在将冷冻/融化的synMSC或MSC注射到小鼠心脏中后，MSC被巨噬细胞靶向，而synMSC则不被巨噬细胞靶向(图15H和15I)。这些结果证明了synMSC优于真正的MSC的冷冻保存和冻干稳定性以及优点。
实施例23
synMSC注射减轻梗塞心脏的左心室重塑：为了测试synMSC的治疗效果，通过左前降支动脉结扎在小鼠中建立急性MI模型，并随后立即心肌内注射synMSC。阴性对照小鼠在MI后不接受治疗。
18F-氟脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描术/计算机断层扫描术(CT)在梗塞后1天(基线)和14天(终点)进行，以测量梗塞面积(图16A)。99mTc-替曲膦单光子发射CT/CT在梗塞后2天(基线)和15天(终点)进行，以测量左心室容积(图16A)。synMSC注射显示梗塞面积显著减少(图16B)。左心室容积变化在两组之间不可区分(图16B)。通过马松三色染色成像的左心室形态计量术揭示了synMSC和MSC治疗对心脏形态学的保护作用(图16C)。当与对照组相比时，synMSC和MSC治疗的小鼠的梗塞壁厚度增加(图16D)且梗塞尺寸减小(图16E)。
实施例24
synMSC注射促进梗塞心脏中的内源性修复：为了揭示synMSC的治疗益处的潜在机制，研究了synMSC注射是否招募更多c-kit阳性干细胞、促进血管发生、并改善梗塞心脏中的细胞增殖。在对照、synMSC和MSC治疗的小鼠的梗塞心脏中对c-kit(图17A)、CD34(图17B)和ki67(图17C)进行免疫染色分析。与对照相比，synMSC和MSC治疗增加了梗塞心脏的c-kit阳性干细胞招募(图17D)和血管密度(图17E)。与对照相比，增殖的细胞在synMSC治疗的小鼠的梗塞心脏中略有增加，但在MSC治疗的小鼠的梗塞心脏中显著增加(图17F)。这些结果表明，synMSC的治疗作用可能通过激活c-kit阳性干细胞和促进血管发生实现。

Claims (27)

1.一种干细胞仿生微粒，所述干细胞仿生微粒包含包埋在生物相容的聚合物核心微粒中的至少一种干细胞旁分泌因子和置于所述聚合物核心微粒上的干细胞的至少一个细胞膜片段的外层。
2.根据权利要求1所述的干细胞仿生微粒，其中所述微粒的生物相容的聚合物核心由单一种类的聚合物、多于一个生物相容的聚合物种类、嵌段共聚物或多于一个聚合物种类组成，并且其中所述聚合物核心的一种或更多种聚合物任选地被交联。
3.根据权利要求2所述的干细胞仿生微粒，其中所述微粒的生物相容的聚合物核心是生物可降解的。
4.根据权利要求1所述的干细胞仿生微粒，其中所述生物相容的聚合物核心包含聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)。
5.根据权利要求1所述的干细胞仿生微粒，其中所述至少一种干细胞旁分泌因子和一个或更多个所述细胞膜片段来自相同种类的干细胞。
6.根据权利要求1所述的干细胞仿生微粒，其中所述至少一种干细胞旁分泌因子和一个或更多个所述细胞膜片段来源于心脏干细胞。
7.根据权利要求1所述的干细胞仿生微粒，其中所述至少一种干细胞旁分泌因子和一个或更多个所述细胞膜片段来自不同种类的干细胞。
8.根据权利要求1所述的干细胞仿生微粒，其中所述至少一种干细胞旁分泌因子来自干细胞条件培养基。
9.根据权利要求1所述的干细胞仿生微粒，其中所述至少一种干细胞旁分泌因子是分离的旁分泌因子。
10.一种干细胞仿生微粒组合物，所述干细胞仿生微粒组合物包含根据权利要求1所述的干细胞仿生微粒和药学上可接受的载体。
11.根据权利要求10所述的干细胞仿生微粒组合物，其中所述组合物被配制成用于直接递送到受试动物或人类的靶组织中，或者用于向受试动物或人类的局部或全身性施用。
12.一种生成仿生微粒的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将包含至少一种干细胞旁分泌因子的水溶液与具有可聚合单体溶解在其中的有机相混合；
(b)将来自步骤(a)的混合物乳化；和
(c)将来自步骤(b)的乳液与水溶液混合，并允许所述有机相蒸发，从而生成具有所述至少一种干细胞旁分泌因子包埋在其中的聚合物微粒。
13.根据步骤12所述的方法，所述方法还包括以下步骤：
(i)获得分离的干细胞膜或其片段；和
(ii)通过将来自步骤(c)的聚合物微粒与分离的干细胞膜或其片段的悬浮液混合，生成干细胞膜包被的仿生微粒。
14.根据步骤12所述的方法，其中所述包含至少一种干细胞旁分泌因子的水溶液是干细胞条件培养基或至少一种分离的干细胞旁分泌因子的水溶液。
15.根据步骤13所述的方法，其中所述包含至少一种干细胞旁分泌因子的水溶液是心脏干细胞条件培养基，并且其中所述细胞膜片段从心脏干细胞分离。
16.根据步骤12所述的方法，其中所述第一可聚合单体的聚合物是聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)。
17.根据步骤12所述的方法，其中步骤(c)还包括将所述聚合物微粒冻干。
18.一种在有相应需要的患者中进行组织修复的方法，所述方法通过向所述患者递送包含干细胞仿生微粒的药学上可接受的组合物来进行，其中所述干细胞仿生微粒包含包埋在生物相容的聚合物核心微粒中的至少一种干细胞旁分泌因子和置于所述生物相容的聚合物核心微粒上的干细胞的至少一个细胞膜片段的外层。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述微粒的生物相容的聚合物核心由单一种类的聚合物、多于一个聚合物种类、嵌段共聚物或多于一个聚合物种类组成，并且其中所述聚合物核心的聚合物任选地被交联。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述微粒的所述聚合物核心是生物可降解的。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述聚合物核心包含聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)。
22.根据权利要求18所述的方法，其中所述至少一种干细胞旁分泌因子和一个或更多个所述细胞膜片段来自相同种类的干细胞。
23.根据权利要求18所述的方法，其中所述至少一种干细胞旁分泌因子和一个或更多个所述细胞膜片段来源于心脏干细胞。
24.根据权利要求18所述的方法，其中所述至少一种干细胞旁分泌因子和一个或更多个所述细胞膜片段来自不同种类的干细胞。
25.根据权利要求18所述的方法，其中所述至少一种干细胞旁分泌因子来自干细胞条件培养基。
26.根据权利要求18所述的方法，其中所述至少一种干细胞旁分泌因子是分离的旁分泌因子。
27.根据权利要求18所述的方法，其中所述药学上可接受的组合物被配制成用于直接递送到受试动物或人类的靶组织中，或者用于向受试动物或人类的局部或全身性施用。
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