CN109125707A - GnRH类似物缓释组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种GnRH类似物缓释组合物及其制备方法，属于医药技术领域。它由GnRH类似物及与GnRH类似物通过共价键连接的壳聚糖分子组成。本发明的GnRH类似物缓释组合物合成工艺简单，采用常规的合成条件即可实现大规模生产。并且其作为口服长效缓释制剂，不仅可以克服GnRH类似物在胃肠道容易降解而不能口服给药的问题，同时还延长了GnRH类似物在体内的作用时间，从而可以克服GnRH类似物必须长期频繁注射给药的问题，具有很强的实用性。

Description

GnRH类似物缓释组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及GnRH类似物，属于医药技术领域，具体地涉及一种GnRH类似物缓释组合物及其制备方法。
背景技术
促性腺激素释放激素(GnRH)是一种下丘脑分泌的多肽类激素，天然的GnRH分子由10个氨基酸组成，分子结构为Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2。大量研究证实，GnRH通过刺激黄体生成素与卵泡生成素的分泌，调节体内的内分泌系统和生殖系统。并且，GnRH透过自/旁分泌调节，还参与了多种良性和恶性肿瘤的发生与发展。因此，几十年来，许多人工合成的GnRH类似物，通过：(1)抑制性激素分泌，治疗激素依赖性疾病，如前列腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌和子宫内膜异位症等；(2)抑制促性腺激素分泌，使性腺暂停发育、性激素分泌回至青春前期状态，治疗性早熟；(3)控制促性腺激素分泌，控制并促进卵泡发育，治疗无排卵、多囊卵巢综合征，用于辅助生育技术；(4)局部作用于有GnRH受体的组织，应用于卵巢癌、乳腺癌、脑垂体瘤等恶性肿瘤。
目前，临床应用的GnRH类似物主要有曲普瑞林(Triptorelin，分子结构为Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2)、布舍瑞林(Buserelin，结构为5-oxo-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser-Leu-Arg-Pro-NHEt)、戈舍瑞林(Goserelin，分子结构为yr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2)、亮丙瑞林(Leuprorelin，分子结构为5-oxo-Pro-His-Trp-Ser-Thr-D-Leu-Leu-Arg-N-ethyl-Pro-NH2)和丙氨瑞林(Alarelin，分子结构为Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-NHCH3)等，它们在临床治疗子宫内膜异位症、子宫腺肌病、子宫肌瘤、妇科肿瘤等得到了广泛应用，获得了良好的效果。此外，BM106(结构为Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2)正在进行实验研究。
上述GnRH类似物均为多肽，像其它肽类激素一样，口服后在消化道易被消化降解，不能发挥作用，故需采用注射剂的形式皮下注射给药。又因这类药物生物半衰期短，必须反复注射，一般每日注射1次，周期3～6个月，病人不易坚持，而且每次注射后，还会引起体内促性腺素和性激素水平急剧波动，从而增加了患者身体、心理和经济上的负担。
许多现有的在长时间段缓慢释放的制剂的根本问题在现有技术中未考虑。显著地，许多GnRH类似物治疗需要给患者使用六个月或更长时间。许多现有制剂的制备相对复杂，相应的方法需要加入一种或多种赋形剂，或另外步骤，例如热融变和模压。另外的赋形剂常要求均匀度、稳定作用，以因此改善可塑性或固化该混合物，如果所要求的性能可以无需加入赋形剂获得将是有利的。可使用热融变和模压，以将活性成分排列在核心中。模压可能是必需的，因为在被引入至核心中以前，混合物被转化为固体。涉及这些步骤的制备方法的问题是相对复杂的，
中国发明专利申请(申请公布号：CN102413835A，申请公布日：2012-04-11)公开了包含GnRH类似物的缓释制剂，它包括至少一种GnRH类似物的控释和缓释的细长的植入剂，该植入剂包含生物可降解的聚合物或共聚物套，和在套中包含至少一种GnRH类似物的聚合物或共聚物核心，套的至少一端是开放的，和套在缓释期间降解。同上，在制备该植入剂的工艺时较复杂。
发明内容
为解决上述问题，本发明公开了一种既可口服长效缓释，同时其制备工艺相对简单的GnRH类似物缓释组合物及其制备方法。
为实现上述目的，本发明公开了一种GnRH类似物缓释组合物，它由GnRH类似物及与所述GnRH类似物通过共价键连接的壳聚糖分子组成。
具体的，GnRH类似物分子的一端通过共价键连接二元羧酸的一端，所述二元羧酸的另一端连接壳聚糖分子。
进一步地，所述共价键为酰胺键。
再进一步地，所述二元羧酸为丁二酸、丁二酸酐、戊二酸或戊二酸酐中的至少一种。
优选的，所述二元羧酸为丁二酸酐。
优选的，所述二元羧酸为丁二酸。
优选的，所述二元羧酸为戊二酸。
优选的，所述二元羧酸为戊二酸酐。
再进一步地，所述GnRH类似物为曲普瑞林、BM106、亮丙瑞林、戈舍瑞林、布舍瑞林、丙氨瑞林中的至少一种。
优选的，GnRH类似物缓释组合物为曲普瑞林(Triptorelin，TPR)通过二羧酸连接臂(R)与壳聚糖分子(CS)以共价偶联形式形成组合物，其结构通式为：TPR-R-CS。
优选的，GnRH类似物缓释组合物为BM106通过二羧酸连接臂(R)与壳聚糖分子(CS)以共价偶联形式形成组合物，其结构通式为：BM106-R-CS。
优选的，GnRH类似物缓释组合物为亮丙瑞林(Leuprorelin，LPR)通过二羧酸连接臂(R)与壳聚糖分子(CS)以共价偶联形式形成组合物，其结构通式为：LPR-R-CS。
优选的，GnRH类似物缓释组合物为戈舍瑞林(Goserelin，GSR)通过二羧酸连接臂(R)与壳聚糖分子(CS)以共价偶联形式形成组合物，其结构通式为：GSR-R-CS。
优选的，GnRH类似物缓释组合物为布舍瑞林(Buserelin，BSR)通过二羧酸连接臂(R)与壳聚糖分子(CS)以共价偶联形式形成组合物，其结构通式为：BSR-R-CS。
优选的，GnRH类似物缓释组合物为丙氨瑞林(Alarelin，ALR)通过二羧酸连接臂(R)与壳聚糖分子(CS)以共价偶联形式形成组合物，其结构通式为：ALR-R-CS。
为了更好的实现本发明的目的，本发明还公开了一种上述GnRH类似物缓释组合物的制备方法，其特征在于：将GnRH类似物与二元羧酸反应后再与壳聚糖分子反应，后处理后即制备得到GnRH类似物缓释组合物。
进一步地，所述反应为室温下搅拌反应。
再进一步地，所述后处理为超滤纯化及冻干。
本发明的有益效果主要体现在如下几个方面：
1、本发明设计的组合物利用壳聚糖(chitosan，CS)良好的生物相容性、生物黏附性和低毒等特点，将其作为GnRH类似物的优良载体，可起到缓释GnRH类似物的目的；
2、本发明设计的组合物在动物体内，0～12h之间血药浓度逐渐升高，12h后开始下降，直到72h，血液样品中依然能够检测到GnRH类似物，这说明本发明的组合物可实现在体内缓慢释放的目的；
3、本发明设计的组合物不仅可克服GnRH多肽类似物在胃肠道容易降解而不能口服给药的问题，同时还延长了GnRH多肽类似物在体内的作用时间，从而可以克服GnRH多肽类似物必须长期频繁注射给药的问题，具有很强的实用性，故可作为口服长效缓释制剂。
4、本发明设计的组合物的制备方法在室温下操作即可，对反应环境要求不高，且生产产率较高，故该制备方法可实现批量生产。
附图说明
图1-1为本发明实施例1制得的GnRH类似物缓释组合物在体外释放曲线；
图1-2为本发明实施例2制得的GnRH类似物缓释组合物在体外释放曲线；
图1-3为本发明实施例3制得的GnRH类似物缓释组合物在体外释放曲线；
图1-4为本发明实施例4制得的GnRH类似物缓释组合物在体外释放曲线；
图1-5为本发明实施例5制得的GnRH类似物缓释组合物在体外释放曲线；
图1-6为本发明实施例6制得的GnRH类似物缓释组合物在体外释放曲线；
图1-7为本发明实施例7制得的GnRH类似物缓释组合物在体外释放曲线；
图1-8为本发明实施例8制得的GnRH类似物缓释组合物在体外释放曲线；
图1-9为本发明实施例9制得的GnRH类似物缓释组合物在体外释放曲线；
图1-10为本发明实施例10制得的GnRH类似物缓释组合物在体外释放曲线；
图1-11为本发明实施例11制得的GnRH类似物缓释组合物在体外释放曲线；
图1-12为本发明实施例12制得的GnRH类似物缓释组合物在体外释放曲线；
图2-1为本发明实施例1和实施例2制得的GnRH类似物缓释组合物经动物灌胃后在血中的药时曲线；
图2-2为本发明实施例3和实施例4制得的GnRH类似物缓释组合物经动物灌胃后在血中的药时曲线；
图2-3为本发明实施例5和实施例6制得的GnRH类似物缓释组合物经动物灌胃后在血中的药时曲线；
图2-4为本发明实施例7和实施例8制得的GnRH类似物缓释组合物经动物灌胃后在血中的药时曲线；
图2-5为本发明实施例9和实施例10制得的GnRH类似物缓释组合物经动物灌胃后在血中的药时曲线；
图2-6为本发明实施例11和实施例12制得的GnRH类似物缓释组合物经动物灌胃后在血中的药时曲线。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
实施例1：曲普瑞林-丁二酰基-壳聚糖(TPR-S-CS)的合成：
将0.5g曲普瑞林和0.12g丁二酸酐溶入于6mL CH2Cl2中，室温下搅拌反应24h后，加9mL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，再加0.1mL N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)，室温下反应4h，加88mL DMF后，边搅拌边加0.66g壳聚糖，继续在室温下反应12h，超滤，冻干，得白色固体物TPR-S-CS。
实施例2：曲普瑞林-戊二酰基-壳聚糖(TPR-G-CS)的合成：
将0.5g曲普瑞林和0.2g戊二酸酐溶入于6mL CH2Cl2中，室温下搅拌反应12h后，加9mL DMF，再加0.1mL DIPEA，室温下反应4h，加88mL DMF后，边搅拌边加0.66g壳聚糖，继续在室温下反应12h，超滤，冻干，得白色固体物TPR-G-CS。
实施例3：BM106-丁二酰基-壳聚糖(BM106-S-CS)的合成：
将0.52g BM106和0.12g丁二酸酐溶入于6mL CH2Cl2中，室温下搅拌反应12h后，加9mL DMF，再加0.1mL DIPEA，室温下反应4h，加88mL DMF后，边搅拌边加0.66g壳聚糖，继续在室温下反应12h，超滤纯化，冻干，得白色固体物BM106-S-CS。
实施例4：BM106-戊二酰基-壳聚糖(BM106-G-CS)的合成：
将0.52g BM106和0.2g戊二酸酐溶入于6mL CH2Cl2中，室温下搅拌反应12h后，加9mL DMF，再加0.1mL DIPEA，室温下反应4h，加88mL DMF后，边搅拌边加0.66g壳聚糖，继续在室温下反应12h，超滤纯化，冻干，得白色固体物BM106-G-CS。
实施例5：亮丙瑞林-丁二酰基-壳聚糖(LPR-S-CS)的合成：
将0.5g亮丙瑞林和0.12g丁二酸酐溶入于6mL CH2Cl2中，室温下搅拌反应12h后，加9mL DMF，再加0.1mL DIPEA，室温下反应4h，加88mL DMF后，边搅拌边加0.66g壳聚糖，继续在室温下反应12h，超滤纯化，冻干，得白色固体物LPR-S-CS。
实施例6：亮丙瑞林-戊二酰基-壳聚糖(LPR-G-CS)的合成：
将0.5g亮丙瑞林和0.2g戊二酸酐溶入于6mL CH2Cl2中，室温下搅拌反应12h后，加9mL DMF，再加0.1mL DIPEA，室温下反应4h，加88mL DMF后，边搅拌边加0.66g壳聚糖，继续在室温下反应12h，超滤纯化，冻干，得白色固体物LPR-G-CS。
实施例7：戈舍瑞林-丁二酰基-壳聚糖(GSR-S-CS)的合成：
将0.5g戈舍瑞林和0.12g丁二酸酐溶入于6mL CH2Cl2中，室温下搅拌反应12h后，加9mL DMF，再加0.1mL DIPEA，室温下反应4h，加88mL DMF后，边搅拌边加0.66g壳聚糖，继续在室温下反应12h，超滤纯化，冻干，得白色固体物GSR-S-CS。
实施例8：戈舍瑞林-戊二酰基-壳聚糖(GSR-G-CS)的合成：
将0.5g布舍瑞林和0.2g戊二酸酐溶入于6mL CH2Cl2中，室温下搅拌反应12h后，加9mL DMF，再加0.1mL DIPEA，室温下反应4h，加88mL DMF后，边搅拌边加0.66g壳聚糖，继续在室温下反应12h，超滤纯化，冻干，得白色固体物GSR-G-CS。
实施例9：布舍瑞林-丁二酰基-壳聚糖(BSR-S-CS)的合成：
将0.5g布舍瑞林和0.12g丁二酸酐溶入于6mL CH2Cl2中，室温下搅拌反应12h后，加9mL DMF，再加0.1mL DIPEA，室温下反应4h，加88mL DMF后，边搅拌边加0.66g壳聚糖，继续在室温下反应12h，超滤纯化，冻干，得白色固体物BSR-S-CS。
实施例10：布舍瑞林-戊二酰基-壳聚糖(BSR-G-CS)的合成：
将0.5g布舍瑞林和0.2g戊二酸酐溶入于6mL CH2Cl2中，室温下搅拌反应12h后，加9mL DMF，再加0.1mL DIPEA，室温下反应4h，加88mL DMF后，边搅拌边加0.66g壳聚糖，继续在室温下反应12h，超滤纯化，冻干，得白色固体物BSR-G-CS。
实施例11：丙氨瑞林-丁二酰基-壳聚糖(ALR-S-CS)的合成：
将0.5g丙氨瑞林和0.12g丁二酸酐溶入于6mL CH2Cl2中，室温下搅拌反应12h后，加9mL DMF，再加0.1mL DIPEA，室温下反应4h，加88mL DMF后，边搅拌边加0.66g壳聚糖，继续在室温下反应12h，超滤纯化，冻干，得白色固体物ALR-S-CS。
实施例12：丙氨瑞林-戊二酰基-壳聚糖(ALR-G-CS)的合成：
将0.5g丙氨瑞林和0.2g戊二酸酐溶入于6mL CH2Cl2中，室温下搅拌反应12h后，加9mL DMF，再加0.1mL DIPEA，室温下反应4h，加88mL DMF后，边搅拌边加0.66g壳聚糖，继续在室温下反应12h，超滤纯化，冻干，得白色固体物ALR-G-CS。
实施例13：体外释放试验：
分别称取上述5mg上述实施例1～实施例12制备的TPR-S-CS、TPR-G-CS、BM106-S-CS、BM106-G-CS、LPR-S-CS、LPR-G-CS、GSR-S-CS、GSR-G-CS、BSR-S-CS、BSR-G-CS、ALR-S-CS或ALR-G-CS各组合物，分别溶入5mL鼠血浆(Rat plasma)、含1％(质量百分比)胰酶的肠液(SIF，pH＝7.5)或含0.32％(质量百分比)胃蛋白酶的胃液(SGF，pH＝1.2)中，密封，置于37℃恒温水浴，然后，在不同时间(1h、2h、4h、8h、16h、24h、32h和48h)点上，取100μL样品，采用HPLC法测量释放到介质中的各GnRH类似物(曲普瑞林、BM106、亮丙瑞林、戈舍瑞林、布舍瑞林或丙氨瑞林)含量，计算不同时间点的累积释药百分率(％)，并绘制释药时间曲线。结果如图1-1、图1-2、图1-3、图1-4、图1-5、图1-6、图1-7、图1-8、图1-9、图1-10、图1-11和图1-12所示，在血浆和肠液中，GnRH类似物缓释组合物的释药较慢，至到48h时，累积释药率分别约为90％和75％左右。而在37℃的胃液中，由于强酸和胃蛋白酶的作用，GnRH类似物从组合物中释放较快，在16h内，累积释药率超过95％，这说明GnRH类似物缓释组合物在胃液中完全释放出来，也说明在正常生理条件下，GnRH类似物与碱性的壳聚糖之间的二羧酸连接臂被裂解，GnRH类似物能够从缓释组合物中游离出来。同时，上述体外释药曲线也显示GnRH类似物缓释组合物体外能够持续释药，具有明显的缓释作用。
实施例14：动物体内药代动力学研究：
选择体重为200～250g的Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠为实验动物。按10mg/kg的经胃管灌胃给与TPR-S-CS、TPR-G-CS、BM106-S-CS、BM106-G-CS、LPR-S-CS、LPR-G-CS、GSR-S-CS、GSR-G-CS、BSR-S-CS、BSR-G-CS、ALR-S-CS或ALR-G-CS，分别于在给药后的0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h、72h断尾取血(0.5～0.8mL)，EDTA-Na2抗凝，离心(4000rmp，10min)，取上清液，采用HPLC法测量样品中的GnRH类似物(曲普瑞林、BM106、亮丙瑞林、戈舍瑞林、布舍瑞林或丙氨瑞林)含量，计算不同时间点的血药浓度(ng/mL)，并绘制药时曲线。结果如图2-1、图2-2、图2-3、图2-4、图2-5及图2-6所示，经大鼠灌胃给与GnRH类似物缓释组合物1h后，血液样品中检测出GnRH类似物(曲普瑞林、BM106、亮丙瑞林、戈舍瑞林、布舍瑞林或丙氨瑞林)，随时间延长，血药浓度逐渐升高，12h后开始下降，直到72h，血液样品中依然能够检测到GnRH类似物，这说明组合物缓慢释放GnRH类似物使血药浓度维持较长时间。
实施例15：动物异位子宫内膜药效试验：
选择体重为200～250g的Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠为实验动物。取动情周期4～5天并连续有2个动情周期的大鼠，在其动情期内，采用外科自体移植术建立子宫内膜异位症动物模型。手术后第4周，再次剖腹观察移植物的生长情况，选择种植处异位内膜生长良好且可见黄色液体内容物囊泡的大鼠为实验对象。给药前测量囊泡的长度(L)与宽度(W)，按公式：V＝L×W2×0.5计算异位内膜体积(V0)后，随机分为GnRH类似物缓释组合物实验组、切除双侧卵巢去势组和壳聚糖对照组。其中，组合物实验组动物按10mg/kg的剂量，经胃管灌胃给与TPR-S-CS、TPR-G-CS、BM106-S-CS、BM106-G-CS、LPR-S-CS、LPR-G-CS、GSR-S-CS、GSR-G-CS、BSR-S-CS、BSR-G-CS、ALR-S-CS或ALR-G-CS，对照组动物按5mg/kg的剂量，经胃管灌胃给与10mg/kg壳聚糖。4周后处死动物，剖腹观察移植物的生长情况。取下病灶组织，测量囊泡的长与宽，计算异位子宫内膜体积(V1)，按公式：I＝(1-V1/V0)×100％计算药物对异位子宫内膜的生长抑制率，结果列于下表1：
表1：各组对抑制大鼠异位子宫内膜的生长作用比较
由上表1可知，壳聚糖对照组动物的异位内膜在实验结束时体积(V1＝95.02±21.22mm3)较给药前体积(V0＝38.26±7.30mm3)明显增大，呈增长趋势，异位子宫内膜的生长抑制率为-145.49±7.12，提示壳聚糖对动物异位内膜生长的无抑制作用。GnRH类似物缓释组合物实验组大鼠异位内膜在实验结束时体积(V1)较给药前体积(V0)明显缩小，增长趋势受到明显抑制，TPR-S-CS、TPR-G-CS、BM106-S-CS、BM106-G-CS、LPR-S-CS、LPR-G-CS、GSR-S-CS、GSR-G-CS、BSR-S-CS、BSR-G-CS、ALR-S-CS和ALR-G-CS的异位子宫内膜生长抑制率(％)分别为74.67±9.01、84.34±3.44、75.86±3.59、80.14±2.40、74.33±1.76、80.35±0.67、73.09±1.61、77.84±4.15、79.49±0.29、79.91±0.12、76.51±0.62和82.44±0.63，这表明组合物对异位子宫内膜的生长有明显抑制作用。此外，切除双侧卵巢的去势组动物，可见异位子宫内膜较去势前明显缩小，其异位内膜生长抑制率为78.66±0.15％，显示动物双侧卵巢切除去势后，异位内膜的增长也受到明显抑制。进一步比较，发现GnRH类似物缓释组合物实验组与去势组动物的异位内膜生长抑制率之间无明显差异，说明GnRH类似物缓释组合物的治疗效果可达去势水平。
结合以上实施例及说明书附图可知，本发明制备的GnRH类似物缓释组合物作为口服长效缓释制剂，不仅可以克服GnRH多肽类似物在胃肠道容易降解而不能口服给药的问题，同时还延长了GnRH多肽类似物在体内的作用时间，从而可以克服GnRH多肽类似物必须长期频繁注射给药的问题，具有很强的实用性。此外，本发明制备GnRH类似物缓释组合物的合成工艺简单，采用常规的合成条件即可实现大规模生产。
以上实施例仅为最佳举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。除上述实施例外，本发明还有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (7)

1.一种GnRH类似物缓释组合物，它由GnRH类似物、壳聚糖分子通过共价键连接组成。
2.根据权利要求1所述GnRH类似物缓释组合物，其特征在于：所述GnRH类似物为曲普瑞林、BM106、亮丙瑞林、戈舍瑞林、布舍瑞林或丙氨瑞林中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述GnRH类似物缓释组合物，其特征在于：所述共价键为酰胺键。
4.一种权利要求1所述GnRH类似物缓释组合物的制备方法，包括将GnRH类似物与二元羧酸反应后再与壳聚糖分子反应，后处理即制备得到GnRH类似物缓释组合物。
5.根据权利要求4所述GnRH类似物缓释组合物的制备方法，其特征在于：所述二元羧酸为丁二酸、丁二酸酐、戊二酸或戊二酸酐中的至少一种。
6.根据权利要求4所述GnRH类似物缓释组合物的制备方法，其特征在于：所述反应为室温下搅拌反应。
7.根据权利要求4所述GnRH类似物缓释组合物的制备方法，其特征在于：所述后处理为超滤纯化及冻干。
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