CN101792484A - 含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的蒽环型衍生物 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物与医药技术领域。更具体的说它涉及含酪-异亮-甘-丝-精氨酸的多肽和蛋白质及其衍生物与蒽环类药物共价连接所形成的偶联化合物及其制备方法。这些共价偶联化合物能主动靶向性定向于具有67kDa层粘连蛋白受体表达的各种肿瘤。其通式如下：Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-AN，Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg表示酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸五肽序列，AN表示蒽环类化合物。本发明能与细胞67kDa层粘连蛋白受体结合，选择性地输送蒽环类抗肿瘤药物到达体内的靶组织，以增加病灶局部药物浓度，提高疗效和降低毒副作用，达到靶向治疗的目的。
Description
技术领域
本发明属于生物与医药技术领域。更具体的说它涉及含酪-异亮-甘-丝-精氨酸的多肽和蛋白质及其衍生物与蒽环类药物共价连接所形成的偶联化合物及其制备方法。这些共价偶联化合物能主动靶向性定向于具有67kDa层粘连蛋白受体表达的各种肿瘤。
背景技术
以阿霉素为代表的蒽环类抗肿瘤抗生素是临床上广泛使用的一类化疗药物。目前在临床上使用的蒽环类药物有：阿霉素(doxorubicin，DOX，多柔比星，adriamycin，ADM)、柔红霉素(daunorubicin，柔红比星，daunomycin，DNR)、表阿霉素(epirubicin，EPI，表柔比星)、吡柔比星(pirarubicin，吡喃阿霉素，perarubicin)、阿克拉霉素(aclarubicin)、去甲氧柔红霉素(idarubicin，伊达柔比星，demethoxydaunorubicin，IDA)、米托蒽醌(mitoxatrone)和替洛蒽醌(teloxantrone，moxantrazole)等。因它们的化学结构中含有蒽醌基团而得名。此类药物的主要作用机理是：(1).嵌入到DNA双螺旋的碱基对之间，与DNA形成非共价键结合，破坏DNA的结构和功能，阻断细胞DNA复制；(2).通过结合拓扑异构酶II并与其发生反应来抑制该酶活性，阻止细胞DNA的复制；(3).抑制DNA依赖的RNA多聚酶，干扰转录过程，阻止RNA尤其是mRNA和蛋白质合成；(4).与细胞膜的磷脂结合，损害存在于细胞膜上的酶如腺苷酸环化酶，造成细胞生长抑制等。试验证明，蒽环类抗生素既抑制DNA的合成又抑制RNA的合成，对细胞周期各阶段均有作用，为细胞周期非特异性的广谱抗肿瘤药物。正是由于它们具有抗瘤谱广、临床疗效高、对乏氧细胞有效等显著特点，已被临床上广泛用于治疗包括肝癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、白血病、非何杰森氏淋巴瘤等多种恶性肿瘤。目前，蒽环类药物已经成为多种临床化疗方案中的核心药物。
蒽环类药物分子量低，进入机体后容易迅速扩散。由于其在体内药物行为仅由药物理化性质及人体解剖生理学特点所决定，不能选择性地分辨肿瘤细胞和正常细胞，缺乏对肿瘤细胞的靶向性，从而产生相对平均的全身组织分布，肿瘤细胞内不能累积超过正常组织细胞更高的药物浓度。这样，它们在对肿瘤细胞发挥作用的同时，往往造成对正常组织的非特异性损害，使人体产生骨髓抑制、胃肠道反应、脱发等毒性副反应。蒽环类药物最为显著和突出的毒性作用是不可逆的剂量累积性心脏损害。这类药物产生的心脏毒性按其发病及进展情况可分为以下类型：①急性心脏毒性反应。可发生于治疗过程或结束用药后几周～几月，表现为扩张性心肌病、心律异常、心衰或猝死。②慢性(亚急性)剂量累积性心脏毒性，常发生在治疗后数周～数年。主要是左心室功能受损，并可导致心力衰竭。③迟发性心功能不全，发生于停药4～20年。蒽环类抗肿瘤药的心脏毒副反应存在明显的剂量依赖性和不可逆性，据报道，当蒽环类药物总量＜400mg/m2体表面积时，充血性心力衰竭的发生率仅为0.14％，而当剂量累积增加至550、700mg/m2体表面积时，则发生率分别陡升至7％和8％，主要表现为充血性心力衰竭和扩张型心肌病。由于越来越多的实验数据表明蒽环类抗肿瘤药物的心脏毒性比其他副作用更危险，因此，它们在临床上的应用受到了严格地限制。为了增加蒽环类抗肿瘤药物的有效利用，提高它们的抗肿瘤作用以及克服药物的毒性副作用，利用肿瘤细胞比非肿瘤细胞(正常组织细胞)中有更高表达和/或异常表达的受体作为靶点，借助配体-受体的结合具有高特异性、高选择性和高亲和力等生物学特性，将配体作为药物载体与蒽环类药物结合形成载体-药物复合物。载体-药物复合物进入体内后，识别肿瘤细胞膜上高度表达和/或异常表达的受体并与其结合，通过细胞受体的介导，载体-药物复合物被细胞摄取进入细胞内。在细胞内，由于细胞酶的作用，蒽环类药物与载体分离并被释放。这样，在肿瘤细胞内可以积聚高浓度的蒽环类药物使其发挥抗肿瘤作用。与此同时，由于该受体在正常组织细胞中没有表达或是低表达，载体-药物复合物不能或很少与这种受体结合，细胞就不摄取或仅摄取少量的药物，从而改变了药物的分布状态，显著降低这类药物对正常组织产生的损害，可以有效克服蒽环类抗肿瘤药物对机体产生的毒性副作用。因此，利用上述原理，设计能使蒽环类药物靶向分布于肿瘤细胞的药物分子或药物传递系统，是目前抗肿瘤治疗中最活跃的研究领域之一。利用配体-受体反应靶向输送抗肿瘤药物，需要该受体在靶细胞(肿瘤细胞)中比其他非靶细胞(正常组织细胞)有更高的表达，才能通过配体-受体途径使靶细胞摄取高浓度的药物，并与非靶细胞所摄取的药物浓度形成明显差异以实现抗肿瘤药物的定向输送。随着对肿瘤分子水平研究的不断深入，与非肿瘤细胞相比，在许多临床上常见的许多恶性肿瘤，如：乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰癌、前列腺癌及甲状腺癌等细胞表面都发现67kDa层粘连蛋白受体(67kDa laminin receptor，以下简称为”67LR”)高度表达或过度表达的数据。例如：在大多数非小细胞肺癌的细胞膜发现67LR的表达呈现过度表达，并且发现67LR的表达水平与淋巴结转移呈正相关。在结肠癌病人中，肿瘤细胞的67LR表达水平比癌旁组织更高，而且与肿瘤的进展和分期呈正相关。在对胃癌患者67LR表达的研究中发现，肿瘤浸润深度与67LR的表达存在密切的关系。人们应用RT-PCR技术分析肝癌中67LR的表达均显著高于非癌组织。转移性肝癌67LR无论在蛋白水平还是在mRNA水平上的表达均显著高于非转移性肝癌，说明67LR在肝癌的转移中起着非常重要的作用。在卵巢癌中，67LR在mRNA及蛋白水平的表达均升高，并且发现卵巢癌临床预后较差的病人67LR呈过度表达。所以，67LR是一种非常理想的靶向性抗肿瘤药物特异性识别和结合的靶点。许多实验结果表明，67LR已成为相关肿瘤治疗研究的重要靶标，显示了针对67LR靶向治疗的广阔前景。
67LR是存在于细胞膜上的跨膜糖蛋白。1983年Terranova等首次在人类乳腺癌细胞中发现67LR。与该受体结合的配体是层粘连蛋白。67LR与LN的结合表现出高亲和性、高选择性和高特异性等生物特性。在人体内，LN是细胞外基质中的非胶原蛋白，主要存在于基膜的透明层，紧靠细胞基底面。LN的基本功能是参与细胞外基质体系的构建、细胞黏附和扩展。LN能与细胞外基质中许多大分子如基底膜蛋白聚糖、巢蛋白和胶原相互作用而形成一个聚合的基质网络。在基质中，巢蛋白的N端与IV型胶原结合，形成LN-IV型胶原的桥，这是形成细胞外基质超大分子结构的基础。而LN与其受体之间的相互作用会触发细胞内一系列的信号传导，从而导致细胞行为的改变包括细胞黏附、迁移和分化等。研究发现，LN和神经轴突的生长及血管发生有关，还与肿瘤浸润、转移等有关。LN分子是由一条重链(α链)及二条轻链(β，γ链)组成的不对称十字形结构的异三聚体。LN分子中含有一些特异性结构序列，其中，尤以LN分子中β链短臂杆状区所含有的一段酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸五肽序列(Tyr(Y)-Ile(I)-Gly(G)-Ser(S)-Arg(R)，简称”YIGSR”)受到特别关注。这段YIGSR多肽序列处于LN分子中929～932位，也是本发明的核心。1987年Graf等人发现LN的β链YIGSR序列是67LR的识别位点，也是67LR与LN结合的特异性位点。人工合成的YIGSR五肽可以与LN竞争结合67LR，从而抑制小鼠黑色素瘤细胞B16F10体内的肺转移。Yudoh等人报道YIGSR能与LN竞争结合67LR，从而抑制肿瘤细胞与LN的粘附以及瘤细胞在LN中的迁移。有报道YIGSR多肽能竞争性地与肺癌细胞上的67LR结合，使肺癌细胞不能与LN结合导致癌细胞的转移能力下降。另外，有研究发现YIGSR肽还具有抗肿瘤血管生成的作用，不但抑制肿瘤转移灶，而且抑制肿瘤原发灶的生长。使用YIGSR肽的衍生物，可以避免YIGSR受到体内某些酶的破坏，延长其在体内的存留时间，更好地发挥抗肿瘤效果。尽管YIGSR多肽具有多种生物功能，但使用YIGSR多肽及其衍生物作为载体与蒽环类抗肿瘤药物偶联形成靶向性抗肿瘤药物，至今仍未见相关报道。YIGSR多肽及其衍生物作为肿瘤靶向性蒽环类药物载体，具有以下优点：
1)、现已发现，67LR分子在许多恶性肿瘤细胞上都存在有高度表达或过度表达，67LR为肿瘤的分子靶向治疗提供了非常理想的特异性识别和结合的靶点。并且，YIGSR多肽及其衍生物与67LR的结合具有高亲和力、高特异性和高选择性等优异特点。因此，YIGSR多肽及其衍生物是十分有效的分子靶向性抗肿瘤药的导向载体。
2)、YIGSR多肽及其衍生物与蒽环类药物之间可有多种结合方式进行偶联，它们之间可以以较牢固的共价键结合，亦可以以较为松散的结合键方式来结合。为YIGSR多肽-蒽环类药物化合物的合成提供多种选择性。载体与药物进行连接形成化合物进入体内后，通过受体介导的细胞内吞作用进入细胞内与溶酶体结合，由于溶酶体与胞浆及胞外环境的显著差异，以及胞内丰富的水解酶、酯酶等多种酶的作用，YIGSR多肽及其衍生物与蒽环类药物之间的结合键发生断裂，药物能迅速从载体上解离下来，恢复其固有的性质，发挥其药理作用。
3)、在血中，小分子蒽环类药物进入体内后随血液循环到达全身组织，经被动扩散方式很快进入各组织细胞内，血中药物浓度迅速地下降。而YIGSR多肽及其衍生物与蒽环类药物偶联化合物进入体内后，不能经过简单被动扩散方式进入细胞内，需与细胞膜上的67LR结合，通过67LR介导，细胞以胞吞作用方式摄取偶联化合物。由于细胞吸收偶联化合物与细胞67LR的表达水平相关，大量没有67LR表达或低表达的正常组织细胞不能摄取或很少摄取药物，使得偶联化合物在血液中的浓度下降缓慢。因此，偶联化合物在血液中可以维持比没有偶联的小分子蒽环类药物有更持久、更高的药物浓度，这样的结果对药物发挥抗肿瘤作用非常有利。YIGSR多肽及其衍生物与蒽环类药物偶联化合物进入体内后，改变了药物在体内的分布形态。由于细胞吸收偶联化合物与细胞67LR的表达水平相关，大量没有67LR表达或低表达的正常组织细胞不能摄取或很少摄取药物，极大地降低了药物在正常组织内的分布，使药物对正常组织产生的损害降到最低。在肿瘤组织中，蒽环类抗肿瘤药物因为相对平均地分布到全身各处组织的缘故，肿瘤细胞内的药物含量非常有限，严重地影响了这类药物的抗肿瘤治疗价值。另一方面，YIGSR多肽及其衍生物与蒽环类药物偶联化合物能够选择性地识别67LR过度表达的肿瘤细胞，67LR高度表达的肿瘤细胞中积聚高浓度药物，极大地提高了药物的抗肿瘤作用。
4)、随着现代生物技术的发展，目前研究较多的药物载体有脂质体、病毒、多聚复合物和蛋白质等。与其它药物载体相比，YIGSR多肽是人体自身存在，广泛分布于人体全身各处，参与人体正常生理活动的物质。众所周知，多肽进入细胞后可以被分解成氨基酸为细胞利用，所以YIGSR多肽对人体是无毒的。而YIGSR多肽无抗原性，无免疫原性，不会对人体产生过敏反应，同时，YIGSR多肽-药物复合物进入体内后也不受免疫系统的影响。并且，YIGSR多肽-药物复合物属于主动性分子靶向，肿瘤的靶向特异性更强。总之，YIGSR多肽-药物复合物具有更多的优越性和更广阔的前景。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有蒽环类抗肿瘤药物所产生的毒性副作用，增强蒽环类化合物的抗肿瘤效果，提供一种含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的蒽环型衍生物。它能与细胞67kDa层粘连蛋白受体结合，选择性地输送蒽环类抗肿瘤药物到达体内的靶组织，以增加病灶局部药物浓度，提高疗效和降低毒副作用，达到靶向治疗的目的。
本发明的技术方案是这样实现的：它是含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的化合物，是由酪-异亮-甘-丝-精氨酸五肽及其衍生物与蒽环类化合物共价结合形成蒽环型衍生物，它具有识别细胞细胞67kDa层粘连蛋白受体并与该受体结合的能力。其通式如下：Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-AN，Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg表示酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸五肽，AN表示蒽环类化合物。
本发明的技术方案是通式如下的化合物：Z1-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Z1-AN，Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg表示酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸五肽，AN表示蒽环类化合物，Z1和Z2分别选自氢、羟基、氨基、酯基、硫醚、硫醇、羧基、羰基、卤素、硝基、氰基、芳烷基、芳基、饱和或不饱和的杂环基团。
本发明优选的技术方案是Z1和Z2分别选自甲苯璜酰基、三氟甲璜酚酯、三氟乙酸酯、一或二苄化氨基、酰化氨基、三氟酰基、三氟酰化氨基、吗啉代、氰基取代的吗啉代、一、二、三或四-甲氧基取代的吗啉代、一、二、三或四-酰氧基取代的吗啉代、C1-C16酰基、C1-C16芳基酰基、酰基、C1-C16酰氧基、酰氧基、酰胺基、C1-C16烷基、C1-C16烷氧基、烷氧基烷基、烃烷基、芳烷基、芳烷氧基烷基、C1-C16芳基氨基羰基、C1-C16芳基氨基硫代羰基、C3-C8环烷基、C3-C8烷基二羧酸基团或羰基或硫代羰基、单糖或多聚糖。
本发明涉及的含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的化合物，是在酪-异亮-甘-丝-精氨酸五肽分子中增加了一个氨基酸或者任意长度氨基酸序列的多肽及其衍生物。它们与蒽环类化合物共价结合形成蒽环型衍生物，具有识别细胞67kDa层粘连蛋白受体并与该受体结合的能力。其通式如下：Z1-Aaa1-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Aaa2-Z2-AN，其中，Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg为酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸五肽；Aaa1表示一个或者任意长度的氨基酸多肽及其衍生物，Aaa2表示一个或者任意长度的氨基酸多肽及其衍生物，Aaa1和Aaa2可以相同或不同；AN为蒽环类化合物。
本发明涉及的蒽环类化合物是阿霉素(英文名称：doxorubicin，adriamycin)或者是阿霉素的衍生物，与含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的化合物共价结合所形成的蒽环型衍生物，具有识别细胞67kDa层粘连蛋白受体并与该受体结合的能力。其通式如下：Z1-Aaa1-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Aaa2-Z2-DOX。
本发明涉及的蒽环类化合物是表阿霉素(英文名称：epirubicin)或者是表阿霉素的衍生物，与含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的化合物共价结合所形成的蒽环型衍生物，具有识别细胞67kDa层粘连蛋白受体并与该受体结合的能力。其通式如下：Z1-Aaa1-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Aaa2-Z2-EPI。
本发明涉及的蒽环类化合物是柔红霉素(英文名称：daunorubicin，daunomycin)或者是柔红霉素的衍生物，其通式如下：Z1-Aaa1-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Aaa2-Z2-DNR。
本发明涉及的蒽环类化合物是吡柔比星(英文名称：pirarubicin)或者是吡柔比星的衍生物，其通式如下：Z1-Aaa1-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Aaa2-Z2-PIR。
本发明涉及的蒽环类化合物是去甲氧柔红霉素(英文名称：idarubicin，demethoxydaunorubicin)或者是去甲氧柔红霉素的衍生物，其通式如下：Z1-Aaa1-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Aaa2-Z2-IDA。
本发明涉及的蒽环类化合物是阿克拉霉素(英文名称：aclarubicin)或者是阿克拉霉素的衍生物，其通式如下：Z1-Aaa1-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Aaa2-Z2-ACL。
本发明涉及的蒽环类化合物是米托蒽醌(英文名称：mitoxatrone)或者是米托蒽醌的衍生物，其通式如下：Z1-Aaa1-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Aaa2-Z2-MIT。
本发明涉及的蒽环类化合物是替洛蒽醌(英文名称：moxantrazole)或者是替洛蒽醌的衍生物，其通式如下：Z1-Aaa1-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Aaa2-Z2-MOX。
本发明提供的含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的蒽环型衍生物能与细胞67kDa层粘连蛋白受体结合，选择性地输送蒽环类化合物到达体内细胞67kDa层粘连蛋白受体高度或过度表达的靶组织，以增加病灶局部药物浓度，提高疗效和降低毒副作用，达到靶向治疗的目的。
附图说明
图1A-图1C为酪-异亮-甘-丝-精-阿霉素不同取代基化合物的分子结构图。
图2A-图2C半胱-天冬-脯-甘-酪-异亮-甘-丝-精-阿霉素不同取代基化合物的分子结构图。
图3A-图3C乙酰-酪-异亮-甘-丝-精-阿霉素不同取代基化合物的分子结构图。
图4A-图4C酪-异亮-甘-丝-精-表阿霉素不同取代基化合物的分子结构图。
图5不同pH环境对酪-异亮-甘-丝-精-戊二酰基-14-氧-阿霉素化合物稳定性的影响曲线图。
图6：蛋白免疫印迹(Western Blot)法测定细胞67kDa层粘连蛋白受体的表达图。
图7A-图7B：不同67kDa层粘连蛋白受体表达水平的细胞，吸收阿霉素(DOX)和酪-异亮-甘-丝-精-戊二酰基-14-氧-阿霉素化合物(YIGSR-glt-14-O-DOX)的比较图。
图8：层粘连蛋白(LN)对细胞吸收阿霉素(DOX)和酪-异亮-甘-丝-精-戊二酰基-14-氧-阿霉素化合物(YIGSR-glt-14-O-DOX)的竞争性抑制作用图。
图9：共焦荧光显微镜观察阿霉素(DOX)和酪-异亮-甘-丝-精-戊二酰基-14-氧-阿霉素化合物在体外培养细胞内的分布图。
图10A-图10F阿霉素(DOX)和酪-异亮-甘-丝-精-戊二酰基-14-氧-阿霉素化合物(YIGSR-glt-14-O-DOX)在荷瘤小鼠体内的分布图。
图11A-图11B：阿霉素(DOX)和酪-异亮-甘-丝-精-戊二酰基-14-氧-阿霉素化合物(YIGSR-glt-14-O-DOX)对荷瘤小鼠体内肿瘤生长的抑制作用。
具体实施例
以下结合实施例对本发明做进一步描述：
实施例1：酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的合成
本发明以Fmoc(9-芴甲氧羰基)保护氨基酸为原料，采用王氏树脂固相多肽合成法合成酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽。其它的多肽合成方法同样适用酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的合成。本实施例多肽的接肽顺序为精氨酸(Arg)→丝氨酸(Ser)→甘氨酸(Gly)→异亮氨酸(Ile)→酪氨酸(Tyr)。首先活化树脂。称取10g王氏树脂，将其放入反应器中，加入150mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)浸泡30分钟(用于活化树脂，使其充分膨胀)，依次用DMF/甲醇/DMF/甲醇/DMF洗涤。将Fmoc-Arg(Pbf)固定到已经活化的王氏树脂上。分别加入1.08g的1-羟基苯并三氮唑(HOBt)、0.82g的二环己基碳二亚胺(DCC)、0.24g的4-二甲氨基哌啶(DMAP)和5.2g的Fmoc-Arg(Pbf)-OH，反应4小时，过滤，依次用二氯甲烷/DMF/甲醇/DMF/甲醇/DMF洗涤反应树脂，每次洗涤不少于1分钟。然后用含20％哌啶的DMF溶液脱除树脂上的Fmoc基团，取少量树脂用茚三酮法(Kaiser法)检测至呈阴性。然后，按照接肽顺序连接下一个氨基酸，即：Fmoc-Ser(tBu)-OH。分别取HOBt 1.08g、DCC 1.64g和Fmoc-Ser(tBu)-OH3.06g加入到反应体系中反应4小时，过滤，二氯甲烷/DMF/甲醇/DMF/甲醇/DMF洗涤，用含20％哌啶的DMF溶液脱除树脂上的Fmoc基团，Kaiser法检测至呈阴性。依次再连接Fmoc-Gly-OH。取HOBt 1.08g、DCC 1.64g和Fmoc-Gly-OH 2.65g加入到反应体系中反应4小时，过滤，二氯甲烷/DMF/甲醇/DMF/甲醇/DMF洗涤，用含20％哌啶的DMF溶液脱除树脂上的Fmoc基团，Kaiser法检测至呈阴性。接肽反应再连接Fmoc-Ile-OH。分别向反应体系中加入HOBt 1.08g、DCC 1.64g和Fmoc-Ile-OH 2.82g，反应4小时，过滤，二氯甲烷/DMF/甲醇/DMF/甲醇/DMF洗涤，用含20％哌啶的DMF溶液脱除树脂上的Fmoc基团，Kaiser法检测至呈阴性。接肽反应接入的下一个氨基酸是Fmoc-Tyr(tBu)-OH。分别加入HOBt 1.08g、DCC 1.64g和Fmoc-Tyr(tBu)-OH 3.68g，反应4小时，过滤，二氯甲烷/DMF/甲醇/DMF/甲醇/DMF洗涤，用含20％哌啶的DMF溶液脱除树脂上的Fmoc基团，Kaiser法检测至呈阴性。这样，五个氨基酸之间的肽键全部形成。经上述方法合成的酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽，需要从树脂上切割下来。加入三氟乙酸、间甲苯酚，0℃反应1.5h。G-3漏斗过滤，滤液浓缩，除去三氟乙酸，加无水乙醚，沉淀出固体，G-4漏斗过滤，除去滤液，将固体溶于双蒸水，冷冻干燥，得粗品酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽。粗肽再经RP-HPLC(反相型高效液相色谱)分离纯化，确定收集目标峰。采用MALDI-Ms质谱法来鉴定所得产品，通过质谱图上的分子量和理论值的比较来确定合成的结果。
实施例2：酪-异亮-甘-丝-精-阿霉素化合物的合成
将105mg的酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽溶于2mL二甲基亚砜中，随后分别加入3.3等当量1-羟基苯并三氮唑(HOBt)(用0.264mL，1M甲基吡咯烷酮溶解)和3.3等当量二环己基碳二酰亚胺(DCC)(用0.264mL，1M甲基吡咯烷酮溶解)。再将50mg盐酸阿霉素溶于0.8mL二甲基亚砜后加入反应体系中，用二异丙基乙胺调整pH值至7.0，在5～10℃下搅拌18小时，真空干燥，加400mL，0.1％碳酸氢铵/水溶液，经制备型HPLC层析得酪-异亮-甘-丝-精-阿霉素化合物。通过该方法合成的偶联化合物分子结构见图1A。
实施例3：以戊二醛作为交联剂合成酪-异亮-甘-丝-精-阿霉素化合物
以戊二醛作为交联剂，借助戊二醛分子中2个对称的活性醛基分别与酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽中的氨基和阿霉素分子中3′位的氨基基团交联形成偶联化合物。戊二醛交联法有一步法和二步法。一步法具体方法如下：分别将1mg的酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽和0.5mg的阿霉素加入到0.5mL含0.1％戊二醛的0.15M氯化钠溶液中，室温下反应30分钟。然后用Dowex 50W×8阳离子交换树脂(H+型，5×15mm)进行层析，再经0.45μm过滤器过滤，取得酪-异亮-甘-丝-精-阿霉素偶联化合物。二步法是将10mg阿霉素溶于2mL含1.25％戊二醛的0.1M磷酸缓冲液(PBS)中，室温下反应1小时，经Sephadex G-25层析除去多余戊二醛，然后加入5mg的酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽，室温下反应2小时。然后用Dowex 50W×8阳离子交换树脂(H+型，5×15mm)进行层析，再经0.45μm过滤器过滤，取得酪-异亮-甘-丝-精-阿霉素化合物。应用戊二醛交联剂合成的偶联化合物分子结构见图1B。
实施例4：酪-异亮-甘-丝-精-戊二酰基-14-氧-阿霉素化合物的合成
通过使用二羧酸间隔区如戊二酸的一个羧基与阿霉素的14位羟基基团形成一个酯键，戊二酸的另一个羧基与酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽分子中的游离氨基形成一个羧酰胺键，从而借助二羧酸间隔区将阿霉素与酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽偶联在一起形成化合物。为了防止戊二酸的羧基与阿霉素的3′位氨基共价结合，我们首先采用9-芴甲氧羰基-N-羟基酰琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)保护阿霉素分子中的3′位氨基，待戊二酸的羧基与阿霉素的14位羟基基团形成酯键并与酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽共价结合形成偶联化合物后，用哌啶去除Fmoc-OSu氨基保护剂。具体方法如下：取80mg盐酸阿霉素溶入2mL N，N-二甲基甲酞胺(DMF)中，加入51mg Fmoc-OSu(保护DOX的3’氨基基团)，再加入49μL的N，N-二异丙基乙基胺(DIPEA)，反应3小时，真空干燥，用0.1％三氟乙酸/水溶液(v/v)使反应物形成结晶，过滤，冷乙醚洗涤一次，去除未与DOX结合的过量的Fmoc-Osu，干燥器干燥后即可得N-Fmoc-DOX。取50mg N-Fmoc-DOX和11.4mg戊二酸酐(偶联剂)，加入1mL DMF和26μL DIPEA，混合过夜，真空干燥，0.1％三氟乙酸/水溶液(v/v)使反应物固化，再用20mL含0.1％三氟乙酸的乙腈/水(60/40，v/v)使固化物溶解并上样于制备型HPLC，获得98％纯度的N-Fmoc-DOX-14-O-半戊二酸酯产物。取85mg YIGSR多肽和40mgN-Fmoc-DOX-14-O-半戊二酸酯，溶解在2mL DMF中，加入44mg苯并三唑-1-基氧三(二甲基氨基)磷六氟磷酸盐、27mg的1-羟基苯及104μL DIPEA，室温下搅拌1小时，真空干燥，加入5mL乙酸乙酯将残余油状物结晶，再用5mL乙酸乙酯洗涤两次，然后用5mL DMF溶解固体结晶物，加入500μL哌啶，反应5分钟使Fmoc-Osu从DOX的3’氨基上脱下，将反应置于冰浴中，并通过加入500μL三氟乙酸、1200μL吡啶和3mL DMF的混合物将其酸化，真空干燥，加入5mL乙酸乙酯将残余油状物结晶，用2mL含0.1％三氟乙酸的乙腈/水(70/30，v/v)使结晶溶解，用5mL，0.1％三氟乙酸水溶液稀释，上样至半制备型HPLC。获得酪-异亮-甘-丝-精-戊二酰基-14-氧-阿霉素化合物(YIGSR-glt-14-O-DOX)最终产品。经上述方法合成的化合物分子结构见图1C。
实施例5：半胱-天冬-脯-甘-酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的合成
在酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸五肽的基础上增加一个或多个氨基酸，如增加半胱氨酸、天冬氨酸、脯氨酸和甘氨酸后形成的半胱-天冬-脯-甘-酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽，也具有特异性识别和结合细胞67kDa层粘连蛋白受体的特性。利用半胱-天冬-脯-甘-酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽作为载体，与阿霉素共价结合而形成的偶联化合物，亦能将阿霉素靶向性定位于具有67kDa层粘连蛋白受体高度或过度表达的各种肿瘤细胞中。与实施例1说明的酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽合成方法一样，任何已知的多肽合成方法也都适用于半胱-天冬-脯-甘-酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽载体的合成。限于篇幅，本发明也是以Fmoc(9-芴甲氧羰基)保护氨基酸为原料，采用王氏树脂固相多肽合成法合成半胱-天冬-脯-甘-酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽。其它的多肽合成方法同样适用半胱-天冬-脯-甘-酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的合成。本实施例多肽的接肽顺序参照实施例1介绍的方法，采用精氨酸(Arg)→丝氨酸(Ser)→甘氨酸(Gly)→异亮氨酸(Ile)→酪氨酸(Tyr)→甘氨酸(Gly)→脯氨酸(Pro)→天冬氨酸(Asp)→半胱氨酸(Cyc)。
首先活化树脂。称取10g王氏树脂，将其放入反应器中，加入150mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)浸泡30分钟(用于活化树脂，使其充分膨胀)，依次用DMF/甲醇/DMF/甲醇/DMF洗涤。将Fmoc-Arg(Pbf)固定到已经活化的王氏树脂上。分别加入1.08g的1-羟基苯并三氮唑(HOBt)、0.82g的二环己基碳二亚胺(DCC)、0.24g的4-二甲氨基哌啶(DMAP)和5.2g的Fmoc-Arg(Pbf)-OH，反应4小时，过滤，依次用二氯甲烷/DMF/甲醇/DMF/甲醇/DMF洗涤反应树脂，每次洗涤不少于1分钟。然后用含20％哌啶的DMF溶液脱除树脂上的Fmoc基团，取少量树脂用茚三酮法(Kaiser法)检测至呈阴性。然后，按照接肽顺序连接下一个氨基酸，即：Fmoc-Ser(tBu)-OH。分别取HOBt 1.08g、DCC1.64g和Fmoc-Ser(tBu)-OH 3.06g加入到反应体系中反应4小时，过滤，二氯甲烷/DMF/甲醇/DMF/甲醇/DMF洗涤，用含20％哌啶的DMF溶液脱除树脂上的Fmoc基团，Kaiser法检测至呈阴性。依次再连接Fmoc-Gly-OH。取HOBt 1.08g、DCC 1.64g和Fmoc-Gly-OH 2.65g加入到反应体系中反应4小时，过滤，二氯甲烷/DMF/甲醇/DMF/甲醇/DMF洗涤，用含20％哌啶的DMF溶液脱除树脂上的Fmoc基团，Kaiser法检测至呈阴性。接肽反应再连接Fmoc-Ile-OH。分别向反应体系中加入HOBt 1.08g、DCC 1.64g和Fmoc-Ile-OH 2.82g，反应4小时，过滤，二氯甲烷/DMF/甲醇/DMF/甲醇/DMF洗涤，用含20％哌啶的DMF溶液脱除树脂上的Fmoc基团，Kaiser法检测至呈阴性。接肽反应接入的下一个氨基酸是Fmoc-Tyr(tBu)-OH。分别加入HOBt 1.08g、DCC 1.64g和Fmoc-Tyr(tBu)-OH 3.68g，反应4小时，过滤，二氯甲烷/DMF/甲醇/DMF/甲醇/DMF洗涤，用含20％哌啶的DMF溶液脱除树脂上的Fmoc基团，Kaiser法检测至呈阴性。接肽反应肽接入的第六个氨基酸是Fmoc-Gly-OH。取HOBt 1.08g、DCC 1.64g和Fmoc-Gly-OH 2.65g加入到反应体系中反应4小时，过滤，二氯甲烷/DMF/甲醇/DMF/甲醇/DMF洗涤，用含20％哌啶的DMF溶液脱除树脂上的Fmoc基团，Kaiser法检测至呈阴性。接肽反应肽接入的第七个氨基酸是Fmoc-Pro-OH。分别加入HOBt1.08g、DCC 1.64g和Fmoc-Pro-OH 2.82g，反应4小时，过滤，二氯甲烷/DMF/甲醇/DMF/甲醇/DMF洗涤，用含20％哌啶的DMF溶液脱除树脂上的Fmoc基团，Kaiser法检测至呈阴性。接肽反应肽接入的第八个氨基酸是Fmoc-Asp(tBu)-OH。分别加入HOBt 1.08g、DCC 1.64g和Fmoc-Asp(tBu)-OH3.26g，反应4小时，过滤，二氯甲烷/DMF/甲醇/DMF/甲醇/DMF洗涤，用含20％哌啶的DMF溶液脱除树脂上的Fmoc基团，Kaiser法检测至呈阴性。接肽反应肽接入的第九个氨基酸是Fmoc-Cyc(Acm)-OH。分别加入HOBt1.08g、DCC 1.64g和Fmoc-Cyc(Acm)-OH 3.75g，反应4小时，过滤，二氯甲烷/DMF/甲醇/DMF/甲醇/DMF洗涤，用含20％哌啶的DMF溶液脱除树脂上的Fmoc基团，Kaiser法检测至呈阴性。这样，九个氨基酸之间的肽键全部形成。经上述方法合成的多肽，需要从树脂上切割下来。加入三氟乙酸、间甲苯酚，0℃反应1.5h。G-3漏斗过滤，滤液浓缩，除去三氟乙酸，加无水乙醚，沉淀出固体，G-4漏斗过滤，除去滤液，将固体溶于双蒸水，冷冻干燥，除去树脂得粗品半胱-天冬-脯-甘-酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽。粗肽再经反相型高效液相色谱分离纯化，确定收集目标峰。采用MALDI-Ms质谱法来鉴定所得产品，通过质谱图上的分子量和理论值的比较来确定合成的结果。
实施例6：半胱-天冬-脯-甘-酪-异亮-甘-丝-精-阿霉素化合物的合成
将186mg的半胱-天冬-脯-甘-酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽溶于3mL二甲基亚砜中，随后分别加入3.3等当量1-羟基苯并三氮唑(用0.264mL，1M甲基吡咯烷酮溶解)和3.3等当量二环己基碳二酰亚胺(用0.264mL，1M甲基吡咯烷酮溶解)。再将50mg盐酸阿霉素溶于0.8mL二甲基亚砜后加入反应体系中，用二异丙基乙胺调整pH值至7.0，在5～10℃下搅拌18小时，真空干燥，加400mL，0.1％碳酸氢铵/水溶液，经制备型HPLC层析得半胱-天冬-脯-甘-酪-异亮-甘-丝-精-阿霉素化合物。通过该方法合成的偶联化合物分子结构见图2A。
实施例7：以戊二醛作为交联剂合成半胱-天冬-脯-甘-酪-异亮-甘-丝-精-阿霉素化合物
与实施例3说明的方法相同，也可以用戊二醛作为交联剂，借助戊二醛分子中2个对称的活性醛基分别与多肽分子中的氨基和阿霉素分子中3′位的氨基基团交联形成偶联化合物。戊二醛交联法有一步法和二步法。一步法具体方法如下：分别将1.5mg的半胱-天冬-脯-甘-酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽和0.5mg的阿霉素加入到0.5mL含0.1％戊二醛的0.15M氯化钠溶液中，室温下反应30分钟。然后用Dowex 50W×8阳离子交换树脂(H+型，5×15mm)进行层析，再经0.45μm过滤器过滤，取得半胱-天冬-脯-甘-酪-异亮-甘-丝-精-阿霉素偶联化合物。二步法是将10mg阿霉素溶于2mL含1.25％戊二醛的0.1M磷酸缓冲液(PBS)中，室温下反应1小时，经Sephadex G-25层析除去多余戊二醛，然后加入7.2mg的半胱-天冬-脯-甘-酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽，室温下反应2小时。然后用Dowex 50W×8阳离子交换树脂(H+型，5×15mm)进行层析，再经0.45μm过滤器过滤，取得半胱-天冬-脯-甘-酪-异亮-甘-丝-精-阿霉素化合物。应用戊二醛交联剂合成的偶联化合物分子结构见图2B。
实施例8：半胱-天冬-脯-甘-酪-异亮-甘-丝-精-戊二酰基-14-氧-阿霉素化合物的合成
本实施例合成半胱-天冬-脯-甘-酪-异亮-甘-丝-精-戊二酰基-14-氧-阿霉素化合物的方法参照实施例4。取80mg盐酸阿霉素溶入2mL N，N-二甲基甲酞胺(DMF)中，加入51mg Fmoc-OSu(保护DOX的3’氨基基团)，再加入49μL的N，N-二异丙基乙基胺(DIPEA)，反应3小时，真空干燥，用0.1％三氟乙酸/水溶液(V/v)使反应物形成结晶，过滤，冷乙醚洗涤一次，去除未与DOX结合的过量的Fmoc-Osu，干燥器干燥后即可得N-Fmoc-DOX。取50mg N-Fmoc-DOX和11.4mg戊二酸酐(偶联剂)，加入1mL DMF和26μL DIPEA，混合过夜，真空干燥，0.1％三氟乙酸/水溶液(v/v)使反应物固化，再用20mL含0.1％三氟乙酸的乙腈/水(60/40，v/v)使固化物溶解并上样于制备型HPLC，获得98％纯度的N-Fmoc-DOX-14-O-半戊二酸酯产物。取105mg半胱-天冬-脯-甘-酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽和40mg N-Fmoc-DOX-14-O-半戊二酸酯，溶解在2mL DMF中，加入44mg苯并三唑-1-基氧三(二甲基氨基)磷六氟磷酸盐、27mg的1-羟基苯及104μL DI PEA，室温下搅拌1小时，真空干燥，加入5mL乙酸乙酯将残余油状物结晶，再用5mL乙酸乙酯洗涤两次，然后用5mL DMF溶解固体结晶物，加入500μL哌啶，反应5分钟使Fmoc-Osu从DOX的3’氨基上脱下，将反应置于冰浴中，并通过加入500μL三氟乙酸、1200μL吡啶和3mL DMF的混合物将其酸化，真空干燥，加入5mL乙酸乙酯将残余油状物结晶，用2mL含0.1％三氟乙酸的乙腈/水(70/30，v/v)使结晶溶解，用5mL，0.1％三氟乙酸水溶液稀释，上样至半制备型HPLC。获得半胱-天冬-脯-甘-酪-异亮-甘-丝-精-戊二酰基-14-氧-阿霉素化合物(CDPGYIGSR-glt-14-O-DOX)最终产品。经上述方法合成的化合物分子结构见图2C。
实施例9：以4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯为交联剂合成阿霉素-半胱-天冬-脯-甘-酪-异亮-甘-丝-精氨酸化合物
4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)是一种常用的异型双功能多肽或蛋白质的交联剂。SMCC分子一端的活性酯与阿霉素3′位上的氨基形成共价的胺键，SMCC分子另一端的顺丁烯二酰亚胺基团与半胱-天冬-脯-甘-酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽(CDPGYIGSR)上的巯基形成稳定的硫醚键，从而使阿霉素和CDPGYIGSR偶联在一起。具体如下：取1mg盐酸阿霉素溶于0.1mL二甲基亚砜(DMSO)和4mL，pH8.0的磷酸缓冲液(PBS)中，再加入20μL三乙胺和2mg的SMCC，室温下搅拌2小时，调pH至5.5，取4.5mgCDPGYIGSR加入反应器中，室温下搅拌2小时，加2mL含0.1％三氟乙酸的乙腈/水(70/30，v/v)溶液，上样至半制备型HPLC。获得阿霉素-环己烷酰胺-马来酰亚胺基甲基-半胱-天冬-脯-甘-酪-异亮-甘-丝-精氨酸化合物最终产品。
实施例9：乙酰-酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的合成
含酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸序列多肽的衍生物，具有特异性识别和结合细胞67kDa层粘连蛋白受体的特性。如使酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸多肽乙酰化，即乙酰-酪-异亮-甘-丝-精氨酸化合物作为载体，与阿霉素共价结合而形成的偶联化合物，亦能将阿霉素靶向性定位于具有67kDa层粘连蛋白受体高度或过度表达的各种肿瘤细胞中。酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的乙酰化首先需要合成酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽。该多肽的合成方法与实施例1说明的酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽合成方法相同，任何已知的多肽合成方法也都适用于酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽载体的合成。限于篇幅，本发明也是以Fmoc(9-芴甲氧羰基)保护氨基酸为原料，采用王氏树脂固相多肽合成法合成酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽。其它的多肽合成方法同样适用酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的合成。本实施例多肽的接肽顺序参照实施例1介绍的方法，采用精氨酸(Arg)→丝氨酸(Ser)→甘氨酸(Gly)→异亮氨酸(Ile)→酪氨酸(Tyr)。首先活化树脂。称取10g王氏树脂，将其放入反应器中，加入150mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)浸泡30分钟(用于活化树脂，使其充分膨胀)，依次用DMF/甲醇/DMF/甲醇/DMF洗涤。将Fmoc-Arg(Pbf)固定到已经活化的王氏树脂上。分别加入1.08g的1-羟基苯并三氮唑(HOBt)、0.82g的二环己基碳二亚胺(DCC)、0.24g的4-二甲氨基哌啶(DMAP)和5.2g的Fmoc-Arg(Pbf)-OH，反应4小时，过滤，依次用二氯甲烷/DMF/甲醇/DMF/甲醇/DMF洗涤反应树脂，每次洗涤不少于1分钟。然后用含20％哌啶的DMF溶液脱除树脂上的Fmoc基团，取少量树脂用茚三酮法(Kaiser法)检测至呈阴性。然后，按照接肽顺序连接下一个氨基酸，即：Fmoc-Ser(tBu)-OH。分别取HOBt 1.08g、DCC 1.64g和Fmoc-Ser(tBu)-OH 3.06g加入到反应体系中反应4小时，过滤，二氯甲烷/DMF/甲醇/DMF/甲醇/DMF洗涤，用含20％哌啶的DMF溶液脱除树脂上的Fmoc基团，Kaiser法检测至呈阴性。依次再连接Fmoc-Gly-OH。取HOBt 1.08g、DCC 1.64g和Fmoc-Gly-OH 2.65g加入到反应体系中反应4小时，过滤，二氯甲烷/DMF/甲醇/DMF/甲醇/DMF洗涤，用含20％哌啶的DMF溶液脱除树脂上的Fmoc基团，Kaiser法检测至呈阴性。接肽反应再连接Fmoc-Ile-OH。分别向反应体系中加入HOBt 1.08g、DCC 1.64g和Fmoc-Ile-OH 2.82g，反应4小时，过滤，二氯甲烷/DMF/甲醇/DMF/甲醇/DMF洗涤，用含20％哌啶的DMF溶液脱除树脂上的Fmoc基团，Kaiser法检测至呈阴性。接肽反应接入的下一个氨基酸是Fmoc-Tyr(tBu)-OH。分别加入HOBt 1.08g、DCC 1.64g和Fmoc-Tyr(tBu)-OH 3.68g，反应4小时，过滤，二氯甲烷/DMF/甲醇/DMF/甲醇/DMF洗涤，用含20％哌啶的DMF溶液脱除树脂上的Fmoc基团，Kaiser法检测至呈阴性。这样，五个氨基酸之间的肽键全部形成。经上述方法合成的酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽-树脂，需要从树脂上切割下来。加入三氟乙酸、间甲苯酚，0℃反应1.5h。G-3漏斗过滤，滤液浓缩，除去三氟乙酸，加无水乙醚，沉淀出固体，G-4漏斗过滤，除去滤液，将固体溶于双蒸水，冷冻干燥除去树脂，加入5％乙酸，经RP-HPLC(反相型高效液相色谱)分离纯化，取得乙酰酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽。
实施例10：乙酰-甘-酪-异亮-甘-丝-精-阿霉素化合物的合成
将186mg的乙酰-酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽溶于3mL二甲基亚砜中，随后分别加入3.3等当量1-羟基苯并三氮唑(HOBt)(用0.264mL，1M甲基吡咯烷酮溶解)和3.3等当量二环己基碳二酰亚胺(DCC)(用0.264mL，1M甲基吡咯烷酮溶解)。再将50mg盐酸阿霉素溶于0.8mL二甲基亚砜后加入反应体系中，用二异丙基乙胺调整pH值至7.0，在5～10℃下搅拌18小时，真空干燥，加400mL，0.1％碳酸氢铵/水溶液，经制备型HPLC层析得乙酰-酪-异亮-甘-丝-精-阿霉素化合物。通过该方法合成的偶联化合物分子结构见图3A。
实施例11：以戊二醛作为交联剂合成乙酰-酪-异亮-甘-丝-精-阿霉素化合物
与实施例3说明的方法相同，也可以用戊二醛作为交联剂，借助戊二醛分子中2个对称的活性醛基分别与多肽分子中的氨基和阿霉素分子中3′位的氨基基团交联形成偶联化合物。戊二醛交联法有一步法和二步法。一步法具体方法如下：分别将1.5mg的半胱-天冬-脯-甘-酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽和0.5mg的阿霉素加入到0.5mL含0.1％戊二醛的0.15M氯化钠溶液中，室温下反应30分钟。然后用Dowex 50W×8阳离子交换树脂(H+型，5×15mm)进行层析，再经0.45μm过滤器过滤，取得半胱-天冬-脯-甘-酪-异亮-甘-丝-精-阿霉素偶联化合物。二步法是将10mg阿霉素溶于2mL含1.25％戊二醛的0.1M磷酸缓冲液(PBS)中，室温下反应1小时，经Sephadex G-25层析除去多余戊二醛，然后加入7.2mg的半胱-天冬-脯-甘-酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽，室温下反应2小时。然后用Dowex 50W×8阳离子交换树脂(H+型，5×15mm)进行层析，再经0.45μm过滤器过滤，取得半胱-天冬-脯-甘-酪-异亮-甘-丝-精-阿霉素化合物。应用戊二醛交联剂合成的偶联化合物分子结构见图3B。
实施例12：乙酰-酪-异亮-甘-丝-精-戊二酰基-14-氧-阿霉素化合物的合成
本实施例合成乙酰-酪-异亮-甘-丝-精-戊二酰基-14-氧-阿霉素化合物的方法参照实施例4。取80mg盐酸阿霉素溶入2mL N，N-二甲基甲酞胺(DMF)中，加入51mg Fmoc-OSu(保护DOX的3’氨基基团)，再加入49μL的N，N-二异丙基乙基胺(DI PEA)，反应3小时，真空干燥，用0.1％三氟乙酸/水溶液(v/v)使反应物形成结晶，过滤，冷乙醚洗涤一次，去除未与DOX结合的过量的Fmoc-Osu，干燥器干燥后即可得N-Fmoc-DOX。
取50mg N-Fmoc-DOX和11.4mg戊二酸酐(偶联剂)，加入1mL DMF和26μL DIPEA，混合过夜，真空干燥，0.1％三氟乙酸/水溶液(v/v)使反应物固化，再用20mL含0.1％三氟乙酸的乙腈/水(60/40，v/v)使固化物溶解并上样于制备型HPLC，获得98％纯度的N-Fmoc-DOX-14-O-半戊二酸酯产物。
取105mg半胱-天冬-脯-甘-酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽和40mgN-Fmoc-DOX-14-O-半戊二酸酯，溶解在2mL DMF中，加入44mg苯并三唑-1-基氧三(二甲基氨基)磷六氟磷酸盐、27mg的1-羟基苯及104μL DIPEA，室温下搅拌1小时，真空干燥，加入5mL乙酸乙酯将残余油状物结晶，再用5mL乙酸乙酯洗涤两次，然后用5mL DMF溶解固体结晶物，加入500μL哌啶，反应5分钟使Fmoc-Osu从DOX的3’氨基上脱下，将反应置于冰浴中，并通过加入500μL三氟乙酸、1200μL吡啶和3mL DMF的混合物将其酸化，真空干燥，加入5mL乙酸乙酯将残余油状物结晶，用2mL含0.1％三氟乙酸的乙腈/水(70/30，v/v)使结晶溶解，用5mL，0.1％三氟乙酸水溶液稀释，上样至半制备型HPLC。获得半胱-天冬-脯-甘-酪-异亮-甘-丝-精-戊二酰基-14-氧-阿霉素化合物(CDPGYIGSR-glt-14-O-DOX)最终产品。经上述方法合成的化合物分子结构见图3C。
实施例13：酪-异亮-甘-丝-精-表阿霉素化合物的合成
表阿霉素为阿霉素的同分异构体，同属蒽环类抗肿瘤药物。与阿霉素相比，表阿霉素的分子结构与阿霉素的只有细微改变，仅是其4′位置上的羟基由阿霉素的顺位变为反位，但表阿霉素的抗肿瘤疗效较阿霉素高，并且其毒副作用也较阿霉素小，尤其是心脏和骨髓毒性较低。正是表阿霉素与阿霉素分子结构上的相似性，表阿霉素在临床上使用的适应症、疗程和剂量等都与阿霉素相同。而且，含酪-异亮-甘-丝-精氨酸序列的多肽及其衍生物也能与表阿霉素共价结合形成偶联化合物，可以靶向性输送表阿霉素定位于细胞67kDa层粘连蛋白受体高度或过度表达的各种肿瘤组织中。在阿霉素与含酪-异亮-甘-丝-精氨酸序列的多肽及其衍生物，具体实施例中描述的方法和浓度同样适用于表阿霉素。将105mg的酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽溶于2mL二甲基亚砜中，随后分别加入3.3等当量1-羟基苯并三氮唑(HOBt)(用0.264mL，1M甲基吡咯烷酮溶解)和3.3等当量二环己基碳二酰亚胺(DCC)(用0.264mL，1M甲基吡咯烷酮溶解)。再将50mg盐酸表阿霉素溶于0.8mL二甲基亚砜后加入反应体系中，用二异丙基乙胺调整pH值至7.0，在5～10℃下搅拌18小时，真空干燥，加400mL，0.1％碳酸氢铵/水溶液，经制备型HPLC层析得酪-异亮-甘-丝-精-表阿霉素化合物。通过该方法合成的偶联化合物分子结构见图4A。
实施例14：以戊二醛作为交联剂合成酪-异亮-甘-丝-精-表阿霉素化合物
以戊二醛作为交联剂，借助戊二醛分子中2个对称的活性醛基分别与酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽中的氨基和表阿霉素分子中3′位的氨基基团交联形成偶联化合物。戊二醛交联法有一步法和二步法。一步法具体方法如下：分别将1mg的酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽和0.5mg的表阿霉素加入到0.5mL含0.1％戊二醛的0.15M氯化钠溶液中，室温下反应30分钟。然后用Dowex 50W×8阳离子交换树脂(H+型，5×15mm)进行层析，再经0.45μm过滤器过滤，取得酪-异亮-甘-丝-精-表阿霉素偶联化合物。二步法是将10mg表阿霉素溶于2mL含1.25％戊二醛的0.1M磷酸缓冲液(PBS)中，室温下反应1小时，经SephadexG-25层析除去多余戊二醛，然后加入5mg的酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽，室温下反应2小时。然后用Dowex 50W×8阳离子交换树脂(H+型，5×15mm)进行层析，再经0.45μm过滤器过滤，取得酪-异亮-甘-丝-精-表阿霉素化合物。应用戊二醛交联剂合成的偶联化合物分子结构见图4B。
实施例15：酪-异亮-甘-丝-精-戊二酰基-14-氧-表阿霉素化合物的合成
取80mg盐酸表阿霉素(EPI)溶入2mL N，N-二甲基甲酞胺(DMF)中，加入51mg Fmoc-OSu(保护DOX的3’氨基基团)，再加入49μL的N，N-二异丙基乙基胺(DIPEA)，反应3小时，真空干燥，用0.1％三氟乙酸/水溶液(v/v)使反应物形成结晶，过滤，冷乙醚洗涤一次，去除未与EPI结合的过量的Fmoc-Osu，干燥器干燥后即可得N-Fmoc-EPI。取50mg N-Fmoc-EPI和11.4mg戊二酸酐(偶联剂)，加入1mL DMF和26μL DIPEA，混合过夜，真空干燥，0.1％三氟乙酸/水溶液(v/v)使反应物固化，再用20mL含0.1％三氟乙酸的乙腈/水(60/40，v/v)使固化物溶解并上样于制备型HPLC，获得98％纯度的N-Fmoc-EPI-14-O-半戊二酸酯产物。取85mg酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽(YIGSR)和40mgN-Fmoc-EPI-14-O-半戊二酸酯，溶解在2mL DMF中，加入44mg苯并三唑-1-基氧三(二甲基氨基)磷六氟磷酸盐、27mg的1-羟基苯及104μL DIPEA，室温下搅拌1小时，真空干燥，加入5mL乙酸乙酯将残余油状物结晶，再用5mL乙酸乙酯洗涤两次，然后用5mL DMF溶解固体结晶物，加入500μL哌啶，反应5分钟使Fmoc-Osu从EPI的3’氨基上脱下，将反应置于冰浴中，并通过加入500μL三氟乙酸、1200μL吡啶和3mL DMF的混合物将其酸化，真空干燥，加入5mL乙酸乙酯将残余油状物结晶，用2mL含0.1％三氟乙酸的乙腈/水(70/30，v/v)使结晶溶解，用5mL，0.1％三氟乙酸水溶液稀释，上样至半制备型HPLC。获得酪-异亮-甘-丝-精-戊二酰基-14-氧-表阿霉素化合物(YIGSR-glt-14-O-EPI)最终产品。经上述方法合成的化合物分子结构见图4C。
实施例16：酪-异亮-甘-丝-精-戊二酰基-14-氧-阿霉素的稳定性及体外释放实验
肿瘤靶向性的含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的蒽环型衍生物，在体内不是依靠偶联化合物的浓度梯度扩散进入细胞，而是通过细胞受体的介导形成内吞体进入细胞内。一般认为，进入细胞内的内吞体在胞浆中与溶酶体结合，由于溶酶体内低pH的缘故，大分子化合物被分解成小分子药物而得到释放。为了证实大分子的含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的蒽环型衍生物，进入细胞内与溶酶体结合后，是否也是受到溶酶体内低pH的影响而被分解，我们在体外模拟溶酶体中的低pH环境，以酪-异亮-甘-丝-精-戊二酰基-14-氧-阿霉素化合物(YIGSR-glt-14-O-DOX)为实验对象，分别在不同时间和不同条件下，检测从偶联化合物中释放出来的小分子阿霉素(DOX)的含量，以评估含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的蒽环型衍生物的体外稳定性和释放特性。由于被检测的DOX是从YIGSR-glt-14-O-DOX分子中释放出来的，即小分子的DOX和大分子的化合物都处于同一反应体系中，为了准确检测游离的DOX含量，需要将它们分离。为此，我们根据文献[Rousselle C，et al.Mol Pharam.57：679-686.2000]报道的方法，采用固相萃取技术，将样品经C18固相萃取小柱萃取后，富集从化合物中释放出来的DOX并与偶联化合物分离。然后，应用HPLC检测提取物中DOX浓度并进行比较，判断不同环境对偶联化合物稳定性的影响。具体方法如下：按YIGSR-glt-14-O-DOX中DOX的含量，以2mg/ml的浓度溶于10mM pH分别为3.0、5.0和7.4的PBS中。在37℃下，于不同的时间点(0、2、4、8、24、48和72小时)上，取250μL样品与1mL含70％甲醇/30％水(v/v)溶液混合。混匀后通过预先活化的Waters Sep-Pak C18固相萃取小柱(预先以3mL甲醇、3mL双蒸水活化)。再用15mL双蒸水洗小柱，收集洗脱液。然后，取100μL洗脱液进样作高压液相色谱检测。高压液相色谱检测系统包括Waters 600高效液相色谱仪(美国Waters公司)，配有2996型二极管阵列检测器，717自动进样器和Empower PDA数据处理工作站。色谱柱为Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)。荧光检测激发波长λexe＝480nm，发射波长λem＝560nm，流动相为甲醇/乙腈/水(50/32/18，v/v/v)，流速：1.0mL/分，柱温为40℃。
在不同pH环境下，DOX从YIGSR-glt-14-O-DOX分子中释放的结果见图5。从图中发现，在pH为3.0的PBS中，8小时内有超过50％的DOX从偶联化合物中释放出来。此时，在pH为3.0的环境中释放的DOX水平，比pH为5.0的高1.2倍，比pH为5.0的更高，超过4.7倍。随着pH的增加，释放的DOX减少。结果表明，pH对肿瘤靶向性含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的蒽环型衍生物的分解，影响效果非常明显。也说明含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽序列的蒽环型衍生物，通过受体介导的细胞内吞作用进入细胞后与溶酶体结合，溶酶体内低pH环境有助于化合物分子间的结合键断裂，使药物能迅速从载体上解离下来，发挥蒽环类药物化合物的药理作用。
实施例17：蛋白免疫印迹(Western Blot)法测定细胞67LR表达
试验所采用的人直肠癌细胞SW480、人胃癌细胞SGC-7901、正常人肝细胞LH-02和鼠黑色瘤细胞B16，均购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。细胞培养液是含10％小牛血清RPMI-1640培养基。参照Montuori等人[Montuori N，et al.J Clin Endocrinol Metab.84(6)：2086-2092.1999]报道的方法，用WesternBlot检测上述各个细胞株中67LR的表达。取对数生长期细胞，胰酶消化悬浮后，调整细胞数为12×104/mL接种于6孔板中(4.5mL)，37℃培养24小时，去培养液，用冷PBS洗1次。每孔加入500μL细胞裂解液(50mM Tris-HCl、120mMNaCl、1mM EDTA、1％Triton X-100、1％脱氧胆酸钠、0.1％十二烷基磺酸钠和1mM苯甲基磺酰氟)。冰上裂解30分钟，12,000rpm 4℃离心1小时。采用蛋白测定试剂盒(Bio-Rab Protein kit)，并按其说明测定实际总蛋白的含量。各取50μg蛋白样品上样，经SDS-聚丙烯酰凝胶电泳分离，将凝胶中的蛋白转移至硝酸纤维素膜(PVDF膜，Millipore，USA)上进行免疫印迹。5％脱脂奶封闭，加入多克隆抗-67LR抗体一抗(1∶1000稀释)，4℃过夜，用含0.2％Tween-20缓冲液(TBS-T)洗膜4次，每次5分钟，后与1∶5000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Richmond CA)室温下温育2小时，用TBS-T洗膜液洗膜4次，每次5分钟，增强化学发光(ECL)法显色检测67LR表达。Western Blot检测结果见图6。从图中可以看到SGC-7901、SW480和B16细胞在相对分子质量67000附近有较粗蛋白条带，而LH-02细胞相应条带呈较弱浅色显示。结果显示SGC-7901、SW480和B16细胞67LR呈现高度表达，LH-02细胞67LR为低表达。
实施例18：酪-异亮-甘-丝-精-戊二酰基-14-氧-阿霉素的体外细胞吸收实验
蒽环类药物化合物与细胞作用后，被细胞吸收而进入细胞内。由于蒽环类化合物具有自发荧光特性，它们在细胞内散发出的荧光，可以被具有荧光强度检测功能的酶标仪检测到。并且，可以根据酶标仪检测的荧光强度来评估细胞吸收化合物的能力和水平。因此，通过与对照组比较，能判断细胞吸收含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的蒽环型衍生物的能力和特性。我们参照文献[Cao N，et al.Biomaterials.29：3856-3865.2008]报道的方法进行本试验。试验所采用的四种细胞株与实施例4中相同。于96孔培养板中，每孔加入5×103个细胞，置入5％CO2、饱和水汽、37℃培养箱中培养24小时。然后，小心地移除细胞培养液，再向每孔中加入100μL包含0.5μM阿霉素(DOX)或酪-异亮-甘-丝-精-戊二酰基-14-氧-阿霉素化合物(YIGSR-glt-14-O-DOX)的无血清RPMI-1640培养液，化合物的浓度以其中所含DOX计与DOX量相当。空白对照组细胞中加入100μL无血清RPMI-1640培养液。细胞在37℃下培养0.5和24小时后，小心地移除细胞培养液，接着每孔分别用100μL PBS洗脱三次，将未被细胞吸收的药物脱去。再向每孔中加入100μL，1％Triton X-100对所有细胞进行处理。随后，用酶标仪(Tecan，瑞士)于λex＝490nm和λem＝590nm波长下测定各孔的吸光度值(荧光强度值)。经与空白对照组比较和修正后，细胞内药物的水平用百分率显示在图7中。从图7中可知，经DOX治疗的细胞，无论是67LR高度表达的SGC7901、SW480和B16细胞，还是低67LR表达的LH-02细胞，各细胞吸收的DOX量无显著差异(p＞0.05)。与DOX用药细胞不同，经YIGS R-glt-14-O-DOX作用的细胞，细胞内化合物的水平与细胞67LR的表达水平密切相关。67LR低表达的LH-02细胞吸收了少量的偶联化合物，67LR高表达的SGC-7901、SW480和B16细胞摄取了更多的偶联化合物，这些细胞内的偶联化合物含量明显增高，与低67LR表达的细胞相比差异非常显著(图7A和图7B，**p＜0.01)。
实施例19：67LR竞争结合/吸收实验
由于人工合成的酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸多肽(YIGSR)，可以竞争性抑制层粘连蛋白(LN)与细胞67LR的结合[lwamoto Y，et al.Science.238(4830)：1132-1134.1987]。也就是LN和YIGSR这两者与细胞67LR的结合具有竞争性。利用这种特性进行67LR竞争结合/吸收实验，来评估含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的蒽环型衍生物，是否保留了YIGSR的特异性识别和结合67LR的能力。具体实验步骤是以偶联化合物单独与细胞作用后，细胞吸收药物的水平为基础，比较在LN和偶联化合物同时作用下，细胞内药物水平的差异性。本实验的方法参照实施例5作了一些修改。采用的四种细胞株与实施例4相同。取对数生长期的上述四种细胞，经胰蛋白酶消化后500g离心5分钟。于96孔培养板中，每孔加入5×103个细胞，置入5％CO2、饱和水汽、37℃培养箱中培养24小时。然后，小心地移去细胞培养液。每株细胞分六组：第I组中加入100μL PBS为空白对照组；第II组中加入100μL含1.5μg LN的PBS；第III组中加入100μL仅含0.5μM阿霉素(DOX)的PBS；第IV组中加入100μL包含0.5μM DOX+1.5μg LN的PBS；第V组中加入100μL仅含0.5μM酪-异亮-甘-丝-精-戊二酰基-14-氧-阿霉素化合物(YIGSR-glt-14-O-DOX)的PBS；第VI组中加入100μL含0.5μM YIGSR-glt-14-O-DOX+1.5μg LN的PBS。其中，第V组和第VI组中偶联化合物的浓度以其中所含DOX计与DOX量相当。细胞在37℃下培养8小时后，小心地移除细胞培养液，接着每孔分别用100μL PBS洗脱三次，将未被细胞吸收的药物脱去。再向每孔中加入100μL，1％Triton X-100对所有细胞进行处理。将未被细胞吸收的药物脱去。再向每孔中加入100μL，1％Triton X-100对所有细胞进行处理。随后，用酶标仪(Tecan，瑞士)于λex＝490nm和λem＝590nm波长下测定各孔的吸光度值(荧光强度值)。经与空白对照组比较和修正后，细胞内药物的水平用百分率显示在图8中。
图8显示的结果表明，四株细胞在与DOX作用的同时，无论是否加用LN，细胞内DOX的含量没有明显的差异，说明细胞摄取DOX不受LN的影响。然而，与没有加用LN相比，当YIGSR-glt-14-O-DOX与LN同时作用细胞后，四种细胞内的药物水平都有不同程度的下降，表明LN对细胞摄取偶联物产生了明显的抑制作用。实验的结果进一步说明，细胞摄取的含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的蒽环型衍生物与67LR的介导有关。
实施例20：酪-异亮-甘-丝-精-戊二酰基-14-氧-阿霉素在体外细胞内的分布
利用蒽环类化合物具有自发荧光的特性，借助荧光显微镜可以直观地观察蒽环类化合物与体外培养的细胞作用后，它们被细胞吸收而进入细胞内的分布情况。本实验以人直肠癌SW480细胞株为例来说明。取对数生长期的SW480细胞，经胰蛋白酶消化后500g离心5分钟。于96孔培养板中，每孔加入5×103个细胞，置入5％CO2、饱和水汽、37℃培养箱中培养24小时。实验共分四组。在小心地移除细胞培养液后，向每孔中加入100μL含0.5μM阿霉素(DOX)或酪-异亮-甘-丝-精-戊二酰基-14-氧-阿霉素化合物(YIGSR-glt-14-O-DOX)(其中的浓度以所含DOX计与DOX量相当)的无血清RPMI-1640培养液，37℃下孵育。分别在0.5和24小时这两个时间点上，用λex＝490nm、λem＝590nm的荧光显微镜观察细胞形态及荧光分布情况。图9显示细胞分别与DOX(A)和YIGSR-glt-14-O-DOX(B)孵育0.5小时的荧光显微镜图像。从图9中可以观察，DOX和YIGSR-glt-14-O-DOX在细胞内的吸收和分布有明显的差别。一般认为，小分子药物、亲脂性药物和离子通过扩散的方式，透过细胞膜进入细胞内，并迅速扩散进入细胞核。从9A中发现，DOX与细胞短时间(30分钟)作用后，药物荧光不仅分布在胞浆中，而且也分布在细胞核，说明DOX迅速扩散进入细胞质和细胞核并在核内积聚。与DOX不同，偶联化合物与SW480细胞作用30分钟后，药物荧光仅分布在细胞浆中，在细胞核中没有发现药物荧光的分布，可以清晰地看到围绕细胞核形成环状荧光分布(见图9B)。表明DOX与YIGSR共价结合形成偶联化合物后，改变了细胞对偶联化合物的吸收和分布状态。进一步说明，含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的蒽环型衍生物不能直接经被动扩散的方式通过细胞膜进入细胞内，也不能直接经核膜进入细胞核。需通过受体介导的细胞内吞作用进入胞内。进入胞浆后，由于水解酶、酯酶以及低pH值等因素的作用，蒽环类化合物从偶联物中解离出来后，才能进入细胞核。因此，短时间内蒽环类药物化合物没有大量地从偶联物中释放出来，以至于仅能看到围绕细胞核形成环状荧光分布(见图9B)。到24小时后，由于DOX不断地从YIGSR-glt-14-O-DOX分子中解离和释放出来而进入细胞核，使得DOX不仅分布在胞浆中，而且也进入了细胞核，所以从图9D中可以清楚的看到，增强的DOX荧光不仅分布在胞浆中而且在核内积聚。相比之下，DOX与细胞作用24小时后，细胞内DOX荧光分布的强度与30分钟时，并没有明显的改变(图9C)。
实施例21：酪-异亮-甘-丝-精-戊二酰基-14-氧-阿霉素的体外细胞毒性实验
阿霉素(DOX)和酪-异亮-甘-丝-精-戊二酰基-14-氧-阿霉素化合物(YIGSR-glt-14-O-DOX)对体外培养细胞的生长抑制作用比较和分析采用四甲基谷氮唑蓝(MTT)法。实验所使用的细胞与实施例4中相同。具体如下：取对数生长期SW480、SGC-7901、LH-02和B16细胞，胰蛋白酶消化后500g离心5分钟。于96孔培养板中按每孔分别加入5×103细胞培养24小时。每孔加入100μL含不同浓度梯度的DOX或YIGSR-glt-14-O-DOX的无血清RPMI-1640培养液，偶联化合物的浓度以其中所含DOX计与DOX量相当。空白对照组细胞中加入100μL无血清RPMI-1640培养液。37℃下培养5和48小时后，每孔加入1mg/mL的MTT/PBS溶液50μL继续培养4小时。小心吸除孔内液体，每孔加入二甲基亚砜200μL，震荡10分钟后，用自动酶标仪于492nm波长下测定各孔的吸光度值(OD值)，记录DOX或偶联化合物的OD值(Isample)，并记录PBS空白组的OD值(Icontrol)。通过下列公式来计算细胞存活率(Cell Viability)：Cell Viability(％)＝100×(Isample/Icontrol)。再根据细胞存活率计算药物的半数抑制浓度(IC50)，并将结果列于表1。
表1：MTT法检测药物对各细胞的生长抑制作用
表中的YIGSR-DOX为YIGSR-glt-14-O-DOX。从表1的结果中可以看出，DOX与SGC-7901、SW480、LH-02和B16细胞作用5小时的半数抑制浓度(IC50)分别为11.46±2.18μM、21.55±1.62μM、167.71±2.38μM和15.39±1.42μM。而YIGSR-glt-14-O-DOX对细胞作用5小时后的IC50值分别为82.16±3.24μM、65.37±2.68μM、191.5±3.22μM和73.65±4.74μM。尽管偶联化合物的浓度以其中所含DOX计与DOX量相当，但在短时间内，偶联化合物被各种细胞吸收，或者是DOX从化合物中释放的量有限，导致偶联化合物对体外培养细胞的毒性(生长抑制作用)比DOX低(IC50值较高)。到48小时后，偶联化合物对体外培养细胞的毒性(生长抑制作用)比DOX更强(IC50值低)。
实施例22：酪-异亮-甘-丝-精-戊二酰基-14-氧-阿霉素在荷瘤动物体内的分布
为了了解含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的蒽环型衍生物在荷瘤动物体内的分布特性，进行本试验。首先建立荷瘤动物模型。C57BL/6小鼠106只，鼠龄6～8周，体重18～22克，雌雄不限。取细胞67LR高度表达的鼠黑色素肉瘤B16细胞株，胰蛋白酶消化后500g离心5分钟。用生理盐水重悬，制备成1×107个细胞悬液接种在小鼠右背部近后枝侧。动物接种肿瘤两周后，接种局部形成约90～120mm3大小肿块。实验动物随机分成24组，其中有8组荷瘤动物(每组5～6只)经其尾静脉注射阿霉素(DOX)，给药剂量为6mg/kg体重。另外8组动物(每组5～6只)经由尾静脉注入酪-异亮-甘-丝-精-戊二酰基-14-氧-阿霉素化合物(YIGSR-glt-14-O-DOX)，给与剂量是按其所含DOX的量计为6mg/kg体重。还有8组动物(每组1～2只)经由尾静脉注入生理盐水为空白对照组，其血浆和组织样品用于制作标准曲线。荷瘤动物在注药后的0.25、0.5、1、2、4、8、24和48小时，取其血液立即离心，留置血浆并冻存于-70℃下，便于样品集中检测。随后处死动物并取其肝脏、心脏、肺、肾脏和肿瘤组织称重，用无菌生理盐水洗去组织上的血迹后剪成小块，再用匀浆器将组织匀浆。样品用标签标记后冻存于-70℃直到检测。参照实施例3，采用HPLC检测动物血浆和组织样品中的DOX含量，结果显示在图10。按6mg/kg体重的剂量注入DOX和YIGSR-glt-14-O-DOX到荷瘤动物体内后，从不同时间段(48小时内)分别取得的动物血浆样品，经HPLC检测其中的DOX浓度，结果显示在图10A。从图中可知，小分子DOX进入血液0.25小时(15分钟)后，平均血药浓度约为6.18±0.11μg/mL，随后在2小时内血中药物浓度迅速下降。而YIGSR-glt-14-O-DOX进入体内0.25小时后，血药浓度超过30μg/mL。而且，在其它各个时间点上，偶联物实验组动物血中药物浓度都是超过DOX实验组。这些数据说明，小分子蒽环类药物进入体内后随血液循环到达全身组织，很快进入各组织细胞内，使血中药物浓度迅速下降。而偶联化合物进入体内后，不能经过简单被动扩散方式进入组织细胞，需与细胞膜上的67LR结合，通过67LR介导才能进入细胞内。由于细胞吸收偶联化合物与细胞67LR的表达水平相关，大量没有67LR表达或低67LR表达的正常组织细胞不能摄取或很少摄取药物，使得偶联化合物在血液中的浓度下降缓慢。因此，偶联化合物在血液中可以维持比没有偶联的小分子蒽环类药物有更持久、更高的药物浓度，这样的结果对药物发挥抗肿瘤作用非常有利。图10B、10C、10D和10E分别显示了动物给与DOX或YIGSR-glt-14-O-DOX后，药物在动物的肝脏、肺、肾脏和心脏组织中的分布情况。从图10B中可知，由于肝脏是DOX代谢的主要器官，静脉注入DOX后，肝中DOX的浓度较肺、肾脏和心脏组织中高。给药30分钟，肝中DOX浓度为26.13±1.42μg/g组织，4小时后DOX浓度开始下降。与DOX不同，在各个时间点(0.25、0.5、1、2、4、8、24和48小时)上，偶联物实验组动物肝中的药物浓度都较DOX实验组的低。在动物的肺和肾组织中也发现了类似的药物分布态势(图10C和图10D)。另外，因为心脏损害是蒽环类药物最为显著和突出的毒性作用，DOX在心脏中的分布一直受到特别的关注。DOX用药组，心脏中的药物浓度在1小时左右达高峰(2.65±0.74μg/g组织)，随后逐渐下降，到24小时后，心脏组织中DOX浓度较峰浓度时，下降超过了20％(图10E)。与DOX用药组相比，从偶联物动物组的心脏组织中，检测的药物浓度较低，用药1小时的峰值浓度比DOX实验组的平均低5.2倍。上述实验结果显示，蒽环类药物缺乏区分正常细胞和肿瘤细胞选择性，在体内容易扩散，导致相对平均的全身组织广泛分布，对正常组织产生严重的伤害。相反，蒽环类药物与YIGSR多肽结合形成偶联化合物后，改变了这类药物在体内的生物学分布。由于细胞吸收偶联化合物与细胞67LR的表达水平相关，大量没有67LR表达或低67LR表达的正常组织细胞不能摄取或很少摄取药物，极大地降低了药物在正常组织内的分布，从而降低了药物的毒性副作用。特别是有效地降低了药物在心脏组织中的分布，对改善蒽环类药物造成的不可逆性心肌细胞损害尤为重要。
图10F显示了药物在DOX和YIGSR-glt-14-O-DOX实验动物的肿瘤组织中的分布状态。蒽环类药物化合物因为相对平均地分布到全身各处组织的缘故，肿瘤细胞内的药物含量非常有限，在DOX实验组，给药0.5小时后肿瘤组织中药物浓度到达最高峰(峰浓度平均为2.55μg/g组织)，24小时后浓度下降到1.24μg/g，至48小时，肿瘤组织中的药物浓度进一步下降到0.67μg/g左右。另一方面，由于B16肿瘤细胞67LR高度表达，YIGSR-glt-14-O-DOX能够选择性地识别67LR过度表达的肿瘤细胞，67LR高度表达的肿瘤细胞内积聚高浓度的药物，在YIGSR-glt-14-O-DOX实验动物组，给药8小时后，检测肿瘤组织中的药物浓度到达最高峰，峰浓度平均为24.32μg/g组织(峰值相比，较DOX组高9.5倍)。48小时后，肿瘤组织中的药物浓度仍维持在6.4μg/g。说明偶联物具有肿瘤靶向输送药物的作用，肿瘤局部积聚高浓度药物，有利于提高药物的抗肿瘤作用。
实施例23：酪-异亮-甘-丝-精-戊二酰基-14-氧-阿霉素在体内的抗肿瘤作用
为了判断含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的蒽环型衍生物的抗肿瘤效果，选择鼠龄6～8周的C57BL/6小鼠(体重18～22克)共70只，雌雄不限。取细胞67LR高度表达的鼠黑色素肉瘤B16细胞株，胰蛋白酶消化后500g离心5分钟。用生理盐水重悬，制备成1×107个细胞悬液接种在小鼠右背部近后枝侧，建立动物的种植性肿瘤模型。所有实验动物随机分成3组，分别在肿瘤接种后的第1天、第8天、第15天和第22天经尾静脉给药。第I组动物经尾静脉注射0.5mL生理盐水为空白对照组。第II组动物按其体重经尾静脉注入5mg/kg的阿霉素(DOX)；第III组动物经尾静脉给与酪-异亮-甘-丝-精-戊二酰基-14-氧-阿霉素化合物(YIGSR-glt-14-O-DOX)，给与剂量是按其所含DOX的量计为5mg/kg体重。每天用游标卡尺测量并记录瘤体的长径(a)和短径(b)，根据如下公式计算动物瘤体的体积(V)：V(mm3)＝(a×b2)/2。通过观察瘤体大小变化和动物的存活状态，并与非靶向性蒽环类药物进行比较，来评价含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的蒽环型衍生物对动物体内的抗肿瘤作用。
如图11A所示，接受DOX治疗的动物，其接种的肿瘤生长缓慢，治疗30天后，瘤体体积比空白对照组动物的肿瘤缩小了36％，两者间呈显著性差异(＊p＜0.05)。相应地，接受DOX治疗的动物存活时间较空白对照组的延长(见图11B)。将接受YIGSR-glt-14-O-DOX治疗的动物与空白对照组相比，治疗30天后，比较瘤体体积的变化，发现比空白对照组动物的肿瘤缩小了近70％，YIGSR-glt-14-O-DOX的抗肿瘤作用非常明显，两者相比差异非常显著(**p＜0.01)(见图11A)。并且，与接受DOX治疗的动物相比，其瘤体体积也减小了36％(＊p＜0.05)。动物存活时间更长，YIGSR-glt-14-O-DOX的抗肿瘤效果比DOX更明显。说明DOX与YIGSR结合形成偶联化合物后，具有对肿瘤组织的靶向输送作用，减轻了DOX对荷瘤小鼠的毒性副作用，增强了抗肿瘤作用。
Claims (20)
1.一种含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的蒽环型衍生物，其通式如下：Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-AN，Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg表示酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸五肽序列，AN表示蒽环类化合物。
2.根据权利要求1所述的含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的蒽环型衍生物，其通式如下：Z1-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Z1-AN，Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg表示酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸五肽序列，AN表示蒽环类化合物，Z1和Z2分别选自氢、羟基、氨基、酯基、硫醚、硫醇、羧基、羰基、卤素、硝基、氰基、芳烷基、芳基、饱和或不饱和的杂环基团。
3.根据权利要求2所述的含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的蒽环型衍生物，其中Z1和Z2分别选自甲苯璜酰基、三氟甲璜酚酯、三氟乙酸酯、一或二苄化氨基、酰化氨基、三氟酰基、三氟酰化氨基、吗啉代、氰基取代的吗啉代、一、二、三或四-甲氧基取代的吗啉代、一、二、三或四-酰氧基取代的吗啉代、C1-C16酰基、C1-C16芳基酰基、酰基、C1-C16酰氧基、酰氧基、酰胺基、C1-C16烷基、C1-C16烷氧基、烷氧基烷基、烃烷基、芳烷基、芳烷氧基烷基、C1-C16芳基氨基羰基、C1-C16芳基氨基硫代羰基、C3-C8环烷基、C3-C8烷基二羧酸基团或羰基或硫代羰基、单糖或多聚糖。
4.根据权利要求2或3所述的含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的蒽环型衍生物，其通式如下：Z1-Aaa1-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Aaa2-Z2-AN，其中，AN为蒽环类化合物；Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg为酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸五肽序列；Aaa1表示一个或者任意长度的氨基酸或其衍生物，Aaa2表示一个或者任意长度的氨基酸或其衍生物，Aaa1和Aaa2可以相同或不同。
5.根据权利要求1、2或4所述的含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的蒽环型衍生物，其中所述的蒽环类化合物是阿霉素或其衍生物。
6.根据权利要求1、2或4所述的含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的蒽环型衍生物，其中所述的蒽环类化合物是表阿霉素或其衍生物。
7.根据权利要求1、2或4所述的含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的蒽环型衍生物，其中所述的蒽环类化合物是吡柔比星或其衍生物。
8.根据权利要求1、2或4所述的含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的蒽环型衍生物，其中所述的蒽环类化合物是阿克拉霉素或其衍生物。
9.根据权利要求1、2或4所述的含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的蒽环型衍生物，其中所述的蒽环类化合物是去甲氧柔红霉素或其衍生物。
10.根据权利要求1、2或4所述的含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的蒽环型衍生物，其中所述的蒽环类化合物是米托蒽醌或其衍生物。
11.根据权利要求1、2或4所述的含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的蒽环型衍生物，其中所述的蒽环类化合物是替洛蒽醌或其衍生物。
12.根据权利要求5所述的含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的蒽环型衍生物，其结构是如下：
13.根据权利要求5所述的含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的蒽环型衍生物，其结构是如下：
14.根据权利要求5所述的含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的蒽环型衍生物，其结构是如下：
15.根据权利要求4所述的含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的蒽环型衍生物，其结构式如下：
16.根据权利要求4所述的含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的蒽环型衍生物，其结构式如下：
17.一种含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的蒽环型衍生物的制备方法，它是以9-芴甲氧羰基保护氨基酸为原料，采用王氏树脂固相多肽合成法合成酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽，然后以戊二醛作为交联剂，将酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽与蒽环型化合物进行交联形成偶联化合物。
18.一种含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的蒽环型衍生物的制备方法，它是将酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽溶于二甲基亚砜中，随后分别加入1-羟基苯并三氮唑和二环己基碳二酰亚胺，再将蒽环型化合物溶于二甲基亚砜后加入反应体系中进行反应，经制备型HPLC层析得酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽阿霉素偶联化合物。
19.一种含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的蒽环型衍生物的制备方法，它是通过二羧酸将蒽环型化合物与酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽偶联在一起形成化合物。
20.一种含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的蒽环型衍生物的制备方法，它是以戊4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯作为交联剂，将含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的化合物与蒽环类化合物进行交联形成含酪-异亮-甘-丝-精氨酸多肽的蒽环型衍生物。
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