CN102875651A - 抗肿瘤靶向激活的多肽阿霉素、其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗肿瘤靶向激活的多肽阿霉素、其制备方法和用途，该多肽阿霉素由化合物A的氨基与化合物B的羧基缩合制得，该化合物A、化合物B的结构如下：该化合物A为阿霉素或其衍生物，该化合物B为凝血蛋白酶和VIIa能够特异性水解的四肽、四肽衍生物、五肽或五肽衍生物的一种。R3为Leu或没有；R4可为Pro,Thr,Phe,Leu,Val或Ala中的任意一种；R5可为Thr,Tyr,Phe,Leu或Val中的任意一种；R6可为任意一种氨基酸；R选择Succinyl或R7；R7选择基团（1）或基团（2）
Description
技术领域
本发明涉及一种抗肿瘤药物化合物，具体地，涉及一种抗肿瘤靶向激活的多肽阿霉素、其制备方法和用途。
背景技术
盐酸阿霉素是一种目前广谱使用的有效的抗肿瘤剂， 用于治疗血液和固体肿瘤，如乳腺癌和卵巢癌，肉瘤，和许多其他实体肿瘤，具有作用强和可用于各生长期的肿瘤等特点。然而，临床上应用这一蒽环类化合物因为具有严重的毒副作用，而被限制其使用剂量。盐酸阿霉素引发多项不良反应，包括骨髓毒性，胃肠疾病，口腔炎，脱发，外渗，急性和累积性心脏毒性。盐酸阿霉素的主要限制是在每个疗程后，大剂量盐酸阿霉素导致骨髓，骨髓和血液中单核细胞和血小板急剧减少。特别令人关切的是累积性心脏毒性能够引发心肌充血性心力衰竭，是不可逆转的，达到5%次累积剂量的阿霉素超过550毫克/平方米。 阿霉素的结构如下：
因此，需要提供一种能降低盐酸阿霉素的毒性，并具有高度药效的抗肿瘤剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种靶向肿瘤微环境的凝血蛋白酶和VIIa激活的多肽阿霉素，该多肽阿霉素比盐酸阿霉素及其衍生物大大降低了药物的毒性，并且药效也有很大的提高。
为了达到上述目的，本发明提供了一种抗肿瘤靶向激活的多肽阿霉素，该多肽阿霉素由化合物A的氨基与化合物B的羧基缩合制得，所述化合物A、化合物B的结构如下：
该化合物A为阿霉素或其衍生物，该化合物B为凝血蛋白酶、水和VIIa能够特异性水解的四肽、四肽衍生物、五肽或五肽衍生物的一种。凝血蛋白酶、水和VIIa都能在Arg 氨基酸前面的位置将肽段水解切断,从而释放A-Leu或A。
四肽: -Arg-R4-R5-R6-；
五肽: -R3-Arg-R4-R5-R6-；
R3 为 Leu 或没有，R3没有就相当于四肽，即Arg的羧基直接与化合物A的氨基共价缩合得到多肽阿霉素。
R4可为Pro,Thr,Phe,Leu,Val或Ala中的任意一种氨基酸。
R5 可为 Thr,Tyr,Phe,Leu 或Val中的任意一种氨基酸。
R6 可为任意一种氨基酸，优选为 Leu或Trp。
R选择丁二酸单酰基（即琥珀酰基，Succinyl）或R7，该丁二酸单酰基能保护氨基酸不被体内的氨基酸外切酶水解；R7选择基团（1）或基团（2）
，其中，所述基团（1）中的n=1～20，所述基团（2）中的R8为取代或未取代的C1～C20的直链或支链饱和或不饱和脂肪烃以及取代或未取代的C6～C20芳香烃。进一步地，R7优选：
上述的抗肿瘤靶向激活的多肽阿霉素，其中，所述的阿霉素衍生物是指表阿霉素，为阿霉素的同分异构体，该表阿霉素的结构式为：
本发明还提供了一种上述的抗肿瘤靶向激活的多肽阿霉素的制备方法，该方法包括以下具体步骤：
步骤1，制备化合物B：偶联氨基酸残基，并分离得到所形成的多肽R3-Arg-R4-R5-R6；
步骤2，步骤1所得到的化合物B的R3端的羧基与化合物A的氨基共价结合，形成多肽阿霉素；
其中，R3为 Leu 或没有，R4选择Pro,Thr,Phe,Leu,Val或Ala中的任意一种氨基酸，R5 选择 Thr,Tyr,Phe,Leu 或Val中的任意一种氨基酸，R6 选择任意一种氨基酸，优选为 Leu或Trp。
上述的抗肿瘤靶向激活的多肽阿霉素的制备方法，其中，所述的步骤1还包含：步骤1.1，在化合物B的R6端形成氨基保护基，该氨基保护基优选为丁二酸单酰基，该丁二酸单酰基能保护氨基酸不被体内的氨基酸外切酶水解。
上述的抗肿瘤靶向激活的多肽阿霉素的制备方法，其中，所述的步骤1还包含：步骤1.2，将步骤1得到的多肽R3-Arg-R4-R5-R6与R7-Cl或R7-OH的酰基或羧基反应得到R3-Arg-R4-R5-R6-R7，R7选择基团（1）
或基团（2）
，所述基团（1）中的n=1～20，所述基团（2）中的R8为取代或未取代的C1～C20的直链或支链饱和或不饱和脂肪烃以及取代或未取代的C6～C20芳香烃。
本发明还提供了一种上述的多肽阿霉素在用于制备抗肿瘤药物中的应用。
由于肿瘤生长增强血管通透性，血清白蛋白能够在肿瘤微环境中积累。 同时凝血因子能够在肿瘤微环境中不断激活肿瘤以及间质细胞表面的凝血级联反应。在肿瘤微环境,组织因子激发的凝血级联反应和纤维蛋白沉积, 这使凝血级联反应中的酶能够成为一个有吸引力的肿瘤药物疗法的靶点。例如以纤溶酶为靶点的阿霉素衍生物，以组织蛋白酶为靶点的阿霉素衍生物。 因此，我们合成了以阿霉素或其衍生物为原料的针对凝血蛋白酶的衍生物。该衍生物还包括能够与血清白蛋白结合的ε- maleimidocaproic(EMC)酸基团，与血清白蛋白结合更增加了靶向药物的溶解性和体内代谢的半衰期。此凝血级联反应的靶向药物大大降低了阿霉素或其衍生物的毒性，使得制备得到的药物在体内都具有很好的运送到肿瘤部位并在肿瘤微环境中的激活的靶向性，能够减少对其他器官和组织的毒性,只在肿瘤部位释放抗肿瘤活性。
综上所述，本发明提供的抗肿瘤靶向激活的多肽阿霉素，其中，凝血蛋白酶、水和VIIa都能在该多肽阿霉素的Arg 氨基酸前面的位置将肽段水解切断,从而释放A-Leu或A；从而，使得本发明的多肽阿霉素具有抗肿瘤靶向性，相对于阿霉素及其衍生物，药效有很大的提高，且药物的毒性大大降低，具有非常好的应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步地说明。
本发明提供靶向肿瘤微环境的激活的多肽阿霉素的制备方法,包括如下步骤：首先，使用已知的化学、生物学或重组技术偶联氨基酸残基，并分离得到所形成的多肽R3-Arg-R4-R5-R6；其次，将形成的多肽的氮段通过已知的化学或生物学方法与能与白蛋白结合的R7的羧基或酰基或丁二酸酐反应形成共价结合物R3-Arg-R4-R5-R6（NH）-R，其中R为R7或丁二酸单酰基；然后将R3-Arg-R4-R5-R6-R的R3的羧基通过已知的化学或生物学方法与阿霉素或其盐或阿霉素衍生物及其盐（即化合物A）的氨基共价结合，从而形成带有短肽以及能与血清白蛋白相结合的集团的阿霉素类似物，化合物A—R3-Arg-R4-R5-R6-R。反应路线图如下：
其中，缩合剂包括用于羧酸与氨基缩合反应成酰胺的已知的化学试剂单独使用或结合使用，如1-羟基苯并三氮唑（HOBT）、N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐）（EDCI）、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯（TATU）、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯（TBTU）、N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑（HOAT）、卡特缩合剂（BOP）、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷（PyBOP）等。
其中，碱包括无机碱和非质子性的有机碱，无机碱如碳酸钠、碳酸钾、碳酸锂、碳酸钙、碳酸镁、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙、碳酸氢镁等，非质子性有机碱包括三乙胺、N,N-二异丙基乙基胺、吡啶、4-二甲氨基吡啶、N-甲基吗啉等。
极性非质子性溶剂包括N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙腈、二氧六环、甲基叔丁基醚、乙二醇二甲醚、二甲亚砜、六甲基磷酰胺等。
实施例1：靶向肿瘤微环境的激活的多肽阿霉素S1合成
S1的合成路线如下：
1. Cbz-L-Leu-L-Thr-L-Pro-L-Arg(Pmc)-L-Leu-OtBu五肽的合成
1）Cbz-L-Arg(Pmc)-L-Leu-OtBu（I）的合成
在三颈瓶中将N-苄氧羰基-N’-（2,2,5,7,8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基）-精氨酸（0.1mol）、N-甲基吗啉（0.1mol）溶于N,N-二甲基甲酰胺（1000mL）中，冷却至-15℃下，搅拌下滴加氯甲酸异丁酯（0.1mol），搅拌30分钟后，加入冰浴冷却的L-亮氨酸叔丁酯盐酸盐（ 0.1mol）和三乙胺（0.1mol）的N，N-二甲基甲酰胺（500mL）的混合溶液，完毕后在0℃下搅拌1小时，升至15℃下搅拌3小时，减压蒸除溶剂，残余物加入1mol/L的枸橼酸溶液，过滤收集沉淀，用水洗后真空干燥，粗品经甲醇/乙酸乙酯重结晶，再用乙酸乙酯洗涤后得到产物Cbz-L-Arg(Pmc)-L-Leu-OtBu（I）（收率：68.64%）。
2）L-Arg(Pmc)-L-Leu- OtBu（II）的合成
在冰浴下将Cbz-L-Arg(Pmc)-L-Leu-OtBu（0.1mol）溶于800mL乙醇中，加入10%钯炭催化剂（4.5g），通入氢气搅拌反应3小时，过滤除去钯炭催化剂，减压蒸除溶剂得到脱除苄氧羰基保护的L-Arg(Pmc) -L-Leu-OtBu二肽（II）粗产品，直接用于下一步反应。
3）Cbz-L-Pro-L-Arg(Pmc)-L-Leu-OtBu（III）的合成
将步骤2所得二肽（II）溶于二氯甲烷（1000mL）和N,N-二甲基甲酰胺（200mL）的混合溶液中，加入1-羟基苯并三氮唑（0.3mol）和N,N’-二环己基碳二亚胺（0.3mol），搅拌2小时后加入Cbz-L-Proline(0.1mol)，室温下搅拌过夜，减压蒸除溶剂，残余物溶于氯仿(100ml)，依次用饱和氯化铵溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后蒸除溶剂，所得粗产品经硅胶柱层析后得到化合物Cbz-L-Pro-L-Arg(Pmc)-L-Leu-OtBu（III）（收率：68.72%）。
4）L-Pro-L-Arg(Pmc)-L-Leu-OtBu（IV）的合成
将Cbz-L-Pro-L-Arg(Pmc)-L-Leu -OtBu（0.1mol）溶于500mL乙醇中，加入10%钯炭催化剂（5g），通入氢气室温下搅拌反应过夜，过滤除去钯炭催化剂，减压蒸除溶剂得到脱除苄氧羰基保护的L-Pro-L- Arg(Pmc)-L-Leu-OtBu三肽（IV）粗品，直接用于下一步反应。
5）Cbz-L-Leu-L-Thr-OMe（V）的合成
将Cbz-L-Leu-OH(0.1mol)和L-Thr-OMe(0.1mol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺（1000mL）中，加入1-羟基苯并三氮唑（0.3mol）,反应液冷却至0℃以下，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（0.3mol）和N,N-二异丙基乙基胺（0.5mol）,升至室温下搅拌过夜。反应完毕后减压蒸除溶剂，残余物中加入水和乙酸乙酯，分液，水相用乙酸乙酯洗涤，合并乙酸乙酯相后依次用1mol/L盐酸、饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂后所得粗品经硅胶柱层析分离得到产物Cbz-L-Leu-L-Thr-OMe（V）（收率：94%）。
6）Cbz-L-Leu-L-Thr-OH（VI）的合成
将Cbz-L-Leu-L-Thr-OMe（0.1mol）溶于500mL四氢呋喃和500mL水的混合溶液中，冰浴至0℃以下加入氢氧化锂（1mol），保持0℃下搅拌18小时，反应完毕后用1N盐酸中和淬灭，减压蒸除大部分四氢呋喃，加入乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗后用无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂得到脱除甲基保护的Cbz-L-Leu-L-Thr-OH（VI）二肽粗产品直接用于下一步反应。
7）Cbz-L-Leu-L-Thr-L-Pro-L-Arg（Pmc）-L-Leu-OtBu（VII）的合成
将步骤4）得到的L-Pro-L-Arg(Pmc)-L-Leu-OtBu（IV）三肽粗品溶于无水N,N-二甲基甲酰胺（800mL）中，加入上述所得Cbz-L-Leu-L-Thr-OH（VI）二肽粗品，1-羟基苯并三氮唑（0.3mol）和N,N-二异丙基乙基胺（0.3mol）,冰浴至0℃以下，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（0.3mol），反应液于室温下搅拌过夜，反应完成后减压蒸除溶剂，加入水和乙酸乙酯分液，水相用乙酸乙酯洗涤，合并乙酸乙酯层，依次用1mol/L盐酸、饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂后所得粗品经硅胶柱层析纯化得产物Cbz-L-Leu-L-Thr-L-Pro-L-Arg（Pmc）-L-Leu-OtBu（VII）（收率：65.21%）。
8）L-Leu-L-Thr-L-Pro-L-Arg(Pmc)-L-Leu- OtBu（VIII）的合成
将Cbz-L-Leu-L-Thr-L-Pro-L-Arg（Pmc）-L-Leu-OtBu（0.1mol）溶于800mL无水乙醇中，加入10%钯炭催化剂（5g），通入氢气室温下搅拌反应过夜，过滤除去钯炭催化剂，减压蒸除溶剂得到脱除苄氧羰基保护的L-Leu-L-Thr-L-Pro-L-Arg（Pmc）-L-Leu-OtBu（VIII）五肽粗品，直接用于下一步反应。
9）Fmoc-L-Leu-L-Thr-L-Pro-L-Arg(Pmc)-L-Leu- OtBu（IX）的合成
将上一步所得五肽粗品（VIII）（0.1mol）悬浮于冰浴的9%的碳酸钠溶液（240mL，0.2mol）中，在0℃强力搅拌下加入9-芴甲基琥珀酰亚胺基碳酸酯（0.10mol）的N,N-二甲基甲酰胺溶液(230mL),反应液在室温下搅拌2小时，加入水稀释，用乙酸乙酯萃取，水相在冰浴下用1mol/L盐酸调节pH至2，析出的固体和水相中加入乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯层，依次用水和饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂，残余物用乙酸乙酯/石油醚重结晶得到Fmoc-L-Leu-L-Thr-L-Pro-L-Arg(Pmc)-L-Leu- OtBu（IX）（收率：86%）。
10）Fmoc-L-Leu-L-Thr-L-Pro-L-Arg(Pmc)-L-Leu- OH（X）的合成
将上述所得Fmoc-L-Leu-L-Thr-L-Pro-L-Arg(Pmc)-L-Leu- OtBu（IX）（0.1mol）溶于250mL二氯甲烷中，加入250mL三氟乙酸，在室温下搅拌过夜，反应液减压蒸干，加入乙酸乙酯溶解，依次用水、饱和食盐水洗后无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂，残余物经乙酸乙酯/石油醚重结晶纯化后得到Fmoc-L-Leu-L-Thr -L-Pro-L-Arg(Pmc)-L-Leu- OH（X），收率：76%。
11）Fmoc-L-Leu-L-Thr-L-Pro-L-Arg(Pmc)-L-Leu- Dox（XI）的合成
将上述所得Fmoc-L-Leu-L-Thr-L-Pro-L-Arg(Pmc)-L-Leu- OH（X）（0.01mol）溶于50mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，加入六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基（0.012mol），在室温下搅拌半小时，加入多柔比星(即阿霉素)盐酸盐（0.01mol）和N,N-二异丙基乙基胺（0.03mol）的N,N-二甲基甲酰胺混合溶液，反应液室温下避光搅拌16小时，反应完成后减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析得产物Fmoc-L-Leu-L-Thr-L- Pro-L-Arg(Pmc)-L-Leu- Dox（XI），收率：42%。
12）Succinyl-L-Leu-L-Thr-L-Pro-L-Arg(Pmc)-L-Leu- Dox（S1）的合成
将上述所得Fmoc-L-Leu-L-Thr-L-Pro-L-Arg(Pmc)-L-Leu- Dox（XI）（0.01mol）溶于DMF（50mL）中，加入哌啶（10mL），反应液在室温下搅拌反应5分钟。降温至-10℃加入丁二酸酐25.0，逐渐升温到室温反应4小时。减压蒸除溶剂，残余物用乙酸乙酯溶解，依次用1mol/L盐酸、水、饱和食盐水洗涤后，经无水硫酸钠干燥，减压蒸干后用制备型HPLC纯化得到产物
Succinyl-L-Leu-L-Thr-L-Pro-L-Arg(Pmc)-L-Leu- Dox（S1），收率：50%。
实施例2 靶向肿瘤微环境的激活的并能够与血清白蛋白结合的多肽阿霉素S2合成方法
ε-maleimidocaproic acid (EMC)的合成参考文献Synthesis, 2008(8), 1316-1318。
S2的合成路线如下：
1. EMC-L-Leu-L-Thr-L-Pro-L-Arg-L-Leu-OH（XIV）的合成
1）EMC-L-Leu-L-Thr-L-Pro-L-Arg（Pmc）-L-Leu-OtBu（XII）的合成
将化合物8溶于无水N,N-二甲基甲酰胺（800mL）中，加入6-马来酰亚胺己酸（0.1mol），1-羟基苯并三氮唑（0.3mol）和N,N-二异丙基乙基胺（0.3mol）,冰浴至0℃以下，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（0.3mol），反应液于室温下搅拌过夜，反应完成后减压蒸除溶剂，加入水和乙酸乙酯分液，水相用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯层，依次用1mol/L盐酸、饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂后所得粗品经硅胶柱层析纯化得产物EMC-L-Leu-L-Thr-L-Pro-L-Arg（Pmc）-L-Leu-OtBu（XII），收率：65.21%。
2）EMC-L-Leu-L-Thr-L-Pro-L-Arg-L-Leu-OH（XIV）的合成
将EMC-L-Leu-L-Thr-L-Pro-L-Arg（Pmc）-L-Leu-OtBu（XII）（0.1mol）溶于500mL 二氯甲烷和500mL三氟醋酸的混合溶液中，室温下搅拌3小时，减压蒸除溶剂，残余物加入乙酸乙酯，依次用饱和碳酸钠和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，残余物经乙酸乙酯重结晶后得到EMC-L-Leu-L-Thr-L- Pro-L-Arg-L-Leu-OH（XIV），收率：72.34%。
2. EMC-L-Leu-L-Thr-L-Pro-L-Arg-L-Leu-Doxorubicin（S2-I）的合成
将上述所得EMC-L-Leu-L-Thr-L-Pro-L-Arg-L-Leu-OH（XIV）（0.126mmol）溶于10mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，加入六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷（0.151mmol），在室温下搅拌30分钟，加入多柔比星盐酸盐（0.126mmol）和N,N-二异丙基乙基胺（0.4mmol），保持避光，在室温下反应16小时，室温下减压蒸除溶剂，残余物经高效液相色谱分离得到目标化合物为红色粉末S2-I，产率：60%。
3. EFA-L-Leu-L-Thr-L-Pro-L-Arg-L-Leu-OH（XV）的合成
1) EFA-L-Leu-L-Thr-L-Pro-L-Arg（Pmc）-L-Leu-OtBu（XIII）的合成
将L-Leu-L-Thr-L-Pro-L-Arg（Pmc）-L-Leu-OtBu（VIII）（0.1mol）溶于无水二氯甲烷（500mL）中，冰浴至0℃下依次滴加富马酸单乙酯单乙酰氯（0.13mol）的干燥的二氯甲烷溶液，和三乙胺（0.13mol）。反应液在室温下搅拌过夜，加入氯仿稀释，依次用饱和氯化铵溶液、饱和食盐水洗涤，有机相经无水硫酸钠干燥后减压蒸除溶剂，得EFA-L-Leu-L-Thr-L-Pro-L-Arg（Pmc）-L-Leu- OtBu粗品（XIII），直接用于下一步反应。
2）EFA-L-Leu-L-Thr-L-Pro-L-Arg-L-Leu-OH（XV）的合成
将EFA-L-Leu-L-Thr-L-Pro-L-Arg（Pmc）-L-Leu-OtBu（XIII）（0.1mol）溶于500mL二氯甲烷和500mL三氟醋酸的混合溶液中，室温下搅拌3小时，减压蒸除溶剂，残余物加入乙酸乙酯，依次用饱和碳酸钠和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，残余物经乙酸乙酯重结晶后得到EFA-L-Leu-L-Thr- L-Pro-L-Arg-L-Leu-OH（XV），收率：70.76%。
4. EFA-L-Leu-L-Thr-L-Pro-L-Arg-L-Leu-Doxorubicin（S2-II）的合成
将上述所得EFA-L-Leu-L-Thr-L-Pro-L-Arg-L-Leu-OH（0.126mmol）溶于10mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，加入六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷（0.151mmol），在室温下搅拌30分钟，加入多柔比星盐酸盐（0.126mmol）和N,N-二异丙基乙基胺（0.4mmol），保持避光，在室温下反应16小时，室温下减压蒸除溶剂，残余物经制备型高效液相色谱分离得到目标化合物为红色粉末S2-II，产率：63%。
实施例3 获得注射剂
合成的S1和S2（包括S2-I及S2-II）经过真空干燥，获得红色粉末，通过气体灭菌发无菌处理，在无菌室进行分装。在动物实验前，在无菌室中用含有20%酒精的注射用水溶解,再用注射用水稀释到所需浓度。
实施例4 S1含量测定的方法及含量范围
S1和S2样品分析型HPLC（ Agilent 1100 series with C8 column VYDAC 218TP54 5 μm, 4.6 mm ID x 250 mm, mobile Phase gradient is from 0 to 95% ACN） 纯度在96%-98.4%。
以下通过药物耐受试验和药效试验证明本发明的有益效果。
试验例1 受试药静脉用药最大耐受剂量（MTD）的测定。
试验目的：通过测定小鼠静脉用药MTD 实验，了解本新药制剂的急性毒性。
治疗药物：S1 和S2注射液，试验时用生理盐水稀释到相应浓度。
动物：一级BALB/C小鼠，体重19-21g, 全为雌性。
方法和结果：受试 BALB/C小鼠72只，体重19-21g, 全为雌性，按体重随机分为6组，每组6只。按0mg, 25mg, 50 mg/kg，75mg/kg,100 mg/kg，150mg/kg一次性腹腔注射，给药体积0.2ml。连续观察17天，每日观察动物是否出现立毛树立、糟乱无光泽、昏睡、弯腰驼背、过激反应等，记录体重和死亡情况。在第3、5、14天采血样进行全血球计数，在第14天解剖动物采取心脏、肝脏、肾脏、肺、脾脏、胰腺HE染色观察。
| 组别 | 剂量（mg/kg） | 动物（只） | 死亡数（只） | 死亡率（%） | |
| 1 | 生理盐水 | 0 mg/kg | 6 | 0 | 0 |
| 2 | S1 | 25 mg/kg | 6 | 0 | 0 |
| 3 | S1 | 50 mg/kg | 6 | 0 | 0 |
| 4 | S1 | 75 mg/kg | 6 | 0 | 0 |
| 5 | S1 | 100 mg/kg | 6 | 0 | 0 |
| 6 | S1 | 150mg/kg | 6 | 2 | 33.3% |
| 7 | S2-I | 25 mg/kg | 6 | 0 | 0 |
| 8 | S2-I | 50 mg/kg | 6 | 0 | 0 |
| 9 | S2-I | 75 mg/kg | 6 | 0 | 0 |
| 10 | S2-I | 100 mg/kg | 6 | 0 | 0 |
| 11 | S2-I | 150mg/kg | 6 | 1 | 16.7% |
| 12 | S2-II | 25 mg/kg | 6 | 0 | 0 |
| 13 | S2-II | 50 mg/kg | 6 | 0 | 0 |
| 14 | S2-II | 75 mg/kg | 6 | 0 | 0 |
| 15 | S2-II | 100 mg/kg | 6 | 0 | 0 |
| 16 | S2-II | 150mg/kg | 6 | 0 | 0 |
| 17 | 盐酸阿霉素 | 10 mg/kg | 6 | 5 | 83.3% |
结果与讨论：在75mg/kg剂量时，动物没有出现立毛树立、糟乱无光泽、昏睡、弯腰驼背、过激反应和死亡情况，表1所示S1、S2药品的MTD值远大于75mg/kg，远大于盐酸阿霉素的MTD值（5～10mg/kg），受试药静脉用药最大耐受剂量是药物毒性的重要参考指数，表明血清白蛋白结合的盐酸阿霉素衍生物的毒性比盐酸阿霉素显著降低。
试验例2 S1和 S2药品在Hsd:Athymic 裸鼠中的药效研究
试验目的：通过小鼠的肿瘤治疗模型，了解S1和 S2药物的抗肿瘤药效。
治疗药物：S1和 S2 注射液和盐酸阿霉素注射液，试验时用生理盐水稀释到相应浓度。
方法和结果：
1．动物：Hsd:Athymic 裸鼠,6-8周龄，全为雌性。
2．产生肿瘤模型
1）MDA-MB231 cells从ATCC购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10%胎牛血清DMEM培养液在37℃，5%的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。 2）肿瘤产生，将106 MDA-MB231细胞皮下注射到nude 小鼠背部，待肿瘤长至0.3～0.4cm左右时随机分组，开始治疗。
3）治疗过程
根据S1和 S2临床用药使用腹腔注射，S1药物治疗组10mmol/kg (<1/10 MTD剂量），S2药物治疗组10mmol/kg (<1/10 MTD剂量） 盐酸阿霉素治疗组3mmol/kg (>1/2 MTD剂量）和对照组（生理盐水）每周两次给药，共三周。
4）分组与结果测量
5）结果与讨论：与盐酸阿霉素对照组比较，在S1和 S2组腹腔给药后，在Hsd:Athymic 裸鼠的肿瘤生长抑制效果被大大提高，S2并且导致了肿瘤缩小和清除，说明此类药物具有良好的抑制肿瘤生长的药效。
试验例3 S1和 S2药品在BALB/C小鼠的肿瘤转移模型中的药效研究
试验目的：通过BALB/C小鼠的肿瘤转移治疗模型，了解S1和 S2药物的抗肿瘤药效。
治疗药物：S1和 S2注射液和盐酸阿霉素注射液，试验时用生理盐水稀释到相应浓度。
1. 动物：BALB/C小鼠,6-8周龄，全为雌性。
2．产生肿瘤模型
1）4T1 cells从ATCC购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10%胎牛血清DMEM培养液在37℃，5%的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。 2）、肿瘤转移的产生，将106 T1 cells细胞皮下注射到BALB/C小鼠背部，待肿瘤长至1.5cm左右时随机分组，手术去除皮下肿瘤，并开始用药物治疗，在第27天时麻醉后处死小鼠，取出整个肺，放入Bouin’s溶液中染色，在解剖显微镜下统计转移到肺部的肿瘤数量。
3）治疗过程：根据S1和S2临床用药使用腹腔注射，S1药物治疗组10mmol/kg (<1/10 MTD剂量）， S2药物治疗组10mmol/kg (<1/10 MTD剂量），盐酸阿霉素治疗组3mmol/kg (>1/2 MTD剂量）和对照组（生理盐水）每天给药，共8天。
4）分组与结果测量
| 组别 | 动物 | 转移肿瘤数量 | 抑制转移率 |
| S 1组 | 10 | 31±11 | 78.6% |
| S 2-I组 | 10 | 12±6 | 91．8% |
| S 2-II组 | 10 | 14±7 | 85.0% |
| 盐酸阿霉素对照组 | 10 | 93±18 | 35.9% |
| 模型对照组 | 10 | 145.0±26 | — |
5）结果与讨论：与盐酸阿霉素对照组比较，在S1和S2组腹腔给药后，在BALB/C小鼠的肿瘤转移抑制效果被大大提高，说明此类药物具有良好的抗肿瘤转移药效。
综上所述，本发明合成了血清白蛋白结合的盐酸阿霉素衍生物，并通过毒性和药效试验证明化合物比盐酸阿霉素具有更低的毒性的，同时还具有显著的抗肿瘤生长和转移的活性。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (10)
1.一种抗肿瘤靶向激活的多肽阿霉素，其特征在于，该多肽阿霉素由化合物A的氨基与化合物B的羧基缩合制得，所述化合物A、化合物B的结构如下：
该化合物A为阿霉素或其衍生物，
该化合物B为凝血蛋白酶和VIIa能够特异性水解的四肽、四肽衍生物、五肽或五肽衍生物的一种，其中，R3为 Leu 或没有，R4选择Pro, Thr, Phe, Leu, Val或Ala中的任意一种氨基酸，R5 选择 Thr, Tyr, Phe, Leu 或Val中的任意一种氨基酸，R6 选择任意一种氨基酸，R选择丁二酸单酰基或R7；R7选择基团（1）
或基团（2），其中，基团（1）中的n=1～20，基团（2）中的R8为取代或未取代的C1～C20的直链或支链饱和或不饱和脂肪烃以及取代或未取代的C6～C20芳香烃。
2.如权利要求1所述的抗肿瘤靶向激活的多肽阿霉素，其特征在于，所述的阿霉素衍生物是指表阿霉素，为阿霉素的同分异构体，该表阿霉素的结构式为：
3.如权利要求1或2所述的抗肿瘤靶向激活的多肽阿霉素，其特征在于，所述的R6选择Leu或Trp氨基酸。
4.如权利要求1或2所述的抗肿瘤靶向激活的多肽阿霉素，其特征在于，所述的R7选择：
。
5.一种根据权利要求1所述的抗肿瘤靶向激活的多肽阿霉素的制备方法，其特征在于，该方法包括以下具体步骤：
步骤1，制备化合物B：偶联氨基酸残基，并分离得到所形成的多肽R3-Arg-R4-R5-R6；
步骤2，步骤1所得到的化合物B的R3端的羧基与化合物A的氨基共价结合，形成多肽阿霉素；
其中，R3为 Leu 或没有，R4选择Pro, Thr, Phe, Leu, Val或Ala中的任意一种氨基酸，R5 选择 Thr, Tyr, Phe, Leu 或Val中的任意一种氨基酸，R6 选择任意一种氨基酸。
6.如权利要求5所述的抗肿瘤靶向激活的多肽阿霉素的制备方法，其特征在于，所述的步骤1还包含：步骤1.1，在化合物B的R6端形成氨基保护基。
7.如权利要求6所述的抗肿瘤靶向激活的多肽阿霉素的制备方法，其特征在于，所述的步骤1.1中，R6端形成的氨基保护基为丁二酸单酰基。
8.如权利要求5所述的抗肿瘤靶向激活的多肽阿霉素的制备方法，其特征在于，所述的步骤1还包含：步骤1.2，将步骤1得到的多肽R3-Arg-R4-R5-R6与R7-Cl或R7-OH的酰基或羧基反应得到R3-Arg-R4-R5-R6-R7，R7选择基团（1）
或基团（2）
，所述基团（1）中的n=1～20，所述基团（2）中的R8为取代或未取代的C1～C20的直链或支链饱和或不饱和脂肪烃以及取代或未取代的C6～C20芳香烃。
9.如权利要求8所述的抗肿瘤靶向激活的多肽阿霉素的制备方法，其特征在于，所述的R7选择：
10.一种根据权利要求1所述的多肽阿霉素在用于制备抗肿瘤药物中的应用。
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