CN104147612A - 一种肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体及其用途，该化合物具有如下通式：
Description
技术领域
本发明属于药物化学领域，涉及一种抗肿瘤药物化合物，具体地，一种肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体及其用途。
背景技术
在肿瘤微环境中，肿瘤细胞表达分泌大量的天冬酰胺肽链内切酶。肿瘤相关巨噬细胞(M2型)区别于单核细胞和炎症型巨噬细胞(M1型)确认标记也是天冬酰胺肽链内切酶的表达。肿瘤分泌的细胞因子诱导单核细胞转化为肿瘤相关巨噬细胞,肿瘤相关巨噬细胞能够刺激产生强烈的免疫抑制和直接帮助肿瘤细胞浸润和转移,同时肿瘤细胞转移时通常分泌大量的蛋白酶水解酶以降解细胞间质。因此,因此结合生物化学及药效药理学检测筛选,不断合成新的化合物,筛选出利用天冬酰胺肽链内切酶可以激活,通过连接臂扩展偶联药物，而又在血液中稳定的化学偶联体,并同时具有靶向和激活的特征化合物。由于化合物中的不同结构能够封闭和改变药物的特性,而肿瘤微环境特异激活的小分子靶向能够释放药物的封闭,所以整体偶联体的靶向、激活、稳定、溶解性、代谢、毒性和药效等功能产生巨大影响。
因此，需要提供一种能将作用药物与功能化合物链接起来，变为靶向激活药物的偶联体。
发明内容
本发明的目的为开发抗肿瘤药物而创造新的具有激活功能等复杂功能的偶联体，提供一类能被天冬酰胺肽链内切酶高效特异性激活等复杂功能的偶联体,该偶联体的结构可以用于抗肿瘤药物中的一部分,能起到改变连接药物的靶向、激活、稳定、溶解性、代谢、毒性和药效的特性。
为达到上述目的，本发明提供了一种肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，该偶联体具有如下通式：
其中，R1为常规功能基团或保护基团,R2为Thr(苏氨酸)，Val(缬氨酸),Ile(异亮氨酸)或Ala(丙氨酸)，中的任意一种氨基酸；R3为Ala，Thr，Val或Asn(天冬氨酸)中的任意一种氨基酸，R4为通过羟基或氨基连接的药物基团，该药物的通式为R4-H。
上述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其中，R1选择氢、亲水基团、疏水基团、氨基保护基团、聚乙二醇、琥珀酰、葡糖苷酸、6-马来酰亚胺己酰，2-甲氧基乙氧基、己酰基中的任意一种。
上述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其中，R2选择Thr、R3选择Ala,该药物的通式为：
上述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其中，R2选择Val、R3选择Ala,该药物的通式为
上述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其中，R2选择Ile、R3选择Ala,该药物的通式为
上述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其中，R2选择Ala、R3选择Ala,该药物的通式为
上述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其中，R4是通过羟基连接的药物基团，R4＝R5-O，R5与酰基结合形成偶联体，该偶联体的通式为：该药物的通式为R5-OH，该药物选择喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康、氟脲苷、去氧氟尿苷、阿糖胞苷、依托泊苷、氟达拉滨、依托泊苷、卡培他滨、长春新碱、埃坡霉素B中的任意一种。
上述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其中，该偶联体是以R1-R2-R3-天冬酰胺酰基-对氨基苯甲醇为关键中间体制备；优选地，制备该偶联体的反应路线如下：
该路线是使得R1-R2-R3-天冬酰胺酰基-对氨基苯甲醇经氯甲酸对硝基苯酚酯或三光气活化反应生成活性碳酸酯或氯甲酸酯后，再与含有醇羟基的药物R5-OH反应，生成偶联体碳酸二酯产物。
上述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其中，R4是通过氨基连接药物的基团，R4＝R6-NH，R6与酰基结合形成偶联体，该偶联体的通式为：该药物的通式为R6-NH2，该药物选择柔红霉素、表阿霉素、甲氨蝶呤、氟达拉滨、吉西他滨、阿糖胞苷、美法仑、尼莫司汀、米托蒽醌中的任意一种。
上述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其中，该偶联体是以R1-R2-R3-天冬酰胺酰基-对氨基苯甲醇为关键中间体制备；优选地，制备该偶联体的反应路线如下：
该路线是使得R1-R2-R3-天冬酰胺酰基-对氨基苯甲醇经氯甲酸对硝基苯酚酯或三光气活化反应生成活性碳酸酯或氯甲酸酯后，再与含有氨基的药物R6-NH2反应，生成偶联体碳酸二酯产物。
上述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其中，所述的连接体具有S1-S5、S7-S27中的任意一种结构。
本发明还提供了一种上述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体的用途，该偶联体用于制备偶联药物，该偶联药物在肿瘤组织或天冬氨酸激活实验中取得很高的激活释放效率。
本发明还提供了一种上述的特异激活的偶联体的用途，该偶联体用于制备抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物能用于不同抗癌症类型的治疗和免疫治疗，所述的不同癌症类型包括：膀胱、脑、乳房/乳腺、宫颈、结肠-直肠、食管、肾、肝、肺、鼻咽、胰腺、前列腺、皮肤、胃、子宫、卵巢、睾丸和血液学的癌症。
肿瘤相关巨噬细胞(M2型)区别于单核细胞和炎症型巨噬细胞(M1型)确认标记就是天冬酰胺肽链内切酶的表达。肿瘤分泌的细胞因子诱导单核细胞转化为肿瘤相关巨噬细胞,肿瘤相关巨噬细胞能够刺激产生强烈的免疫抑制和直接帮助肿瘤细胞浸润和转移。
由于天冬酰胺肽链内切酶特异性激活的偶联体的不同部分对最终药物在靶向、激活、稳定、毒性和药效等功能产生巨大影响,本发明天冬酰胺肽链内切酶特异性激活的偶联体的使用能够有效降低被联接药物的毒性,使最终药物带有了新的靶向、激活和代谢特性,增加了治疗肿瘤的效果,并产生了新的肿瘤适应症和对抗肿瘤转移产生作用,产生了全新的结构和功能。
本发明通过试验发现该偶联体的特性如下:(1)该偶联体可以通过基团转换,将R4更换为多个对肿瘤具有治疗或辅助治疗效果的药物。(2)通过天冬酰胺肽链内切酶的特异性激活，只有肿瘤微环境中的肿瘤细胞或肿瘤相关巨噬细胞释放有效药物，以达到靶向激活的目的。如果药物无法激活,药物是一个无细胞毒性或低毒的药物,不会杀害正常细胞。(3)该偶联体在非肿瘤微环境的部位是稳定不激活的,如心脏组织。(4)该偶联体的构象效应导致在血液和正常器官细胞的中性pH值是稳定不激活的。(5)联接后药物相比被联接药物毒性大大降低。(6)天冬酰胺肽链内切酶是从Asn处切断，从代谢产物分析该偶联体中的对氨基苯甲醇能够逐渐释放掉落,起到了辅助激活的作用。(7)对氨基苯甲醇能够延长连接臂,有效降低连接上药物后对天冬酰胺肽链内切酶反应中心接近的空间位阻。(8)偶联体能在多种肿瘤激活,加上溶解性的改变,直接能够改变被联接药物肿瘤适应症限制的情况,开发成为广谱性或特殊针对性抗肿瘤药物。(9)肿瘤细胞转移时通常分泌大量的蛋白酶水解酶以降解细胞间质,因此联接后的靶向药物对肿瘤转移治疗具有特殊的疗效。(10)R1与药物的激活释放,以及药物的溶解性,稳定性和有效性都密切相关。R1除了连接常规基团,还可以连接特殊的亲水基团或靶向基团,给药物的带来特殊功能和提高药物的药效。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地说明。
实施例1化合物中间体的合成
1)N-(N-苄氧羰基-L-丙氨酰)-L-丙氨酸甲酯(I)的合成
将N-苄氧羰基-L-丙氨酸(100g,0.45mol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(3L)中，搅拌下加入1-羟基苯并三氮唑(简称HOBt，72.6g,0.54mol)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(简称EDC，103.3g,0.54mol)，搅拌反应1小时后，冰浴至0℃下滴加L-丙氨酸甲酯(46.2g,0.45mol)和N,N-二异丙基乙基胺(173.8g,1.34mol)的N,N-二甲基甲酰胺(1L)溶液，滴加完毕后在室温下搅拌10h，减压蒸除溶剂，粗产品溶于二氯甲烷(2L)，依次用饱和氯化铵溶液、水和饱和氯化钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂后粗产物重结晶后得到白色固体I，(101g，收率：73.1％)。
2)N-(N-苄氧羰基-L-丙氨酰)-L-丙氨酸(II)的合成
将N-(N-苄氧羰基-L-丙氨酰)-L-丙氨酸甲酯(100g,0.34mol)溶于四氢呋喃(2L)和水(1L)的混合溶液中，冷却至0℃下滴加1M的氢氧化锂溶液(400mL)，搅拌反应10小时，滴加浓盐酸中和至pH<6，旋转蒸发除去大部分四氢呋喃，剩余水相用二氯甲烷(1L×3)萃取，有机相经无水硫酸钠干燥，减压蒸干得到白色固体II(88g，收率：92.2％)。
3)4-N-(N-芴甲氧羰基-N’-三苯甲基-L-天冬酰胺酰基)-氨基苄醇(III)的合成
于三口瓶中加入N-芴甲氧羰基-N’-三苯甲基-L-天冬酰胺(20g,0.03mol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)(15g,0.04mol)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(200mL)，搅拌30min。然后0℃下分别加入对氨基苄醇(4.1g,0.03mol)的DMF溶液(5mL)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(8.7g,0.06mol)，室温下搅拌3h，旋转蒸发除去大部分DMF，残余物溶于乙酸乙酯(200mL)，依次用饱和氯化铵溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后，蒸除溶剂，所得粗产品经打浆得白色固体III(21.3g,收率：90％)。
4)4-N-(N’-三苯甲基-L-天冬酰胺酰基)-氨基苯甲醇(IV)的合成
将4-N-(N-芴甲氧羰基-N’-三苯甲基-L-天冬酰胺酰基)-氨基苄醇(13.0g,18mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(80mL)的混合溶液中，加入哌啶(30mL)，室温下搅拌2h，减压蒸出溶剂，然后置于真空干燥箱高真空干燥除去少量的哌啶，得淡黄色固体IV,未经纯化直接用于下一步。
5)4-N-(N-(N-(N-苄氧羰基-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-N’-三苯甲基-L-天冬酰胺酰基)-氨基苯甲醇(V)的合成
于三口瓶中加入N-(N-苄氧羰基-L-丙氨酰)-L-丙氨酸(6.0g,20.4mmol)、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(11.6g,30.6mmol)和DMF(50mL)，冰浴下搅拌30min。然后0℃下分别加入化合物4-N-(N’-三苯甲基-L-天冬酰胺酰基)-氨基苯甲醇的DMF溶液(50mL)和N,N-二异丙基乙胺(7.89g,61.2mmol)，室温下搅拌过夜，减压蒸除溶剂，残余物溶于乙酸乙酯(200mL)，依次用饱和氯化铵溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后，蒸除溶剂，所得粗产品经重结晶得白色固体V(15g,收率：97％)。
6)4-N-(N-(L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-N’-三苯甲基-L-天冬酰胺酰基)-氨基苯甲醇(VI)的合成
将4-N-(N-(N-(N-苄氧羰基-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-N’-三苯甲基-L-天冬酰胺酰基)-氨基苯甲醇(5.0g,6.61mmol)溶于THF(150mL)中，加入10％钯炭(1g)，通入氢气，常温常压下搅拌反应5h，过滤除去钯炭，用甲醇洗涤，合并滤液和洗液，旋转蒸发除去大部分溶剂得到粗品，经柱层析得到白色固体VI(2.0g,收率：49％)。
7)4-N-(N-N-(N-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-丙氨酰基)-L-丙氨酰基)-N’-三苯甲基-L-天冬酰胺酰基)-氨基苄醇(VII)的合成
将2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸(432mg,3.22mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(20mL)中，加入苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(1.83g,4.83mmol)，搅拌30min，然后滴加4-N-(N-(L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-N’-三苯甲基-L-天冬酰胺酰基)-氨基苯甲醇(2.0g,3.22mmol)和N,N-二异丙基乙胺(1.24g,9.61mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(20mL)，完毕后缓慢升至室温搅拌10h。减压蒸除大部分DMF，所得残余物溶于乙酸乙酯(200mL),依次用饱和的氯化铵溶液和饱和的氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋转蒸发除去溶剂，所得粗产品经硅胶柱层析得白色固体VII(1.2g,收率：50％)。
8)4-N-(N-(N-(N-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰基)-氨基苄醇(VIII)的合成
将化合物4-N-(N-N-(N-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-丙氨酰基)-L-丙氨酰基)-N’-三苯甲基-L-天冬酰胺酰基)-氨基苄醇(VII)(1.0g,1.36mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，加入三氟乙酸(2mL)，室温下搅拌5小时。反应液经水洗后分液后，有机相无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，高真空蒸除残余的三氟乙酸，粗品经柱层析分离得X(600mg,收率：89％)。
9)4-N-(N-(N-(N-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰基)-氨基苄醇-对硝基苯酚-碳酸二酯的合成
化合物4-N-(N-(N-(N-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰基)-氨基苄醇(500mg,1.01mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，氮气保护冰浴至5℃下，依次滴加氯甲酸对硝基苯酯(406mg,2.02mmol)的二氯甲烷溶液和吡啶(160mg，2.03mmol)，完毕后室温下搅拌过夜，反应液经水洗后分液后，有机相无水硫酸钠干燥。旋蒸除去溶剂，所得粗产品经柱层析分离得产物为淡黄色固体(450mg,收率：67％)。
中间体连接不同的药物或化合物
实施例2化合物4-N-(N-(N-(N-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-苏氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰基)-氨基苄醇-10-羟基喜树碱-碳酸二酯(S1)的合成
将4-N-(N-(N-(N-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰基)-氨基苄醇-对硝基苯酚-碳酸二酯(330mg，0.5mmol)和10-羟基喜树碱(182mg,0.5mmol)用干燥的N,N-二甲基甲酰胺(10mL)溶解，冷却至0℃下加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)(122mg,1.0mmol)和1-羟基苯并三氮唑(27mg,0.2mmol)，室温搅拌过夜。将反应液倒入乙酸乙酯(100mL)中，依次用水(50mL×3)和饱和食盐水(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去溶剂得到粗产物，经柱层析分离纯化得目标产物S1为淡黄色固体(82mg,收率：19％)。
实施例3化合物4-N-(N-(N-(N-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰基)-氨基苄醇-喜树碱-碳酸二酯(S2)的合成
将三光气(600mg，2.02mmol)溶于干燥的二氯甲烷(10mL)中，冷至-10℃下，氮气保护下滴加化合物4-N-(N-(N-(N-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰基)-氨基苄醇(500mg,1.01mmol)和吡啶(0.35mL,12.12mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液，0℃下搅拌反应1小时，自然升至室温下搅拌2小时后，滴加喜树碱(348mg，1mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液，室温下反应6小时，反应液依次用水(30mL)，饱和碳酸氢钠(20mL)和饱和食盐水(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥后过滤，减压蒸干，残余物经硅胶柱层析得到白色固体(291mg，33.5％)。
实施例4化合物4-N-(N-(N-(N-(8-(N-羟基氨基)-1,8-辛二酸-1-单酰基)-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰基)-氨基苄醇-卡培他滨-碳酸二酯(S3)的合成
将4-N-(N-(N-(N-(8-(N-羟基氨基)-1,8-辛二酸-1-单酰基)-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰基)-氨基苄醇-对硝基苯酚-碳酸二酯(715mg，1.0mmol)和卡培他滨(360mg,1.0mmol)用干燥的N,N-二甲基甲酰胺(20mL)溶解，冷却至0℃下加入DMAP(244mg,2.0mmol)和1-羟基苯并三氮唑(27mg,0.2mmol)，室温搅拌过夜。将反应液倒入乙酸乙酯(100mL)中，依次用水(100mL×3)和饱和食盐水(100mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去溶剂得到粗产物，经柱层析分离纯化得目标产物S3为淡黄色固体(198mg,收率：21％)。
实施例5化合物4-N-(N-(N-(N-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-苏氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰)-氨基苯甲醇-柔红霉素-氨基甲酸酯(S4)的合成
将4-N-(N-(N-(N-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-苏氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰基)-氨基苄醇-对硝基苯酚-碳酸二酯(264mg,0.4mmol)和N,N-二异丙基乙基胺(1mL)溶于N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中，20℃下滴加柔红霉素(211mg,0.4mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(10mL)溶液，完毕后室温下反应3小时，反应液倒入甲基叔丁基醚中，搅拌半小时后过滤，所得红色固体经柱层析纯化后得到红色固体产物S4(177mg，产率：42.2％)。
实施例6化合物S5的合成
1)4-N-(N-(N-(N-(6-马来酰亚胺己酰-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-N’-三苯甲基-L-天冬酰胺酰)-氨基苯甲醇的合成
6-马来酰亚胺己酸(120mg,0.57mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(20mL)中，加入1-羟基苯并三氮唑(92mg,0.68mmol)和N,N-二异丙基乙基胺(0.19mL,1.15mmol)，氮气保护下加入4-N-(N-(N-(L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-N’-三苯甲基-L-天冬酰胺酰)-氨基苯甲醇(353mg,0.57mmol)，搅拌半小时后冰浴至0℃下滴加1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(120mg,0.62mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(10mL)溶液，完毕后升至室温下搅拌过夜，将反应液倒入乙酸乙酯(150mL)中，依次用水(100mL×3)、5％稀盐酸(50mL)和5％碳酸钠(50mL)洗涤，有机相经无水硫酸钠干燥，减压蒸干后硅胶柱层析得到产物为白色固体(300mg,收率：64.8％)。
2)4-N-(N-(N-(N-(6-马来酰亚胺基己酰)-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰)-氨基苯甲醇的合成
化合物4-N-(N-(N-(N-(6-马来酰亚胺己酰-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-N’-三苯甲基-L-天冬酰胺酰)-氨基苯甲醇(163mg,0.2mmol)溶于二氯甲烷(5mL)中，加入三氟乙酸(2mL)，室温下搅拌5小时。反应液经水洗后分液后，有机相无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，高真空蒸除残余的三氟乙酸，粗品经柱层析分离得产物为淡黄色固体(97mg,收率：85％)。
3)4-N-(N-(N-(N-(6-马来酰亚胺基己酰)-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰)-氨基苯甲醇-对硝基苯酚-碳酸二酯的合成
化合物4-N-(N-(N-(N-(6-马来酰亚胺基己酰)-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰)-氨基苯甲醇(814mg,1.0mmol)溶于二氯甲烷(100mL)中，冰浴至0℃，氮气保护下依次滴加氯甲酸对硝基苯酯(406mg,2.0mmol)的二氯甲烷(20mL)溶液和吡啶(0.16mL，2.0mmol)。滴加完毕后升至室温下搅拌过夜，反应液经水洗分液后，有机相用无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，所得粗产品经柱层析分离得产物为白色固体(597mg,收率：81％)。
4)4-N-(N-(N-(N-(6-马来酰亚胺基己酰)-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰)-氨基苯甲醇-柔红霉素-氨基甲酸酯(S5)的合成
4-N-(N-(N-(N-(6-马来酰亚胺基己酰)-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰)-氨基苯甲醇-对硝基苯酚-碳酸二酯(200mg,0.27mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(30mL)中，加入柔红霉素盐酸盐(152mg,0.27mmol)，氮气保护下冰浴至5℃，滴加N,N-二异丙基乙基胺(0.1mL,0.6mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(2mL)的溶液，完毕后升至室温下搅拌反应过夜，反应液倒入甲基叔丁基醚(600mL)中，搅拌半小时后，过滤，收集红色沉淀经硅胶柱层析得到产物为红色固体S5(164mg,收率：54％)。
实施例7化合物4-N-(N-(N-(N-(6-马来酰亚胺基己酰)-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰)-氨基苯甲醇-MMAE-氨基甲酸酯(S6)的合成
4-N-(N-(N-(N-(6-马来酰亚胺基己酰)-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰)-氨基苯甲醇-对硝基苯酚-碳酸二酯(298mg,0.40mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(30mL)中，加入MMAE(monomethyl auristatin的简称)盐酸盐(305mg,0.40mmol)，氮气保护下冰浴至5℃，滴加N,N-二异丙基乙基胺(0.1mL,0.6mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(2mL)的溶液，完毕后升至室温下搅拌反应过夜，反应液倒入甲基叔丁基醚(600mL)中，搅拌半小时后，过滤，收集红色沉淀经硅胶柱层析得到产物为红色固体S6(434mg,收率：82.4％)。
化合物S1,S2,S3,S4,S5的合成结果如下表，质谱(MS)检测结果S1,S2,S3,S4,S5的对应质荷比分别为916,885,880,1079,1513,与结构计算获得分子量相同，如表1所示。
表1：S1-S5的性状和质谱测试数据
R2和R3的不同,只是氨基酸连接时原料不同,其不同氨基酸侧链对于合成过程没有影响,与上述的方法一致,只是将对应的R2氨基酸和R3氨基酸用于合成过程。R4的连接反应如上述,只是催化条件和反应药物的不同。
实施例8化合物S7-S18
当R1选择H,R2选择Thr,R3选择Ala时，肿瘤微环境特异激活的小分子靶向连接基团可以成功通过羟基连接的化合物，即R4是喜树碱(S7)、10-羟基喜树碱(S8)、拓扑替康(S9)、氟脲苷(S10)、去氧氟尿苷(S11)、阿糖胞苷(S12)、氟达拉滨(S13)、依托泊苷(S14)、卡培他滨(S15)、吉西他滨(S16)、长春新碱(S17)、埃坡霉素B(S18)。
肿瘤微环境特异激活的小分子靶向喜树碱(S7)
肿瘤微环境特异激活的小分子靶向10-羟基喜树碱(S8)
肿瘤微环境特异激活的小分子靶向拓扑替康(S9)
肿瘤微环境特异激活的小分子靶向氟脲苷(S10)
肿瘤微环境特异激活的小分子靶向去氧氟尿苷(S11)
肿瘤微环境特异激活的小分子靶向阿糖胞苷(S12)
肿瘤微环境特异激活的小分子靶向氟达拉滨(S13)
肿瘤微环境特异激活的小分子靶向依托泊苷(S14)
肿瘤微环境特异激活的小分子靶向卡培他滨(S15)
肿瘤微环境特异激活的小分子靶向吉西他滨(S16)
肿瘤微环境特异激活的小分子靶向长春新碱(S17)
肿瘤微环境特异激活的小分子靶向埃坡霉素B(S18)
实施例9化合物S19-S27
当R1选择H,R2和R3选择Ala时，肿瘤微环境特异激活的小分子靶向连接基团可以成功通过氨基连接的化合物，即R4是柔红霉素(S19)、表阿霉素(S20)、氟达拉滨(S21)、吉西他滨(S22)、尼莫司汀(S23)、米托蒽醌(S24)、甲氨蝶呤(S25)、阿糖胞苷(S26)、美法仑(S27)。
肿瘤微环境特异激活的小分子靶向柔红霉素(S19)
肿瘤微环境特异激活的小分子靶向表柔比星(S20)
肿瘤微环境特异激活的小分子靶向氟达拉滨(S21)
肿瘤微环境特异激活的小分子靶向吉西他滨(S22)
肿瘤微环境特异激活的小分子靶向尼莫司汀(S23)
肿瘤微环境特异激活的小分子靶向米托蒽醌(S24)
肿瘤微环境特异激活的小分子靶向甲氨蝶呤(S25)
肿瘤微环境特异激活的小分子靶向阿糖胞苷(S26)
肿瘤微环境特异激活的小分子靶向美法仑(S27)
实施例10肿瘤微环境特异激活的小分子靶向联接基团连接不同R4化合物的条件各不相同
1)所述化合物中，R4通过羟基连接与通过氨基连接的方法完全不同。
与药物R6的通过氨基连接的反应是否可以成功完全取决于R6的选择,例如与喜树碱的反应不同于与MMAE的反应，主要在于与MMAE的反应是通过其MMAE的氨基的强亲核性发生反应(82.4％)，而与喜树碱的反应是通过喜树碱上羟基的亲核性置换对硝基苯酚的反应，由于羟基的亲核性要弱于氨基的亲核性，与对硝基苯酚相当或稍弱，因此使该步反应理论上无法进行。
我们通过对几十种催化剂的筛选合成反应都失败了,只有当在该步反应中加入HOBT等作为催化剂使用时，并严格固定到所筛选的温度时,由于HOBT的羟基能与对硝基苯酚(PNP)交换互变，从而形成更易离去的结合HOBT过渡态，最后通过控制反应截止时间,才能有效的与喜树碱的羟基交换的活性反应,而不产生大量反应杂质,得到目前的最大产率(19％)。
2)AAN-天冬酰胺-氨基苯甲醇-对硝基苯酚-碳酸二酯与药物R5的通过氨基连接的反应是否可以成功完全取决于R5的选择
R5上的氨基的空间位阻以及取代基对连接反应有决定性影响，脂肪族取代的氨基与R1-R2-R3-天冬酰胺-氨基苯甲醇-对硝基苯酚-碳酸二酯的连接反应可以在温和条件下获得较高产量(如MMAE)，但是芳香族氨基由于氨基的孤对电子与芳香环共轭，降低了其亲核性，同样反应条件下得不到产物。只有通过高通量的筛选、剧烈的反应条件，例如尼莫司汀与R1-R2-R3-天冬酰胺-氨基苯甲醇-对硝基苯酚-碳酸二酯的连接反应,最终筛选到只有用DMAP做碱，在80℃到85℃的温度,才能得到少量产物(收率：20％)。
3)所述化合物中R1选择对R4连接有不同影响。
不同的R1基团对R1-R2-R3-天冬酰胺-氨基苯甲醇-对硝基苯酚-碳酸二酯与R4的对接反应的条件有重要影响，比如4-N-(N-(N-(N-(6-马来酰亚胺基己酰)-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺)-氨基苯甲醇-对硝基苯酚-碳酸二酯与喜树碱对接反应得不到产物。因此只有通过筛选不同的反应物和实验条件才能获得产物,例如，采用4-N-(N-(N-(N-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-丙氨酰)-L-丙氨酰)-L-天冬酰胺酰基)-氨基苄醇-对硝基苯酚-碳酸二酯才可以与喜树碱在特定的温度条件下得到相应产物。
实施例11肿瘤微环境特异激活的小分子靶向联接基团连接不同的化合物具有不同的激活效率
联接基团与连接的化合物基团间的相互构效关系决定了激活效果。肿瘤微环境特异激活的小分子靶向联接基团在我们的实验中,在37℃下10微克/毫升酸化的天冬酰胺肽链内切酶中或不同肿瘤组织匀浆(30微克/毫升)中加入1毫克/毫升的S1,S2,S3,S4和S5,S6,通过HPLC能够检测反应物的减小和产物增加，从而比较天冬酰胺肽链内切酶的激活效率,通过筛选发现S1,S2,S3,S4和S5具有很高的被肿瘤组织激活的效率,而S6被肿瘤组织激活的效率较低(表2)。我们的实验结果发现,S3中R1为(N-羟基氨基)-1,8-辛二酸-1-单酰基能够靶向结合肿瘤高表达的金属蛋白酶mmp2,而S5中R1为6-马来酰亚胺基己酰能够靶向结合肿瘤高表达的组织蛋白酶mmp2,因此更为提高靶向激活效果。
表2：S1,S2,S3,S4和S5,S6的激活测定(％)
实施例12肿瘤微环境特异激活的小分子靶向联接基团连接不同的化合物具有不同的激活效率
联接基团与连接的化合物基团间的相互构效关系决定了激活效果。肿瘤微环境特异激活的小分子靶向联接基团在我们的实验中,在37℃10微克/毫升酸化的天冬酰胺肽链内切酶中加入1毫克/毫升的S7～S27化合物,通过HPLC能够检测反应物的减小和产物增加，从而比较天冬酰胺肽链内切酶的激活效率，如表3所示。
表3：S7～S27的激活测定(％)
| 化合物 | S7 | S8 | S9 | S10 | S11 | S12 | S13 | S14 |
| 激活效率％ | 75.7 | 55.5 | 86.4 | 95.4 | 66.2 | 73.6 | 79.6 | 85.3 |
| 化合物 | S15 | S16 | S17 | S18 | S19 | S20 | S21 | S22 |
| 激活效率％ | 84.6 | 23.4 | 89.4 | 93.5 | 89.3 | 26.7 | 95.4 | 97.5 |
| 化合物 | S23 | S24 | S25 | S26 | S27 | |||
| 激活效率％ | 91.5 | 90.7 | 74.4 | 78.5 | 73.5 |
由表3可以看出，通过实验发现最终不同化合物具有不同的被天冬酰胺肽链内切酶激活的效率,筛选合成的S7～S27化合物激活效率基本大于60％,S6,S16,S20激活效率较低小30％。天冬酰胺肽链内切酶的激活位点是天冬酰胺酰基-对氨基苯甲醇的连接处，激活断裂后，对氨基苯甲醇能够自释放，而进一步释放出R4-H药物。天冬酰胺肽链内切酶的酶活中心位于球囊状内陷的底部,切割位点需要接近酶活中心,这时所连接的化合物对切割位点是否有空间位阻和改变连接位点的极性变为非常重要。通过筛选实验的结果,推测S6,S8,S20空间位阻和极性影响激活,因此出现S6,S8,S20激活效率较低,其他化合物激活效率较高的情况。
结果与讨论:结果说明该肿瘤微环境特异激活的小分子靶向联接基团可以连接和激活不同的化合物,并大部分具有很高的激活效率,支持权利要求中的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体的激活效果,R4的可选择S1～S5,S7,S9～S19,S21～S27。
实施例13S1,S2,S3,S4，S5和S6注射液在裸鼠(nude mice)中的药效研究
试验目的：通过小鼠的肿瘤治疗模型，了解S1,S2,S3,S4，S5和S6化合物的抗肿瘤药效。
治疗药物：S1,S2,S3,S4，S5和S6注射液，试验时用生理盐水稀释到相应浓度。
方法和结果：
1.动物：裸鼠，6-8周龄，全为雌性；
2.产生肿瘤模型
1)人乳腺癌MDA-MB231(细胞)从美国模式培养物集存库(American typeculture collection，ATCC)购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10％胎牛血清达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基(简称，DMEM培养液)在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。
2)肿瘤产生，将5×106Panc-1细胞皮下注射到裸鼠(nude mice)小鼠背部，待肿瘤长至少达100mm3左右时随机分组，开始治疗,以开始治疗当天为第一天。
3)治疗过程：根据S1,S2,S3,S4，S5和S6临床用药使用IV(静脉)注射，S1,S2,S3,S4，S5和S6都使用26.2微摩/公斤剂量，每周一次给药，共4周。
4)分组与结果测量如下表4所示
表4：S1,S2,S3,S4，S5和S6药物对裸鼠治疗肿瘤的效果
5)结果与讨论：如表4所示，与各对照组,柔红霉素组和S6比较，在S1,S2,S3,S4和S5具有更强肿瘤生长抑制的效果,说明偶联体对药物的疗效带来的巨大的提高。也说明激活效率与治疗效果有一定相关性。实验结果发现,S3中R1为(N-羟基氨基)-1,8-辛二酸-1-单酰基能够靶向结合肿瘤高表达的金属蛋白酶mmp2,而S5中R1为6-马来酰亚胺基己酰能够靶向结合肿瘤高表达的组织蛋白酶mmp2,从而更为提高靶向治疗效果。
实施例14～28
本发明的实施例(实施例14～28，合成方法与实施例S1相同,就是合成采用的氨基酸原料不同)中，对于不同氨基酸结构的化合物的激活特性、抑瘤率分别进行了测试，测试方法与上述实施例4,6,8,12,13相同，测试结果如下表5所示：
表5：实施例14～28的激活特性、抑瘤率结果
结果与讨论：如表5所示，实施例14～28的化合物都具有一定激活活性和肿瘤生长和转移抑制效果，实验结果证明：R2可为Thr，Val,Ile,Ala，中的任意一种氨基酸；R3可为Ala，Thr，Val或Asn中的任意一种氨基酸。
实施例29S1,S2,S3,S4，S5和S6药物在D121肿瘤免疫模型的药效研究
试验目的：通过D121肺癌肿瘤免疫模型治疗模型，了解S1,S2,S3,S4，S5和S6药物的抗肿瘤药效。
动物：C57小鼠,6-8周龄，全为雌性。
产生肿瘤模型：
1)D121肺癌肿瘤从美国模式培养物保藏所ATCC购买，细胞使用含有10％胎牛血清DMEM培养液在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。
2)肿瘤免疫,小鼠腹腔注射5×105经过照射死亡的D121肺癌细胞(购自美国模式培养物保藏所),免疫注射3次,每次间隔2周。在免疫结束后注射瘤细胞,然后再给药,每周一次给药，共4周。
3)肿瘤产生：在第32天,将106活的D121肺癌肿瘤细胞皮下注射到肿瘤免疫的C57小鼠背部，待肿瘤长至0.3～0.4cm左右时开始治疗。
4)肿瘤CD8+T细胞分析。肿瘤组织经过匀浆,过滤分离出肿瘤中单个细胞,用缓冲液洗两次,白细胞共同抗原CD45-PE和CD8-FITC标记的抗体在室温1小时结合,细胞用包含1％胎牛血清磷酸缓冲液PBS洗两次,然后用流式细胞仪分析白细胞共同抗原(CD45)阳性细胞中T淋巴细胞抗原(CD8)阳性细胞的比例。
5)分组与结果测量，如表6所示。
表6：S1,S2,S3,S4，S5和S6药物、多烯紫杉醇治疗组及对照组肿瘤抑制和免疫激活的效果
6)结果与讨论：与免疫对照组和其他治疗对照组相比较,S1,S2,S3,S4，S5在C57小鼠的治疗效果大大提高，S1与PDL1-抗体具有良好的协同促进免疫和协同治疗效果作用。实验结果证明S1,S2,S3,S4,S5能够通过提高免疫抑制肿瘤的生长。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。从S1到S27的实施例可看出,肿瘤微环境特异激活的小分子靶向联接基团可以连接和激活不同的化合物，所以对于本发明的R4位基团的药物或化合物替换和改变都将是显而易见,从R1选择氢、亲水基团或靶向基团的实施例可看出,对于本发明的R1位基团的药物或化合物替换和改变都将是显而易见。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (17)
1.一种肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其特征在于，该偶联体具有如下通式：
其中，R1可为常规基团或特殊功能基团,R2为Thr，Val，Ile或Ala，中的任意一种氨基酸；R3为Ala，Thr，Val或Asn中的任意一种氨基酸，R4为通过羟基或氨基连接的药物基团，该药物的通式为R4-H。
2.如权利要求1所述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其特征在于，R1可为常规基团或特殊功能基团,即R1选择氢、甲基、聚乙二醇、琥珀酰、2-甲氧基乙氧基乙酰基、6-马来酰亚胺己酰、N-羟基氨基-1,8-辛二酸-1-单酰基中任意一种。
3.如权利要求1所述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其特征在于，R2选择Thr、R3选择Ala,该药物的通式为：
4.如权利要求1所述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其特征在于，R2选择Val、R3选择Ala,该药物的通式为
5.如权利要求1所述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其特征在于，R2选择Ile、R3选择Ala,该药物的通式为
6.如权利要求1所述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其特征在于，R2选择Ala、R3选择Ala,该药物的通式为
7.如权利要求1所述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其特征在于，R4是通过羟基连接的药物基团，R4＝R5-O，R5与酰基结合形成偶联体，该偶联体的通式为：该药物的通式为R5-OH，该药物选择喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康、氟脲苷、去氧氟尿苷、阿糖胞苷、依托泊苷、氟达拉滨、依托泊苷、卡培他滨、长春新碱、埃坡霉素B中的任意一种。
8.如权利要求7所述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其特征在于，该偶联体是以R1-R2-R3-天冬酰胺酰基-对氨基苯甲醇为关键中间体制备；优选地，制备该偶联体的反应路线如下：
该路线是使得R1-R2-R3-天冬酰胺酰基-对氨基苯甲醇经氯甲酸对硝基苯酚酯或三光气活化反应生成活性碳酸酯或氯甲酸酯后，再与含有醇羟基的药物R5-OH反应，生成偶联体碳酸二酯产物。
9.如权利要求1所述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其特征在于，R4是通过氨基连接药物的基团，R4＝R6-NH，R6与酰基结合形成偶联体，该偶联体的通式为：该药物的通式为R6-NH2，该药物选择柔红霉素、表阿霉素、甲氨蝶呤、氟达拉滨、吉西他滨、阿糖胞苷、美法仑、尼莫司汀、米托蒽醌中的任意一种。
10.如权利要求9所述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其特征在于，该偶联体是以R1-R2-R3-天冬酰胺酰基-对氨基苯甲醇为关键中间体制备；优选地，制备该偶联体的反应路线如下：
该路线是使得R1-R2-R3-天冬酰胺酰基-对氨基苯甲醇经氯甲酸对硝基苯酚酯或三光气活化反应生成活性碳酸酯或氯甲酸酯后，再与含有氨基的药物R6-NH2反应，生成偶联体碳酸二酯产物。
11.如权利要求1所述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其特征在于，R1选择(2-甲氧基乙氧基)乙酰基,R2选择Thr,R3选择Ala,R4选择10-羟基喜树碱,该偶联体的结构式为S1：
12.如权利要求1所述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其特征在于，R1选择(2-甲氧基乙氧基)乙酰基,R2选择Ala,R3选择Ala,R4选择喜树碱,该偶联体的结构式为S2：
13.如权利要求1所述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其特征在于，R1选择化合物(N-羟基氨基)-1,8-辛二酸-1-单酰基,R2选择Ala,R3选择Ala,R4选择卡培他滨,该偶联体的结构式为S3：
14.如权利要求1所述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其特征在于，R1选择2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基,R2选择Thr,R3选择Ala,R4选择柔红霉素,该偶联体的结构式为S4：
15.如权利要求1所述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体，其特征在于，R 1选择6-马来酰亚胺基己酰,R2选择Ala,R3选择Ala,R4选择柔红霉素,该偶联体的结构式为S5：
16.一种根据权利要求1所述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体的用途，其特征在于，该偶联体用于制备偶联药物，该偶联药物在肿瘤组织或天冬氨酸激活实验中取得很高的激活释放效率。
17.一种根据权利要求1所述的肿瘤微环境特异激活的小分子靶向偶联体的用途，其特征在于，该偶联体用于制备抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物能用于不同抗癌症类型的治疗和免疫治疗，所述的不同癌症类型包括：膀胱、脑、乳房/乳腺、宫颈、结肠-直肠、食管、肾、肝、肺、鼻咽、胰腺、前列腺、皮肤、胃、子宫、卵巢、睾丸和血液学的癌症。
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