CN104231045B

CN104231045B - 一种靶向激活释放的丝裂霉素衍生物及其用途

Info

Publication number: CN104231045B
Application number: CN201410417882.1A
Authority: CN
Inventors: 刘辰; 刘源
Original assignee: YAFEI (SHANGHAI) BIO-PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: YAFEI (SHANGHAI) BIO-PHARMACEUTICAL Co Ltd
Priority date: 2014-08-22
Filing date: 2014-08-22
Publication date: 2017-10-31
Anticipated expiration: 2034-08-22
Also published as: CN104231045A

Abstract

本发明公开了一种靶向激活释放的丝裂霉素衍生物及其用途，该靶向激活释放的丝裂霉素衍生物结构式为：

Description

一种靶向激活释放的丝裂霉素衍生物及其用途

技术领域

本发明涉及一种抗肿瘤药物化合物，具体地，涉及一种靶向激活释放的丝裂霉素衍生物及其制备抗肿瘤药物的用途。

背景技术

丝裂霉素(结构式为：)是一种目前广泛使用的有效的抗肿瘤剂，主要用于各种实体肿瘤如胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和癌性胸、腹水等。然而，临床上应用这一化合物因为具有严重的毒副作用和不良反应，而被限制其使用剂量。丝裂霉素能够具有骨髓毒性，造成白细胞、血小板减少。能够引发静脉炎、溢出血管外可引起组织坏死，脱发，乏力和带来肝肾功能损害。因此，需要提供一种能降低丝裂霉素毒性，并具有高度药效的的靶向性药物作为抗肿瘤剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种肿瘤微环境靶向激活的化合物，该化合物为丝裂霉素的衍生物，其由于丝裂霉素结合了恰当的化合物而减弱了毒性，同时由于化合物在肿瘤部位聚集和断裂而释放丝裂霉素，成为更有效和低毒的药物。

为了达到上述目的，本发明提供了一种靶向激活释放的丝裂霉素衍生物，其中，所述的靶向激活释放的丝裂霉素衍生物结构式为：

。所述的衍生物中，R1为Ala(丙氨酸)，Thr(苏氨酸)，Val(缬氨酸)或Ile(异亮氨酸)中的任意一种氨基酸；R2为Ala，Thr，Val或Asn(天冬氨酸)中的任意一种氨基酸；n选择1～300中的任意整数；所述的丝裂霉素衍生物能够在肿瘤微环境中靶向激活释放。

上述的靶向激活释放的丝裂霉素衍生物，其中，所述的衍生物中n选择1～11中的任意整数。

上述的靶向激活释放的丝裂霉素衍生物，其中，所述的衍生物中n选择n＝1时，R1和R2都选择Ala，所得的化合物S1结构式为:

上述的靶向激活释放的丝裂霉素衍生物，其中，所述的衍生物中n选择n＝5时，R1和R2都选择Ala，所得的化合物S2结构式为:

上述的靶向激活释放的丝裂霉素衍生物，其中，所述的衍生物中n选择n＝11时，R1和R2都选择Ala，所得的化合物S3结构式为:

上述的靶向激活释放的丝裂霉素衍生物，其中，所述的衍生物中n选择n＝300时，R1和R2都选择Ala，所得的化合物S4结构式为:

本发明还提供了一种上述的靶向激活释放的丝裂霉素衍生物用于制备抗肿瘤药物的用途。

上述的靶向激活释放的丝裂霉素衍生物用于制备抗肿瘤药物的用途，其中，所述的抗肿瘤药物能够用于不同癌症类型疾病的治疗，依据衍生肿瘤的组织的胚胎起源来归类，所述的癌症类型包含膀胱癌、脑癌、乳房/乳腺癌、宫颈癌、结肠-直肠癌、食管癌、肾癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌和血癌。

上述的靶向激活释放的丝裂霉素衍生物用于制备抗肿瘤药物的用途，其中，所述的抗肿瘤药物能够用于癌症的药物免疫治疗。

本发明还提供了一种上述的靶向激活释放的丝裂霉素衍生物用于制备预防和治疗眼科疾病的药物的用途，其中，所述的药物包含治疗伤愈疤痕，脉络膜新生血管或抑制巨噬细胞的药物。

上述的靶向激活释放的丝裂霉素衍生物用于制备预防和治疗眼科疾病的药物的用途，其中，所述的眼科疾病包含角膜移植、青光眼、翼状胬肉等手术的后遗症。

本发明还提供了一种上述的靶向激活释放的丝裂霉素衍生物用于制备抗病毒药物的用途，其中，所述的药物包含抗脑膜炎、抗肝炎或抗HIV病毒的药物。

本发明提供的靶向激活释放的丝裂霉素衍生物具有以下优点：

本发明的肿瘤微环境释放丝裂霉素具有抗肿瘤靶向性，特异的激活活性和免疫促进的特性，相对于丝裂霉素，抑制肿瘤生长和转移的药效具有很大的提高，且药物的毒性大大降低，具有非常好的应用前景。迄今为止，尚未有专利和文献报道与其相同的肿瘤微环境靶向激活丝裂霉素，更没有与之似的肿瘤微环境靶向激活丝裂霉素药物用于治疗人体肿瘤的有效方法。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式作进一步地说明。

本发明提供的靶向激活释放的丝裂霉素衍生物，其结构式为：

其中，R1为Ala(丙氨酸)，Thr(苏氨酸)，Val(缬氨酸)或Ile(异亮氨酸)中的任意一种氨基酸；R2为Ala，Thr，Val或Asn(天冬氨酸)中的任意一种氨基酸；n选择1～300中的任意整数，优选n＝1～11中的任意整数。该丝裂霉素衍生物能够在肿瘤微环境中靶向激活释放。

n选择n＝1时，R1和R2都选择Ala，所得的化合物S1结构式为:

n选择n＝5时，R1和R2都选择Ala，所得的化合物S2结构式为:

n选择n＝11时，R1和R2都选择Ala，所得的化合物S3结构式为:

n选择n＝300时，R1和R2都选择Ala，所得的化合物S4结构式为:

本发明还提供了一种该靶向激活释放的丝裂霉素衍生物用于制备抗肿瘤药物的用途。

该药物可以用于不同癌症类型的治疗，可以治疗的恶性肿瘤。依据衍生肿瘤的组织的胚胎起源来归类，恶性肿瘤类型包括但不限于：膀胱、脑、乳房/乳腺、宫颈、结肠-直肠、食管、肾、肝、肺、鼻咽、胰腺、前列腺、皮肤、胃、子宫、卵巢、睾丸和血液学的癌症。

本发明还提供了一种该靶向激活释放的丝裂霉素衍生物用于制备预防和治疗眼科疾病的药物的用途，其中，该药物包含治疗伤愈疤痕，脉络膜新生血管或抑制巨噬细胞的药物。

本发明还提供了一种该靶向激活释放的丝裂霉素衍生物用于制备抗病毒药物的用途，其中，该药物包含抗脑膜炎、抗肝炎或抗HIV病毒的药物。

本发明提供的靶向激活释放的丝裂霉素衍生物，实验设计思路来源于通过大量的合成实验设计制备不同连接的方式的复杂化合物，然后通过连接复杂化合物到丝裂霉素上，再通过肿瘤组织或天冬酰胺肽链内切酶(Legumain)存在时激活效率的大小进行丝裂霉素效率筛选，并依次筛选所得化合物在R1、R2，以及n取不同值时对肿瘤的抑制作用，最终得到毒性降低，激活效率高的肿瘤微环境靶向激活的丝裂霉素。其中肿瘤微环境靶向激活的丝裂霉素的结构为我们首次合成和报道。化合物不同部分的结构对肿瘤微环境靶向激活的丝裂霉素的靶向、激活、稳定、毒性和药效等功能产生巨大影响。肿瘤微环境靶向激活的丝裂霉素能够通过复杂的化学连接封闭丝裂霉素的毒性，而使其在肿瘤组织中的肿瘤细胞或肿瘤相关巨噬细胞中才能够被天冬酰胺肽链内切酶有效激活，从而靶向的释放毒性，达到治疗肿瘤的效果。取得肿瘤靶向性，封闭毒性和高效激活是与整个化合物整体的构效关系相关的。通过R1、R2，以及n的筛选研究发现R1、R2，以及n的选择也具有一定的构效关系，但从实验可以看出n优选的取值范围为1～300时获得的治疗效果相近。

本发明提供的靶向激活释放的丝裂霉素衍生物，是基于如下发现：

(1)肿瘤微环境靶向激活丝裂霉素衍生物在肿瘤部位具有聚集，滞留和激活效应，具有靶向肿瘤微环境的特性。

(2)肿瘤微环境靶向激活丝裂霉素衍生物能够被肿瘤组织特异性的激活或断裂，生成丝裂霉素。

(3)在体外体内代谢实验中肿瘤微环境靶向激活丝裂霉素衍生物在血液中并不激活，具有长期的血液稳定性和对正常组织器官低毒的特性。

(4)肿瘤微环境靶向激活丝裂霉素衍生物的毒性相比丝裂霉素大大降低。

(5)化合物短肽的两边基团，以及丝裂霉素的偶连位置直接决定了药物的激活释放，以及药物的溶解性，稳定性和有效性都密切相关。如果药物无法激活，药物是一个无细胞毒性的药物，将不会具有疗效。

(6)肿瘤微环境靶向激活丝裂霉素衍生物在多种肿瘤激活，加上溶解性的改变，直接能够改变丝裂霉素肿瘤适应症限制的情况，直接成为广谱性药物，

(7)肿瘤微环境靶向激活丝裂霉素衍生物的长度也具有不同的影响，既n不同长度的药物对整体药物的制剂和药效有影响，随着n值增大，激活活性轻微下降，并且等摩尔计量的药物质量数增大，但是因为n值增大也使药物代谢半衰期增大，因此整体药效并没有降低。经实验发现，在n选自1～300的范围内，肿瘤微环境靶向激活丝裂霉素衍生物能取得的治疗效果没有明显变化。

(8)理论上由于肿瘤细胞转移时化合物对应的天冬氨酸等蛋白酶水解活性升高，所以对肿瘤转移治疗具有特殊的疗效。

肿瘤相关巨噬细胞(M2型)区别于单核细胞和炎症型巨噬细胞(M1型)确认标记就是天冬酰胺肽链内切酶的表达。肿瘤分泌的细胞因子诱导单核细胞转化为肿瘤相关巨噬细胞，肿瘤相关巨噬细胞能够刺激产生强烈的免疫抑制和直接帮助肿瘤细胞浸润和转移。本发明的丝裂霉素衍生物是在天冬酰胺肽链内切酶存在的条件下特异性激活和释放丝裂霉素，而我们的研究中进一步发现肿瘤微环境释放性丝裂霉素具有杀伤肿瘤相关巨噬细胞，减弱微环境中免疫抑制的细胞因子和促进毒性CD8细胞的免疫增强现象。其中更重要的肿瘤微环境释放性丝裂霉素只在肿瘤局部激活，不同于传统化疗药物会损伤整体免疫系统，在我们的实验中肿瘤微环境释放性丝裂霉素和PD-1(程序性死亡分子1，programmeddeath-1)抑制抗体(PDL1-抗体，市售，是目前认为具有免疫治疗效果的候选药物)具有强烈协同治疗作用，能够解决免疫治疗很难和化疗药物结合使用的弊端。

角膜移植，青光眼，翼状胬肉等手术后，由于伤愈反应而导致巨噬细胞在伤口处的聚集，从而引发脉络膜新生血管(CNV)或疤痕组织。脉络膜新生血管(CNV)对视力具有重大威胁，并导致常见的相关并发症，如视网膜变性，炎性疾病，尤和与年龄相关黄斑变性(AMD)。由于肿瘤微环境靶向激活丝裂霉素没有毒性，并且具有靶向在以上眼科疾病中都存在的巨噬细胞(M2型)的特性，所以肿瘤微环境靶向激活丝裂霉素作为药物在治疗角膜移植，青光眼，翼状胬肉等手术后使用更具有良好的预防和治疗脉络膜新生血管(CNV)或疤痕组织的作用。

实施例1：靶向肿瘤微环境的丝裂霉素的合成。

该合成过程包含以下步骤：

1)Fmoc-L-Ala-L-Ala-OMe(芴甲氧羰基-L-丙氨酸-L-丙氨酸甲酯)(I)的合成。

将Fmoc-L-Ala-OH(芴甲氧羰基-L-丙氨酸)(33g，0.1mol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(1L)中，搅拌下加入1-羟基苯并三氮唑(20.2g，0.15mol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(34g，0.15mol)和L-丙氨酸甲酯(13.9g，0.1mol)和N，N-二异丙基乙基胺(25.8g，0.2mol)的N，N-二甲基甲酰胺(500mL)溶液，室温下搅拌10小时，减压蒸除溶剂，粗产品溶于二氯甲烷(2L)，依次用饱和氯化铵溶液、水和饱和氯化钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂后粗产物重结晶后得到纯品为白色固体I(30g，收率：75.1％)。

2)Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH(芴甲氧羰基-L-丙氨酸-L-丙氨酸)(II)的合成。

将Fmoc-L-Ala-L-Ala-OMe(40g，0.1mol)溶于四氢呋喃(2L)和水(1L)的混合溶液中，冷却后加入1M氢氧化锂溶液(400mL)，搅拌反应10小时，滴加浓盐酸中和至pH<6，减压蒸除四氢呋喃，剩余水相用二氯甲烷(1L×3)萃取，有机相经无水硫酸钠干燥，减压蒸干得到白色固体II(36g，收率：94％)。

3)Fmoc-L-Asn(Trt)-L-对氨基苄醇(III)的合成。

在三口瓶中加入Fmoc-L-Asn(Trt)-OH(芴甲氧羰基-三苯甲基-L-天冬酰胺)(20g，0.03mol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)(15g，0.04mol)、DMF(200mL)，搅拌30min后分别加入对氨基苄醇(4.1g，0.03mol)的DMF溶液(5mL)，N，N-二异丙基乙基胺(8.7g，0.06mol)，室温下搅拌3h，减压蒸除溶剂，残余物溶于乙酸乙酯(200mL)，依次用饱和氯化铵溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后，蒸除溶剂，所得粗产品打浆得白色固体III(21.3g，收率：90％)。

4)L-Asn(Trt)-L-对氨基苄醇(IV)的合成。

将Fmoc-L-Asn(Trt)-L-对氨基苄醇(13g，18mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(80mL)的混合溶液中，加入哌啶(30ml)，室温下搅拌2小时后，减压蒸出溶剂，然后置于真空干燥箱高真空干燥除去少量的哌啶，得淡黄色固体到IV，未经纯化直接用于下一步。

5)Fmoc-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-对氨基苄醇(V)的合成。

在三口瓶中加入Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH(5.4g，14mmol)、苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(8g，21mmol)、DMF(50mL)，冰浴下、氮气保护下搅拌30min。然后0℃下分别加入化合物L-Asn(Trt)-对氨基苄醇(6.7g，14mmol)的DMF溶液(50mL)，N，N-二异丙基乙基胺(5.5g，42mmol)，室温下搅拌过夜，减压蒸除溶剂，残余物溶于乙酸乙酯(200mL)，依次用饱和氯化铵溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后，蒸除溶剂，所得粗产品打浆得白色固体V(18.5g，收率：78％)。

6)L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-对氨基苄醇(VI)的合成。

将Fmoc-L-Asn(Trt)-L-对氨基苄醇(864mg，1mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(30mL)的混合溶液中，加入哌啶(10mL)，室温下搅拌2小时后，减压蒸出溶剂，得到淡黄色固体VI，未经纯化直接用于下一步。

7)2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-对氨基苄醇(VII)的合成。

将2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸(134mg，1mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(5mL)，冷却至0℃下加入3-(二乙氧基磷酰氧基)-1，2，3-苯并三嗪-4-酮(DEPBT)(450mg，1.5mmol)，搅拌半小时，加入L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-对氨基苄醇(621mg，1mmol)和N，N-二异丙基乙基胺(387mg，3mmol)，避光下反应温度缓慢升高至室温下搅拌5小时，将反应液倒入200mL醋酸水溶液中，二氯甲烷萃取，合并有机相，水洗，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂得到橙红色粗产物，经硅胶柱层析纯化得白色粉末VII(479mg，收率：65％)。

8)2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-对氨基苄基对硝基苯基碳酸酯(VIII)的合成。

在三口瓶中加入2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-对氨基苄醇(1.9g，2.6mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，滴加氯甲酸对硝基苯酯(1g，5.2mmol)，吡啶(400mg，5.2mmol)的二氯甲烷溶液。室温下搅拌过夜。反应液经水洗分液后，有机相无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，所得粗产品硅胶柱层析纯化得VIII(1.8g，收率：80％)。

9)2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-Ala-L-Ala-L-Asn-对氨基苄基对硝基苯基碳酸酯(IX)的合成。

将2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-对氨基苄基对硝基苯基碳酸酯溶于二氯甲烷(2mL)中，加入三氟乙酸(2mL)，室温下搅拌2小时。反应液经水洗后分液后，有机相无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，粗品经柱层析分离得IX(625mg，收率：47％)。

10)2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-Ala-L-Ala-L-Asn-对氨基苄基丝裂霉素(S1)的合成。

将2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-Ala-L-Ala-L-Asn-对氨基苄基对硝基苯基碳酸酯(400mg，0.6mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(10mL)中，加入丝裂霉素C(200mg，0.6mmol)，1-羟基苯并三唑(HOBT)(17mg，0.12mmol)，N，N-二异丙基乙基胺(156mg，1.2mmol)，完毕后升至室温下搅拌10小时，减压蒸除溶剂，残余物溶于二氯甲烷(200mL)，依次用饱和氯化铵溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后蒸除溶剂，所得粗产品经硅胶柱层析得淡黄色固体目标化合物S1(237mg，收率：46％)。

S2，S3，S4的合成参照S1的合成，区别仅在于第7步的合成使用的烷氧基取代乙酸的分子量的不同。S2的合成是以3，6，9，12，15，18-六氧杂十九酸替代2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸；S3的合成是以3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36-十二氧杂三十七酸替代2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸；S4的合成是以多氧杂脂肪酸替代2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸；质谱(MS)检测结果S1，S2，S3的对应质荷比分别为855，1032，1296，与结构计算获得分子量855.85.1032.06和1296.37相对应。基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测S4分子量约为14032，与结构计算获得分子量14023.76相对应，如表1所示。

表1：化合物S1～S4的性状、质谱及荧光测试结果。

实施例2：获得注射剂S1，S2，S3和S4。

合成的S1，S2，S3和S4经过真空干燥，通过气体灭菌无菌处理，在无菌室进行分装。在动物实验前，在无菌室中S1用含有50％酒精的注射用水溶解，再用注射用水稀释到所需浓度。S2，S3和S4可用注射用水直接稀释到所需浓度。

实施例3：所得产物中S1，S2，S3和S4的含量测定的方法及含量范围。

使用分析型HPLC(安捷伦1220(Agilent1220series)，C8柱5μm，4.6mm ID×250mm，流动相为0～95％乙腈(ACN)，测得S1，S2，S3和S4的纯度均在纯度均在95％-99％范围内。

实施例4：肿瘤微环境靶向激活丝裂霉素在不同肿瘤组织激活的影响。

在37度温度下100微克酸化的肿瘤组织匀浆中的蛋白酶加入1mg/ml的化合物，肿瘤组织匀浆能够导致释放丝裂霉素，通过HPLC能够检测化合物的减小和丝裂霉素的增加而比较肿瘤组织对药物的激活效率，通过筛选发现目前的化合物连接在筛选的化合物中具有最高的激活效率，同时在不同肿瘤类型中的激活也说明了药物治疗的广谱性，参见下表2。

表2：S1，S2，S3，S4的激活测定，即不同肿瘤组织匀浆中的S1，S2，S3，S4的化合物激活比例表。

实施例5：受试药静脉用药最大耐受剂量(MTD)的测定。

实验目的：通过测定小鼠静脉用药MTD实验，了解本新药制剂的急性毒性。

治疗药物：S1，S2，S3和S4注射液，实验时用生理盐水稀释到相应浓度。

动物：一级巴比赛(BALB/C)小鼠，体重19-21g，全为雌性。

方法和结果：受试BALB/C小鼠210只，体重19-21g，全为雌性，按体重随机分为21组，每组10只。如表3所示，按0mg/kg，50mg/kg，70mg/kg，90mg/kg，110mg/kg，分别一次性静脉注射S1，S2，S3和S4，并进行生理盐水组、丝裂霉素组注射的对照实验，给药体积0.2ml。连续观察17天，每日观察动物是否出现立毛树立、糟乱无光泽、昏睡、弯腰驼背、过激反应等，记录体重和死亡情况。在第3、5、14天采血样进行全血球计数，在第14天解剖动物采取心脏、肝脏、肾脏、肺、脾脏、胰腺HE染色观察。

表3：受试小鼠分别接受不同剂量的S1，S2，S3和S4注射液与生理盐水、丝裂霉素注射液的死亡率结果对照。

结果与讨论：注射S1，S2，S3和S4注射液的小鼠组，在90mg/kg剂量时，动物没有出现立毛树立、糟乱无光泽、昏睡、弯腰驼背、过激反应和死亡情况，如表1所示S1和S2注射液的MTD值约为90mg/kg，远大于丝裂霉素的MTD值6mg/kg，受试药静脉用药最大耐受剂量是药物毒性的重要参考指数，表明靶向激活释放的丝裂霉素的毒性比丝裂霉素显著降低。

实施例6：S1，S2，S3和S4注射液在裸鼠(nude mice)中对Panc-1细胞的药效研究。

实验目的：通过小鼠的肿瘤治疗模型，了解S1，S2和S3药物的抗肿瘤药效。

治疗药物：S1，S2，S3和S4注射液和丝裂霉素注射液，实验时用生理盐水稀释到相应浓度。

方法和结果：

1.动物：裸鼠，6-8周龄，全为雌性。

2.产生肿瘤模型。

1)Panc-1cells(细胞)从美国模式培养物集存库(American type culturecollection，ATCC)购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10％胎牛血清达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基(简称，DMEM培养液)在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。

2)肿瘤产生，将5×10⁶Panc-1细胞皮下注射到裸鼠(nude mice)小鼠背部，待肿瘤长至少达100mm³左右时随机分组，开始治疗，以开始治疗当天为第一天。

3)治疗过程。

根据S1，S2，S3和S4临床用药使用IV注射(静脉注射)，S1，S2，S3和S4都使用1/6MTD的计量15mg/kg剂量，丝裂霉素药物治疗组使用1/3MTD的计量2mg/kg剂量，对照组使用生理盐水，每周一次给药，共4周。

4)分组与结果测量如下表4所示。

表4：S1，S2，S3和S4药物、丝裂霉素及对照组对裸鼠治疗肿瘤的效果。

5)结果与讨论：如表4所示，与等摩尔浓度的丝裂霉素药物治疗组对照组比较，在S1，S2，S3和S4治疗组的肿瘤生长抑制效果被大大提高。

实施例7：S1，S2，S3和S4注射液在裸鼠(nude mice)中对HT1080细胞的药效研究。

实验目的：通过小鼠的肿瘤治疗模型，了解S1，S2，S3和S4药物的抗肿瘤药效。

方法和结果：

1.动物：裸鼠，6-8周龄，全为雌性。

2.产生肿瘤模型。

1)HT1080(细胞)从美国模式培养物集存库(American type culturecollection，ATCC)购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10％胎牛血清达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基(简称，DMEM培养液)在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。

2)肿瘤产生，将5×10⁶HT1080细胞皮下注射到裸鼠(nude mice)小鼠背部，待肿瘤长至少达100mm³左右时随机分组，开始治疗，以开始治疗当天为第一天。

3)治疗过程。

根据S1，S2，S3和S4临床用药使用IV注射，S1，S2，S3和S4和都使用1/6MTD的计量15mg/kg剂量，丝裂霉素药物治疗组使用1/3MTD的计量2mg/kg剂量，对照组使用生理盐水，每周一次给药，共4周。

4)分组与结果测量如下表5所示。

表5：S1，S2，S3和S4药物、丝裂霉素及对照组对裸鼠治疗肿瘤的效果。

5)结果与讨论：如表5所示，与等摩尔浓度的丝裂霉素药物治疗组对照组比较，在S1，S2，S3和S4治疗组的肿瘤生长抑制效果被大大提高。

实施例8：S1，S2，S3和S4药物在BALB/C小鼠的肿瘤转移模型中的药效研究。

实验目的：通过BALB/C小鼠的肿瘤转移治疗模型，了解S1，S2，S3和S4药物的抗肿瘤药效。

1.动物：BALB/C小鼠，6-8周龄，全为雌性。

2.产生肿瘤模型。

1)4T1cells从ATCC购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10％胎牛血清DMEM培养液在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。

2)、肿瘤转移的产生，将10⁶T1cells细胞皮下注射到BALB/C小鼠背部，待肿瘤长至1.5cm左右时随机分组，手术去除皮下肿瘤，并开始用药物治疗，在第27天时麻醉后处死小鼠，取出整个肺，放入布安溶液(Bouin’s solution)中染色，在解剖显微镜下统计转移到肺部的肿瘤数量。

3)治疗过程：根据S1，S2，S3和S4临床用药使用IV注射，S1，S2，S3和S4和都使用1/6MTD的计量，15mg/kg剂量，丝裂霉素药物治疗组使用1/6MTD的计量1mg/kg剂量，对照组使用生理盐水，每三天一次给药，共4次。

4)分组与结果测量如表6所示。

表6：S1，S2，S3和S4药物、丝裂霉素治疗组及对照组对于裸鼠肿瘤转移抑制的效果。

5)结果与讨论：如表6所示，与丝裂霉素治疗组对照组比较，在S1，S2，S3和S4组腹腔给药后，在BALB/C小鼠的肿瘤转移抑制效果被大大提高，说明此类药物具有良好的抗肿瘤转移药效。

实施例9：S1，S2，S3和S4药物在D121肿瘤免疫模型的药效研究。

实验目的：通过D121肺癌肿瘤免疫模型治疗模型，了解S1，S2，S3和S4药物的抗肿瘤药效。

动物：C57小鼠，6-8周龄，全为雌性。

产生肿瘤模型：

1)D121肺癌肿瘤从美国模式培养物保藏所ATCC购买，细胞使用含有10％胎牛血清DMEM培养液在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。

2)肿瘤免疫，小鼠腹腔注射5x10⁵经过照射死亡的D121肺癌细胞(购自美国模式培养物保藏所)，免疫注射3次，每次间隔2周。在免疫结束后注射瘤细胞，然后再给药，每周一次给药，共4周。

3)肿瘤产生：在第32天，将10⁶活的D121肺癌肿瘤细胞皮下注射到肿瘤免疫的C57小鼠背部，待肿瘤长至0.3～0.4cm左右时开始治疗。

4)肿瘤CD8+T细胞分析。肿瘤组织经过匀浆，过滤分离出肿瘤中单个细胞，用缓冲液洗两次，白细胞共同抗原CD45-PE和CD8-FITC标记的抗体在室温1小时结合，细胞用包含1％胎牛血清磷酸缓冲液PBS洗两次，然后用流式细胞仪分析白细胞共同抗原(CD45)阳性细胞中T淋巴细胞抗原(CD8)阳性细胞的比例，该比例升高则显示T淋巴免疫细胞细胞增多，表明了动物体内的针对肿瘤的免疫力提高。

5)分组与结果测量如表7所示。

表7：S1，S2，S3和S4药物、丝裂霉素治疗组及对照组肿瘤抑制和免疫激活的效果。

6)结果与讨论：与免疫对照组和其他治疗对照组相比较，S1，S2，S3和S4在C57小鼠的治疗效果大大提高，S1与PDL1-抗体具有良好的协同促经免疫和协同治疗效果作用，能够通过提高免疫抑制肿瘤的生长。见表7。

实施例10：S1注射液在多肿瘤模型的药效研究。

实验目的：通过小鼠的多肿瘤模型，了解S1的抗肿瘤药物的广谱性。

治疗药物：S1注射液，实验时用生理盐水稀释到相应浓度。

方法和结果：

1.动物：裸鼠，6-8周龄，全为雌性。

2.产生肿瘤模型。

1)对应的细胞从美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10％胎牛血清达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基(简称，DMEM培养液)在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。

2)肿瘤产生，将5×10⁶对应细胞皮下注射到裸鼠(nude mice)小鼠背部，待肿瘤长至少达100mm³左右时随机分组，开始治疗，以开始治疗当天为第一天。

3)治疗过程。

根据S1临床用药使用IV注射，S1都使用1/6MTD的计量15mg/kg剂量，对照组使用生理盐水，每周一次给药，共3周。

4)分组与结果测量如下表8所示。

表8：S1在多肿瘤模型的治疗效果。

5)结果与讨论：如表8所示，S1在多种肿瘤模型中具有良好的药效，说明药物已经成为一个广谱性的肿瘤治疗药物。

实施例11：S1，S2，S3和S4滴眼液抑制疤痕和脉络膜新生血管(CNV)的研究。

动物：C57小鼠，16周龄，全为雌性，每组8只。

伤愈产生和治疗：150mW，激光光凝固定照射后，然后每日滴入S1，S2，S3和S4药物，2周后每组4只取眼部组织进行免疫组化(HE)染色。另外4只在50mW，激光光凝固定照射后治疗后48小时，取眼部组织匀浆，过滤分离出疤痕和CNV组织中单个细胞，用缓冲液洗两次，使用biotin-conjugated anti-F4/80(生物素标记的巨噬细胞的前体细胞抗原)和FITC-conjugated anti-CD45(异硫氰酸荧光素标记的白细胞共同抗原)在室温1小时结合染色，细胞用包含1％胎牛血清磷酸缓冲液PBS洗两次，然后用流式细胞仪分析白细胞共同抗原(CD45)阳性细胞中巨噬细胞的前体抗原阳性细胞的比例，该比例降低则显示该巨噬细胞的前体抗原阳性细胞减少，表明了动物体内的有关该疾病的巨噬细胞受到抑制。如下表9所示。

表9：S1，S2，S3和S4滴眼液抑制疤痕和脉络膜新生血管(CNV)的研究。

结果与讨论：与对照组和丝裂霉素治疗对照组相比较，S1，S2，S3和S4在伤痕半径和抑制巨噬细胞的治疗效果大大提高。见表9。

在本发明的一些实施例(实施例12～26)中，还合成了其他的靶向激活释放的丝裂霉素衍生物化合物(化合物S12～S26)，其中，n＝1-300中的任意整数，R₁为Ala，Thr，Val或Ile中的任意一种氨基酸；R₂为Ala，Thr，Val或Asn中的任意一种氨基酸；化合物S10-S24合成方法与S1相近，只是氨基酸连接时原料不同如下表10所示。

将对应的R₁氨基酸和R₂氨基酸溶于N，N-二甲基甲酰胺中，分别加入缩合剂(如1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)反应，于0℃-25℃反应0.5-2h，再加入天门冬酰胺；，于0℃-25℃反应2-24h。反应液经后用纯化处理，得到3肽，将三肽按实施例1中的方法替代Ala-Ala-Asn为合成中间替制备S10-S24化合物。质谱(MS)检测结果确认S10-S24化合物分子量依次如下表10，与结构计算预测的分子量相符合。

表10：化合物S12～S26的性状、质谱及荧光测试结果。

对上述实施例分别做了上述的MTD测试(方法同实施例5)、对肿瘤的疗效研究(方法同实施例6、7)、转移疗效(方法同实施例8)及多肿瘤疗效(方法同实施例8)的实验，并取得了与S1-S4相似的实验结果。经实验证明，n＝1-300范围内，随着n增大，抑瘤率轻微下降。随着n值增大，激活活性轻微下降，并且等摩尔计量的药物质量数增大，但是因为n值增大也使药物代谢半衰期增大，因此整体药效只是轻微下降，在n选自1～300的范围内，均能到达本发明实施例S1-S4相近的技术效果。

综上所述，本发明合成了肿瘤微环境靶向激活丝裂霉素的抗肿瘤药物，并通过毒性和药效实验证明化合物比丝裂霉素具有更低的毒性的，同时在等摩尔浓度剂量和等毒性剂量的条件下，抗肿瘤生长的药效具有显著的提高。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims

1.一种靶向激活释放的丝裂霉素衍生物，其特征在于，所述的靶向激活释放的丝裂霉素衍生物为化合物S1或化合物S2；

所述的化合物S1结构式为:

所述的化合物S2结构式为:

所述的丝裂霉素衍生物能够在肿瘤微环境中靶向激活释放。

2.一种如权利要求1所述的靶向激活释放的丝裂霉素衍生物用于制备抗肿瘤药物的用途，其特征在于，所述的抗肿瘤药物用于不同癌症类型疾病的治疗，所述的癌症类型包括膀胱癌、脑癌、乳房/乳腺癌、宫颈癌、结肠-直肠癌、食管癌、肾癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌和血癌。

3.如权利要求2所述的靶向激活释放的丝裂霉素衍生物用于制备抗肿瘤药物的用途，其特征在于，所述的抗肿瘤药物能够用于癌症的药物免疫治疗。

4.一种如权利要求1所述的靶向激活释放的丝裂霉素衍生物用于制备预防和治疗眼科疾病的药物的用途，其特征在于，所述的药物包含治疗伤愈疤痕，脉络膜新生血管或抑制巨噬细胞的药物。

5.一种如权利要求4所述的靶向激活释放的丝裂霉素衍生物用于制备预防和治疗眼科疾病的药物的用途，其特征在于，所述的眼科疾病包含角膜移植、青光眼、翼状胬肉手术的后遗症。