CN110357947B

CN110357947B - 一种combretastatin A4衍生物

Info

Publication number: CN110357947B
Application number: CN201910174233.6A
Authority: CN
Inventors: 计炜; 胡峻
Original assignee: Nanjing Hengyuan Technology Development Co ltd
Current assignee: Nanjing Hengyuan Technology Development Co ltd
Priority date: 2019-03-08
Filing date: 2019-03-08
Publication date: 2023-05-26
Anticipated expiration: 2039-03-08
Also published as: CN110357947A

Abstract

本发明涉及一种combretastatin A4衍生物，本发明针对CA‑4P药物分子结构中的顺式双键会部分转化成更稳定的反式结构这一问题考虑增加分子内位阻，降低双键发生翻转的可能性。本发明针对CA‑4P药物的心血管毒性，在CA‑4P药物分子结构中引入环状RGD肽，形成双靶点，并增强抑制肿瘤的功效。

Description

一种combretastatin A4衍生物

技术领域

本发明涉及医药合成领域，具体涉及一种combretastatin A4衍生物。

背景技术

使君子科(Combretastaceae)植物是一类分布于热带和亚热带的灌木和树木，具有十分重要的医学应用价值。上世纪70年代末，Pettit的研究小组通过P388细胞药理活性跟踪的方法，从南非的一种灌木矮柳树(Combretum Caffrum)的树皮中分离得到了一系列的顺式二苯乙烯类康普瑞汀(Combretastatin)化合物(见下图)，该类化合物在体外的细胞毒活性和抑制肿瘤细胞活性实验中，均表现出较高的活性。

癌症化疗方法通常是肿瘤治疗的主要手段之一，但是传统化疗药物大多属于细胞毒类药物，有毒副作用大、选择性差和易产生耐药性等缺点。寻找高效、低毒、新作用机制及新治疗策略的抗肿瘤药物一直是药学研究的重要课题。

许多影响蛋白质合成的细胞毒类抗肿瘤药物逐渐被开发出来，其中一类药物的靶点主要针对细胞的微管系统(microtubule system)，它们与微管作用，抑制微管聚合，使纺锤体不能形成，从而使细胞分裂停止在有丝分裂中期(M期)，阻止了癌细胞的分裂繁殖；或者是促进微管聚合，抑制微管解聚而抑制癌细胞分裂。紫杉醇类药物是近年来发现的能促使微管蛋白迅速聚集成微管，并结合到微管上抑制微管的解聚，从而使细胞有丝分裂终止。

由于原发肿瘤的生长和转移是依赖于新生血管生成的，所以肿瘤新生血管生成(tumor angiogenesis，TA)已经成为一个崭新的、有希望的抗肿瘤治疗靶点，人们致力于开发和研究能破坏和抑制血管生成，有效阻止肿瘤的生长和转移的药物，该类药物称为TA抑制剂。这类药物具有许多优势，(1)肿瘤发生时血管形成已被启动，具有良好的特异性；(2)血管内皮细胞暴露于血流中，药物能直接发挥作用；(3)内皮细胞基因表达相对稳定，不易产生耐药性。

康普瑞汀类化合物抗肿瘤机制不仅能抑制微管蛋白聚合，诱导细胞凋亡而且能对抗肿瘤血管生成，是新一代的TA抑制剂。围绕上述康普瑞汀类化合物的研究，Pettit等发现CA-4活性最高，CA-4P作为第一个TA抑制剂，引起了人们的广泛关注。1995年，Pettit等首次报道了CA-4P的全合成方法并确认了所合成的化合物图谱与天然提取物完全吻合。由于CA-4其水溶性太差，导致其药代动力学性能下降，使其在临床上的应用受到限制。1996年，Petti:等将其设计改造成磷酸二钠盐前药(CA-4P)，其磷酸基团可在血浆中解离，从而释放出CA-4，使其发挥抗肿瘤活性。CA-4P由Oxigene公司进一步进行临床研发，2013年7月18日，EMEA批准CA-4P用作卵巢癌患者的孤儿药上市

2015年12月29日消息，FDA授予Oxigene公司CA-4P治疗神经内分泌肿瘤孤儿药资格。然而，2017年9月27日，Mateon Therapeutics宣布终止开发fosbretabulin，因为在治疗铂抵抗卵巢癌患者的II/III期研究中，临床失败。CA-4P作为一种血管生成抑制剂使其具有良好的抑制细胞增殖活性，有一定的发展潜力，但经临床药毒理研究发现CA-4P分子中的顺式双键会部分转化成更稳定的反式结构而使得抑制肿瘤细胞增殖活性大大降低、甚至丧失。另外CA-4P具有升高血压等一系列心血管毒性，近十几年来科研工作者对考布他汀进行了大量的结构修饰，设计和合成了各种不同的考布他汀衍生物及其类似物，但到目前为止还未发现有其他衍生物进临床试验或上市的，其结构有待进一步修饰。

整合素是细胞表面受体的主要家族，其中αvβ3的作用尤为重要，所以整合素αvβ3成为许多抗肿瘤血管生成药物的主要靶点，RGD肽是一类含有精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)活性短肽,作为整合素和其配体相互作用的识别位点,能与肿瘤细胞或者新生血管特异表达的某些整合素如αvβ3结合，故RGD肽可以诱导肿瘤细胞凋亡。而对RGD肽进行修饰与改造后的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸-赖氨酸环形五肽结构,与原先的短肽相比较具有稳定性、亲和性、特异性、靶向性，延长在体内的作用时间等优势。我们考虑将环形RGD肽与CA-4P相结合，从分子结构方面考虑，当CA4P与一个环形五肽以磷酰胺的方式结合后，该物质的稳定性大大增加，另外环形五肽的存在使得分子内位阻增大，双键发生翻转的可能性大大降低。从药理方面考虑，该药物对肿瘤血管具有双靶点，可以更精确地标记定位肿瘤，达到更有效和安全的治疗目的。从药效方面考虑，该药物在体内需要经过磷酰胺键及磷脂键的解离才释放出母体，从一定程度上延长了药物的作用时间，使药物能更好地发挥其药效，而解离的环形RGD肽亦会对肿瘤细胞的转移起到抑制作用，可以增加药效，从而使得用量降低，从一定程度上缓解CA-4P本身具有的一系列心血管毒性。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，提供一种combretastatin A4(CA4)衍生物。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：

一种combretastatin A4衍生物，为以下结构：

其中，X₁是H；X₂是H；X₃是H或金属离子。

所述combretastatin A4衍生物为一种前药，其中，X1、X2是H，X3是金属离子。

进一步的，所述X3是Na离子。

本发明还公布了所述的combretastatin A4衍生物的制备方法，包括以下步骤：

a)使用固相合成法将Fmoc-甘氨酸、Fmoc-精氨酸(Alloc)、Fmoc-赖氨酸(Cbz)、Fmoc-D-苯丙氨酸、Fmoc-天冬氨酸(Alloc)偶联，得到带有保护基团的线性RGD肽，并将获得的线性五肽从树脂上裂解下来；

b)使用叠氮磷酸二苯酯类物质或者其他缩合剂将线性多肽中的Gly和Asp首尾相连，使成环；

c)使用Pd/C氢化脱除赖氨酸上Cbz基团，使其ε-氨基裸露；

d)二氯化磷酸苄酯在三乙胺类有机碱存在下依次与裸露ε-氨基的环肽、Combretastatin A-4发生磷酰胺化、酯化反应，得到带有保护基团的combretastatin A4(CA-4)衍生物；

e)使用类似Pd(PPh₃)₄物质脱除Alloc基团，使用Pd/C氢化脱除苄基，终产品用甲醇钠以钠盐的形式从反应液中析出，HPLC制备纯化。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.本发明针对CA-4P药物分子结构中的顺式双键会部分转化成更稳定的反式结构这一问题考虑增加分子内位阻，降低双键发生翻转的可能性。

2.本发明针对CA-4P药物的心血管毒性，在CA-4P药物分子结构中引入环状RGD肽，形成双靶点，并增强抑制肿瘤的功效。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，应理解，下述实施例意在说明，不对本发明构成限制。

本发明中所用缩写及其含义列于下表：

一、固相合成(线性RGD肽的合成)：

用固相合成法得到带有保护基团的线性RGD肽。如下图所示在多肽固相合成管中加入固相载体2-氯三苯甲基氯树脂，将9-芴甲氧羰基(Fmoc)作为不稳定的α-氨基酸保护基团，将下列被保护的氨基酸依次偶联。

Fmoc-甘氨酸

Fmoc-精氨酸(Alloc)

Fmoc-赖氨酸(Cbz)

Fmoc-D-苯丙氨酸

Fmoc-天冬氨酸(Alloc)

Fmoc固相多肽的合成分为以下几个部分：

1.活化偶联

在活化偶联步骤中，脱去α-氨基酸保护基团的氨基依次与下一个活化氨基酸进行酰胺化反应。偶联反应是多肽合成中最为关键的步骤，影响因素很多：如已偶联到树脂上的氨基酸序列、氨基酸本身的特性、偶联反应本身的动力学、树脂的溶涨状态及羧基的活化形式等，其中以羧基的活化形式影响最大。因为在多肽合成中，羧基的反应性不强，必须在偶联之前将羧基转化为酰化形式。常用的方法有碳二亚胺法、酰氯法、酰基叠氮法、酸酐法、活化酯法及偶联试剂等，碳二亚胺法是目前最为常用的是偶联试剂，这种试剂的独特之处在于它能被加入氨基和羧基的化合物中，活化和偶联同时进行。此外，一些偶联试剂的联合使用可降低多肽合成中的消旋反应，从而保证了产品的手性纯度。这类偶联试剂常用的有BOP、PyBOP、HOAt、HOBt、TBTU、HBTU、HATU等等。

2.掩蔽

在偶联带有保护基团的氨基酸完成后，用20％的醋酸酐/二氯甲烷溶液将树脂上未反应的氨基乙酰化。这样可以避免其与之后的氨基酸交叉偶联，确保反应结束后所得产品的纯度。

3.脱保护

在脱保护过程中，实验室用20％的哌啶/DMF溶液将树脂处理两次将保护基团(Fmoc)从延长肽的N-端氨基酸的α-氨基位脱除。

4.洗涤

洗涤步骤能够除去上步反应中过量的试剂，在尽量去除过量试剂的过程中，为了确保不产生没有预计到的副反应，溶剂的选择是非常仔细的。每个洗涤步骤需要提供充足的时间使得肽树脂与洗涤溶剂的充分接触，以便于对反应试剂的提取。在偶联和脱保护操作完成后均需用DMF充分搅拌洗涤以除去残留的试剂，另外用异丙醇使树脂收缩以除去多余的溶剂。

5.裂解

偶联结束后将获得的线性五肽，在正离子捕捉剂的参与下用稀释过的强酸三氟醋酸将多肽从树脂上脱除。

二、环状RGD肽的合成：

1.如下图所示将洗脱得到的带有保护基团的线性多肽中的Gly和Asp首尾相连，使成环。多肽成环的方法有：1.活泼酯法2.迭氮法3.缩合剂法4.酶法链。

2.如下图所示脱除赖氨酸上的Cbz保护基，将赖氨酸上的ε-氨基裸露。

三、combretastatin A4(CA4)衍生物的合成：

1.如下图所示将赖氨酸上裸露的ε-氨基与二氯化磷酸苄酯在有机碱存在下发生磷酰胺化反应。

2.如下图所示将CA4与磷酰氯在有机碱存在下发生酯化反应。

3.如下图所示将带有保护基团的CA4衍生物逐步去除Alloc、Bn保护基并成钠盐。

实施例1：combretastatin A4(CA4)衍生物—2-甲氧基-5-[(1Z)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙烯基]苯酚-环(L-精氨酰-甘氨酰-L-天冬氨酰-D-苯丙氨酰-L-赖氨酰)-磷酸钠盐的合成

1.1固相合成(线性RGD肽的合成)

1.1.1Fmoc-Gly-OH氨基树脂的偶联合成

称取2-Chlorotrityl chloride resin树脂(W₀克)(N₀mmol)，将树脂加入到反应器中，加入DMF洗涤树脂后，将20％DBLK[20％哌啶/DMF(V/V)](用量3-4ml/克树脂)加入反应器中，反应10+10分钟，用DMF洗涤树脂。

以2-Chlorotrityl chloride resin树脂摩尔量N0为基数，按一定投料比称量以下物料：Fmoc-Gly-OH(3倍量)；HOBt(3.6倍量)；用适量DMF溶解。冰浴下加入DIC(3.9倍量)，活化反应3±1分钟后加入到反应器中。偶联反应2.0±0.1小时，用DMF洗涤4次。量取15N0mmol的乙酸酐和15N0mmol的吡啶加入反应器中，封闭反应2.0±0.1小时。

检测反应：取少量反应液，滴3-5滴茚三酮溶液，加热至沸腾；以DMF洗涤树脂颗粒，观察是否显色，以确定反应是否完全。如显色，继续封闭0.5小时。

重复上述操作将下列Fmoc-AA偶联到树脂上Fmoc-Arg(Alloc)、Fmoc-Lys(Cbz)、Fmoc-D-phe、Fmoc-Asp(Alloc)，将偶联完成的肽树脂真空干燥12小时以上，称量肽树脂的重量。

1.1.2肽树脂裂解

裂解液配置：按10ml/g的比例，配置裂解液：(TFA:H₂O＝95:5v/v)

乙醚/石油醚：根据100ml/g树脂的比例，其中乙醚：石油醚＝1:1v/v

树脂称量：称取W(g)干燥的肽树脂，投入至裂解反应瓶中。在冰浴(0-5℃)条件下，缓慢加入配置的冰冻裂解液，充分搅拌0.5hr，撤去冰浴。室温(20-30℃)下充分搅拌树脂,反应1.5～2.0hr，反应完毕后收集滤液。搅拌下将滤液缓慢加入10倍体积的冰冻乙醚/石油醚中，搅拌均匀，离心，收集沉淀。将所得线性RGD肽,真空干燥8.0小时以上，置于冰箱，冷藏保存。粗肽收率在80～90％。

1.2环状RGD肽的合成

1.2.1环合

将带有保护基团的线性多肽链5.0g(5.41mmol)溶解于50mlDMF中，冰浴下(0-5℃)滴加叠氮磷酸二苯酯2.23g(8.11mmol)，滴加完毕后，室温(20-30℃)下搅拌5～6hr。完毕后加入500ml乙醚，搅拌均匀，离心，收集沉淀。将所得Cbz保护的环状RGD肽,真空干燥8.0小时以上，置于冰箱，冷藏保存。Cbz保护的环状RGD肽收率在90～95％。

1.2.2脱除Cbz

将上述步骤中得到的Cbz保护的环状RGD肽4.0g(4.42mmol)溶解于40ml DMF/MeOH/CHCl3中，用10％Pd/C常压加氢脱除Cbz保护基，完毕后加入400ml乙醚，搅拌均匀，离心，收集沉淀。将所得环状RGD肽,真空干燥8.0小时以上，置于冰箱，冷藏保存。环状RGD肽收率在95～100％。1.3combretastatin A4(CA4)衍生物—2-甲氧基-5-[(1Z)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙烯基]苯酚-环(L-精氨酰-甘氨酰-L-天冬氨酰-D-苯丙氨酰-L-赖氨酰)-磷酸钠盐的合成

1.3.1磷酰胺化

在-20℃，向搅拌的环状RGD肽3.0g(3.89mmol)和二氯磷酸苄酯875mg(3.89mmol)的30ml二氯甲烷溶液中，缓慢滴加含有三乙胺393mg(3.89mmol)的二氯甲烷溶液5ml，反应液温度不超过-10℃，滴加完毕后，保持该温度再搅拌反应0.5hr，过滤，滤饼用少量二氯甲烷洗涤后弃去，滤液直接用于后面的酯化反应。

1.3.2酯化

在-35℃，加入Combretastatin A-4 1.23g(3.89mmol)、三乙胺393mg(3.89mmol)，以及无水乙腈30ml，，滴加上述步骤中得到的二氯甲烷反应液，反应液温度不超过-20℃，滴加完毕后，保持该温度再搅拌反应1.5hr。将反应液倾入100ml冰水中，分出有机层，水层再用10ml*2二氯甲烷萃取两次，合并有机层，10ml*1水洗，10ml*1饱和氯化钠洗，干燥，蒸干得磷酸酯粗品。

精制：将粗品用乙酸乙酯-石油醚(1:1)约10eq重结晶，25℃下干燥，即得磷酸酯精制品。磷酰胺化、酯化两步反应总收率在70～80％。

1.3.3脱保护

将上述步骤中得到的磷酸酯精制品3.50g(2.82mmol)溶解于35ml无水乙腈中，室温(20-30℃)下加入Pd(PPh₃)₄ 330mg(0.28mmol),保持该温度搅拌反应3.5hr，过滤，反应液加入10％Pd/C常压加氢脱除Bn保护基，完毕后过滤，滤液用氢氧化钠溶液调pH＝7～8，离心，收集沉淀，真空干燥8.0小时以上，置于冰箱，冷藏保存。combretastatin A4(CA4)衍生物粗品收率在70～80％。

1.3.4纯化

将combretastatin A4(CA4)衍生物粗品按100mg/mL加纯化水，搅拌溶解，用中速定性滤纸，进行过滤。过滤完成后，按下述条件进行HPLC纯化。

纯化梯度：95％A+5％B→上样→95％A+5％B平衡2min→77％A+23％B→64％A+36％B线性梯度洗脱→50％A+50％B→95％A+5％B。combretastatin A4(CA4)衍生物纯化收率在70～80％，纯度98.53％。比旋度：

元素分析：C：53.73％、H：5.97％、N：12.49％、Na：2.24％；质谱(MALDI-TOF/TOF)：[M-Na+H]981.82。

实施例2：combretastatin A4(CA4)衍生物—2-甲氧基-5-[(1Z)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙烯基]苯酚-环(L-精氨酰-甘氨酰-L-天冬氨酰-D-苯丙氨酰-L-赖氨酰)-磷酸钠盐的合成

2.1固相合成(线性RGD肽的合成)

2.1.1Fmoc-Gly-OH氨基树脂的偶联合成

重复上述操作将下列Fmoc-AA偶联到树脂上Fmoc-Arg(Alloc)、Fmoc-Lys(Dde)、Fmoc-D-phe、Fmoc-Asp(Alloc)，将偶联完成的肽树脂真空干燥12小时以上，称量肽树脂的重量。

2.1.2肽树脂裂解

裂解液配置：按10ml/g的比例，配置裂解液：(TFA:H₂O＝95:5v/v)

2.2环状RGD肽的合成

2.2.1环合

将带有保护基团的线性多肽链5.0g(5.24mmol)溶解于50mlDMF中，冰浴下(0-5℃)滴加叠氮磷酸二苯酯2.16g(7.86mmol)，滴加完毕后，室温(20-30℃)下搅拌5～6hr。完毕后加入500ml乙醚，搅拌均匀，离心，收集沉淀。将所得Dde保护的环状RGD肽,真空干燥8.0小时以上，置于冰箱，冷藏保存。Dde保护的环状RGD肽收率在90～95％。

2.2.2脱除Dde

将上述步骤中得到的Dde保护的环状RGD肽4.0g(4.27mmol)溶解于40ml 2％的水合肼/DMF中，室温搅拌脱除Dde保护基，完毕后加入400ml乙醚，搅拌均匀，离心，收集沉淀。将所得环状RGD肽,真空干燥8.0小时以上，置于冰箱，冷藏保存。环状RGD肽收率在95～100％。

2.3combretastatin A4(CA4)衍生物—2-甲氧基-5-[(1Z)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙烯基]苯酚-环(L-精氨酰-甘氨酰-L-天冬氨酰-D-苯丙氨酰-L-赖氨酰)-磷酸钠盐的合成

2.3.1磷酰胺化

在-20℃，向搅拌的环状RGD肽4.0g(5.18mmol)和二氯磷酸苄酯1166mg(5.18mmol)的40ml二氯甲烷溶液中，缓慢滴加含有三乙胺524mg(5.18mmol)的二氯甲烷溶液5ml，反应液温度不超过-10℃，滴加完毕后，保持该温度再搅拌反应0.5hr，过滤，滤饼用少量二氯甲烷洗涤后弃去，滤液直接用于后面的酯化反应。

2.3.2酯化

在-35℃，加入Combretastatin A-4 1.64g(5.18mmol)、三乙胺524mg(5.18mmol)，以及无水乙腈40ml，，滴加上述步骤中得到的二氯甲烷反应液，反应液温度不超过-20℃，滴加完毕后，保持该温度再搅拌反应1.5hr。将反应液倾入100ml冰水中，分出有机层，水层再用10ml*2二氯甲烷萃取两次，合并有机层，10ml*1水洗，10ml*1饱和氯化钠洗，干燥，蒸干得磷酸酯粗品。

2.3.3脱保护

将上述步骤中得到的磷酸酯精制品4.00g(3.23mmol)溶解于40ml无水乙腈中，室温(20-30℃)下加入Pd(PPh₃)₄ 370mg(0.32mmol),保持该温度搅拌反应3.5hr，过滤，反应液加入10％Pd/C常压加氢脱除Bn保护基，完毕后过滤，滤液用氢氧化钠溶液调pH＝7～8，离心，收集沉淀，真空干燥8.0小时以上，置于冰箱，冷藏保存。combretastatin A4(CA4)衍生物粗品收率在70～80％。

2.3.4纯化

纯化梯度：95％A+5％B→上样→95％A+5％B平衡2min→77％A+23％B→64％A+36％B线性梯度洗脱→50％A+50％B→95％A+5％B。combretastatin A4(CA4)衍生物纯化收率在70～80％，纯度98.75％。比旋度：

元素分析：C：53.59％、H：5.85％、N：12.62％、Na：2.34％；质谱(MALDI-TOF/TOF)：[M-Na+H]981.52。

实施例3：combretastatin A4(CA4)衍生物—2-甲氧基-5-[(1Z)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙烯基]苯酚-环(L-精氨酰-甘氨酰-L-天冬氨酰-D-苯丙氨酰-L-赖氨酰)-磷酸钾盐的合成

3.1磷酰胺化

3.2酯化

3.3脱保护

将上述步骤中得到的磷酸酯精制品4.00g(3.23mmol)溶解于40ml无水乙腈中，室温(20-30℃)下加入Pd(PPh₃)₄ 370mg(0.32mmol),保持该温度搅拌反应3.5hr，过滤，反应液加入10％Pd/C常压加氢脱除Bn保护基，完毕后过滤，滤液用氢氧化钾溶液调pH＝7～8，离心，收集沉淀，真空干燥8.0小时以上，置于冰箱，冷藏保存。combretastatin A4(CA4)衍生物粗品收率在70～80％。

3.4纯化

纯化梯度：95％A+5％B→上样→95％A+5％B平衡2min→77％A+23％B→64％A+36％B线性梯度洗脱→50％A+50％B→95％A+5％B。combretastatin A4(CA4)衍生物纯化收率在70～80％，纯度98.33％。比旋度：

元素分析：C：52.83％、H：5.79％、N：12.53％、K：3.74％；

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。

Claims

1.一种双靶向combretastatin A4衍生物，其特征在于：为以下结构：

其中，X₁是H；X₂是H；X₃是H或金属离子。

2.根据权利要求1所述的双靶向combretastatin A4衍生物，其特征在于：所述X₃是Na离子。

3.权利要求1所述的双靶向combretastatin A4衍生物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

a)使用固相合成法将Fmoc-甘氨酸、带保护基的Fmoc-精氨酸、带保护基的Fmoc-赖氨酸、Fmoc-D-苯丙氨酸、带保护基的Fmoc-天冬氨酸偶联，得到带有保护基团的线性RGD肽，并将获得的线性五肽从树脂上裂解下来；

b)使用叠氮磷酸二苯酯类物质或者其他缩合剂将线性多肽中的甘氨酸和天冬氨酸首尾相连，使成环；

c)选择性脱除赖氨酸上保护基团，使其ε-氨基裸露；

d)二氯化磷酸苄酯在三乙胺类有机碱存在下依次与裸露ε-氨基的环肽、

Combretastatin A-4发生磷酰胺化、酯化反应，得到带有保护基团的combretastatinA4衍生物；

e)脱除环肽上精氨酸和天冬氨酸的保护基团，脱除磷酸上的苄基，终产品用氢氧化钠类含金属离子的碱性物质以金属盐的形式从反应液中析出，HPLC制备纯化。